STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE
VEGETALĂ CU POTENȚIALE EFECTE
NEUROPROTECTOARE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Coordonator știintific:
Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU
Doctorand:
Farmacist Andrei-Florin PĂDURARU
2021
STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE
VEGETALĂ CU POTENȚIALE EFECTE
NEUROPROTECTOARE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Coordonator știintific:
Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU
Doctorand:
Farmacist Andrei-Florin PĂDURARU
2021
Actuala Teză de doctorat “Studiul unor extracte de origine
vegetală cu potențiale efecte neuroprotectoare” cuprinde 173 pagini
dintre care 48 dedicate Părții Generale, 103 Părții Personale și 22
Bibliografiei.
Teza cuprinde 121 figuri, 20 tabele, și 290 referințe bibliografice.
În acest Rezumat, figurile, tabelele și referințele bibliografice
selectate păstrează același număr ca cel alocat în textul Tezei de doctorat.
Cuvinte cheie: Ajuga reptans L, Ajuga genevensis L, Leuzea
carthamoides (Willd) Iljin, Leuzea salina, iridoide, ecdisone,
ecdisteroide, acizi polifenolici, flavonoide, antiinflamatoare,
anabolizante, antioxidante, antistres-adaptogene, neuroprotectoare,
anxiolitice, antidepresive, nootrope, demențe, Alzheimer, Parkinson,
demența cu corpi Lewy, demența Huntington.
CUPRINS
MULȚUMIRI v
ABREVIERI viii
A. Partea generală
CAPITOLUL 1: Date actuale privind etiologia și evoluția
unor boli neurodegenerative moderne, cu accent pe boala
Parkinson.
1
1.1 Introducere 1
1.2 Fiziologia neuronului 2
1.3 Neurogeneza la adulți 5
1.4 Apoptoza 7
1.5 Demențele 8
1.5.1 Demențele vasculare 8
1.5.2 Boala Alzheimer 9
1.5.3 Boala Parkinson 10
1.5.3.1 Epidemiologie 10
1.5.3.2 Patofiziologie și etiologie 11
1.5.3.3 Biochimia și farmacologia sindromului Parkinson 13
1.5.3.4 Simptomele bolii 13
1.5.3.5 Importanța stresului oxidativ și a inflamației în boala
Parkinson
15
1.5.3.6 Farmacoterapia simptomatică în boala Parkinson 19
1.6 Măsuri profilactice și terapia adjuvantă în bolile
neurodegenerative
21
CAPITOLUL 2: Date de literatură privind speciile vegetale
luate în studiu
32
2.1 Cunoștințe actuale privind speciile Ajuga reptans și Ajuga
genevensis
32
2.1.1 Încadrare botanică 32
2.1.2 Compoziție chimică 33
2.1.3 Acțiuni farmacologice 36
2.1.4 Biogeneză 36
2.1.5 Rol în organismul vegetal 37
2.1.6 Utilizări și dozaj 37
2.2 Cunoștințe actuale privind genul Leuzea 38
2.2.1 Încadrare botanică 38
2.2.2 Compoziția chimică 39
2.2.3 Rol în organismul vegetal și animal 44
2.2.4 Acţiuni farmacologice 46
2.2.5 Mecanism de acţiune 47
2.2.6 Contraindicaţii şi efecte secundare 48
2.2.7 Utilizari si dozaj 48
B. Parte personală
CAPITOLUL 3: Motivarea alegerii temei; scopul și
obiectivele cercetării
49
3.1 Motivarea alegerii temei 49
3.2 Scopul și obiectivele cercetării 51
CAPITOLUL 4: Material, metode și tehnici de lucru 53
4.1 Prezentarea materialului vegetal supus cercetării 53
4.1.1 Analiza farmacognostică microscopică 53
4.1.2 Analiza histoanatomică 54
4.1.2.1 Protocolul de realizare a preparatelor 54
4.1.2.2 Examinarea la microscopul de baleiaj 54
4.2 Obținerea extractelor incluse în experimentele derulate 55
4.3 Analiza chimică 56
4.3.1 Analiza chimică calitativă prin cromatografie pe strat
subțire (CSS) pentru derivați flavonoidici, polifenolici și
iridoide
56
4.3.2 Analiza chimică cantitativă 57
4.3.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor
totali a flavonoidelor și a iridoidelor
57
4.3.2.2 Analiza prin cromatografie în fază lichidă de înaltă
performanţă (UHPLC)
61
4.4 Investigarea potențialului biologic ale extractelor de Ajuga
sp. si Leuzea sp. studiate
68
4.4.1 Investigarea in vitro a potențialului antioxidant și
anticolinesterazic
68
4.4.1.1 Inhibarea lipoxigenazei 68
4.4.1.2 Inhibarea colinesterazelor 69
4.4.1.3 Capacitatea de chelatare a ionul feros 69
4.4.2 Evaluarea in vivo a unor efecte farmacologice 70
4.4.2.1 Obținerea modelului experimental de boală
Parkinson indus la șobolani
71
4.4.2.2 Studiul acțiunii antidepresive și anxiolitice a
extractelor de Leuzea: modelul experimental de pești-zebra
(Danio rerio)
77
CAPITOLUL 5: Contribuții la studiul farmacognostic și
biologic a produselor Ajugae herba: Rezultate și Discuții
82
5.1 Analiza fitochimică a produselor Ajugae herba 82
5.1.1 Studiul fitochimic al materialului vegetal recoltat în
anul 2017 din flora spontană
83
5.1.2 Studiul fitochimic a două mostre de Ajuga (reptans și
respectiv genevensis) provenite din cultură
87
5.2 Evaluarea potențialului biologic al extractelor de Ajuga sp. 93
5.2.1. Evaluarea potențialului antioxidant și anticolinesterazic
al extractelor de Ajuga sp.
94
5.2.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a
colinesterazelor
94
5.2.1.2 Investigarea acțiunii a extractelor asupra
lipoxigenazei
97
5.2.1.3 Evaluarea capacității de chelatare al ionului feros
5.2.2 Cercetări in vivo privind potențialul anti-Parkinson al
extractelor evaluate
98
99
5.2.2.1 Teste comportamentale 100
5.3 Concluzii 112
CAPITOLUL 6: Contribuții la studiul farmacognostic și
biologic al extractelor obținute din speciile de Leuzea
carthamoides și Leuzea salina: Rezultate și Discuții
113
6.1 Analiza farmacognostică a speciilor Leuzea carthamoides și
Leuzea salina
113
6.1.1 Analiza farmacognostică macroscopică a speciilor
Leuzea carthamoides și Leuzea salina
114
6.1.2 Studiul histoanatomic al speciilor de Leuzea 114
6.1.2.1 Leuzea carthamoides 115
6.1.2.2 Leuzea salina 119
6.1.3 Analiza microscopică a preparatelor superficiale 124
6.2 Contribuții la analiza fitochimică a extractelor de Leuzeae
herba (L. carthamoides și L. salina)
128
6.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor totali și
a flavonoidelor din extractele celor două specii de Leuzea
129
6.2.2 Identificarea și cuantificarea unor componente bioactive
din extractele de Leuzea, utilizând tehnica UHPLC
130
6.3 Contribuții la evaluarea potențialului biologic al extractelor
de Leuzea sp
134
6.3.1 Evaluarea potențialului antioxidant si anticolinesterazic
al extractelor de Leuzea sp.
134
6.3.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a
colinesterazelor
134
6.3.1.2 Investigarea acțiunii de inhibare a lipoxigenazei 136
6.3.1.3 Evaluarea capacității de de chelatare al ionului feros 138
6.3.2. Investigarea potențialului anti-Parkinson al extractelor
de Leuzea prin intermediul testului zebra-fish (Danio rerio)
138
6.3.2.1 Teste comportamentale 139
6.4 Concluzii 144
CAPITOLUL 7: Concluzii generale; Originalitatea tezei;
Perspective de continuare a cercetărilor
146
BIBLIOGRAFIE
152
1
PARTEA PERSONALĂ
Motivarea alegerii temei; scopul și obiectivele cercetării
Plecând de la datele și considerentele prezentate în Capitolul 1
referitor la etiologia și evoluția bolii Parkinson, cele mai importante
substanțe farmacologice active recomandate pacienților sunt levodopa
combinat cu benserazida sau carbidopa al căror rol este de a asigura
creierului o cantitate suficientă de dopamină, neurotransmițător
insuficient sintetizat în această boală.
De asemeni inhibitori de catecol-O-metiltransferaza (COMT)
cum ar fi entacapon sau tolpacon prin blocarea enzimei împiedică
metilarea levodopa la nivelul grupării hidroxil fenolic, cu formarea astfel
a unui metabolit inactiv; prin inhibarea acestei reacții acțiunea levodopa
administrată este accentuată. Entacapon inhibă COMT la nivel periferic
în timp ce Tolcapon o inhibă atât periferic cât și la nivelul SNC. Cu toate
acestea pentru ambele substanțe medicamentoase efectul periferic se află
în prim plan, deoarece COMT este localizat în SNC mai ales în celulele
gliale, neuronii dopaminergi prezentând doar o activitate COMT mică,
până la inexistentă.
Inhibitorii de monoaminoxidază B (MAO-B) reprezintă o altă
posibilitate de a crește concentrația dopaminei la nivelul receptorilor
dopaminergici centrali. Cele două forme izo MAO-A și MAO-B diferă
între ele prin exprimarea lor la nivelul țesuturilor și specificitate de
substrat. MAO-B intermediază degradarea dopaminei precum și
dezaminarea β-feniletilaminei care stimulează eliberarea de dopamină și
inhibă repreluarea neuronală a dopaminei. Inhibarea MAO-B conduce
astfel la o creștere a concentrației intrasinaptice a dopaminei. Prin
blocarea MAO-B se reduce totodată generarea unor specii reactive de
oxigen (RLO). Cei mai importanți inhibitori MAO-B sunt: selegilina,
rasagilina și safinamida.
Agoniștii dopaminergici se folosesc în special la pacienții mai
tineri, efectul lor principal fiind cel de stimulare a receptorilor D2.
2
Agoniștii dopaminergici existenți se subîmpart în derivați ergotinici și
non-ergotinici.
Anticolinergice centrale, sunt antagonisti lipofili terțiari ai
receptorilor muscarinici și reprezintă de fapt cele mai vechi medicamente
antiparkinson cunoscute și încă utilizate. Studiile clinice n-au adus însă
date concludente privind eficiența lor în tratamentul sindromului
Parkinson. Cu toate acestea anticolonergicele sunt clinic utile la pacienții
care prezintă un tremor de repaus foarte intens.
Amantadina, dezvoltată inițial pentru profilaxia gripei s-a dovedit
a fi un inhibitor eficient al receptorilor NMDA (N-metil-D-asprtat) și prin
aceasta inhibă acțiunea glutamatului. În plus, amantadina crește
concentrația extracelulară a dopaminei și inhibă eliberarea acetilcolinei
în SNC. Se utilizează în asociere cu levodopa și antiparkinsoniene
dovedindu-și utilitatea mai ales în crizele akinetice.
Butipin, inhibă receptorii NMDA și este în plus un antagonist al
receptorilor muscarinici: reduce mai ales tremorul, fiind admis în terapia
de combinare la pacienții cu Parkinson fără fluctuații (186).
Desigur că administrarea unor astfel de medicamente de sinteză,
puternic active, vin cu o paletă destul de largă de reacții adverse.
Din grupul medicamentelor utilizate în tratamentul bolii
Parkinson se constată că lipsesc atât antiinflamatoarele, cât și
antioxidantele, cu toate că se știe că atât inflamația cât și supraproducția
de specii reactive de oxigen contribuie la înrăutățirea simptomatologiei
bolii.
Din acest motiv, identificarea speciilor vegetale care să vină cu
principii active cu acțiune: antioxidantă, antiinflamatoare și anabolizantă
este de un real interes.
Produsele vegetale conțin numeroase componente cu acțiune
antioxidantă (47) în special compușii polifenolici (flavonoide și acizi
polifenolici); pentru acțiunea antiinflamatoare așa cum este în cazul bolii
Parkinson ne-am orientat spre identificarea unor plante cu conținut în
iridoide, mai ales din grupul harpagidei, în timp ce pentru acțiunea
anabolizantă ne-am orientat către compuși de tip fitoecdisone.
Astfel am identificat 4 specii vegetale și anume: Ajuga reptans și
Ajuga genevensis,
3
care conform literaturii conțin pe lângă polifenoli antioxidanți și iridoide
din grupul harpagidei, dar și fitoecdisone anabolizante, care apar în
concentrație mai mare la Leuzea carthamoides (Rhaponticum
carthamoides) și Leuzea salina. În ambele specii de Leuzea apar de
asemeni compuși polifenolici, antioxidanți (210).
Deoarece în sindromul Parkinson farmacoterapia utilizează doar
substanțe cu acțiune simptomatică, nu cauzală, cu siguranță că eventuala
identificare a unor noi compuși naturali care sa susțină și să completeze
tratamentul medicamentos alopat deja bine stabilit ar influența
simptomatologia specifică.
Am selectat două specii de Ajuga, comune în țara noastră și a
căror compoziție chimică fusese investigată în cadrul unor studii
prospective efectuate în ultimul deceniu (111, 112, 115). Acestea
puseseră în evidență faptul că în partea aeriană înflorită a celor două
specii, pe lângă derivați polifenolici (în principal flavonoide și acizi
polifenolici) se găsesc iridoide, unele dintre acestea apropiate structural
de 8-O-acetilharpagida. Harpagida reprezintă una dintre componentele
bioactive existente în extractele din tubero-bulbii secundari de
Harpagophyutm procumbens (Burchell de Candolle), plantă care crește
în Africa de Sud. În produsul vegetal Harpagophyti radix se găseste o
întreagă familie de derivați iridoidici printre care harpagozida,
procumbida, 8-p-cumaroilharpagida și 8-O-acetilharpagida (25). Fiind
substanțe amare, iridiodele menționate dezvoltă o serie de acțiuni și
anume: apetisantă, coleretică, de stimulare a secreției gastrice, dar și
antiflogistică și ușor analgetică (151, 274).
Pe piață farmaceutică actuală circulă numeroase medicamente
care conțin extracte preparate din Harpagophyutm procumbens (gheara
diavolului); în afara utilizării pentru calitățile de principii amare acestea
se folosesc și ca antiinflamatoare în tratamentul mai ales al inflamațiilor
cronice (247), în artrita reumatoidă sau în artroză (32).
În ceea ce privește mecanismul de acțiune al extractului din
Harpagophythi radix, acesta se bazează pe inhibarea sintezei de
prostaglandine proinflamatoare (1). Extractele de Harpagophytum
acționează antiinflamator prin inhibarea ciclooxigenazei 2 (COX 2) din
cadrul cascadei acidului arahidonic (1), si în mod selectiv asupra
lipoxigenazei (LOX) (111), împiedicând prin aceasta sinteza de
4
leucotriene (LT). Totodată, interesant este faptul că extractul iridoidic
determină inhibarea interleukinei 2 (IL 2), și suplimentar a activității
colagenazelor ceea ce se traduce prin inhibarea activității enzimelor care
degradează colagenul. Experimental a fost pusă în evidență o inhibare a
metalo-proteinazelor matriciale pe celule articulare, fapt care explică
eficiența dovedită în ceea ce privește tratamentul cu preparate conținând
iridoidele menționate în diferitele forme de artroză (69).
Există în literatura de specialitate o multitudine de lucrări
publicate care se referă la studii clinice dublu-orb precum și un studiu în
care s-a urmărit nivelul eliberării de prostaglandine E (PGE) și
prostaglandine I (PGI) (227) după administrarea unor preparate din
rădăcină de gheara diavolului la pacienți. Pentru principiile active din
extractele de Harpagophytum procumbens s-a dovedit capacitatea
acestora de a traversa bariera hematoencefalică și a dezvolta la nivel
cerebral o acțiune antiinflamatoare, exploatată deocamdată în tratamentul
unor cancere cerebrale; inflamația și durerile asociate acesteia se reduc
semnificativ după aproximativ trei săptămâni de tratament cu minimum
600 mg extract/zi. De altfel în literatura, acțiunea antiinflamatoare a
iridoidelor este frecvent abordată (36, 149, 150, 153, 267, 287), și
totodată se scoate în evidență faptul că unele dintre acestea cum ar fi
genipina și genipozida pot fi folosite datorită efectului antinociceptor
(81), dar și datorită proprietăților neurotrope (125, 166, 167, 280).
Genipozida are chiar calitatea de a atenua moartea neuronală la nivelul
hipocampusului, dacă acesta este supus unei hipoxii și deprivării de
glucoză.
Pe de altă parte, Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin
(sinonim Leuzea carthamoides DC), este o specie care a constituit
subiectul unei teze de doctorat în anii 80 la disciplina de Farmacognozie
U.M.F. Iași, iar în ultimii ani chimismul (21, 27, 28, 33, 57, 146, 173,
272) și proprietățile biologice ale extractelor au fost investigate mai
indeaproape. Astfel s-a pus în evidență pe lângă altele, acțiunea
adaptogenă (168, 173, 183, 283) a extractelor și efectul de prevenire a
schimbărilor destructive și a descreșterii densității sinapselor în cortexul
cerebral la șobolani cărora li s-a indus și menținut timp de 5 zile o
ischemie cerebrală (168), precum și o îmbunătățire a capacităților de
învățare și memorare (183, 281).
5
De asemeni s-a pus în evidență efectul antioxidant (209) al
extractului total. Toate aceste date din literatură ne-au determinat să
reluăm cercetările și asupra speciei Leuzea carthamoides cultivată, la
acestea adaugându-se existența unei a doua specii de Leuzea, Leuzea
salina. În măsura în care cultivarea L. salina ar putea deveni interesantă
pentru firmele care condiționează produse vegetale, aceasta ar putea fi
cultivată și pe terenuri mlăștinoase.
Pentru toate cele 4 produse vegetale ne-am propus o investigare
chimică corelată cu un studiu al activității biologice (prin studii in vitro
și in vivo) care să confirme eventuale calități anti-Parkinson ale
materialului studiat.
Scopul și obiectivele cercetării
În scopul identificării unei eventuale acțiuni anti-Parkinson, ne-
am propus într-o primă fază aprofundarea studiului chimic cu privire la
prezența iridoidelor, flavonoidelor, acizilor polifenolcarboxilici și
ecdisteroidelor în extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis, si
ilustrarea variabilității intra și inter specifice, pentru ca apoi să urmărim
in vitro și in vivo efectele biologice.
În partea a doua a tezei ne-am propus investigarea chimică
comparativă a două mostre de Leuzea. Este vorba de Leuzea
carthamoides prelevată din câmpul experimental al C.C.B. Piatra Neamț
si Leuzea salina recoltată din apropiere de Valea Lupului, Iași. Totodată
materialul vegetal a fost supus și unei analize fitochimice care a urmărit
derivații ecdisonici și compușii polifenolici, realizându-se și o
investigare a proprietăților biologice ale extractelor.
Ținând cont de faptul că în cadrul tezei am analizat două specii
de Ajuga și două de Leuzea, obiectivele urmărite au constat în:
recoltarea unor probe de Ajuga sp. în anii 2015, 2016, 2017 și
2018 din flora spontană și din câmpul experimental de plante
medicinale al Centrului de cercetări biologice Stejarul din
Piatra Neamț, la momentul maximei înfloriri (prima
săptămână din mai),
6
recoltarea unor indivizi de Leuzea carthamoides DC de la
C.C.B. Stejarul din Piatra Neamț și respectiv de Leuzea salina
din Valea Lupului, Iași în anii 2017-2018,
studiul histoanatomic al organelor subterane și supraterane ale
speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea salina,
uscarea materialului vegetal în condiții similare,
prelucrarea drogurilor pentru obținerea unor extracte
hidroalcoolice,
analizarea chimică (calitativă și cantitativă) pentru stabilirea
componentelor de tip iridoidic, flavonoidic, a polifenolilor
acizi și a polifenolilor totali, a ecdisonelor pentru Ajuga și
respectiv, a polifenolilor și ecdisonelor în cazul speciilor de
Leuzea,
cercetarea in vitro a acțiunii asupra lipoxigenazei,
colinesterazelor și determinarea capacității de chelatarea a
ionului feros,
cercetarea efectului neuroprotector al extractelor de Ajuga sp.
pe șobolani cărora li s-a indus un sindrom Parkinson prin
injectare cu neurotoxina 6-OHDA,
cercetarea influenței extractelor de Leuzea asupra peștilor din
specia Danio rerio, ca măsură a influenței asupra memoriei și
a motivației de căutare/explorare a recompensei.
Presupunând că efectul neuroprotector al extractelor s-ar putea
datora pe de-o parte acțiunii antiinflamatoare și pe de altă parte calităților
antioxidante, dar și prezenței în extracte a ecdisteroidelor în Capitolul
Rezultate și Discutii ale lucrării de față prezentăm rezultatele înregistrate
in vitro a acțiunii asupra unor enzime specifice dar și a capacității de
chelatare a ionului feros, în timp ce in vivo s-a investigat efectul de
imbunătățire a memoriei de scurtă/ lungă durată la șobolani cărora li s-a
provocat un Parkinson experimental (prin injectare cu 6-OHDA), în timp
ce prin testul zebra-fish s-a pus în evidență efectul anxiolitic, antidepresiv
și anti-Parkinson.
Cercetarea noastră a urmărit in vivo și capacitatea celor 4 extracte
de a inhiba acetilcolinesteraza și butirilcolinesteraza, ambele catalizând
hidroliza acetilcolinei sau a altor esteri ai colinei. Unii compuși de origine
vegetală pot bloca mai mult sau mai puțin intens activitatea celor două
7
enzime, ceea ce duce la stimularea în măsură mai mare sau mai mică a
unor procese neuronale, dar și la apariția unor reacții adverse cum ar fi:
grețuri, vărsături, diaree, dispepsie, deprimare respiratorie și apariția unor
erupții cutanate.
Derivații polifenolici, dar și iridoidele din extractele vegetale ar
putea avea o acțiune antioxidantă de foarte bună calitate aceasta fiind
investigată în cadrul cercetărilor actuale prin determinarea in vitro a
capacității de chelatarea a ionului feros.
Cum deja menționasem în Parkinson apare o componentă
inflamatorie de tip cronic, față de care iridoide precum harpagida din
Ajuga ar putea fi eficiente; pentru a pune în evidență acest lucru am apelat
la testul in vitro de inhibare a lipooxigenazei, pentru a constata dacă
această cale de metabolizare a acidului arahidonic către leucotrienele de
tip A4 (pro-inflamatoare, pro-chemotactice, pro-anafilactice) este sau nu
întreruptă. Același test a fost întreprins și pentru extractele de Leuzea.
8
CAPITOLUL 5: Contribuții la studiul farmacognostic și biologic a
produselor Ajugae herba: Rezultate și Discuții
5.1 Analiza fitochimică a produselor Ajugae herba
Având în vedere prezentarea produselor vegetale derivate din
Ajuga reptans și Ajuga genevensis făcută anterior conform datelor din
literatură privind chimismul lor, ne-am propus pentru început
investigarea materialului vegetal existent la noi în țară. Pe lângă aspectul
macroscopic al probelor am urmărit și elementele microscopice care pot
fi evidențiate în partea aeriană înflorită a celor două specii, Ajuga reptans
și Ajuga genevensis, constatând, cum era de așteptat păstrarea
caracteristicilor deja cunoscute din cercetări anterioare (115), motiv
pentru care in teza de față n-am insistat asupra acestora.
Pe de altă parte după cum dovedesc o serie de lucrări efectuate în
ultimii ani, variabilitatea chimică a unei specii este largă și caracteristică
pentru fiecare zonă în parte. Chimismul diferă datorită ofertei de
substanțe nutritive din sol, de clima existentă și modificarile acesteia în
anul recoltării, de nivelul precipitațiilor, intensitatea și durata iluminării
zilnice și bineînțeles in funcție de caracteristicele genetice ale indivizilor.
Pentru a urmări acest aspect în anii 2015- 2019 am prelevat
mostre de Ajuga reptans și respectiv, Ajuga genevensis pe care le-am
uscat și le-am extras cu etanol 70% la reflux, conform descrierii de la
punctul 4.2.
Extractele obținute au fost analizate prin:
A. cromatografie pe strat subțire (analiza chimică calitativă) urmată de
B. determinări spectrofotometrice (probele anilor 2015-2018) pentru
dozarea:
polifenolilor totali- exprimați în g (echivalent) acid galic/ 100g
drog,
flavone- exprimate în g (echivalent) rutozidă/ per 100g drog,
completate cu
dozarea iridoidelor- exprimate în g aucubozidă/ 100g drog si
C. analiza calitativă și cantitativă prin UHPLC pentru polifenoli, acizi
polifenolici, flavonoide, iridoide și ecdisone.
9
Pentru aceste studii comparative materialul vegetal prelucrat a
constat din indivizi de vineriță și suliman prelavați din câmpul
experimental de la C.C.B. Piatra Neamț si respectiv din flora spontană.
Analiza chimică calitativă
Am urmărit evidențierea prin cromatografie pe strat subțire a
derivaților polifenolici, a iridoidelor și a compușilor triterpenici (72) din
cele două specii vegetale, imaginile fiind redate în fig. 5.9A, B, C, D.
Deoarece în momentul cromatografierii nu am avut la dispoziție nici un
etalon din grupul harpagidei, am aplicat ca etalon un extract obținut dintr-
un medicament de proveniență germană Sogoon®, și care conține
harpagozidă.
A. B.
C. D.
Fig. 5.9: CSS pentru acizi polifenolicarboxilici (A,B), flavonoide (C) și iridoide (D) din parțile
aeriene de Ajuga reptans=1 și Ajuga genevensis=2. Etaloane: acid cafeic (Ac.caf), acid
clorogenic (Ac.cl.), acid rozmarinic (Ac.roz.), acid ferulic (Ac.fer.), acid p-cumaric (Ac.p-
cum.), apigenol (A), apigenol-7-O-glucozidă (A7gl), luteolină (L), luteolin-7-O-glucozida
(L7gl), rutozidă (R), aucubozidă (A) și extract din Sogoon (H) (fotografii originale).
10
Analiza chimică cantitativă
S-au urmărit din extractele luate în studiu dozarea
spectrofotometrică a flavonoidelor (exprimate în rutozidă), a
polifenolilor totali (exprimați în acid galic) și a iridoidelor exprimate în
aucubozidă.
În fig. 5.10 redăm rezultatele determinărilor spectrofotometrice
pentru cele două probe de Ajuga recoltate în anul 2018 din câmpul
experimental al C.C.B. Piatra Neamț.
Analiza spectrofotometrică a celor două specii de Ajuga a
evidențiat că extractele sunt bogate în polifenoli, dar mai ales în iridoide;
flavonoidele se regăsesc și ele în aceste probe, dar în cantități mult mai
reduse decât celelalte două clase chimice. Rezultatele obținute dovedesc
că ambele specii conțin același clase de compuși, dar în cantități diferite
deși provin din același mediu de cultură și au fost recoltate la același
moment în fenofaze identice.
Fig. 5.10: Cele mai importante grupe de principii active din probele de Ajuga investigate.
Aceste rezultate sunt în concordanță cu datele din literatura de
specialitate (75, 128, 262, 263, 270) dar nu în totalitate. Cu toate acestea,
trebuie precizat că plantele incluse în studiu provin din cultură controlată,
0 500 1000 1500 2000
Ajuga reptans
Ajuga genevensis
concentrație (mg%)Ajuga reptans Ajuga genevensis
Iridoids 1860 1250
Flavones 141,3 183,6
Total phenols 311,9 375,7
11
în timp ce datele din literatură fac referire în special la produs vegetal
provenit din flora spontană.
Pe de alta parte, pentru a putea confirma variabilitatea specifică
este necesară nu doar o determinare grosieră a totalurilor polifenolice și
iridoidice ci și identificarea și/sau cuantficarea unor principii active
individuale care ar putea fi principalii responsabili de acțiunile biologice
exprimate de extractele hidroalcoolice obținute din cele două specii.
Astfel, prin tehnica de cromatografie de lichide (UHPLC) a fost
confirmată prezența următorilor derivați polifenolici în cele două probe
de Ajuga investigate: acid rozmarinic, acid cafeic, acid p-cumaric,
precum și catehină, apigenol, luteolină și 7-O-glicozida sa.
Astfel de principii active au fost identificate și de către alți autori
în extracte obținute prin diverse metode din speciile de Ajuga (75, 128,
270) (fig. 5.11).
Fig. 5.11: Cromatograma UHPLC a celor două extracte de Ajuga incluse în studiu, unde
AR(albastru) – Ajuga reptans; AG (negru) – Ajuga genevensis. Legendă: 1. acid clorogenic; 2.
acid p-cumaric; 3. catehină; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid rozmarinic; 7. 8-acetil-
harpagozidă; 8. harpagozidă; 9. apigenol.
Valoarea medie a celor trei determinări realizate pentru fiecare
probă este redată comparativ în tabelul VIII. Se observă că spectrul
polifenolilor este același pentru ambele probe, dar cantitativ aceste
componente diferă de la o probă la alta.
12
Tabel nr.VIII: Polifenoli identificați și cuantificați în probele de Ajuga investigate.
Probă
Component (mg/g pv)
acid
cafeic
acid p-
cumaric
acid
ferulic
acid
rosmari
nic
catehină
luteolin-
O-
glucozidă
Luteol
ină Apigenol
Ajuga
reptans
0.85±
0.2
0.646 ±
0.3
2.43±
0.3
19.877±
0.1
1.631±
0.2
9.796 ±
0.1
0.21±
0.2
3.235±
0.1
Ajuga
genevensis
0.33±
0.1
0.333 ±
0.2
4.75±
0.2
17.434±
0.1
2.352 ±
0.1
7.697±
0.4
3.84±
0.3
2.721±
0.2
De asemenea, datele nu permit poziționarea cantitativă a vreuneia
dintre specii, deoarece există compuși în care A. genevensis e mai bogată
(acid ferulic, catehină, luteolină), în timp ce A. reptans este mai bogată
în alții (acid rozmarinic, apigenol).
Conform standardelor utilizate în determinările UHPLC, am
identificat patru iridoide (tabelul nr. IX), dintre care harpagida și
derivatul său acetilat au însumat aproximativ 45% din conținutul total de
iridoide investigate anterior. Pe de altă parte, s-au determinat, de
asemenea, cantități mici de aucubină și catalpol.
Tabel nr. IX: Cuantificarea și identificarea iridoidelor din probele investigate.
Probă
Compus (µg/g pv)
Harpagidă Aucubozidă Catalpol 8-O-acetil-
harpagozidă
Ajuga
reptans 203.899 ± 0.21 17.011± 0.15 11.211± 0.17 610.862 ± 0.11
Ajuga
genevensis 178.61 ± 0.02 8.205± 0.13 10.431± 0.40 420.112 ± 0.22
În ultimii ani s-a pus în evidență prezența unor ecdisterone în
culturile celulare ale unor specii de Ajuga (A. multiflora, A. reptans, A.
iva, A. chamaepitys, A. orientalis). Totodată, speciile de Ajuga au fost
considerate alături de spanac (Spinacia oleracea) noi surse de
fitoecdisteroide, compuși recunoscuți pentru proprietățile lor biologice
complexe, de la antioxidante la hipoglicemiante, hepatoprotectoare,
modulatoare ale creșterii și chiar imunomodulatoare.
De aceea, la analiza cromatografică am urmărit și spectrele unor
ecdisterone precum 20-OH-ecdisterona și α-ecdisterona (conform cu
standardele disponibile în laborator).
13
La integrarea cromatogramelor am reușit identificarea celor două
ecdisterone în ambele probe, la lungimea de undă de λ =245 nm. Un
detaliu al cromatogramei înregistrate la lungimea de undă menționată
prezintă cele mai importante peak-uri de ecdisteroide (fig. 5.12).
Fig.5.12: Detaliu cromatogramă UHPLC Ajuga sp. cu indicarea peak-urilor pentru alte
componente [AR(negru) – Ajuga reptans; AG (albastru) – Ajuga genevensis]. Legendă: 1.
swertiamarina; 2. catalpol; 3. 20-OH-ecdisona; 4. α-ecdisonă; 5. aucubozidă.
Valorile înregistrate pentru cele două ecdisterone, 20-OH-
ecdisona și respectiv α-ecdisona, sunt trecute comparativ în tabelul X.
Tabel nr. X: Cuantificarea ecdisonelor din probele de Ajuga investigate
Probă Compus (mg/g pv)
20-OH-ecdisona α-ecdisona
Ajuga
reptans
0.344 1.625
Ajuga
genevensis
1.367 1.336
În ceea ce privește cromatogramele obținute pentru lungimea de
undă corespunzătoare acizilor polifenolcarboxilici (λ=330 nm), acestea
sunt prezentate în fig. 5.13.
14
Fig. 5.13. Cromatograme pentru extractele de Ajuga sp.investigate la 330 nm, unde AR(negru) –
Ajuga reptans; AG (albastru) – Ajuga genevensis.
După cum se observă din figură, putem aprecia că aspectul și
amplitudinea peak-urilor prezente în cromatograme prezintă atât
asemănări, cât și diferențe, dar cu siguranță concentrațiile fiecărui
compus variză de la o probă la alta. Acest lucru este evidențiat și de date
prezente în literatura de specialitate, când se urmărește extractibilitatea
principiilor active din speciile de Ajuga în funcție de procedeul de
obținere (extracție accelerată cu solvenți, extracție asistată de ultrasunete
și respectiv, metoda de izolare în Soxhlet) utilizat pentru materialul
vegetal amintit.
Autorii au identificat acizi polifenolici (clorogenic, cafeic și
ferulic), dar și glicozide flavonoidice. Totodată, trebuie remarcată
proporția diferită dintre tipurile de acizi polifenoloci, flavonoide și
iridoide din probe, ceea ce ar putea influența semnificativ potențialul
biologic al acestor extracte. Totuși, pentru o corelare doză–acțiune–
structură trebuie urmărite variațiile intensităților de activitate în cadrul
testelor in vitro, utilizate în cadrul acestei teze.
5.2 Evaluarea potențialului biologic al extractelor de Ajuga sp.
5.2.1. Evaluarea potențialului antioxidant și anticolinesterazic al
extractelor de Ajuga sp.
15
În procesele care se desfașoară la nivel cerebral în cazul bolii
Parkinson, am investigat capacitatea de chelatare a fierului având în
vedere faptul că afecțiunea degenerativă este strâns legată și de stresul
oxidativ.
După cum menționam deja în partea introductivă, la baza
simptomelor bolii se află declinul masiv al neuronilor dopaminergici din
ganglionii bazali, un domeniu subcortical al creierului, căruia îi revin
funcții importante în motricitate. Ca urmare apare un dezechilibru al
neurotransmițătorilor, când se instalează: un deficit de dopamină
inhibitoare și un exces relativ de acetilcolină și glutamat excitatoare.
În Parkinson excesul de acetilcolină determină apariția
simptomelor vegetative cunoscute: hipersalivație, transpirații profunde,
hipotensiune ortostatică, constipație, insomnii și tulburări de micțiune.
De aceea am considerat indicată investigarea efectului extractelor noastre
asupra unor enzime din grupul colinesterazelor, acestea fiind implicate în
degradarea acetilcolinei în exces. În lipsa unei astfel de acțiuni, am putea
spera că excesul de acetilcolină prezent în arealele afectate de boală ar
putea fi îndepărtat sub acțiunea enzimei, astfel reducându-se simptomele
vegetative.
Totodată se pare că există un focar inflamator continuu susținut
de metabolizarea la prostanoide proinflamatoare a acidului arahidonic
eliberat din membranele neuronale (sub acțiunea fosfolipazei A2).
Această metabolizare are loc ca urmare a intervenției a două enzime în
cascada acidului arahidonic și anume: ciclooxigenaza (COX) și
lipoxigenaza (LOX).
Având în vedere aspectele enumerate, am investigat în cadrul
studiului nostru efectul pe care cele 2 extracte l-ar putea avea asupra:
lipoxigenazei, colinesterazelor și asupra chelatării ionului feros, ca
parametru de urmărire a capacității antioxidante.
Stresul oxidativ joacă un rol central atât în procesul de
îmbătrânire căt și în patogeneza oricaror afecțiuni degenerative, astfel
încât organismul a dezvoltat mecanisme proprii de protecție pentru
menținerea unei homeostazii redox. Pentru a o ajuta însă, se poate
interveni și cu medicamente antioxidante, polifenolii și iridoidele fiind
cunoscute a avea proprietăți de acest gen, putând interveni prin activarea
16
sistemelor endogene de apărare față de speciile reactive de oxigen, prin
modularea unor procese de semnalizare celulară.
5.2.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a colinesterazelor
Acetilcolinesteraza (AChE) catalizează hidroliza acetilcolinei la
colină şi acid acetic. Enzima este fixată pe membrana post-sinaptică de
la nivelul sinapselor colinergice şi al plăcii neuromotorii. Enzima
controlează cantitatea de neuromediator implicată în transmiterea
impulsului nervos către neuronul post sinaptic sau efectorul post-
sinaptic.
Butirilcolinesteraza (BuChE) sau pseudocolinesteraza este o
enzimă cu localizare predominantă în ficat şi plasmă şi care catalizează
hidroliza acetilcolinei sau a altor esteri ai colinei, inclusiv medicamente
cum sunt succinilcolina, mivacurium şi procaina (8). Inhibitorii enzimei
vor creşte disponibilul de neuromediator cu intensificarea procesului de
transmitere sinaptică şi ameliorarea declinului cognitiv la pacienţii cu
boală Alzheimer sau alte afecţiuni neurodegenerative (222). Studii
experimentale evidenţiază legătura dintre acetilcolinesterază şi difuzia
pre-amiloidului la nivel cerebral, structura nucleului plăcilor mature de
amiloid şi modificările vasculare din boala Alzheimer. De asemenea se
consideră că enzima induce fibrilogeneză prin formarea unor complexi
stabili AchE-β-amiloid (216, 127).
Compuşii de origine vegetală pot interacţiona cu grupările
funcţionale din centrul activ al enzimei sau cu alte grupări funcţionale ale
aminoacizilor din structura enzimei. Unii polifenoli inhibă
acetilcolinesteraza prin mecanism necompetitiv, aceştia formează
legături de hidrogen cu grupări ceto şi hidroxil din structura enzimei.
Gradul de inhibiţie este direct proporţional cu numărul grupărilor hidroxil
din structura inhibitorului (162). Creşterea ponderii fragmentelor lipofile
în detrimentul celor hidrofile în structura inhibitorului determină
reducerea acţiunii acestuia asupra AChE. Pentru alcaloizi (cum ar fi
galantamina utilizata ca martor) gradul de inhibiţie enzimatică depinde
de prezenţa unei grupări carbonilice în apropierea atomului de azot (38,
39). Blocarea intensă a enzimei va determina stimularea proceselor
neuronale, dar şi apariţia reacţiilor adverse consecutive suprastimulării
17
colinergice pe teritoriul parasimpatic, cum sunt: greţurile, vărsăturile,
diareea, durerile abdominale, dispepsia, deprimarea respiratorie şi
erupţiile cutanate. Având în vedere aceste reacţii adverse sunt de preferat
compuşii care induc o inhibiţie moderată a enzimei.
La determinarea capacității de inhibare a colinesterazelor, pentru
extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis am obținut rezultatele
redate în tabelele XI și XII.
Tabel nr. XI: Inhibarea acetilcolinesterazei la tratarea acetilcolinei cu extract de Ajuga reptans
respectiv Ajuga genevensis, comparativ cu galantamina martor.
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg 1.25 mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
soluție
finală)
Ajuga reptans 66.91±
0.04
45.14±
0.13
32.33±
0.12
27.87±
0.09
17.66±
0.11
14.07±
0.07
10.65±
0.10
583.67±
2.04
Ajuga
genevensis
63.84±
0.14
44.84±
0.12
35.71±
0.13
29.35±
0.18
15.68±
0.17
9.75±
0.08
4.60±
0.08
603.57±
2.76
Galantamină - - 95.39±
0.25
82.76±
0.18
73.23±
0.21
52.27±
0.20
33.24±
0.11
28.70±
0.20
Tabelul nr. XII: Inhibarea butirilcolinesterazei de catre extractele de vineriță și suliman,
comparativ cu galantamina martor.
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg 1.25 mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
soluție
finală)
Ajuga reptans 75.46±
0.23
45.5±
0.20
29.29±
0.11
22.7±
0.10
17.30±
0.18
14.27±
0.08
8.76±
0.14
554.10±
2.62
Ajuga
genevensis
68.58±
0.28
49.3±
0.17
36.89±
0.31
29.8±
0.11
21.84±
0.25
14.45±
0.08
12.49±
0.11
512.56±
5.09
Galantamină - - 96.34±
0.11
83.0±
0.07
74.14±
0.14
59.73±
0.18
37.08±
0.05
23.20±
0.09
În fig. 5.14 sunt prezentate comparativ rezultatele obținute pentru
capacitatea extractelor de a determina inhibiția acetilcolinesterazei.
Pe lângă acțiunea inhibitoare asupra acetilcolinesterazei, a fost
investigată și influența extractelor asupra butirilcolinesterazei, deoarece
s-au observat că inhibitorii cu acțiune duală asupra celor două enzime
sunt de preferat celor cu acțiune selectivă (doar asupra AchE) (fig. 5.15).
S-a observat că odată cu progresia bolii Alzheimer, activitatea
BuChe este mai intensă comparativ cu cea a AChE. Unii inhibitori ai
18
BuChe au capacitatea de a reduce sau bloca agregarea β-amiloidului (fig.
5.14 și 5.15).
Fig. 5.14: Inhibiţia acetilcolinesterazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),
galantamina (G).
Fig. 5.15: Inhibiţia butirilcolinesterazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),
galantamina (G).
Compuşii multi-target sunt mai eficienţi în terapia bolii
Alzheimer, comparativ cu cei care îşi manifestă acţiunea printr-un singur
mecanism, Astfel mai eficienţi sunt cei care au atât efect inhibitor asupra
colinesterazelor cât şi efect antioxidant (234).
0
20
40
60
80
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20
% I
nh
ibiţ
ie
mg/mL
AgArG
0102030405060708090
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20
% I
nhib
iţie
mg/mL
AgArG
19
Extractele de Ajuga genevensis şi Ajuga reptans au blocat
colinesterazele, dar eficacitatea acestei inhibiţii este mult mai mică
comparativ cu cea indusă de galantamină, diferenţa de eficacitate fiind
extrem de semnificativă statistic (p<0,0001). Ambele extracte au inhibat
mai puternic butirilcolinesteraza comparativ cu acetilcolinesteraza.
5.2.1.2 Investigarea acțiunii extractelor asupra lipoxigenazei
Lipoxigenazele (5-, 12-, 15-lipoxigenaza) (EC 1.13.11.34; EC
1.13.11.31; EC 1.13.11.33) sunt metaloenzime care conţin un singur lanţ
polipeptidic cu două domenii, dintre care domeniul C-terminal este
catalitic. Aceste enzime conţin în centrul catalitic ionul feros sau ionul
feric în funcţie de implicarea în reacţia redox pe care o catalizează.
Domeniul catalitic prezintă o structură de tip „buzunar” care este
hidrofobă şi unde va fi fixat substratul a cărui transformare este catalizată
de enzimă (124).
La nivel cerebral 5-lipoxigenaza este implicată în sinteza
leucotrienelor, a acidului 5-hidroxi-eicosatetraenoic şi a acidului 5-
hidroxi-peroxieicosatetraenoic care induc inflamaţie şi neurodegenerare.
Inhibitorii acestei enzime, dar şi ai 12/15-lipoxigenazei cresc rezistenţa
neuronilor dopaminergici din sistemul nigrostriat, cresc conţinutul în
dopamină al acestor neuroni şi activitatea tirozin hidroxilazei implicată
în sinteza dopaminei (34).
Rezultatele obținute au evidențiat că extractele de Ajuga au
acţiune inhibitorie asupra 15-lipoxigenazei, mult mai redusă comparativ
cu cea indusă de cvercetol, asa cum reiese din tabelul XIII.
Tabel nr. XIII: Rezultatul determinărilor privind inhibarea lipoxigenazei de către extractele
testate (A. reptans și A. genevensis).
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg
1.25
mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
solutie
finala)
Ajuga
reptans
- - 18.98±
0.27
15.28±
0.32
7.82±
0.21
4.02±
0.08
3.52±
0.18
-
Ajuga
genevensis
- - 22.10±
0.37
11.51±
0.28
9.63±
0.30
6.08±
0.36
3.45±
0.12
-
Cvercetol 100±0 100±0 77.45±
1.12
63.08±
0.86
53.98±
0.46
38.40±
0.36
25.33±
0.42
17.46±
0.32
20
Transpunerea grafică a valorilor înregistrate pentru cele două
extracte de Ajuga este prezentată în fig. 5.16.
Fig. 5.16: Inhibiţia lipoxigenazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),
cvercetol (C).
5.2.1.3 Evaluarea capacității de chelatare al ionului feros
Ionii feroşi sunt implicaţi în reacţia Fenton de sinteză a radicalului
hidroxil care este un oxidant neselectiv, unul din cei mai toxici compuşi
sintetizaţi în procesele metabolice celulare şi care va induce stres
oxidativ. Dintre compuşii organici, radicalul hidroxil va ataca mai ales
acizii graşi polinesaturaţi din structura fosfolipidelor membranare, cu
reducerea stabilităţii acesteia.
Compuşii capabili să chelateze ionul feros vor reduce rata de
sinteză a radicalului hidroxil şi vor bloca reacţiile de sinteză a radicalilor
organici la nivel celular (250).
În cadrul cercetărilor noastre, pentru extractele investigate am
obținut valori din care au fost calculate CE50 și care sunt redate în tabelul
XIV. Tabel nr. XIV: Capacitatea de chelatare a ionului feros (martor cvercetol).
Probă CE50 (μg/sol finală)
Ajuga reptans 457,51 ± 1,38
Ajuga genevensis 514,97 ± 2,72
Cvercetol 474,61 ± 4,28
0
20
40
60
80
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20
% I
nhib
iţie
mg/mL
AgArC
21
Valorile CE50 indică o capacitate de chelatare a ferului apropiată
de a cvercetolului pentru Ajuga reptans și Ajuga genevensis, cel mai activ
extract în ceea ce privește chelatarea fierului s-a dovedit a fi cel de Ajuga
reptans.
În fig. 5.17 sunt redate grafic valorile CE50 privind chelatarea
ferului de extractele de Ajuga sp.
Fig. 5.17: Chelatarea ferului – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar), cvercetol
(C).
5.2.2 Cercetări in vivo privind potențialul anti-Parkinson al
extractelor evaluate
Cercetarea acțiunii biologice a celor 2 extracte incluse în studiu
s-a efectuat prin intermediul unui model experimental de inducere a bolii
Parkinson la șobolani.
Pentru o urmărire mai ușoară a acestora vom recapitula modul în
care au fost constituite cele șase loturi experimentale asupra cărora s-a
efectuat testul farmacologic. Fiecare lot a fost constituit din câte 5
animale de experiență, șobolani albi, masculi, rasa Wistar, cu vârsta de 4
luni, având la începutul experimentului o greutate de 320±10g.
Pentru a putea controla experimentul, extractele hidroetanolice
stoc de Ajuga reptans și Ajuga genevensis au fost prelucrate mai întâi
pentru obținerea unor extracte moi. Din extractele moi s-au preparat apoi
0
20
40
60
80
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10
% c
hel
atar
e
mg/mL
Ag
Ar
C
22
soluții prin diluare cu ser fiziologic, care au fost analizate chimic,
rezultatele pentru cele doua extracte fiind redate la punctul 5.1.
Loturile experimentale
Repartizarea animalelor incluse în test s-a făcut în 6 loturi, tratate
după cum urmează:
Lotul 1, grupul de control "fals operat" și injectat la 14 zile
intraperitoneal cu ser fiziologic,
Lotul 2, tratat cu neurotoxina 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA)
și injectat la 14 zile intraperitoneal cu ser fiziologic (denumit
și grup martor),
Lotul 3, tratat cu 6-OHDA, și injectat la 14 zile cu extract de
Ajuga reptans 25 mg/mL intraperitoneal,
Lotul 4, tratat cu 6-OHDA, și injectat la 14 zile cu extract de
Ajuga reptans 75 mg/mL intraperitoneal,
Lotul 5, tratat cu 6-OHDA, și injectat la 14 zile cu extract de
Ajuga genevensis 25 mg/mL intraperitoneal,
Lotul 6, tratat cu 6-OHDA, și injectat la 14 zile cu extract de
Ajuga genevensis 75 mg/mL, intraperitoneal.
Au fost efectuate următoarele teste comportamentale:
testul labirintului Y- masoară activitatea locomotorie și
alternarea spontană,
testul labirintului cu brațe radiale- evaluează memoria de
lucru precum și memoria de referință; de asemeni au fost
calculate erorile memoriei de lucru și ale memoriei de
referință pe grup și pe zile,
testul labirintului cu brațe deschise- s-au calculat numărul de
intrări și timpul petrecut in brațele labirintului de loturile de
șobolani tratați cu cele două extracte,
testul înotului forțat- masoară timpul de imobilitate respectiv
timpul de înot al loturilor.
5.2.2.1 Teste comportamentale
A. Testul labirintului cu trei brațe
23
Testul Y-maze utilizat în cadrul acestui studiu cuantifică memoria
de scurtă durată (fig. 5.20) și comportamentul de căutare a recompensei
(fig. 5.19), bazându-se pe tendința rozătoarelor de a explora orice mediu
nou în care se află (121).
Nu
mă
ru
l d
e i
ntr
ări
în b
ra
te
Co
ntr
ol
6-O
HD
A
6-O
HD
A+A
. re
pta
ns (
25 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
. re
pta
ns (
75 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
. g
en
even
sis
(25 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
. g
en
even
sis
(75 m
g/k
g)
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
Fig. 5.19: Compararea activității locomotorii (evaluată prin numărul de intrări în brațe) pentru
loturile de șobolani tratate cu extract de Ajuga reptans 25mg/Kg și 75mg/kg și Ajuga genevensis
25mg/kg și 75 mg/kg.
Sp
on
tan
ep
us
alt
ern
ati
on
%
Co
ntr
ol
6-O
HD
A
6-O
HD
A+A
.rep
tan
s (
25 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
.rep
tan
s (
75 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
.gen
even
sis
(25 m
g/k
g)
6-O
HD
A+A
.gen
even
sis
(75 m
g/k
g)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Fig. 5.20: Procentul de alternare spontană între loturile tratate cu extract de Ajuga genevensis
25mg/kg și 75mg/kg și cele tratate cu Ajuga reptans 25mg/kg și 75 mg/kg: rezultate
comparative.
Conform datele obținute la testul labirintului cu trei brațe (Y-maze)
toate loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. dovedesc o îmbunătățire a
24
memoriei de scurtă durată (MSD). Lotul tratat cu Ajuga reptans în doză
mare (de 75 mg/kg corp) înregistrează cea mai intensă activitate de
îmbunătățire a memoriei MSD comparabilă cu cea a animalelor din lotul de
control sănătoase.
B. Testul labirintului cu brațe radiale
Acest test evaluează memoria spațială a rozatoarelor (121), la
realizarea sa folosindu-se labirintul cu brațe radiale. Șobolanii au fost
testați individual pe parcursul a 7 zile consecutive după ce în prealabil 4
zile s-au acomodat cu labirintul și au învățat brațele în care a fost plasată
momeala.
A fost evaluată memoria de lucru (fig. 5.22 și 5.23), care este o
formă a memoriei de scurtă durată (MSD).
Fig. 5.22: Numărul erorilor memoriei de lucru pentru lotuturile tratate cu Ajuga reptans
25mg/kg și 75mg/kg.
Fig. 5.23: Numărul erorilor memoriei de lucru pentru loturile tratate cu Ajuga genevensis
25mg/kg 75mg/kg.
25
De asemenea au fost evaluate numărul erorilor memoriei de
referință (fig. 5.24 și 5.25), ca formă a memoriei de lungă durată (MLD).
În acest sens au fost contorizate numărul de erori ale memoriei de lucru
(reintrarea într-un braț marcat cu momeală) și numărul de erori ale
memorie de referință (intrarea într-un braț fără momeală).
Fig. 5.24: Numărul erorilor memoriei de referință pentru loturile tratate cu
extracte de Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg.
Fig. 5.25: Numărul erorilor memoriei de referință pentru loturile tratate cu
extracte de Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.
În cadrul studiului statistic efectuat, datele anterior prezentate au
fost defalcate de data aceasta pe loturi experimentale (fig. 5.26) și
respectiv pe zile, urmărid existența diferențelor care apar în ceea ce
privește erorile memoriei de lucru și respectiv, ale memoriei de referință.
26
A. B.
Fig. 5.26: Interpretarea statistică a erorilor memoriei de lucru pentru loturile evaluate: lotul
1=control; lotul 2= martor; lotul 3=tratat cu vineriță 25mg/kg corp, lotul 4= tratat cu vineriță 75
mg/kg corp, lotul 5 =tratat cu suliman 25mg/kg corp, lotul 6= tratat cu suliman 75 mg/kg corp.
Încercând să urmărim variația erorilor medii ale memoriei de
lucru defalcată pe zile, am obținut pentru loturile tratate cu extractele de
Ajuga reptans (loturile 3 și 4) rezultatele înregistrate în fig. 5.27A, iar
pentru loturile 5 și 6, cărora li s-a administrat extract de Ajuga
genevensis, cele redate în fig. 5.27B.
A. B.
Fig. 5.27: Erorile medii ale memoriei de lucru defalcate pe zile pentru grupurile experimentale
tratate cu A=Ajuga reptans (lot 3 si 4) respectiv, B=Ajuga genevensis (lot 5 si lot 6) comparativ
cu martorii (lot 1-control și lot 2-6-OHDA).
Încheind cu aprecierea memoriei de lucru la animalele de
experiență, am trecut la evaluarea erorilor medii în ceea ce privește
memoria de referință. Erorile medii ale memoriei de referință au fost
27
calculate în funcție de doi parametrii și anume: în funcție de lot (fig. 5.28)
și în funcție de zile (fig. 5.29).
A. B.
Fig. 5.28: Interpretarea statistică a erorilor memoriei de referință pentru loturile evaluate: lotul
1=control, fals operat; lotul 2= martor 6-OHDA; lotul 3 si 4 tratate cu vineriță 25 respectiv 75
mg/kg corp (A); loturile 5 si 6 tratate cu suliman 25 respectiv 75 mg/kg corp (B).
Defalcând pe zile rezultatele înregistrate cu privire la memoria
de referință pentru cele patru grupe experimentale, acestea s-au
prezentat după cum reiese din fig. 5.29A pentru vineriță și respectiv B,
pentru Ajuga genevensis.
A. B.
Fig. 5.29: Erorile memoriei de referință pentru cele 6 grupuri experimentale: A - Lot 1, 2
martori, Lot 3 și 4 tratați cu Ajuga reptans 25 și 75 mk/kg corp și B - Lot 5 și 6 tratați cu Ajuga
genevensis 25 și 75 mg/ kg corp (defalcare pe zile).
Conform rezultatelor înregistrate la testul labirintului cu brațe-
radiale (radial arm-maze) toate loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. au
28
avut îmbunătățiri în ceea ce privește memoria de lungă durată (MLD) atât
comparativ cu martorii netratați dar și raportat la rezultatele obținute de
control. Lotul tratat cu extract de Ajuga genevensis în doză mică (de 25
mg/kg corp) dovedește cea mai intensă acțiune de îmbunătățire a
memoriei MLD dar și a memoriei de scurtă durată (MSD), intensitatea
efectului menținâdu-se relativ constantă pe parcursul celor 7 zile de
administrare.
C. Testul labirintului cu brațe deschise
Acest test este utilizat pentru a evalua efectele anxiolitice
respectiv anxiogenice provocate de diferiți agenți farmacologici la
rozătoare (23), în cazul nostru acesta fiind constituit din extractele de
Ajuga reptans și Ajuga genevensis, pentru care au fost evaluate numărul
de intrări în brațele deschise care reflectă activitatea locomotorie (fig.
5.31) și respectiv timpul petrecut în brațele dechise care reflectă
proprietățile anxiolitice ale extractelor (fig. 5.32).
A. B.
Co
ntr
ol
6-O
HD
A
6-O
HD
A+
A.
ge
ne
ve
ns
is (
25
mg
/kg
)
6-O
HD
A+
A.
ge
ne
ve
ns
is (
75
mg
/kg
)0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
Nu
mă
rul
de
in
tră
ri î
n
bra
tele
de
sc
his
e
Fig. 5.31: Numărul de intrări în brațele deschise pentru loturile de șobolani tratate cu extract de
A- Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg si B- Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.
În urma efectuării testului labirintului cu brațe deschise (elevated
plus-maze) rezultatele obținute pun în evidență acțiunea anxiolitică a
extractelor de Ajuga sp., doza mare de Ajuga genevensis (75 mg/kg corp)
29
a înregistrat activitatea anxiolitică cea mai intensă depașind-o pe cea a
lotului de control neintoxicat.
A. B.
Co
ntr
ol
6-O
HD
A
6-O
HD
A+
A. re
pta
ns (
25 m
g/k
g)
6-O
HD
A+
A. re
pta
ns (
75 m
g/k
g)
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
Tim
pu
l p
etr
ec
ut
în
bra
tele
de
sc
his
e
(%)
p < 0 .0 1
p < 0 .0 0 1
Fig. 5.32: Timpul petrecut în brațele deschise pentru grupurile de șobolani tratate cu extract de
A - Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg și B - Ajuga genevensis de 25mg/kg și 75mg/kg.
5.2.3.4 Testul înotului forțat
Testul este utilizat pentru evaluarea acțiunii antidepresive (123),
când șobolanii sunt forțați să înoate într-un spațiu limitat, după o perioadă
inițială de luptă, vor deveni imobili, pierzându-și speranța de
supraviețuire, stare care corespunde cu depresia mentală.
Au fost măsurate: timpul de imobilitate (fig. 5.34) care ne indică
faptul că animalul a renunțat la speranța de supraviețuire, dar și timpul
de înot (fig. 5.35) care indică încercarea de adaptare și de a lupta cu
situația dată (componenta motivațională).
Comportamentul de înot respectiv de imobilitate
operaționalizează conceptul de motivație pentru supraviețuire care este
asociată potențialul antidepresiv al extractelor. Rezultatele obținute în
cadrul testului înotului forțat (forced swimming test) dovedesc faptul că
loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. (în doză mică și mare) au avut
rezultate semnificativ mai mari (p<0,0001) în ceea ce privește motivația
pentru supraviețuire (operaționalizată prin timpul de înot respectiv timpul
de imobilitate) comparativ cu martorii netratați, depăsind mult și
30
rezultatele obținute de animalele sănătoase. Doza mare de Ajuga
genevensis (75 mg/kg corp) a avut efectul cel mai intens.
A. B.
Tim
pu
l d
e i
mo
bil
ita
te (
s)
Co
ntr
ol
6 -OH
DA
6 -OH
DA
+A
. re p
tan
s (2 5 m
g/k
g)
6 -OH
DA
+A
. re p
tan
s (7 5 m
g/k
g)
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0p < 0 ,0 0 0 1
p < 0 ,0 0 0 1
Fig. 5.34: Timpul de imobilitate pentru grupurile tratate cu extract de A - Ajuga reptans
25mg/kg și 75mg/kg și respectiv de B - Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.
A. B.
Tim
pu
l d
e î
no
t (s
)
Co
ntr
ol
6 -OH
DA
6 -OH
DA
+ A. r
e pta
ns (
2 5 mg
/kg
)
6 -OH
DA
+ A. r
e pta
ns (
7 5 mg
/kg
)0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
p < 0 ,0 0 0 1
p < 0 ,0 0 0 1
Tim
pu
l d
e î
no
t (s
)
Co n tr
o l
6 -OH
DA
6 -OH
DA
+ A. g
e n e v e n s is (2
5 mg /k
g )
6 -OH
DA
+ A. g
e n e v e n s is (7
5 mg /k
g )0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
p < 0 ,0 0 0 1
p < 0 ,0 0 0 1
Fig. 5.35: Timpul de înot pentru grupurile tratate cu extract de A - Ajuga reptans 25mg/kg și
75mg/kg și B - Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.
31
CAPITOLUL 6: Contribuții la studiul farmacognostic și biologic al
extractelor obținute din speciile de Leuzea carthamoides și Leuzea
salina: Rezultate și Discuții
6.1 Analiza farmacognostică a speciilor Leuzea carthamoides și
Leuzea salina
Pentru cele două specii de Leuzea, Leuzea carthamoides (Willd)
Iljin și Leuzea salina nemenționată ca atare în literatură, am întreprins o
serie de cercetări care au urmărit evidențierea:
caracterelor morfologice și histoanatomice; în urma acestora
speram să putem lămuri dacă în cazul a ceea ce în cursul tezei
am denumit Leuzea salina este vorba de o chemovarietate
derivată de la Leuzea carthamoides, sau chiar vorbim de o
specie nemenționată în literatură (202);
anumite elemente importante și eventual diferențiale, cum ar
fi celulele epidermice de pe fața inferioară și superioară ale
frunzelor, glandele salinifere, perii tectori, stomatele, au fost
studiate și cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj;
componentelor chimice, din cele două mostre de Leuzea,
astfel in extractele realizate au fost investigate în primul rând
componentele de tip ecdisteroidic și polifenolic, înțelegând
prin aceasta flavonoidele totale și polifenolii totali.
În acest context, am efectuat analiza cromatografică pe strat
subțire (care nu ne-a adus foarte multe clarificări), urmată de determinări
cantitative utilizând în acest scop spectrofotometria, pentru a finaliza
apoi cercetarea chimică apelând la tehnica UHPLC.
Studiul chimic calitativ și cantitativ a fost completat cu
investigarea unor efecte biologice ale extractelor, prin teste in vitro și in
vivo, rezultatele fiind prezentate în capitolul VII al tezei.
6.1.2 Studiul histoanatomic al speciilor de Leuzea
Fiind o specie medicinală, Leuzea carthamoides a mai fost
studiată, dar în literatura de specialitate consultată există puține date
privind anatomia și structura acesteia (169), fapt ce a impus realizarea
unui studiu de acest fel pentru materialul vegetal provenit din cultura
32
inițiată la Centrul de Cercetări Biologice Stejarul din Piatra Neamț.
Prelevarea indivizilor s-a făcut în vara anului 2017.
Pentru Leuzea salina probabil că nu există cercetări
histoanatomice deoarece în literatura de specialitate nici nu este
menționată ca atare. Materialul nostru vegetal a provenit din flora
spontană și a fost recoltat în anul 2017 de pe marginea șoselei Iași-
Lețcani (în apropierea localității Valea Lupului).
6.1.2.1 Leuzea carthamoides
Aspectul histoanatomic al tulpinei aeriene:
Aceasta este extrem de scurtă, cu structură primară incipientă, în
care nu s-au diferențiat țesuturile conducătoare, fiind înconjurată de mai
multe frunze de mărime și vărstă diferită, realizând câteva cercuri
concentrice (fig. 6.4A). Frunzele de pe cele 3-4 cercuri concetrice au
marginile apropiate realizând forma revolută.
La toate grosimea limbului descrește spre margini, nervura
mediană fiind vizibil proeminentă la fața externă, iar fasciculele
conducătoare, de mărime diferită sunt dispuse în profunzimea
mezofilului parenchimatic (fig. 6.4). A. B.
Secțiunea prin frunză:
Fig. 6.4: Secțiune transversală prin tulpina de Leuzea carthamoides: A. imagine generală, B.
detaliu (fotografii originale).
Frunza matură prezintă un pețiol (fig. 6.5) de formă semicirculară
în secțiune transversală, având un șanț adaxial larg și superficial,
delimitat de 2 creste latero-adaxiale în al căror parenchim omogen se
33
observă câte un fascicul conducător foarte mic, localizat în dreptul unui
cordon subțire de colenchim hipodermic.
Epiderma prezintă celule izodiametrice cu peretele extern ușor
mai îngroșat decât ceilalți și slab cutinizat. Din loc în loc se observă
stomate. Parenchimul fundamental are celule a căror mărime descrește
spre interiorul organului. Stratul hipodermic este ușor colenchimatizat,
iar în cele 2 creste latero-adaxiale celulele de colenchim au pereții vizibil
îngroșați.
Partea centrală a pețiolului este ocupată de o cavitate aeriferă
largă, cu intrânduri vizibile în parenchimul interfascicular. Fasciculele
conducătoare, în număr de aproximativ 10, de mărime diferită și dispuse
pe un arc, sunt formate din liber (tuburi ciuruite și celule anexe) și lemn
(vase și parenchim lignificat), fig. 6.5. A. B.
Fig. 6.5: Secțiune transversală prin pețiolul de Leuzea carthamoides: A. imagine generală, B.
detaliu (fotografii originale).
La microscopul electronic de baleiaj, pețiolul de Leuzea
carthamoides apare ca în fig. 6.6.
Fig. 6.6: Pețiolul de Leuzea carthamoides văzut la microscopul electronic (fotografii originale).
34
Limbul frunzei mature (fig. 6.7) are nervura mediană vizibil
proeminentă la fața inferioară și o creastă slab proeminentă la fața
superioară. Epiderma prezintă celule izodiametrice mai mici la fața
inferioară a limbului, cu pereții subțiri, iar din loc în loc se observă peri
tectori lungi, pluricelulari, cu vârful obtuz sau ascuțit. În aceeași
epidermă pot fi observate și formațiuni secretoare de săruri.
Mezofilul este gros, diferențiat în țesut palisadic la fața superioară
și țesut lacunos la fața inferioară, deci limbul are o structură bifacială-
heterofacială (dorsi-ventrală).
Țesutul palisadic este bi- sau tristratificat, cu celule relativ scurte
și largi, ocupând aproximativ 40% din grosimea mezofilului (fig.6.7).
A. B
Fig. 6.7: Secțiune transversală prin limbul foliar de Leuzea carthamoides: A. nervură principală,
B. mezofil (fotografii originale).
Țesutul lacunos, mai gros decât cel palisadic are celule mari
separate de lacune aerifere. În mijlocul nervurii mediane este o cavitate
aeriferă largă, de formă neregulată, adesea în contact cu fasciculele
conducătoare. Acestea, în număr de 3 formează un arc și au o structură
primară, cu liberul spre fața inferioară (format din tuburi ciuruite și celule
anexe) și lemn spre fața superioară (format din vase și parenchim ușor
lignificat). Această cavitate este înconjurată de parenchim omogen lipsit
de cloroplaste.
Între nervurile laterale de ordinul I se află mai multe fascicule
conducătoare, dar mai mici decât cele din nervura mediană, toate cu
structură primară (fig. 6.7).
35
La microscopul electronic de baleiaj epiderma prezintă celule cu
contur neregulat și de mărime uniformă, cu peretele ondulat și stomate,
prezente la nivelul ambelor epiderme, și peri tectori (fig. 6.8, fig. 6.9).
A. B.
Fig. 6.8: Epidermă foliară superioară la Leuzea carthamoides văzută de față: A. imagine de
ansamblu, B. stomată (fotografii originale).
A. B.
Fig. 6.9: Epidermă foliară inferioară la Leuzea carthamoides văzută de față: A. imagine de
ansamblu, B. păr tector (fotografii originale).
6.1.2.2 Leuzea salina
Studiul histoanatomic al tulpinii:
Conturul secțiunii transversale este circular costat, în coaste fiind
vizibile cordoane hipodermice de colenchim. Epiderma prezintă celule
izodiametrice în dreptul coastelor și ușor alungite tangențial în dreptul
valeculelor. Scoarța este foarte subțire, cu cavități aerifere din loc în loc.
36
Cilindrul central este gros și cuprinde: un inel de fascicule
conducătoare libero-lemnoase, de tip colateral; un parenchim
fundamental lignificat în poziție interfasciculară și celulozic în
vecinătatea cavității aerifere centrale.
Fasciculele conducătoare, în număr mare și de mărime diferită,
prezintă câte un cordon gros perifloemic de elemente sclerenchimatice la
exterior, o zonă subțire subadiacentă de liber și o alta internă, mai groasă,
de lemn. Elementele sclerenchimatice perifloemice au pereții puternic
îngroșați și intens lignificați, mărimea și gradul lor de lignificare
descrescând de la periferie spre liber. Liberul prezintă tuburi ciuruite și
celule anexe, care adesea se dezorganizează rezultând cavități aerifere de
mărimi diferite. Lemnul prezintă vase cu dispoziție neregulată și de
diametru diferit, separate de parenchim celulozic în curs de
dezorganizare spre interior și celule de parenchim lignificat spre exterior.
La fața internă a fasciculelor conducătoare se află o calotă de țesut
mecanic, formată din celule cu pereții mai subțiri decât cele din cordonul
gros perifloemic. Parenchimul interfascicular are celule cu pereții subțiri,
dar ușor lignificați. Cavitatea aeriferă centrală foarte mare este
înconjurată de parenchim celulozic (fig. 6.14).
A. B.
Fig. 6.14: Secțiune transversală prin tulpina de Leuzea salina: A. imagine de ansamblu, B.
fascicul conducător (fotografii originale).
La microscopul electronic de baleiaj se observă, printre celulele
epidermice de mărime diferită, formațiuni salifere cu structură de tip
special (fig. 6.15), care nu existau la Leuzea carthamoides, provenite
din câmpul de cultură de la Piatra Neamț (202).
37
A. B.
Fig. 6.15: Tulpina de Leuzea salina văzută la microscopul electronic de baleiaj: A. imagine de
ansamblu; B. formațiuni salifere (fotografii originale).
Sectiunea prin limbul foliar:
În secțiune transversală prin limb, nervura mediană este groasă și
proeminenta la fața inferioară. În grosimea nervurii mediene predomină
parenchimul lipsit de cloroplaste în care există mai multe (10-12)
fascicule conducătoare, de mărime diferită, dispuse pe un arc, toate cu
structură primară.
Epiderma prezintă celule ușor alungite tangențial cu peretele
extern ușor mai îngroșat decât ceilalți și slab cutinizat. Din loc în loc se
observă peri tectori pluricelulari, relativ scurți, și glande salifere,
inexistente la Leuzea carthamoides. Mezofilul este aproape în totalitate
de tip palisadic, cu celule relativ scurte și largi, așadar limbul are o
structură bifacială izofacială (ecvifacială) (fig. 6.16 A. B.
Fig. 6.16: Secțiune transversală prin limbul foliar de Leuzea salina: A. nervură mediană, B.
mezofil (fotografii originale).
38
Indiferent de mărime toate fascicule conducătoare au liberul
format din tuburi ciuruite și celule anexe și lemnul format din vase
separate de celule parenchimatice cu pereții groși și intens lignificați spre
liber. La fasciculele mari se observă câte un cordon perifloemic de
elemente colenchimatizate și câteva celule mecanice cu pereții moderat
îngroșați și lignificați. La microscopul electronic de baleiaj celulele
epidermice de pe față inferioară și superioară a limbului foliar, apar cu
contur neregulat, cu pereții laterali neregulat ondulați, iar printre ele se
observă stomate, care au formă eliptică, iar pereții ce delimitează ostiola
sunt foarte groși (fig. 6.17 și 6.18). A. B.
Fig. 6.17: Epiderma inferioară a limbului foliar de Leuzea salina vazută la microscopul
electronic de baleiaj: A. imagine de ansamblu, B. stomată (fotografii originale).
A. B.
Fig. 6.18: Epiderma superioară a limbului foliar de Leuzea salina vazută la microscopul
electronic de baleiaj: A. imagine de ansamblu, B. stomată (fotografii originale).
39
Analizând secțiunile transversale practicate prin rădăcina,
rizomul, tulpină și limbul foliar a celor două specii de Leuzea incluse în
studiu am constatat o serie de asemănări care sunt normale pentru plante
aparținând aceluiași gen dar și o serie de diferențe atât la nivelul
rizomului cât și al rădăcinii, a tulpinii aeriene, și a limbului foliar;
asemănările morfologice dintre cele două materiale de Leuzea investigate
sunt normale pentru specii aparținând aceluiași gen.
Singura diferență majoră constă în existența unor formarțiuni
salifere, evidențiate la microscopul electronic de baleiaj, doar în cazul
indivizilor de Leuzea salina; în literatura de specialitate consultată nu am
găsit date cu privire la existența unor astfel de formațiuni, nici măcar
pentru specia Leuzea carthamoides. Asta nu înseamnă însă că vorbim cu
adevarat de două specii diferite, Leuzea carthamoides și Leuzea salina,
ci poate fi vorba de o varietate chimică a primei specii, care însă s-a
dezvoltat pe un teren inițial mlăștinos, transformat în cursul verii în
sărătură.
6.2 Contribuții la analiza fitochimică a extractelor de Leuzeae herba
(L. carthamoides și L. salina)
Materialul vegetal analizat din punct de vedere fitochimic în
lucrarea de față a fost prelevat în anul 2018 și 2019; plantele de Leuzea
carthamoides au provenit din câmpul experimental de la C.C.B. Piatra
Neamț (fiind deci exemplare de cultură, la noi în țară specia negăsindu-
se în flora spontană) în timp ce plantele de Leuzea salina au fost recoltate
din flora spontană de pe un câmp mlăștinos și sărăturos din apropiere de
Iași.
Partea aeriană înflorită a celor două specii de Leuzea a fost uscată,
extrasă conform indicațiilor de la punctul 4.2, extractele rezultate fiind
analizate prin:
cromatografie pe strat subțire, pentru flavone și polifenoli,
determinări spectrofotometrice pentru polifenoli totali și
flavone,
40
UHPLC, când s-a urmărit natura polifenolilor și
ecdisteroidelor, care totodată au fost cuantificate.
6.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor totali și a
flavonoidelor din extractele celor două specii de Leuzea
Rezultatele determinării cantitative a polifenolilor totali și a
flavonoidelor din extractele obținute din rădăcinile de Leuzea
carthamoides și Leuzea salina (recolta anului 2018) pot fi exprimate
grafic ca în fig. 6.25.
Fig. 6.25: Cele mai importante grupe de principii active determinate in probele de Leuzea
investigate.
Se observă încă de la început că există diferențe cantitative
importante între cele două specii în ceea ce privește conținutul în
polifenoli totali și respectiv flavonoide.
Precizăm că din punct de vedere cantitativ, extractul de L.
carthamoides este mult mai bogat în fracțiunile urmărite (flavonoide și
polifenoli), diferențele fiind de două sau chiar trei ori mai mari la specia
recunoscută botanic, comparativ cu L. salina.
Valorile obținute în cursul studiului nostru pentru mostra de
Leuzea carthamoides analizată sunt asemănătoare cu cele din literatura
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Leuzea salina
Leuzea carthamoides
concentrație (g %)Leuzea salina Leuzea carthamoides
Flavonoide 47,33 178,94
Polifenoli totali 119,23 349,44
41
de specialitate, dar datele pentru Leuzea salina nu pot fi verificate din
lipsa studiilor pe această temă (74, 146, 188, 233, 238, 239).
Cu toate că literatura de specialitate nu menționează specia
Leuzea salina, cercetările din lucrarea de față pun problema existenței
acestei specii spontane în țara noastră. Deși este încă prematur să
afirmăm că datele analizei chimice indică existența unei variabilități între
cele două specii (deci variabilitate interspecifică), la o primă vedere se
poate specula acest aspect, deoarece între cele două probe există o
variabilitate chimică marcată.
Pentru confirmarea și validarea acestor considerații se impune o
analiză chimica pe un număr de cel puțin 6 ani, și care să aprofundeze
calitativ și cantitativ spectrul de principii bioactive existente în probele
de Leuzea incluse în studiu. Aceasta ar presupune totodată aducerea în
cultură la C.C.B. Piatra Neamț a unor exemplare de Leuzea salina, care
ar avea la dispoziție aceleași condiții de sol și mediu înconjurător ca
Leuzea carthamoides, fără a mai exista intervenția solului sărăturos și
mlăștinos.
6.2.2 Identificarea și cuantificarea unor componente bioactive din
extractele de Leuzea, utilizând tehnica UHPLC
Apelând la analiza cromatografică ultrarapidă de lichide în fază
inversă și verificând raportul dintre diferitele componente identificate în
probe, ne-am putut da seama că din punct de vedere majoritar speciile
conțin: acid clorogenic, luteolină și kemferol, acid ferulic, elagic, β-
sitosterol, alături de o serie de componente minore.
Prin tehnica de cromatografie lichidă a fost confirmată prezența
următorilor derivați polifenolici în cele două probe: acid clorogenic, acid
galic, acid ferulic, precum și derivați glucozidați ai cvercetolului,
kemferolului și luteolinei.
Astfel de principii active au fost identificate și de către alți autori
în extracte obținute din L. carthamoides.
În fig. 6.26 sunt redate cromatogramele UHPLC obținute la
analiza extractelor hidroalcoolice de Leuzea la λ=245 nm, pentru
ecdisteroizi și iridoide.
42
Fig. 6.26: Cromatogramele UHPLC pentru extractele de Leuzea la λ=245 nm
L. carthamoides (albastru); L. salina (negru).
Deoarece proba de L. carthamoides s-a dovedit a fi mult mai
bogată în principii active decât L. salina, cromatogramele din figură au
fost redate la amplitudinea maximă a peak-urilor (fig. 6.27).
Fig. 6.27: Detaliu al cromatogramelor UHPLC (λ=245 nm), unde: L. carthamoides (albastru), L.
salina (negru); Etaloane: 1. 20-OH-ecdisonă; 2. izomeri ai hidroxiedcisonei; 3. α-ecdisona; 4.
rutozida.
Calculând conținutul în ecdisteroizi evidențiați în extractele de L.
carthamoides și L. salina studiate prin UHPLC, am obținut valorile
redate în tabelul XV.
43
Tabel nr. XV: Ecdisone identificate în extractele din radacini de Leuzea sp.
Compus (mg /g pv) Extract
L. salina L. carthamoides
20-OH-ecdisona 3.0654 4.3506
α-ecdisona 1.6358 5.2942
alte ecdisteroide 1.7813 3.6546
Deoarece acești compuși nu sunt stabili și tautomerizează ușor
chiar și în condiții de lucru blânde (cantități și concentrații mici de acizi,
în acest caz acid fosforic la eluare), sunt greu de izolat din materialul
vegetal. De cele mai multe ori, prezența compușilor acestora a fost
evidențiată mai ales în absența completă a mediului acid.
Totuși, evidențierea spectrelor și a standardelor ne-a permis
identificare și cuantificarea cu precizie a 20-OH-ecdisonei și a α-
ecdisonei. Am regăsit însă între componentele identificate și spectre care
se înscriu în domeniul ecdisteroidelor, pe care le-am cuantificat ca un
total ecdisonic.
Analizând prin HPLC extractele la lungimea de undă λ= 280 și
275 nm, probele fiind prelucrate identic (același solvent, timp de
extracție, aceeași concentrație de 4mg/mL și cantitate identică injectată –
5 μl de către autosampler) am obținut curbele cromatografice redate în
fig. 6.28 și 6.29.
Fig. 6.28: Cromatogramele UHPLC pentru cele două extracte de Luzea înregistrate la
λ=280 nm; L. carthamoides (albastru), L. salina (negru).
44
Fig. 6.29: Identificarea peak-urilor pentru flavonoidele din extractele de Leuzea la
λ= 275 nm; Legendă: L. carthamoides (albastru), L. salina (negru); Etaloane: 1. epicatehină; 2.
acid clorogenic; 3. acid elagic; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid ferulic; 7. kemferol-
glucozida; 8. luteolina; 9. sitosterol; 10. kemferol.
Pentru a putea urmări cu mai mare acuratețe prezența acizilor
polifenolcarboxilici în extractele analizate, au fost înregistrate
cromatogramele UHPLC la lungimea de undă λ=330 nm; imaginile sunt
redate în fig. 6.30.
Fig. 6.30: Cromatograme UHPLC inregistrate la 330 nm pentru cele două probe de Leuzea
incluse în studiu. Legendă: L. carthamoides (albastru), L. salina (negru), Etaloane: 1.
epicatehină; 2. acid clorogenic; 3. acid elagic; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid ferulic;
7. kemferol-glucozida; 8. luteolina; 9. sitosterol; 10. kemferol.
45
Rezultatele înregistrate în cursul acestor determinări sunt
prezentate în tabelul XVI care redă natura și cantitatea polifenolilor
existenți în materialul vegetal.
Tabel nr. XVI: Polifenoli identificați și cuantificați în probele de Leuzea investigate.
Nr. Compus (mg /g pv) Extract
L. salina L. carthamoides
1. epicatehină 0.8665 3.3547
2. acid clorogenic 3.1477 52.3850
3. acid elagic 0.8430 4.2942
4. rutozidă 0.9639 0.6479
5. lueolin-glucozida 0.5062 3.3896
6. acid ferulic 4.0845 4.5096
7. kemferol-glucozidă 0.6402 2.6048
8. luteolină 1.2171 9.3322
9. sitosterol 0.6487 5.2996
10. kemferol 3,8061 9.1120
Din aceste date se remarcă prezența în cantități ridicate a acizilor
polifenolici față de fracțiunea flavonoidică, tendință care se păstrează la
ambele specii. Mai mult, se evidențiază că odată cu aceste clase de
compuși s-au mai extras și taninuri, precum și mici cantități de sitosterol.
Conform rezultatelor se poate concluziona că specia Leuzea
carthamoides este mai valoroasă din punct de vedere compozițional decât
Leuzea salina, atât în ceea ce privește conținutul în polifenoli cât și în
ecdisone.
Studiile de specialitate publicate menționează existența acelorași
compuși, dar o cuantificare amănunțită a acestora nu a fost realizată până
în prezent. Totodată, sursele bibliografice actuale nu conțin nici o referire
la specia sau chemovarietatea Leuzea salina.
6.3 Contribuții la evaluarea potențialului biologic al extractelor de
Leuzea sp.
Investigarea acțiunii biologice s-a realizat cu ajutorul:
testelor biochimice, când a fost urmarită influența extractelor
asupra unor componente implicate în procesul degenerativ al
neuronilor din boala Parkinson, și
46
unui test farmacologic, în care reactivul animal a fost
reprezentat de pești din specia Danio rerio.
6.3.1 Evaluarea potențialului antioxidant si anticolinesterazic al
extractelor de Leuzea sp.
6.3.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a colinesterazelor
Pentru extractele de Leuzea probe de concentrații diferite au fost
evaluate privind inhibarea acțiunii colinesterazelor, rezultatele obținute
sunt redate în tabelele XVII și XVIII.
Tabel nr. XVII: Inhibarea acetilcolinesterazei la tratarea acetilcolinei cu extract de Leuzea
carthamoides și Leuzea salina, comparativ cu galantamina martor.
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg
1.25
mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
solutie
finala)
Leuzea
carthamoides
90.60±
0.16
75.39±
0.23
64.45±
0.17
34.72±
0.14
22.68±
0.07
13.77±
0.11
11.73±
0.08
178.41±
0.64
Leuzea
salina
96.42±
0.14
76.88±
0.09
54.78±
0.15
36.56±
0.12
22.89±
0.03
13.71±
0.17
7.68±
0.06
208.43±
1.12
Galantamina - - 95.39±
0.25
82.76±
0.18
73.23±
0.21
52.27±
0.20
33.24±
0.11
28.70±
0.20
Tabelul XVIII: Inhibarea butirilcolinesterazei de catre extractele Leuzeae herba, comparativ cu
galantamina martor.
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg
1.25
mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
solutie
finala)
Leuzea
carthamoides
92.45±
0.47
86.77±
0.04
62.14±
0.08
35.23±
0.21
21.15±
0.07
10.21±
0.04
2.43±
0.06
182.86±
0.65
Leuzea
salina
97.58±
0.32
89.62±
0.11
62.75±
0.25
39.40±
0.14
32.37±
0.34
18.74±
0.26
11.93±
0.09
171.23±
0.96
Galantamina - - 96.34±
0.11
83.08±
0.07
74.14±
0.14
59.73±
0.18
37.08±
0.05
23.20±
0.09
Extractele de Leuzea salina au efecte inhibitorii mai intense
asupra BuChE comparativ cu AChE, valoarea CE50 fiind de 171,23 ±
0,96 µg/mL şi respectiv 208,43 ± 1,12 µg/mL.
47
Pentru extractul de Leuzea carhtamoides efectul inhibitor este
mai intens faţă de AChE (CE50 178,40 ± 0,64 µg/mL) comparativ cu
BuChE (CE50 182,86 ± 0,65 µg/mL).
Reprezentarea grafică a intensității de acțiune a extractelor asupra
AChE și BuChE este redată în fig. 6.31 și 6.32.
Fig. 6.31: Inhibiţia acetilcolinesterazei – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea
carthamoides (Lc), martor: galantamina (G).
Fig. 6.32: Inhibiţia butirilcolinesterazei – de către extractele de Leuzea salina (Ls) şi Leuzea
carthamoides (Lc), martor: galantamina (G).
Blocarea colinestrazelor sub acţiunea celor 2 extracte vegetale
este de intensitate mai mică comparativ cu cea indusă de galantamină,
0
20
40
60
80
100
0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20
% I
nhib
iţie
mg/mL
LsLcG
0102030405060708090
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20
% I
nh
ibiţ
ie
mg/mL
Ls
Lc
G
48
ceea ce prezintă un avantaj la pacienţii cu boală Parkinson şi declin
cognitiv datorită deficitului de acetilcolină la nivelul sinapselor cerebrale.
O acţiune inhibitorie enzimatică intensă va permite un control mai
bun al declinului cognitiv, dar în acelaşi timp va reduce din acţiunea
terapeutică a medicamentelor utilizate în terapia bolii Parkinson.
Acţiunea inhibitorie mai redusă a celor 2 extracte, comparativ cu
a galantaminei subliniază avantajul pe care utilizarea acestora în cazul
bolii Parkinson însoţită de declin cognitiv l-ar putea avea în sensul
reducerii de efecte adverse.
6.3.1.2 Investigarea acțiunii de inhibare a lipoxigenazei
În procesul de degenerare neurologică caracteristică bolii
Parkinson sunt implicate activ lipoxigenazele prin generarea unor
citokine de tip leucotriene dar și a unor acizi cum ar fi acidul 5-hidroxi-
eicosatetraenoic și acidul 5-hidroxi-peroxieicosatetraenoic care
determină inflamație și neurodegenerare.
După cum a rezultat din studiul nostru, extractele de Leuzea au
acţiune inhibitorie asupra 15-lipoxigenazei, însă mai redusă decât cea a
cvercetolui, așa cum reiese din tabelul XIX.
Tabel nr. XIX: Rezultatul determinărilor privind inhibarea lipoxigenazei de către extractele
testate (martor cvercetol).
Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg
1.25
mg
0.625
mg
0.3125
mg
CE50
(µg/mL
solutie
finala)
Leuzea
carthamoides
- - 49.47±
0.59
25.47±
0.90
12.55±
1.03
8.92±
0.42
7.57±
0.40
-
Leuzea
salina
- 27.49±
1.19
18.30±
0.19
12.48±
0.46
9.98±
0.18
8.30±
0.30
4.79±
0.19
-
Cvercetol 100±0 100±0 77.45±
1.12
63.08±
0.86
53.98±
0.46
38.40±
0.36
25.33±
0.42
17.46±
0.32
Capacitatea de inhibiţie enzimatică a celor 2 extracte analizate
este redusă; pentru nici unul dintre acestea nu s-a obţinut o inhibiţie mai
mare de 50%, motiv pentru care nu s-a calculat valoarea CE50 (fig. 6.33).
49
Dacă ne referim la eventualul mecanism de acțiune, am putea
presupune că substanțele active prezente în extractele de Leuzea ar putea
bloca enzima prin mai multe căi.
Reprezentarea grafică a intensității de acțiune a extractelor asupra
lipoxigenazei este redată în fig. 6.33.
Fig. 6.33: Inhibiţia lipoxigenazei – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea
carthamoides (Lc), martor: cvercetol (C).
6.3.1.3 Evaluarea capacității de de chelatare al ionului feros
Urmărind să evidențiem și pentru extractele de Leuzea
capacitatea de chelatare al ionului feros am obținut valori din care au fost
calculate CE50, care sunt redate în tabelul XX.
Tabel nr. XX: Capacitatea de chelatare a ionului feros (martor cvercetol).
Probă CE50 (μg/sol finală)
Leuzea salina 497,10 ± 1,20
Leuzea cartamoides 1068,49 ± 0,73
Cvercetol 474,61 ± 4,28
Valorile CE50 indică o capacitate de chelatare a ferului apropiată
de cea a cvercetolului pentru extractul de Leuzea salina, în timp ce pentru
Leuzea carthamoides valoarea CE50 este de două ori mai mare decât cea
a cvercetolului (fig. 6.34).
Rezultatele au dovedit puterea de chelatare al ionului feros de
către componentele din extracte care este apropiată de cea a cvercetolului
0
20
40
60
80
100
0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20
% I
nhib
iţie
mg/mL
Ls
Lc
C
50
martor (sau mai mare) lucru important, deoarece în arealele cerebrale
afectate în boala Parkinson se acumulează Fe2+ care generează o
supraproducție de radicali hidroxil, dăunatori (fig. 6.34).
Fig. 6.34: Chelatarea ferului – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea carthamoides
(Lc), martor: cvercetol (C).
6.3.2. Investigarea potențialului anti-Parkinson al extractelor de
Leuzea prin intermediul testului zebra-fish (Danio rerio)
Extractele de Leuzea carthamoides și L. salina au fost investigate
în ceea ce privește acțiunea biologică in vivo cu ajutorul testelor zebrafish
(Danio rerio), pentru care modul de lucru a fost prezentat în cadrul
punctului 4.5.2.2.
Repartizarea animalelor pe loturi a fost realizată conform
protocolului următor:
Lotul 1 (de control propriu-zis): pești sănătoși, care nu au fost
intoxicați cu neurotoxină 6-OHDA,
Lotul 2 (martor): animale intoxicate cu 6-OHDA și netratate cu
extracte vegetale,
Lotul 3 (experimental): animale intoxicate cu 6-OHDA și carora
li s-a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea
carthamoides în doză de 0,5 mg/L apă,
0
20
40
60
80
100
0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10
% c
hel
atar
e
mg/mL
Ls
Lc
C
51
Lotul 4 (experimental): animale tratate cu 6-OHDA și carora li s-
a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea carthamoides
în doză de 1mg/L apă,
Lotul 5 (experimental): animale tratate cu 6-OHDA și carora li s-
a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea salina în doză
de 0,5 mg/L apă,
Lotul 6 (experimental): animale tratate cu 6-OHDA și carora li s-
a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea salina în doză
de 1mg/L apă.
Au fost efectuate următoarele teste comportamentale:
testul labirintului cu trei brațe (Y maze) care apreciază activitatea
locomotorie și memoria spațială ca și componentă a memoriei de
scurtă durată (121) și
testul bazinului nou (novel tank diving test), care evaluează starea
de anxietate și comportamentul de explorare al peștilor.
6.3.2.1 Teste comportamentale
A. Testul labirintului cu trei brațe (Y-maze)
Testul Y-maze evaluează activitatea locomotorie și memoria
spațială ca și componentă a memoriei de scurtă durată (121).
Activitatea locomotorie se apreciază ținând cont de numărul de
intrări al animalelor de experiență (Danio rerio) în cele trei brațe ale
dispozitivului (fig. 6.36).
În cazul evaluării memoriei de scurtă durată (importantă mai mult
în Alzheimer decât în Parkinson) se înregistrează alternarea spontană,
adică secvențele de intrare în cele trei brațe.
Dacă secvențele sunt consecutive A-B-C acest lucru înseamnă o
bună funcționare a memoriei. Dacă animalul de experiență revine
repetat într-unul din brațe practuitând faptul că a mai explorat brațul
respectiv acest lucru înseamnă o degradare a memoriei de scurtă durată
(fig. 6.37).
52
Fig. 6.36: Activitatea locomotorie evaluată prin numărul de intrări în brațe pentru loturile de
pesti tratați cu Leuzea carthamoides 0,5mg/L (A) și 1mg/L respectiv cu Leuzea salina (B)
0,5mg/L și 1mg/L.
Fig. 6.37: Procentul de alternare spontană pentru loturile tratate cu extracte de Leuzea
carthamoides în doze de 0,5mg/L și 1mg/L (A) respectiv pentru loturile tratate cu Leuzea salina
în doze de 0,5mg/L și 1mg/L (B).
Recunoșterea brațului nou și timpul petrecut pentru explorarea
acestuia implică o bună funcționare a memoriei de scurtă durată. Așa cum
am menționat inițial, fiecare braț are aplicată pe partea exterioară o folie
cu figurine specifice: triunghiuri-brațul A, pătrate-brațul B și cercuri-
brațul C, astfel încât peștii să poată face deosebirea și să poata învăța
traseul prin toate brațele.
Dacă se ia în calcul timpul petrecut în brațul nou, abia deschis
pentru explorare, se consideră că memoria de scurtă durată crește o dată
cu creșterea timpului petrecut în noul brat (fig. 6.38).
53
Fig. 6.38: Timpul petrecut în brațul nou pentru loturile tratate cu extracte de LC în doze de 0,5
mg/L și 1 mg/L, respectiv LS în doze de 0,5mg/L și 1mg/L apa.
Potrivit datelor obținute le testele comportamentale efectuate, la
testul labirintului Y (Y-maze) toate loturile tratate cu extracte de Leuzea
sp. au prezentat activitate locomotorie mai bună față de martori, depășind
la doze mari de L. cathamoides (1mg/L) și respectiv doze mici de L.
salina, valorile înregistrate de loturile de control sănătoase. Doza mică
de Leuzea salina (de 0,5mg/L) a stimulat cel mai mult activitatea
locomotorie a animalelor prin labirint.
Recunoașterea și timpul petrecut în brațul deschis pun în evidență
tendința animalelor de explorarea a noului și de căutare a recompensei
care implică căile dopaminergice cerebrale. Conform datelor obținute
toate loturile tratate cu extracte de Leuzea sp. s-au mișcat semnificativ
mai mult în brațul deschis, fiind mai motivate în căutarea recompensei
comparativ cu animalele cu Parkinson indus și netratate. Lotul tratat cu
doză mare de L. salina (1mg/L) a înregistrat rezultate asemănătoare
lotului de control sănătos.
Motivația este o componentă psihologică cheie care lipsește
pacienților diagnosticați cu depresii severe. Având în vedere aceste
aspecte și datele obținute din experimentele efectuate investigarea în
viitor prin examene specifice a potențialul antidepresiv al extractelor din
Leuzea sp este o direcție de cercetare promițătoare.
În ceea ce privește memoria de scurtă durată (MSD)
(operaționalizată prin procentul de alternare spontană și timpul petrecut
în brațul deschis) loturile tratate cu extracte de Leuzea sp. au avut
îmbunătățiri semnificative a MSD față de lotul martor, depășind și
54
loturile de control sănătoase. Valorile cele mai mari au fost înregistrate
pentru lotul tratat cu L. carthamoides în doză mică de 0,5mg/L (în ceea
ce privește alternarea spontană) și respectiv lotul tratat cu L salina în doză
mare de 1mg/L (în ceea ce privește timpul petrecut în brațul deschis).
B. Testul bazinului nou (novel tank diving test)
Testul bazinului nou evaluează starea de anxietate și
comportamentul de explorare operaționalizate prin: timpul petrecut în
zona superioară a bazinului, distanța totală parcursă de pești în bazin și
numărul de intrări în zona superioară a bazinului.
Peștii fiind anxioși au tendința de a înota în zona inferioară a
bazinului, abia când devin mai relaxați încep să exploreze și
compartimentul superior, în căutarea hranei (fig. 6.40).
Fig. 6.40: Timpul petrecut în zona superioară a bazinului pentru loturile de pești tratați cu
extracte de Leuzea carthamoides (A) și Leuzea salina (B).
Comportamentul de explorare și căutare a recompensei se
urmărește prin înregistrarea numărului de intrări a peștilor în zona
superioară a bazinului (fig. 6.41).
Acest comportament se mai numește si motivație de explorare sau
motivație de căutare a recompensei și implicată calea nigrostriată a
dopaminei care este afectată in cazul pacienților cu boală Parkinson
55
Fig. 6.41: Numărul de intrări în zona superioară a bazinului pentru loturile de pești tratați cu
extract de Leuzea carthamoides (A) și Leuzea salina (B) în doze de 0,5mg/L și 1mg/L apă.
Starea de anxietate a animalelor poate fi apreciată și în funcție de
distanța totală parcursă de indivizi în bazin. Dacă animalele parcurg
distanțe mai mari în zona inferioară a bazinului înseamnă că nivelul
acestora de anxietate este mare, în timp ce parcurgerea unei distanțe mai
mari în zona superioară a bazinului indică prezența comportamentului de
explorare, concomitent unui grad de anxietate redus. Rezultatele obținute
în cadrul acestui experiment sunt redate în fig. 6.42.
Fig. 6.42: Distanța totală parcursă în bazin pentru loturile de pești tratați cu Leuzea
carthamoides (A) 0,5mg/l și 1mg/l respectiv cu Leuzea salina (B) 0,5mg/L și 1mg/L apă.
Datele obținute la testul bazinului nou (novel tank diving test)
arată că loturile cu Parkinson indus și tratate cu extracte de Leuzea sp.
prezintă o activitate anxiolitică semnificativă în comparație cu martorii
netratați. Cele mai bune rezultate au fost obținute de lotul tratat cu
Leuzea carthamoides în doză mare (1mg/L).
56
CAPITOLUL 7: Concluzii generale; Originalitatea tezei;
Perspective de continuare a cercetărilor
În cadrul cercetărilor noastre au fost studiate din punct de vedere
farmacognostic, fitochimic și al activității biologice părțile aeriene a două
specii de Ajuga: Ajuga reptans L. și Ajuga genevensis L. și rădăcinile
provenite de la două specii de Leuzea: Leuzea carthamoides (Willd.)
[sinonim Rhaponticum carthamoides (Willd. Iljin)] și Lauzea salina.
Concluziile studiului întreprins asupra extractelor de Ajuga
reptans și Ajuga genevensis
Studiile efectuate au condus la o serie de rezultate care au generat
următoarele concluzii. În cadrul cercetărilor noastre au fost analizate din
punct de vedere fitochimic și al calităților biologice părțile aeriene a două
specii de Ajuga: A. reptans și A. genevensis; rezultatele înregistrate ne
permit să tragem o serie de concluzii:
studiul chimic calitativ și cantitativ a demonstrat prezența în
extractele celor două specii de Ajuga a unor grupe de principii
active și anume: acizi polifenolcarboxilici, flavonoide, iridoide și
ecdisteroide;
analiza cromatografică în start subțire a permis evidențierea în
extracte a unor spoturi masive atribuite de noi 8-O-
acetilharpagidei și harpagidei, a luteolin-7-O-glucozidei, precum
și a unor acizi polifenolici;
între cele două specii există, așa după cum ne așteptam o
variabilitate interspecifică, și, de asemeni o variabilitate
intraspecifică, pentru indivizii aceleiași specii recoltate din locații
diferite; variabilitatea interspecifică se datorează moștenirii
genetice, în timp ce variabilitatea intraspecifică depinde de
condițiile de mediu (compoziția solului, temperatura, precipitații,
solarizare) în care s-a dezvoltat planta;
prin spectrofotometrie am realizat o determinare cantitativă, care
apoi a fost completată prin analiza UHPLC. Am constatat că
părțile aeriene de Ajuga reptans conțin o cantitate mai mare de
derivați polifenolici (de unde rezultă acțiunea antioxidantă), în
57
timp ce la Ajuga genevensis, predomină iridoidele, responsabile
de efectul antiedematos, antiinflamator;
analiza UHPLC a cuantificat diferitele componente, identificând
printre altele: acizii cafeic, p-cumaric, rozmarinic, catehina,
luteolin-7-O-glucozida, luteolina, apigenolul, harpagida,
aucubozida, catalpolul și 8-O-acetil-harpagozida;
din punct de vedere biochimic am urmărit influența extractelor
asupra activității unor enzime, cum ar fi: acetilcolineteraza,
butirilcolinesteraza și lipoxigenaza dar și capacitatea de chelatare
a fierului, toate implicate activ în procesul de degenerare
neuronală din Parkinson. S-a constatat că ambele extracte inhibă
atât acetilcolinesteraza cât și butirilcolinesteraza (aceasta din
urmă mai intens), precum și lipoxigenaza, efectul de inhibiție
fiind cu atât mai mare cu cât doza de pricipii active crește. Ca
intensitate, inhibarea de către extracte a enzimelor cercetate a fost
mult mai mică decât cea indusă de etaloanele galantamină și
respectiv cvercetol;
în Parkinson la nivelul ganglionilor bazali și a substanței negre,
nivelul de radicali hidroxil este foarte ridicat, ca de altfel și
acumularea de ion feros. De aceea se caută compuși capabili să
chelateze ionul feros pentru a reduce nivelul de producție al
radicalului hidroxil, prin aceasta blocându-se reacțiile de sinteză
a unor radicali organici la nivel celular. Atât pentru extractul din
Ajuga reptans cât și pentru cel din Ajuga genevensis s-au obținut
valori CE50 care indică o capacitate de chelatare a ferului
apropiată de cea a cvercetolului, etalon;
cercetările farmacologice efectuate au demonstrat că extractele
acționează avantajos, dar pentru fiecare din specii intensitatea de
acțiune pe o anumită componentă la nivel cerebral este
caracteristică;
investigând memoria de scurtă durată a animalelor cu Parkinson
experimental, am putut constata că ambele extracte determină o
mai bună funcționare a acesteia efectul cel mai puternic fiind
înregistrat pentru Ajuga reptans la doza de 75 mg/kg corp. Este
drept că activitatea locomotorie a fost se pare mai puțin
58
influențată, procentul de îmbunătățire a alternării spontane fiind
semnificativ crescut;
urmărind să evaluăm memoria spațială, memoria de lucru (ca
formă a memoriei de scurtă durată) și memoria de referință (ca
formă a memoriei de lungă durată) a rozatoarelor am utilizat
testul labirintului cu brațe radiale. Rezultatele sugerează că
procesul degenerativ indus prin injectare cu 6-OHDA a fost
parțial contracarat prin tratamentul aplicat; interesant este faptul
că la Ajuga reptans răspunsul a fost mai intens la doza de 75
mg/kg corp, cum era de asteptat, în timp ce pentru suliman
eficiența mai mare o are doza redusă de 25 mg/kg corp;
efectele anxiolitice au fost investigate cu ajutorul testului
labirintului cu brațe deschise, când s-a constatat că ambele
extracte administrate în doză mare conduc la o scădere
semnificativă a nivelului de anxietate; de această dată Ajuga
genevensis având o eficiență anxiolitică mai mare decât cea a
extractului de vineriță;
în cadrul testului înotului forțat a fost urmarită acțiunea
antidepresivă pe care o dezvoltă cele două extracte. Datele
înregistrate în cadrul acestui test demonstrează eficiența
terapeutică, antidepresivă, care crește în relație directă cu doza
aplicată;
după efectuarea tuturor testelor farmacologice cu extractele de
Ajuga reptans și Ajuga genevensis, este evident că acțiunea
antidepresivă este puternic influențată de tratamentul cu extract
de suliman, care are capacitatea de contracarare a alterărilor
neurologice de acest tip, produse animalelor de experiență prin
inducerea Parkinsonului cu 6-OHDA.
În ceea ce privește activitatea biologică, putem presupune că
fiecare dintre cele două extracte acționează ca un fitocomplex în sine;
având în vedere determinările noastre chimice, biochimice și
farmacologice presupunem că acțiunea neuroprotectoare și evident
neuroregeneratoare este conferită de componentele prezente, dintre care:
59
flavonoidele și polifenolii vin cu o importantă acțiune
antioxidantă, prezenta, dar investigată deja la noi în țară (26, 115,
262, 263),
iridoidele cu activitate antiinflamatoare și antiedematoasa și
ecdisonele, și ele antiinflamatoare, dar totodată puternic
antistres - adaptogene, anxiolitice și antidepresive.
Având în vedere faptul că derivații chimici din grupele mai sus
menționate acționează la administrări repetate, dispersate pe o perioadă
mai lungă de timp, aspectele de acțiune farmacologică a trebui investigate
eventual pe o perioadă de 14-21 zile, deoarece abia în administrare
cronică se poate vedea cu adevărat eficiența tratamentului.
În orice caz, prin compoziția complexă și nivelele diferite la care
acționează diversele grupe de principii active, putem considera că
extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis se înscriu în categoria
preparatelor cu acțiune multi-target.
Cercetări privind speciile Leuzea carthamoides și Leuzea salina
În cadrul tezei de doctorat am prezentat rezultatele obținute
pentru analiza farmacognostică, constând din studiul macroscopic,
microscopic (preparate superficiale) și morfologic (202), cea fitochimică
și biologică, ceea ce ne-a permis să tragem următoarele concluzii:
analizând secțiunile transversale practicate prin rădăcina,
rizomul, tulpina și limbul foliar a celor două specii de Leuzea
incluse în studiu am constatat o serie de asemănări care sunt
normale pentru plante aparținând aceluiași gen dar și o serie de
diferențe atât la nivelul rizomului cât și al rădăcinii, a tulpinii
aeriene, și a limbului foliar; asemănările morfologice dintre cele
două materiale de Leuzea investigate sunt normale pentru specii
aparținând aceluiași gen;
singura diferență majoră constă în existența unor formarțiuni
salifere, evidențiate la microscopul electronic de baleiaj, doar în
cazul indivizilor de Leuzea salina; în literatura de specialitate
consultată nu am găsit date cu privire la existența unor astfel de
formațiuni, nici măcar pentru specia Leuzea carthamoides;
60
asta nu înseamnă însă că vorbim cu adevarat de două specii
diferite, Leuzea carthamoides și Leuzea salina, ci poate fi vorba
de o varietate chimică a primei specii, care însă s-a dezvoltat pe
un teren inițial mlăștinos, transformat în cursul verii în sărătură;
elemente de acest tip cum ar fi glandele salifere sunt pe larg
discutate în literatură științifică mai veche (107, 257) ca fiind
caracteristice plantelor halofite. Oricum în momentul de față nu
există informații recente privind prezența acestor formațiuni și
rolul lor la plantele de Leuzea.
rezultatele studiului chimic și biologic ar putea aduce lămuriri în
această problemă, dar totodată este posobil să fie necesare studii
mai aprofundate ca durată și spectru de compuși chimici, pentru
clarificarea acestui aspect;
de asemeni este necesară stabilirea cu exactitate dacă în acest caz
este vorba într-adevăr de glande prin care se elimină clorura de
sodiu din plantă, sau ele conțin alte componente minerale;
studiul fitochimic a urmărit determinarea cantitativă (prin
spectrofotometrie și UHPLC) a compușilor flavonoidici, a
acizilor polifenolcarboxilici și a derivaților ecdisonici din
extractele de rădăcini de Leuzea. S-a dovedit că atât polifenolii
cât și ecdisteroidele sunt cantitativ mai bine reprezentate la specia
Leuzea carthamoides;
componentele identificate prin UHPLC în extractul de Leuzea
carthamoides au fost: epicatehina, acid clorogenic, acid elagic,
rutozida, luteolin-7-O-glucozida, acid ferulic, o kemferol-
glucozida, luteolina, sitosterolul și kemferolul;
pentru Leuzea salina, epicatehina, acidul elagic, rutozida,
luteolin-7-O-glucozida, kemferol-glucozida și sitosterolul se află
în cantități de sub 1 mg/g pulbere vegetală, conținutul fiind mult
redus față de specia medicinală;
testele biochimice au dovedit pentru cele două extracte de Leuzea
capacitatea de blocare a colinesterazelor mai redusă decât cea
provocată cu galantamină; acest lucru însemnând pentru
extractele vegetale că o dată cu o inhibiție mai redusă a enzimei
se reduc efectele adverse (numeroase și grave) ale inhibitorilor de
colinesteraza;
61
capacitatea de inhibitie a lipoxigenazei comparativ cu cea a
cvercetolului este mai redusă, dar totuși notabilă. Și în acest caz
extractul de Leuzea carthamoides este mai eficient;
valorile CE50 obținute indică pentru Leuzea salina o capacitate
de chelatare a ferului apropiată de cea a cvercetolului, în timp ce
pentru Leuzea carthamoides este de două ori mai mare decât cea
a martorului cvercetol (CE50 = 474,61 ± 4,28 g/sol finală);
în testul labirintului cu trei brațe am constatat că activitatea
locomotorie s-a îmbunătățit foarte mult în prezența extractului de
Leuzea salina 0,5 mg/L;
memoria de scurtă durată (puternic afectată mai ales în
Alzheimer) s-a îmbunătățit sub tratament, cel mai eficient
dovedindu-se a fi extractul de Leuzea carthamoides 0,5mg/L;
comportamentul de explorare (afectat în Parkinson) s-a dovedit a
fi influențat pozitiv de ambele extracte, efectul cel mai evident
apărând pentru Leuzea salina 1mg/L;
actiunea anxiolitică dezvoltată de ambele extracte este și ea
remarcabilă, având în vedere că la administrare este activat
comportamentul de explorare care angajează câile dopaminergice
(alterate în Parkinson), efectul cel mai intens dezvoltându-se la 1
mg/l apă Leuzea carthamoides, totodată numărul de intrări în
zona superioară a bazinului și distanța parcursă la acest nivel fiind
semnificativ mai mare pentru loturile intoxicate și tratate
comparativ cu peștii control respectiv, intoxicati cu neurotoxină.
Reiese din cercetările efectuate că cele 4 specii studiate conțin
principii active importante și în cantități suficient de mari pentru ca la o
administrare adecvată să se obțină răspunsuri farmacologice nete, dintre
care se remarcă: acțiunea antioxidantă, antiinflamatoare și
antiedematoasă, nootropă și neuroregeneratoare, îmbunătățirea activității
locomotorii și a comportamentului de explorare, îmbunătățirea memoria
de scurtă și lungă durată, acțiunea anxiolitică și antidepresivă.
62
Originalitatea tezei
Studiile realizate pe parcursul acestei lucrări asupra speciilor
Ajuga reptans și Ajuga genevensis au adus o serie de aspecte originale:
prezența unor cantități importante de iridoide antiinflamatoare în
special în Ajuga genevensis în timp ce plantele de Ajuga reptans
conțin mai mulți polifenoli, antioxidanți;
capacitatea celor două extracte de a inhiba moderat acetil- și
butirilcolinesteraza, ceea ce reprezintă o calitate, dacă acestea ar
urma să fie folosite ca adjuvanți în tratamentul bolii Parkinson
sau Alzheimer;
acțiunea de inhibare a lipoxigenazei implicată în procesele
inflamatorii;
capacitatea de chelatare a fierului, implicat activ în procesul de
degenerare neuronală din Parkinson și Alzheimer;
s-a demonstrat influența benefică pe care extractele o au asupra
memoriei spațiale și a memoriei de lucru (ca formă a memoriei
de scurtă durată) și memoria de referință (ca formă a memoriei de
lungă durată) la animalele cărora li s-a provocat un Parkinson
experimental.
În cazul cercetărilor speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea
salina originalitatea rezultatelor constă în:
efectuarea unui studiu morfologic comparativ a diferitelor organe
ale celor două specii;
identificarea, pentru prima oară, a unor glande salifere în ceea ce
studiul nostru n-a putut atribui speciei Leuzea salina respectiv,
sau unei chemovarietăți de de sărătură a speciei Leuzea
cathamoides;
analiza fitochimică a materialului vegetal provenit din țara
noastră, cu identificarea în extracte a epicatehinei, acidului
clorogenic, acidului elagic, a rutozidei, a luteolin-7-O-glucozidei,
a kemferol-glucozidei, a sitosterolului precum și a 2 componente
ecdisteroidice (20-OH-ecdisona, α-ecdisona);
63
pentru prima dată s-a investigat cu ajutorul unor teste biochimice
capacitatea de blocare a colinesterazelor, a lipoxigenazei precum
și cea de chelatare a ionului feros;
pentru prima dată a fost investigată, prin testul pe pești din specia
Danio rerio capacitatea de contracarare a efectelor de deriorare
neurologică indusă reactivului biologic la tratarea cu neurotoxina
6-OHDA; s-au urmărit influența asupra memoriei de scurtă, a
comportamentul de explorare, acțiunea anxiolitică, și acțiunea
antidepresivă, care s-au dovedit a fi remarcabile.
Perspective de continuarea a cercetărilor
Ar fi interesantă și chiar importantă continuarea studiilor
morfologice asupra speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea
salina timp de 5 – 6 ani, cu material de cultură provenind, pe de-
o parte dintr-o cultură controlată (eventual Gradina Botanică), și
respectiv de pe terenul sărăturos de lângă Valea Lupului, Iași.
De asemeni merită investigată problematica existenței speciei
Leuzea salina ca specie de sine stătătoare, sau ca și varietate
chimică a speciei L. carthamoides; Ar trebui investigată natura
chimică a excreției salifere, precum și dacă este vorba de o glandă
care elimină sărurile în vacuolă sau glande care elimină sărurile
în afara celulelor (67).
În ceea ce privește rezultatele obținute la testele in vivo efectuate
cu extractele de Leuzea sp. studiile viitoare ar putea analiza prin
examene specifice efectul antidepresiv si de ameliorare a
tulburărilor de memorie al extractelor menționate.
Investigarea mai de aproape a potențialului antimicrobian și
antiviral al extractelor de Leuzea carthamoides și Leuzea salina.
În baza rezultatelor înregistrate la testele comportamentale cu
extractele de Ajuga sp. studiile viitoare ar putea investiga prin
examene specifice potențialul extractelor menționate în terapia și
profilaxia tulburărilor mnezice (demențe, inclusiv demența
vasculară, Alzheimer, demența cu corpi Lewi) dar mai ales în
ceea ce privește terapia tulburărilor depresive (depresia majoră și
episoadele depresive din cadrul tulburările afective bipolare).
64
Administrarea extractelor să se efectueze pe perioade mai lungi
(atât în cazul speciile de Leuzea cât și de Ajuga sp.) urmărindu-se
intensitatea efectului terapeutic în timp, dacă acesta se menține
relativ constant sau dacă apar fluctuații de intensitate.
65
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Abdelouahab N, Heard C. Effect of the major glycosides of
Harpagophytum procumbens (Devil’s Claw) on epidermal
cyclooxygenase-2 (COX-2) in vitro. J Nat Prod 2008; 71(5): 746-749.
8. Andersson M L, Møller A M, Wildgaard K. Butyrylcholinesterase
deficiency and its clinical importance in anaesthesia: a systematic review.
Anaesthesia 2019; 74(4): 518-528.
21. Biskup E, Szynklarz B, Golebiowski M, Borsuk K, Stepnowski P,
Lojkowska E. Composition and biological activity of Rhaponticum
carthamoides extracts obtained from plants collected in Poland and
Russia. J Med Res 2013; 7(11): 687-95.
23. Blainski A, Piccolo V K, Mello J C, de Oliveira R M. Dual effects of
crude extracts obtained from Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) on
experimental anxiety in mice. J Ethnopharmacol 2010; 128(2): 541–4.
25. Boje K, Lechtenberg M, Nahrstedt A. New and known iridoid- and
phenylethanoid glycosides from Harpagophytum procumbens and their
in vitro inhibition of human leucocyte elastase. Planta Med 2003; 69(9):
820:5.
26. Bokov D O, Sidorova Yu S, Mazo V K, Bessonov V V. Prospects for
the use of spinach (Spinacia oleracea L.) containing phytoecdysteroids
and polyphenols. Pharmacognosy Journal 2020; 12(2):246-250.
27. Borovikova E B, Boltaev U A. Lesterone a new phytoecdysteroids
from the seeds of Leuzea carthamoides. Chem Nat Comp 1999; 35(2):
182-183.
28. Borovikova E B, Shangaraeva G S, Boltaev U A. Rhapisterone D-20
acetat from the seeds of Leuzea carthamoides. Chem Nat Compd 1999;
35(2): 184-186.
66
32. Brien S, Lewith G T, Mc Gregor G. Devil’s claw (Harpagophytum
procumbens) as a treatment for osteoarthrits: A review of efficacy and
safety. J Altern and Complement Med 2006; 12(10): 981-93.
33. Budesínský M, Vokác M, Harmatha J, Cvacka J. Additional minor
ecdysteroid components of Leuzea carthamoides. Steroids 2008; 73(5):
502-514.
34. Bui T T, Nguyen T H. Natural product for the treatment of
Alzheimer’s disease. J Basic Clin Physiol Pharmacol 2017; 28(5): 413-
423.
36. Carillo-Ocampo D, Bazaldúa-Gómez S, Bonilla Barbosa J R, Aburto-
Amar R, Rodríguez-López V. Anti-inflammatory activity of iridoids and
verbascoside isolated from Castilleja tenuiflora. Molecules 2013; 18(10):
12109-12118.
38. Cespedes C L, Balbontin C, Avila J G, Dominguez M, Alarcon J, Paz
C, Burgos V, Ortiz L, Peñaloza-Castro I, Seigler D S, Kubo I. Inhibition
on cholinesterase and tyrosinase by alkaloids and phenolics from
Aristotelia chilensis leaves. Food and Chemical Toxicol 2017; 109( pt 2):
984-995.
39. Cespedes C L, Munoz E, Salazar J R, Yamaguchi L, Werner E,
Alarcon J, Kubo I. Inhibition of cholinesterase activity by extracts,
fractions and compounds from Calceolaria alcana and C.integrifolia
(Calceolariaceae: Scrophulariaceae). Food and Chemical Toxicol 2013;
62:919-926.
47. Ciocârlan V. Flora ilustrată a României Ed a-II-a, Ed. Ceres București
2000.
57. Dinan L, Hormann R E. Ecdysteroid agonists and antagonists.
Elsevier BV 2005; 198-213.
67. Fahn A. Secretory tissues in plants. Academic Press Oxford 1988.
67
69. Ferger B E I. Morbus Parkinson. Deutsch Apoth Z 2000; 140: 566-
671.
72. Garg A, Sharma R, Dey P, Kundu A, Kim H S, Bhakta T, Kumar A.
Analysis of triterpenes and triterpenoids. In Recent Advances in: Natural
Products Analysis. Elsevier 2020; 393-426.
74. Geszprych A, Weglarz Z. Composition of essential oil from
underground and aboveground organs of Rhaponticum carthamoides
(Willd.) Iljin. Herba Pol 2002; 48:188-92.
75. Ghiță G, Cioancă O, Gille E, Necula R, Zamfirache M, Stănescu U.
Contributions to the phytochemical study of some samples of Ajuga
reptans L. and Ajuga genevensis L. Bull. Univ. Transilvania Braşov Ser.
VI: Med. Sci 2011; 4(53):7-14.
81. Gong N, Fan H, Ma A N, Xiao Q, Wang Y X. Geniposide and its
iridoid analogs exhibit antinociception by acting at the spinal GLP-1
receptors. Neuropharmacology 2014; 84:31-45.
107. Helder R J. The loss of substances by cells and tisues (salt glands)
In: Ruhland W (Ed) Handbuch der Pflanzenphysiologie, Vol. 2 Springer,
Berlin-Göttingen-Heidelberg 1956; 466-488.
111. Hemcinschi A, Gille E, Necula R, Dănilă D, Trifan A, Stănescu U.
Chemical variability of some natural population of Ajuga sp from the
North-Eastern part of Romania. Planta Med 75(Suppl 1) 2009; 931.
112. Hemcinschi A, Gales R, Stănescu U, Toma C. Comparative histo-
anatomy and chemical composition of two Ajuga species from the
romanian flora. Analele științifice ale Universității Al. I. Cuza, Iași, S. a
II-a Bilologie Vegetală 2009; 55(2):3346.
115. Hemcinschi Lungu A. Contrubuții la studiul unor specii indigene de
Galium și Ajuga, Teză de doctorat, Universitatea de Medicină și
Farmacie Gr. T. Popa Iași 2011.
68
121. Hrițcu L. Fiziologie animală experimentală. Ed. Universităţii Al. I.
Cuza Iaşi 2012.
123. Hrițcu L, Ioniță R, Motei D E, Babii C, Ștefan M, Mihășan M.
Nicotine versus 6-hydroxy-L-nicotine against chlorisondamine induced
memory impairment and oxidative stress in the rat hippocampus.
Biomedicine & Pharmacotherapy 2017; 86:102-108.
124. Hu C, Ma S. Recent development of lipoxygenase inhibitors as anti-
inflammatory agents. Medchemcomm 2017; 9(2):212-225.
125. Huang B, Chen P, Huang L, Li S, Zhu R, Sheng T, Yu W, Chen Z,
Wang T. Geniposide attenuates post-ischemic neurovascular demage via
Glu N2A/AKT/ERK- dependent mechanism. Cell Physiol Biochem
2017; 43:705-716.
127. Inestrosa N, Dinamarca M C, Alvarez A. Amyloid-cholinesterase
interactions. Implications for Alzheimer's disease. FEBS J 2008;
275(4):625-632.
128. Inomata, Yusuke & Terahara, Norihiko & Kitajima, Junichi &
Kokubugata, Goro & Iwashina, Tsukasa. Flavones and anthocyanins
from the leaves and flowers of Japanese Ajuga species (Lamiaceae).
Biochemical Systematics and Ecology 2013; 51:123–129.
146. Kokoska L, Janovska D. Chemistry and pharmacology of
Rhaponticum carthamoides: a review. Phytochemistry 2009; 70(7):842-
55.
149. Koo H J, Lim K H, Jung H J, Park E N. Anti-inflammatory
evaluation of gardenia-extract, geniposide and genipin. J
Ethnopharmacol 2006; 103(3):496-500.
150. Koo H J, Song Y S, Kim H J, Lee Y H, Hong S M, Kim S J, Kim B
C, Jin C, Lim C J, Park E H. Anti-inflammatory effects on genipin, an
active principle of gardenia. Eur J Pharmacol 2004; 495(2-3):201-8.
69
151. Kraft K. Antientzündliche Mechanismen von Arzneipflanzen.
Phytotherapie Austria 2017; 11(6):4.
153. Küpeli E, Harput U S, Varel M, Yesilada E, Saracoglu I. Bioassay-
guided isolation of iridoid glucosides with antinociceptive and anti-
inflammatory activities from Veronica anagallis-aquatica L. J
Ethnopharmacol. 2005; 102(2):170-6.
162. Lee J, Jun M. Dual BACE1 and cholinesterase inhibitory effects of
phlorotannins from Ecklonia cava - An in vitro and in silico study. Mar
Drugs 2019; 17:91.
166. Liu J H, Yin F, Guo L X, Deng X H, Hu Y H. Neuroprotection of
geniposide against hydrogen peroxide induced PC12 cells injury:
involvement of P13 kinase signal pathway. Acta Phamacologica Sinica
2009; 30:159-165;
167. Liu J, Zheng X, Yin F, Hu Y, Guo L, Deng X, Chen G, Jiajia J,
Zhang H. Neurotrophic property of geniposide for inducing the neuronal
differentiation of PC 12 cells. Int J Dev Neurosci. 2006; 24(7):419-24.
168. Logvinov S V, Pugachenko N V, Potapov A V, Krasnov E A,
Plutnikov M B, Maslov M Yu, Aliev O I, Tyukavkina N A. Ischemia-
induced changes in synaptoarchitectonis of brain cortex and their
correction with ascovertin and Leuzea extract. Bull Exp Biol Med 2001;
132:1017-20.
169. Lotocka B, Geszprych A. Anatomy of the vegetative organs and
secretory structures of Rhaponticus carthamoides (Asteraceae). Bot J
Linnean Sok 2004; 144(2):207-233.
173. Mamedov N, Mamadalieva N. Medicinal plants from countries of
former USSR used for treatment of depression. In: Grosso C. (ed), Herbal
medicine in depression, Springer Publ. Elvetia 2016; 183-258.
70
183. Mosharrof A H. Effects of extract from Rhaponticum carthamoides
(Willd) Iljin (Leuzea) on learning and memory in rats. Acta Physiol
Pharmacol Bulg 1987; 13(3):37-42.
186. Mutschler E, Geisslinger G, Menzel S, Ruth P, Schmidtko A.
Pharmakologie kompakt WVG Stuttgart 2016.
188. Namuna A. Bioecological Characteristics and Natural Resources of
Rhaponticum integrifolium in Uzbekistan. American Journal of Plant
Sciences 2019; 10(05):850-865.
202. Păduraru A F, Cioancă O, Gille E, Iancu C, Burlec F, Enache L,
Toma C, Hăncianu M. Morphologic profile of two Leuzea species
harvested from wild flora of Eastern Romania. Med. Surg. J. Rev. Med.
Chir. Soc. Med. Nat. Iași 2019; Vol. 123, No. 1 :187-194.
209. Pospelova M L, Barnaul O F. The anti hypoxant and antioxidant
effects of medicinal plants as the basis for their use in destructive diseases
of the brain. Human Psychol 2000; 26(1):86-91.
210. Prior R L, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the
determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary
supplements. J Agric Food. Chem 2005; 53:4290-4302.
216. Rees T, Hammond P, Soreq H, Younkin S, Brimijoin S.
Acetylcholinesterase promotes beta-amyloid plaques in cerebral cortex.
Neurobiol Aging 2003; 24:777-787.
222. Russo P, Kisialiou A, Lamonaca P, Moroni R, Prinzi G, Fini M.
New drugs from marine organisms in Alzheimer’s disease. Mar Drugs
2016; 14:5.
227. Schilcher H, Kammerer S, Wegener T. Leitfaden Phytotherapie. ed.
a lV-a, Urban & Fischer, München 2010;
71
233. Sharaf M, Skiba A, Werglarz Z, El- Ansari M A. Two flavonoid 5-
O-glycosides from the roots of Leuzea carthamoides. Fitoterapia 2001;
72:940-942.
234. Sharma P, Srivastava P, Seth A, Tripathi P N, Banerjee A G,
Shrivastava S K. Comprehensive review of mechanisms of pathogenesis
involved in Alzheimer’s disease and potential therapeutic strategies.
Progr Neurobiol 2019; 174:53-89.
238. Skiba A, Werglarz Z. Phenolic acides of Rhaponticum
carthamoides. Acta Hortic 2003; 597:119-124.
239. Skiba A, Werglarz Z. Accumulation of the biomass and some
polyphenolic compounds in Rhaponticum carthamoides (Willd.)
Iljin. Annals of Warsaw Agricultural University SGGW, Horticulture
(Landscape Architecture) 2000; 20:19-25.
247. Stănescu U, Hăncianu M, Cioancă O, Aprotosoaie A, Miron A.
Plante medicinale de la A la Z, ed. a II-a. Polirom Iași 2014; 306-308.
250. Stoyanovsky D A, Tyurina Y Y, Shrivastava I, Bahar I, Tyurin V A,
Protchenko O, Jadhav S, Bolevich S B, Kozlov A V, Vladimirov Y A,
Shvedova A A, Philpott C C, Bayir H, Kagan V E. Iron catalysis of lipid
peroxidation in ferroptosis: Regulated enzymatic or random free radical
reaction? Free Radic Biol Med. 2019; 133:153-161.
257. Thomson W W. The structures and functions of salt glands. In:
Polyakoff-Mayber A, Gale J (eds) Plants in Saline Environemets.
Ecological studies (Analysis and Synthesis), Vol. 15, Springer, Berlin-
Heidelberg 1975.
262. Toiu A, Vlase L, Arsene A L, Vodnar D C, Oniga I. LC/UV/MS
profile of polyphenols, antioxidant and antimicrobial effects of Ajuga
genevensis L. Extracts. Farmacia 2016; 64:53–57.
72
263. Toiu A, Vlase L, Gheldiu A M, Vodnar D, Oniga I. Evaluation of
the antioxidant and antibacterial potential of bioactive compounds from
Ajuga reptans extracts. Farmacia 2017; 65:351–355.
267. Tundis R, Loizzo M R, Menichini F, Statti G A, Menichini F.
Biological and pharmacological activities of iridoids: recent
developments. Mini Rev Med Chem. 2008; 8(4):399-420.
270. Venditti A, Frezza C, Riccardelli M, Foddai S, Nicoletti M, Serafini
M, Bianco A. Unusual molecular pattern in Ajugoideae subfamily: the
case of Ajuga genevensis L. from Dolomites. Natural Product Research
2016; 30(9):1098-1102.
272. Vereskovskii V V, Kintya P K, Shapiro D K, Chekalinskaya I I.
Triterpene glycosides of Rhaponticum carthamoides cultivated in
Belorussia. Chem. Nat. Compd. 1978; 13:484- 485.
274. Vlachojannis J, Roufogalis B D, Chrubasik S. Systematic review on
the safety of Harpagophytum preparations for osteoarthritic and low back
pain. Phytother Res 2008; 22(2):149-52.
280. Wang S W, Lai C Y, Wang C J. Inhibitory effect of geniposide on
aflatoxin B1-induced DNA repair synthesis in primary cultured rat
hepatocytes. Cancer Lett. 1992; 65(2):133-7.
281. Willborn C D, Taylor L W, Campbell B I, Kerksick C, Rasmussen
C J, Greenwood M, Kreider R B. Effects of methoxyisoflavone,
ecdysterone and sulfo-polysaccharide supplementation on tranning
adaptation in resistance-trained males. J Int Soc Sports Nutritio 2006;
3(2):19-27.
287. Zuo T, Zhu M, Xu W, Wang Z, Song H. Iridoids with genipin stem
nucleus inhibit lipopolysaccharide-induced inflammation and oxidative
stress by blocking the NF-kB pathway in polycystic ovary syndrome.
Cell Physiol Biochem 2017; 43:1855-1865.
Top Related