• PREPARATE MICROSCOPICE

• CATEDRA DE MICROBIOLOGIE

• LP 3

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

INDICATII:

- colorarea la cald a micobacteriilor din prelevate patologice sau culturi

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Reactivi:

1. Solutie de fucsina fenicata Ziehl

2. Solutie decoloranta: amestec acid – alcool (H2SO4 + alcool etilic 95°)

3. Solutie recoloranta: albastru de metilen

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

Procedura:

1. Se aseaza lama cu frotiul fixat pe un suport metalic

2. Se acopera frotiul din abundenta cu sol. de fucsina fenicata

3. Se lasa 15’, timp in care se fac 3 treceri cu flacara becului de gaz Bünsen pe sub lama de sticla, astfel incat sa incalzim colorantul pana la emitere de vapori.

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Atentie! Colorantul nu trebuie sa ajunga la fierbere!

• Daca colorantul se evapora sau se usuca pe lama, trebuie sa adaugam colorant proaspat!

4. Se spala frotiul din abundenta cu apa de robinet

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

5. Se decoloreaza frotiul cu amestec acid – alcool – 2’

6. Se spala cu apa de robinet

7. Recolorare cu sol. albastru de metilen – 1’

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA ZIEHL - NEELSEN

• Citire si interpretare:

- bacilii acido – alcoolo - rezistenti (BAAR) –

apar rosii stralucitori

- celulele inflamatorii, celulele de

descuamare sau celulele tisulare, bacteriile

neacido – alcoolo – rezistente – se vor

colora in nuante de albastru

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• INDICATII:

Coloratie la rece a micobacteriilor din prelevate patologice sau culturi

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• Reactivi:

A. Solutie de fucsina fenicata Kinyoun

B. Solutie decoloranta de acid – alcool

(HCl + alcool etilic 95°)

C. Solutie recoloranta: albastru de metilen

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

Procedura:

1. Colorare la rece cu sol. de fucsina fenicata Kinyoun – 5’

2. Spalare cu apa de robinet

3. Decolorare cu amestec acid – alcool – 30”

4. Spalare cu apa de robinet

5. Recolorare cu albastru de metilen – 1’

6. Spalare cu apa de robinet.

• COLORATII DIFERENTIALECOLORATIA KINYOUN

• Citire si interpretare:

- bacilii acido – alcoolo - rezistenti (BAAR) –

apar rosii stralucitori

- celulele inflamatorii, celulele de

descuamare sau celulele tisulare, bacteriile

neacido – alcoolo – rezistente – se vor

colora in nuante de albastru

• COLORATII SIMPLE

• Coloratia cu albastru de metilen: 2’

• Coloratia cu albastru de metilen, varianta Wayson: 10”

• COLORATII NEGATIVE

1. Coloratia negativa cu tus de India

Principiu:

particulele colorate nu pot penetra capsula bacteriilor sau levurilor, care apare necolorata pe fondul colorat al preparatului

Indicatii:

depistarea Cryptococcus neoformans, depistarea capsulei bacteriene in primoculturi, urmarirea reactiei de umflare a capsulei etc.

• COLORATII NEGATIVE

• Citire si interpretare:

Bacteriile si levurile capsulate apar inconjurate cu un halou clar pe fondul uniform intunecat al preparatului.

• COLORATII NEGATIVE

2. Coloratia negativa cu nigrozina

• COLORATII FLUORESCENTE

Coloratia cu auramina – rhodamina

Principiu:

• Structuri speciale, lipoidice, asociate peretelui unor bacterii confera rezistenta la decolorarea protoplastului prin solutii de acizi sau/si alcool. Bacteriile care nu poseda asemenea structuri sunt decolorate si trebuie recolorate pentru a putea fi observate.

• Endosporii bacterieni, ascosporii, chistele unor protozoare (ex. Cryptosporidium) sunt de asemenea acidorezistenti gratie invelisurilor lor.

• COLORATII FLUORESCENTE

• Invelisurile unor microorganisme (micobacterii,endospori, chiste de Cryptosporidium etc.) sunt impermeabile si pentru colorant, care trebuie sa actioneze in solutii concentrate fie la cald, fie in prezenta unor detergenti.

• COLORATII FLUORESCENTE

Indicatii:

Triajul frotiurilor din prelevate patologice

pentru depistarea rapida a bacililor

tuberculozei.

• COLORATII FLUORESCENTE

Reactivi:

1. Solutie coloranta cu Auramina O – Rhodamina B

2. Solutie decoloranta (HCl conc. + alcool etilic 95°)

3. “Contracolorant”: KMnO4

• COLORATII FLUORESCENTE

Procedura:

1. Colorare cu sol. Auramina O – Rhodamina B– 15’

2. Spalare cu apa de robinet

3. Decolorare cu acid – alcool – 2’

4. Spalare cu apa de robinet

5. “Contracolorare” cu KMnO4 – 2’

6. Spalare cu apa de robinet

• COLORATII FLUORESCENTE

• Examinare la microscopul cu fluorescenta cu obiectivele de 20x si 40x, asociate cu oculare de 10x.

• COLORATII FLUORESCENTE

Citire si interpretare:

Bacilii acido – alcoolo – rezistenti se coloreaza fluorescent stralucitor in galben – portocaliu cu Auramina O – Rhodamina B.

“Contracolorarea“ cu KMnO4 face fondul frotiului negru eventual numai cu resturi celulare cu fluorescenta galbena slaba.

• ALTE TIPURI DE COLORATII

1. Coloratia May – Grünwald – Giemsa (aprecierea celularitatii)

2. Coloratia pentru Fe. (hemosiderina, sangerari tisulare)

3. Coloratia PAS (depistarea fungilor – se coloreaza in rosu)

4. Coloratia cu albastru de toluidina (pentru Pneumocystis carinii, P.jirovecii)

• ALTE TIPURI DE COLORATII

5. Coloratia cu SUDAN III – pentru lipide

6. Coloratii imunocitochimice, reactii peroxidaza – antiperoxidaza

etc.