1
Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară Bucureşti
Facultatea de Medicină Veterinară
Master: Igiena alimentelor de origine animală şi sănătate publică
LUCRARE DE DIZERTAŢIE
METODE MODERNE DE MONITORIZARE A
IGIENEI IN INDUSTRIA LAPTELUI -
DETECTIA ATP PRIN BIOLUMINISCENTA
Coordonatori:
Şef lucrări Dr. Stelian Bărăităreanu
Conf. Dr. Mihaela Popp
Masterand
POPAZU (ROMANCIUC) CLAUDIA MARIA
Bucureşti - 2011
2
CUPRINS
Introducere 3
1. Partea I-a
STUDIU BIBLIOGRAFIC
5
1.1. Detectia ATP prin bioluminiscenta 5
1.2. Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea
igienei suprafetelor
7
1.2.1. Istoric 7
1.2.2. Principiul metodei 9
1.3. Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea
igienei ( calitatii microbiologice ) a apei ca materie prima
10
1.3.1. Istoric 10
1.3.2. Principiul metodei
1.4. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la
monitorizarea igienei laptelui crud, pasteurizat, ESL
(Extending Shelf Life) si UHT
1.4.1. Istoric
1.4.2. Principiul metodei
Partea a II-a
CERCETĂRI PERSONALE:
Material si metoda
Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP
/bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor
suprafete din spatiul de productie / ambalare intr-o fabrica de
lactate
Rezultate si discutii
CONCLUZII
Bibliografie
3
INTRODUCERE
Industria alimentara, in general, si industria lactatelor, in special, adopta din ce in ce
mai multe sisteme pentru siguranta alimentelor si managementul calitatii care sunt mai
proactive si preventive decat cele folosite in trecut si care se bazau pe testarea produsului final
si inspectie vizuala [Griffiths et al., 2003].
Ultimii 25 de ani au fost dedicati dezvoltarii de noi metode pentru Asigurarea Calitatii
Managementul Calitatii si sistemul Analiza Riscului si Punctelor Critice de Control ( Hazard
Analysis and Critical Control Point –HACCP) [Dostalek etal., 2005].
In Romania a fost adoptat standadul SR EN ISO 22000/ 2005 (Sisteme de management
al sigurantei alimentelor. Cerinte pentru orice organizatie din lantul alimentar), care
stipulează că o organizatie din lantul alimentar trebuie sa demonstreze capacitatea sa de a
controla pericolele pentru siguranta alimentului, pentru a se asigura ca alimental este sigur in
momentul consumului uman. Acest sistem de management combina urmatoarele elmente
cheie, recunoscute in general, pentru a asigura siguranta alimentelor pe tot lantul alimentar,
pana la consumatorul final:
- comunicare interactiva;
- sistem de management;
- programe preliminare;
- principii HACCP.
Pentru ca sistemul HACCP sa fie eficace sunt necesare metode rapide de analiza
pentru monitorizare si verificare. Monitorizarea uzuala consta in supravegherea parametrilor
fizici si chimici ai procesului (temperature de pasteurizare, timp, pH) in timp ce validarea
performantelor HACCP necesita teste pentru detectia unor patogeni ca Salmonella, Echerichia
coli O157:H7 etc.
Starea de igiena a suprafetelor din zona de productie a produselor lactate este un
element esential in producerea de alimente sigure, de calitate. Igienizarea unor astfel de
suprafete se face fie in mod automat (sistemul „Clean in place" =CIP), fie manual, în funcţie
de natura suprafetelor ce trebuie curatate [Pater P.,1994].
In general, igienizarea cuprinde o etapa de indepartare a reziduurilor de alimente cu
ajutorul unor detergenti si o etapa de dezinfectie pentru a distruge microorganismele. Pentru
a se demonstra eficienta igienizarii, trebuie implementat un sistem de verificare. O igienizare
neeficace poate conduce la esecul indepartarii microorganismelor si / sau resturilor de produs
de pe suprafetele de testat.
4
Microorganismele ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic in urma unui ciclu de
igienizare neeficace reprezinta un risc direct pentru urmatoarele loturi de produs care vor intra
in contact cu aceste suprafete.
Reziduurile de produse ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic, in urma unui ciclu
de igienizare neeficace, contin suficienti nutrienti pentru a transforma, printr-o crestere rapida,
o contaminare initiala mica cu microorganisme, intr-o populatie mare. Acest lucru se poate
intampla in perioada de dupa igienizare si pana la urmatoare utilizare [Pater P.,1994].
Suprafetele care vin in contact (direct sau indirect) cu alimentele si care sunt dificil de
curatat ar trebui sa fie in centrul atentiei in procesul de monitorizare. Suprafetele de contact
direct cu alimentele sunt suprafetele unde prezenta oricarui contaminant va conduce, in final,
la contaminarea produsului finit.
Suprafetele de contact indirect sunt cele in care exista potentialul de a fi imprastiate
alimente, praf sau lichide (prin imprastiere, picurare sau cadere accidentala in produs).
Suprafete dificil de curatat pot include zone care se infileteaza manual, zone cu inele, zone cu
suprafete de forma neregulata, colturi, crapaturi si gauri.
Pana in perioada ‘80, singura metoda disponibila, pentru a evalua starea de igiena a
unei suprafete care vine in contact cu alimentul, era metoda conventionala, in placi, cu mediu
de cultura (agar). Metodele clasice furnizeaza informatii despre numarul de microorganisme
de pe o suprafata si detecteaza microorganisme specifice. In schimb, nu furnizeaza informatii
despre reziduurile de alimente remanente [Martin E.,2003]. Insa, aceasta metoda este legata, in
particular, de eficienta dezinfectiei şi în mai mică măsura de curatenie. Informatiile nu sunt
obtinute intr-un timp care sa permita actiunea de recuratare in timp util, cand rezultatele sunt
inacceptabile [Ramsay C., 2002].
Avantajele testelor microbiologic sunt: identifică microflora prezentă, metodele de
lucru sunt bine documentate şi nivelul de contaminare poate fi cuantificat.
Dezavantajele testelor microbiologice sunt: necesita peste 24 ore pentru rezultate,
rezultatele pot fi variabile, in functie de viabilitatea celulelor şi nu iau in considerare si alte
tipuri de reziduuri (reziduuri de produse alimentare care reprezinta nutrienti pentru bacterii).
Din aceste motive, industria produselor lactate a cautat tehnici rapide si sensibile pentru
a monitoriza starea de igiena a suprafetelor din fluxul tehnologic, ambalajelor, echipamentelor,
apei, produsului finit.
Termenul de valabilitate al produselor lactate, si in special al laptelui de consum si al
altor produse lactate care nu contin culturi lactice, este afectat in principal de contaminarea
bacteriana postpasteurizare
Analiza de ATP cu ajutorul bioluminiscentei determina continutul de ATP atat pe o
suprafata de contact cat si in probe de produse lactate.
5
Aceasta metoda, in contrast cu metoda traditionala, poate transforma monitorizarea
retrospectiva intr-o evaluare practica a tuturor aspectelor legate de igienizare: curatenie si
dezinfectie.
ATP detectat din lapte si produse lactate cat si de pe suprafetele care vin in contact cu
laptele are trei surse: ATP liber, ATP din celulele somatice si ATP microbial [Nelson W.H.,
1991]. Deci, prin această metodă este detectată atât prezenţa reziduurilor alimentare de pe
suprafete, cât şi prezenţa microorganismelor, astfel că metoda reprezintă un indicator bun
pentru aprecierea stării de igienă a suprafeţelor testate.
Deoarece reacţia bioluminiscenta este foarte rapidă, rezultatele testării obţinându-se în
câteva minute, faţă de câteva zile necesare în metodele tradiţionale de determinare a
microorganismelor prin cultivare în plăci, echipa însărcinată cu efectuarea curăţeniei poate
relua operaţiunea, dacă se detectează deficienţe în activitatea ei. Cu alte cuvinte, dacă pe
suprafaţă se găsesc concentraţii ridicate de ATP, suprafeţele pot fi curăţate din nou înainte de
începerea activităţii de producţie. Simplitatea şi rapiditatea metodei de determinare a ATP-ului
prin bioluminiscenţă a condus la dezvoltarea mai multor sisteme pentru monitorizarea stării de
igienă, care în prezent sunt disponibile comercial. Însă, înainte de a implementa în practică
testările pe bază de ATP, pentru evaluarea stării de igienă într-o fabrică, trebuie determinate
criteriile de diferenţiere a suprafeţelor murdare de cele curate, în unităţi RLU (Relative Light
Units). Acest lucru trebuie făcut în timpul procesului de producţie, în momentele în care se
cunoaşte că suprafeţele sunt murdare sau curate.
Lucrarea de faţă abordează ca metodă modernă de monitorizare a igienei in industria
laptelui, detectia ATP prin bioluminiscenta, fiind structurată în două părţi:
- studiu bibliografic: in care se prezintă diferite modalitati de aplicare a analizei ATP
prin bioluminiscenta la determinarea gradului de igiena in industria lactatelor ;
- certcetari personale: care cuprinde un studiu comparativ intre metoda microbiologica
si ATP /bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor suprafete din spatiul de
productie / ambalare intr-o fabrica de lactate.
7
I.1. Detectia ATP-ului prin bioluminiscenta.
Prima explicaţie stiinţifică a bioluminiscenţei a fost elaborată de fizicianul Robert
Boyle, in 1672 [Day , 2009]. Introducând sub un recipient un cotlet de viţel alterat care în
întuneric degaja lumina a remarcat că stralucirea scade progresiv. Când aerul era lăsat să
pătrundă sub recipient, lumina îsi recăpăta intensitatea. Se demonstra astfel că bioluminiscenţa
este în strânsă legatură cu reacţiile chimice care încetează în absenţa oxigenului si că orice
superstiţie legată de acest fenomen nu si găsea justificarea. Abia în 1885 zoologul francez
Raphael Dubois [Lynch T., 1999], a descoperit cele două substanţe din corpul plantelor si
animalelor care dau nastere la lumina printr-o reacţie chimică. Aceste substanţe sunt luciferina
si oxiluciferina.
Bioluminiscenţa este procesul biologic de producere a luminii de către organismele vii.
În organismele bioluminiscente se sintetizează o substanţă fotogenă numită luciferina (Fig 1)
care sub acţiunea O2 si a enzimelor catalizatoare (luciferaze) se oxidează. Reacţia este
exoterma iar modificarea energiei libere este folosită pentru a excita o moleculă la o stare
foarte bogată în energie. Pentru revenirea moleculei astfel excitate la starea de bază se produce
o emisie de lumină.
Fig. 1 Structura luciferinei [ Ceresa L., 2006 ]
ATP-ul este o molecula care actioneaza ca mediu major de stocare a energiei pentru
celulele vii [Ceresa L., 2006]. Molecula de ATP are urmatoarea structura ( Fig. 2) :
Fig.2. Structura ATP
8
Hidroliza gruparilor fosfat elibereaza energie si conduce la o varietate de reactii
biochimice in interiorul celulelor. Deci, molecula de ATP poate fi folosita ca un marker al
contaminarii cu celule [Ceresa L., 200]
Cea mai comuna metoda pentru detectia ATP bazata pe masurarea bioluminiscentei
foloseste sistemul luciferin/luciferaza si consta in oxidarea luciferinei de catre enzima
luciferaza, in prezenta oxigenului si a sarurilor de magneziu, cu emiterea de lumina (Fig 3)
[Griffiths, 2003]:
Fig. 3 Oxidarea luciferinei cu emitere de lumina
ATP reactioneaza cu complexul enzimatic luciferin-luciferaza, lumina emisa fiind
masurata cu ajutorul unui luminometru si exprimata in RLU (Relative Light Units). Cantitatea
de ATP este direct proportionala cu cantitatea de lumina emisa.
Domeniul de aplicare a detectiei ATP prin metoda masurarii bioluminiscentei este
destul de variat. Faptul ca ATP este prezent atat in microorganisme cat si in reziduurile de
produs alimentar este un dezavantaj in cazul in care aceasta tehnica se vrea aplicata la
determinarea incarcaturii microbiene a unor alimente, dar este un mare beneficiu atunci cand
tehnica este aplicata pentru a determina gradul de igienizare al suprafetelor din zona de
productie [Ramsay C., 2002].
Reziduurile de alimente contin o mare cantitate de ATP, fie in celule intacte fie sub
forma libera.
9
I.2. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin
bioluminiscenta la monitorizarea starii de igiena a
suprafetelor
1.2.1. Istoric
Tehnica ATP–bioluminiscenta este din ce in ce mai des folosita pentru masurarea
eficientei igienizarii suprafetelor si ustensilelor folosite. Daca procesul de igienizare nu a fost
eficient, suprafetele vor ramane contaminate cu reziduuri de produs sau microorganisme.
Prin metoda clasica (inoculare in agar) se poate detecta doar contaminarea microbiana
(se poate urmari numai eficienta dezinfectarii) a suprafetei de testat, dar nu se poate obtine nici
o informatie despre gradul de curatare (reziduuri de produs) .
Prin metoda ATP-bioluminiscenta, pe de alta parte, se pot detecta ambele surse de
ATP: microorganisme si /sau reziduuri de produs in doar cateva minute, fiind un indicator mult
mai real al gradului de igienizare.
Cateva studii au comparat rezultatele obtinute prin cele doua metode pentru evaluarea
starii de igiena a suprafetelor. Unele dintre ele au raportat corelatii bune intre metode [Seeger
si Griffiths. 1994; Kiriakides et al., 1991; Bautista et al. , 1992]. Altele au obtinut o slaba
corelatie intre cele doua metode [Griffiths et al., 1997; Carrick et al., 2001].
Cateva din discrepantele gasite pot fi explicate fie prin natura diferita a suprafetelor si a
contaminarii (prezenta sporilor, de exemplu), fie prin capacitatea diferita a tampoanelor
folosite de a colecta microorganismele. Viabilitatea redusa a bacteriilor in timpul uscarii poate
de asemenea sa aiba un impact major in ambele tehnici. Nu in ultimul rand, prezenta
detergentilor , dezinfectantilor sau altor chimicale pot sa interfere cu reactia de bioluminiscenta
[Velasquez, 1997] conducand la rezultate fals negative.
In ciuda acestor dificultati, tehnica ATP-bioluminiscenta a fost folosita cu succces ca
un pas initial in monitorizarea igienei, in special in planurile HACCP.
Cu toate ca kiturile ATP existente sunt suficiente pentru 90% din nevoile industriei
alimentelor (sensibilitate si acuratete satisfacatoare), in cazul unei fabrici de lactate este
nevoie se se detecteze nivele mici de contaminare bacteriana care pot sa fie inca prezente. In
acest caz, se foloseste un amestec de enzime pentru a amplifica nivelul redus de ATP
[Hawronski et al., 1994]. Reactivul de amplificare consta intr-o mixtura de luciferaza,
myokinaza si piruvat-kinaza care, impreuna cu substratele lor (luciferina, AMP si
fosfoenolpiruvat), amplifica, efectiv, tot AMP in ATP (Fig. 4):
10
Fig 4. Schema reactiei de amplificare pentru ATP
Timpul de reactie pentru a se obtine jumatate din maximum de semnal luminos este
direct proportional cu ATP si poate fi folosit ca indicator al curateniei.
O alta metoda a fost propusa de Sakakibara et al. [1999] . Detectia simultana a ATP,
AMP si RNA a fost realizata prin reactia de cuplare a piruvat ortofosfat dikinazei (PPDK) cu
luciferaza (Fig. 5):
Fig.5 Schema reactiei de determinare a bioluminiscentei pentru ATP si AMP.
Limita de detectie a metodei a crescut de aproape o suta de ori fata de metoda uzuala
care folosea ATP ca un index.
1.2.2.Principiul metodei
Indiferent de numele producatorului de luminometre si kitu-uri de analiza a ATP de
pe suprafete prin bioluminiscenta, principiul metodei este acelasi, fiind simplu si implicand
urmatoarele etape [Pater P. ,1994]:
11
- se recolteaza tampoane de sanitatie de pe suprafata de testat si orice
microorganism sau reziduu de produs care s-a recoltat este transferat intr-o eprubeta ce contine
un diluant sau un extractant;
- extractantul distruge peretii celulari ;
- ATP continut in celulele somatice sau microbiene, impreuna cu ATP liber din
reziduurile alimentare, este eliberat in solutie;
- detectia de ATP este realizata prin aditia de complex enzimatic
luciferin/luciferaza, care va conduce la producerea de lumina;
- cantitatea de lumina (exprimata in RLU) este cuantificata cu ajutorul unui
luminometru, fiind direct proportionala cu cantitatea de ATP din proba.
In tabelul 1 sunt cateva kit-uri de analiza a ATP prin bioluminiscenta si cateva
luminometre disponibile comercial.
Tabel 1.Luminometre şi kituri de detectie ATP prin bioluminescenţă
Producator Kit analiza Luminometru detector
Biotrace
LTD
Detergent
rece
Multi-Line Numerator de protoni-fotodioda
Lumac BV Detergent
rece
MI 500 Light fotomultiplicator
12
1.3. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta
la monitorizarea calitatii microbiologice a apei de proces in
industria lactatelor
1.3.1. Istoric
Apa potabila in industria lactatelor se foloseste in mai multe scopuri:
- materie prima in anumite produse ;
- la clatirea finala a tuturor instalatiilor, tancurilor , masinilor de ambalat, cisternelor cu
care se transporta laptele.
Deoarece laptele si produsele lactate reprezinta un mediu optim pentru inmultirea bacteriilor, o
contaminare extreme de mica a apei folosite in procesul tehnologic conduce la o contaminare
de proportii a produsului finit.
Avand in vedere acest lucru, starea de igiena a apei de proces este un punct critic de control
care se monitorizeaza cu mare atentie.
In acest caz, calitatea microbiologica a apei (igiena) trebuie analizata foarte atent si
repede, pentru a avea un raspuns rapid inainte de a o folosi ca si materie prima in productie
[Bagur E., 2009], sau ca si apa la clatirea finala a instalatiilor dupa dezinfectie.
Metoda standardizata de analiza a NTG din apa (EN ISO 6222), cu inoculare in agar,
presupune urmatoarele etape (Fig. 6):
- 1 ml apa de analizat se inoculeaza in mediu nutritiv;
- incubarea probei la temperature specifica metodei, 72 h;
- enumerarea coloniilor;
- exprimarea rezultatului in nr. cfu/ml.
Deoarece limita de detectie este de 1 cfu/ml, s-a imbunatatit aceasta metoda
introducandu-se metoda filtrarii pe membrane (Fig. 6) [SARTORIUS, Controlul microbiologic
al produselor farmaceutice], care consta in urmatoarele etape:
- 100 ml de apa se filtreaza aseptic printr-un filtru cu dimensiunea porilor de
0.45 μm, care va retine toate microorganismele prezente in proba;
- filtrul se transfera aseptic intr-o placa Petri in care se afla fie mediu nutritiv
solidificat (Fig.6) fie un cartonas impregnat cu mediu nutritiv (Fig 7) [SARTORIUS, Controlul
microbiologic al produselor farmaceutice];
- incubarea probei la temperature specifica metodei, timp de 72 h;
- dupa expirarea timpului de incubare se numara coloniile formate si se
raporteaza rezultatul in nr. cfu/100ml .
14
In cazul in care se utilizeaza cartonase impregnate cu mediu , se procedeaza ca mai jos (fig. 7):
Fig. 7 Indicatii de lucru –cartonase impregnate cu mediu nutritive (CMN)
15
In fig. 8 [SARTORIUS, Controlul microbiologic al produselor farmaceutice] sunt
cateva exemple de placi inoculate cu apa potabila, pe care au crescut diverse microorganisme :
Fig.8. NTG - Exemple de placi dupa incubare
Prin aceasta imbunatatire limita de detectie a ajuns de la 1 cfu/ml la 0.01 cfu/ml. Cu
toate ca limita de detectie a fost imbunatatita de 100 de ori, timpul de obtinere a rezultatelor a
ramas acelasi .Intarzierea in obtinerea rezultatelor poate conduce la imposibilitatea de a mai lua
actiuni corective, apa respectiva fiind deja introdusa in produs la momentul obtinerii
rezultatelor.
Astfel, s-a impus de la sine gasirea unei noi metode de analiza a calitatii microbiologice
a apei, cu ajutorul careia sa se obtina rezultate rapide care sa permita luarea unei decizii in ceea
ce priveste utilizarea sau neutilizarea apei ca materie prima, la un lot nou de produs .
ATP/bioluminiscenta incepe sa devina o alternative foarte rapida (<5 min.) pentru
detectia bacteriilor in apa de baut in comparative cu metoda conventionala care dureaza 3 zile
[Deininger et al., 2001].
Ceresa L. ET AL., [2006], descrie un sistem de detectie ATP in apa, Pallchek Rapid
Microbiology System, cu ajutorul caruia este analizata apa de proces, rezultatele exprimandu-
se absent/present.
Acelasi sistem de analiza a apei, dar cu imbunatatiri, este descris si de Bagur E. [2009].
1.3.2. Principiul metodei.
Sistemul Pallachek [Bagur E., 2009] ( Fig. 9 ) consta intr-un luminometru portabil si un
set de reactivi :
- un extractant, care va extrage ATP-ul intracelular al fiecarei celule microbiene
prezente in proba;
16
- substratul luciferin/luciferaza care, in reactia cu ATP va genera o cantitate de
lumina direct proportionala cu cantitatea de ATP .
Fig. 9 Sistemul Pallachek Rapid Microbiology
Cu ajutorul sistemului de mai sus se poate detecta ATP-ul prin bioluminiscenta in doua
moduri: direct si indirect.
Metoda directa are o limita de detectie de 1000cfu/proba [Bagur E., 2009]. Acest lucru
o face aplicabila probelor la care se stie din istoric ca nivelul de contaminare depaseste aceasta
limita. Timpul de analiza este de 1 minut dupa ce proba a fost filtrata.
Etapele de lucru in cazul metodei directe sunt redate schematic in fig. 10 [Bagur E.,
2009], si constau in:
- filtrarea unui anumit volum de apa, in functie de clasa de puritate estimata a
probei (vezi Tabelul 2);
- masurarea imediata a ATP/bioluminiscenta;
- interpretarea datelor obtinute conform tabelului 2.
Fig. 10 Metoda directa de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru
17
Avantajele metodei directe sunt timpul scurt de raspuns (aprox. 30 min) si simplitatea.
Rapiditatea cu care se obtine rezultatul ofera posibilitatea identificarii rapide a unui rezultat in
afara limitelor si aplicarea imediata a unor actiuni corective .
+ = valoarea RLU> 1000cfu/ volum proba filtrata;
- = valoarea RLU< 1000cfu/ volum proba filtrata
Tabel 2 Metoda directa: interpretarea datelor
Cel mai important dezavantaj il reprezinta sensibilitatea metodei, limitand aplicarea sa
la probele cu un nivel relativ ridicat al contaminarii (>1000cfu/proba) [Bagur E., 2009].
Pentru apa de process, folosita in industria lactatelor, limita interna stabilita in marea
majoritate a fabricilor de lactate, este de <1cfu /100ml (aceasta fiind limita de detectie a
metodei ISO-metoda cu filtrare).
Pentru acest caz, se poate folosi metoda indirecta. Este tot o metoda calitativa
(absent/present), in cadrul careia ATP este masurat dupa o preimbogatire a probei. Dupa
filtrarea probei , membrana este incubată peste noapte in mediu nutritiv lichid, pentru a obtine
o crestere microbiana si, in consecinta, o amplificare a semnalului bioluminescent obtinut.
Etapele de lucru sunt urmatoarele (Fig. 11) [Bagur E., 2009]:
- proba de apa este diluata astfel incat sa se obtina 100 ml din dilutiile 1/10 si
1/100;
- 100 ml proba ca atare precum si ambele dilutii sunt apoi filtrate ;
- cele 3 membranele sunt transferate aseptic in cate 10 ml mediu nutritiv lichid
si incubate 24 h;
- se filtreaza 8 ml mediu din fiecare proba si se masoara valoarea ATP ca si la
metoda directa.
Volum proba filtrata Clasa 1 Clasa 2 Clasa 3 Clasa 4
1000 ml - + + +
100 ml - - + +
10 ml - - - +
Nivel estimat de
contaminare
<1 cfu/ml <10 cfu/ml <100 cfu/ml <1000
cfu/ml
18
Fig. 11 Metoda indirecta de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru
Tabelul 3 [Bagur E., 2009] centralizeaza posibilele limite de detectie pentru aceasta
metoda.
Tabel 3. Metoda indirecta de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: interpretarea
datelor
+ = valoarea RLU> 1cfu/ volum proba filtrata;
- = valoarea RLU< 1cfu/ volum proba filtrata
Avantajul acestei metode este ca rezultatul este obtinut intr-un timp mai scurt decat prin
metoda clasica.
Aplicarea metodei ATP /bioluminiscenta in analiza probelor de apa intr-o fabrica de
lactate permite aplicarea rapida a unor actiuni corrective , ca [Bagur E., 2009]:
- repetarea recoltarii probelor si reanalizarea lor atunci cand limitele sunt
depasite;
- infirmarea sau confirmarea rapida a unui rezultat in afara limitelor;
- alertarea rapida a departamentului de productie pentru a nu folosi apa cu limite
depasite si pentru a trece la actiuni corective ;
- analiza rapida a probelor de apa dupa ce s-au aplicat actiunile corective de
remediere a neconformitatii (limite depasite).
Volum proba Clasa 1 Clasa 2 Clasa 3 Clasa 4
1 - + + +
1/10 - - + +
1/100 - - - +
Nivel estimat de
contaminare
<1 cfu/100ml 1-10
cfu/100ml
10-100
cfu/100ml
100-1000
cfu/100ml
19
1.4. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta
la monitorizarea igienei laptelui
1.4.1. Istoric
Industria lactatelor, ca si alte sectoare ale industriei alimentare, a cautat sa dezvolte
metode mai rapide pentru controlul calitatii microbiologice a materiei prime principale, laptele,
precum si a produselor lactate.
Conform legislatiei (Ordinul MAPAM 1106/2003), incepand cu 1 ianuarie 2009, NTG
pentru laptele crud trebuie sa fie <100 000 cfu/ml. Deci, metoda de analiza aleasa trebuie sa
aiba o limita de detectie cel putin egala cu aceasta valoare.
Metoda standardizata de analiza a NTG din lapte crud (SR EN ISO 4833-2003) are
limita de detectie de 1cfu/ml si presupune urmatoarele etape de lucru:
- prepararea de dilutii zecimale ( 1/10, 1/100, 1/1000);
- inocularea a cate 1 ml din fiecare dilutie in placi Petri cu mediu nutritiv;
- incubarea placilor la 30°C, timp de 72h;
- enumerarea coloniilor pe placa si exprimarea rezultatelor in nr. cfu/ml.
Dezavantajul major al acestei metode il reprezinta timpul mare de obtinere a
rezultatelor (72 h), fapt ce face imposibil controlul microbiologic al laptelui materie prima
inainte de a fi descarcat din cisterna. Cu aceasta metoda nu se poate face decat o monitorizare
bazata pe istoric.
Prima descriere a unei metode rapide de detectie ATP in lapte contaminat cu bacterii a
fost facuta de catre Sharpe et al., in 1970. Dezavantajul acestei metode il constituie limita de
detectie de 1x106cfu/ml , cu mult peste limita impusa de legislatia actuala.
Cel mai important factor care influenteaza limita de detectie a acestei metode o
reprezinta ATP nonbacterial din lapte. ATP-ul nonbacterial din lapte provine din 2 surse: ATP
nativ secretat in timpul lactatiei si ATP din celule somatice.
Procedurile recente de detectie ATP bacterian din lapte crud prin bioluminiscenta au
limita de detectie de 1x104 iar timpul de analiza este de 5-10 min [Dostalek et al., 2005].
1.4.2. Principiul metodei
Diferite studii descriu metode de determinare a gradului de contaminare micobiana a
laptelui crud prin tehnica detectiei ATP pe baza bioluminiscentei [Bautista et al, 1992;
Griffiths, 1991; Samkutty et al., 2001]. Principalele etape de lucru in cazul acestor metode
sunt:
20
- incubarea probei de lapte cu un agent de lizare a celulelor somatice, pentru a
elibera ATP din acestea;
- filtrarea probei pe o membrana care va retine microorganismele; in acest mod
se elimina ATP –ul nonbacterial provenit din ambele surse;
- lizarea microorganismelor retinute pe filtru pentru eliberarea ATP microbial;
- analiza ATP prin bioluminiscenta.
Acuratetea acestei metode este destul de redusă (0,2-0,87 log UNITS) [Griffith M W,
2003].
Pentru imbunatatirea acuratetii metodei, se poate introduce o etapa de preincubare a
probei la 15,60C, timp de 18 ore [Samkutty ey al., 2001]. Acest lucru a dus la cresterea
coeficientului de regresie liniara a detectiei ATP comparativ cu metoda standard de la 0,58 la
0,80.
O alta abordare este aceea de a folosi un reactiv de „concentrare”,Enliten, care
„clarifica” laptele , microorganismele fiind apoi separate prin centrifugare. Combinarea acestui
tratament cu detectia ATP/bioluminiscenta a condus la scaderea limitei de detectie la
104cfu/ml, analiza putandu-se efectua in 6-7 min. [Pahuski et al., 1991].
Introducerea unei etape de preincubare inainte de analiza ATP a condus la largirea
ariei de aplicare a metodei si la laptele pasteurizat, UHT, ESL sau sterilizat.[Griffiths M W,
1993].
21
Partea a II-a
CERCETĂRI PERSONALE
Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP /
bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a suprafetelor din
spatiul de productie intr-o fabrica de lactate
22
II.1.Scopul lucrarii
Cercetările proprii au avut ca obiective prezentarea unei metode de detectia a ATP de
pe suprafete care vin in contact direct cu produsul si un studiu comparativ intre rezultatele
obtinute prin metoda microbiologica clasica si metoda de detectie ATP prin bioluminiscenta,
pe probe recoltate de pe suprafete din fluxul de productie al unei fabrici de produse lactate,
inainte si dupa efectuarea procedurilor de sanitizare.
23
II.2. Material si metoda
In cursul lucrarilor practice am folosit un aparat UNI-LITE® NG (producator
BIOTRACE) si teste "CLEAN-TRACE –surface ATP", "CLEAN –TRACE-water –Total
ATP" si "CLEAN –TRACE-water –FREE ATP" ( producator 3M).
Tehnica de detectie ATP prin bioluminiscenta s-a folosit in paralel cu metoda
standardizata de determinare a NTG, la evaluarea procedurilor de curatenie si dezinfectie a
unor suprafete din fluxul tehnologic de fabricatie al produselor lactate, in cadrul unei fabrici
de produse lactate din judetul Ilfov.
2.1.Suprafete testate.
S-au recoltat probe de pe mai multe suprafete care vin in contact direct cu produsul, de
pe fluxul tehnologic de productie al laptelui de consum , pasteurizat la temperatura inalta: tanc
lapte crud, tanc lapte degresat, tanc smantana, tanc standardizare, tanc aseptic de umplere, linia
aseptica de ambalare, cuva umplere masina ambalare, capete de dozare masina de ambalare.
Diagrama de flux a acestui produs este redata in fig. 12.
Fig. 12. Diagrama de flux lapte de consum
24
Probele s-au recoltat inainte si dupa aplicarea unor proceduri diferite de igiena.
2.2. Proceduri de igienizare .
Intregul proces de spalare si dezinfectie a instalatiilor din fluxul tehnologic este
automat, fiind cuprins intr-un sistem CIP (Clean –in –place). Sistemul CIP este constituit din
tancuri care contin solutii de detergenti, acizi, dezinfectanti si apa de clatire de la care solutiile
respective sunt conduse cu ajutorul unor pompe prin toate instalatiile din fluxul tehnologic,
fara ca acestea sa fie deschise.
Ciclul unei igienizari complete cuprinde urmatoarele etape:
1. indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de
aproximativ 40oC, timp de 2 minute;
2. spalarea instalatiilor cu solutie NaOH (soda caustica), 1%, incalzita la o
temperatura de 70oC, timp de 25 minute;
3. clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica ;
4. dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;
In cadrul acestui experiment, s-au aplicat atat cicluri complete de igienizare cat si
cicluri incomplete, pentru a se observa eficienta igienizari, pentru fiecare procedura in parte.
Planul de experiment in ceea ce priveste procedurile de igiena aplicate a fost urmatorul:
Procedura A:
- indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de
aproximativ 40oC, timp de 2 minute;
Procedura B:
- indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de
aproximativ 40oC, timp de 2 minute;
- dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;
Procedura C, ciclul complet.
Procedurile de igienizare A-C s-au aplicat in zile diferite, pe parcursul a 4 luni.
2.3. Plan de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza ATP
prin bioluminiscenta.
Probele s-au recoltat inainte si dupa fiecare procedura A-C, conform planului de
recoltare si analiza din tabelul 4.
25
Tabel 4: Plan de recoltare si analize probe
Nr.
crt
Locul
recoltarii
Procedura
de igienizare aplicata
Procedura A
Procedura B
Procedura C
1
tanc lapte crud
Ziua
1
*inainte **1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
**1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
*dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
2
tanc
standardizare
Ziua
1
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
3
tanc aseptic de
umplere
Ziua
1
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
4
linia aseptica de
ambalare
Ziua
1
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
5
cuva umplere
masina ambalare
Ziua
1
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
6
Capete de
dozare masina
ambalat
Ziua
1
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
Ziua
2
inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG
1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP
*inainte: inainte de aplicarea procedurii de igienizare respective / dupa: dupa aplicarea procedurii de igienizare respective
** 1 pb. NTG: 1 proba recoltata pentreu analiza NTG / 1pb. ATP: 1 proba recoltata pentru analiza ATP.
In total, s-au recoltat 144 de probe, din care 72 pentru analiza microbiologica NTG
(36 de probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate
dupa aplicare procedurilor de igienizare) si 72 pentru analiza ATP/bioluminiscenta (36 de
probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate dupa
aplicare procedurilor de igienizare).
26
2.4. Proceduri de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza
ATP prin bioluminiscenta.
Probele pentru analiza ATP/bioluminiscenta s-au recoltat cu ajutorul unor teste 3M™ Clean-
Trace™ Surface ATP, pentru ATP de pe suprafete (producator 3M) (Fig. 13).
Testul 3M™ Clean-Trace™ Surface ATP
reprezinta un dispozitiv de unica folosinta
ce contine un tampon pentru colectarea
unei probe de pe o suprafata ( Instructiuni
de utilizare de la producator, pentru Test
3M™ Clean-Trace™ Surface ATP).
Tamponul este pre-umezit cu un agent
cationit care faciliteaza recoltarea probei de
pe suprafata.
Fig. 13 Test Clean-Trace™
Metoda de recoltare este cea specificata in instructiunile de utilizare de la producator si consta
in urmatoarele etape:
-se lasa testele Clean Trace la temperatura camerei pentru cel putin 10 min inainte de
utilizarea lor;
-imediat inainte de utilizare se scoate tamponul de sanitatie din eprubeta testului si se
tamponeaza o suprafata de testat de 10x10 cm , urmand aceleasi reguli ca si in cazul metodei
de recoltare pentru analiza microbiologica;
-se reintroduce tamponul in eprubeta testului , cu manerul inserat in pozitia originala a
dispozitivului neutilizat.
Fig. 14 Luminometru 3M™ Clean-Trace™
27
Probele astfel recoltate s-au analizat imediat, la locul de recoltare , folosind un
luminometru portabil, 3M™ Clean-Trace™ NG Luminometer, producator 3M ( fig. 14), astfel:
Pentru analiza microbiologica, recoltarea probelor s-a executat folosind tampoane de
sanitatie sterile, in tuburi cu capac, sterile (swab tube, Greiner Biotrace , cat no.420161, fig.
15).
Fig. 15 Tampoane
de sanitatie Greiner
Metoda de recoltare este conform SR ISO 18593:2007 si consta in urmatoarele etape:
- se umecteaza vata din varful tamponului prin imersare in eprubeta in care s-au
introdus in prealabil 10 ml solutie de neutralizare sterila;
- se preseaza varful tamponului pe peretii eprubetei pentru a indeparta excesul de lichid;
- se pune varful tamponului pe suprafata de investigat si si se plimba pe o arie de
aproximativ 100cm2, in timp ce se roteste tamponul intre degetul mare si aratator, in doua
directii in unghi drept una fata de cealalta;
- se introduce tamponul in eprubeta cu solutie de neutralizare si se agita pe vortex
10sec ; aceasta reprezinta suspensia initiala ( 10ml).
Probele au fost analizate in maxim 30 min de la recoltare, conform metodei specificate
in SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda
orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC
2.5. Modul de lucru
2.5.1. Analiza ATP prin bioluminiscenta.
Se porneste luminometrul cu 1-2 minute inainte de analiza, pentru a intra in regim de
functionare.
Dispozitivul de unica folosinta in care s-a introdus tamponul dupa recoltare contine la
baza sa reactivul combinat luciferin/luciferaza , sigilat cu o folie penetrabila.
28
Se apasa tamponul pana la baza
dispozitivului, penetrand folia protectoare
iar ATP –ul colectat cu ajutorul tamponului
va reactiona cu reactivul (fig. 16).
Fig. 16
Dupa activare, testul se agita rapid
(5 secunde), ca in fig. 16, dupa care se
introduce imediat in aparat (fig. 14) si se
citeste rezultatul afisat pe ecranul
aparatului, exprimat in RLU (fig. 17)
Fig. 17
La recomandarea producatorului, s-au respectat urmatoarele reguli de utilizare:
- dispozitivul de testare s-a tinut in pozitie verticala in momentul activarii, agitarea
realizndu-se dintr-o parte in alta, nu mai mult de 5 secunde , citirea efectuandu-se imediat;
- nu se agita dispozitivul in nici o alta pozitie decat cea indicata mai sus;
- activarea dispozitivelor s-a realizat pe rand, unul cate unul, imediat inainte de analiza;
- luminometrul s-a tinut in pozitie verticala in momentul in care s-au realizat
determinarile de luminiscenta;
- la finalul analizelor, se verifica sa nu ramana un dispozitiv in camera de citire a
luminometrului.
2.5..2. Analiza NTG (Numar Total de Germeni)
Analiza NTG s-a realizat conform. SR EN ISO 4833-2003.
S-au inoculat cate 2 placi Petri/proba cu cate 1 ml din suspensia initiala obtinuta
conform punctului 1.3.
S-a folosit mediu de cultura PCA ( plate count agar) cu urmatoarea compozitie:
29
Extract de drojdii 2,5 g
Digest pancreatic de caseina 5,0 g
Glucoza 1,0 g
Agar 15,0 g
Apa distilata 1000 ml
S-a verificat pH-ul si s-a ajustat , astfel incat dupa sterilizare acesta sa aiba valoarea
7,0±0,2 la 25ºC. Mediul astfel preparat se sterilizeaza in autoclav la 121ºC timp de 15 minute.
Flacoanele cu mediu se racesc pe baia de apa la 45±1ºC, aceasta fiind temperatura de lucru.
Placile s-au incubat la 370C, timp de 72h.
S-au ales placile care contin mai putin de 300 colonii si s-au numarat aceste colonii.
Exprimarea rezultatelor s-a realizat astfel:
- pentru placile care, dupa incubare, nu contin nici o colonie: <1 cfu/10cm2
- pentru placile care, dupa incubare, contin mai putin de 300 colonii calcularea
numarului de cfu/10cm2 ( N) se realizeaza folosind urmatoarea formula:
C x V
N= x D= C
A
unde:
C - este numarul de colonii pe 1ml lichid de dilutie=10cm2 (pe placa), egal cu media aritmetica
a valorilor celor doua placi utilizate;
V - este volumul de apa deionizata din eprubeta, in ml (=10ml);
A - suprafata investigata (aprox. 100cm2), in cm
2;
D - inversul factorului de dilutie ( D=101=10)
30
II.3. Rezultate si discutii.
Probele recoltate s-au analizat atat pentru NTG cat si pentru ATP. Rezultatele obtinute
sunt cuprinse in tabelele 5,6 si 7, de mai jos.
Limitele admise pentru fiecare loc de recoltare sunt stabilite intern, de catre echipa
HACCP a fabricii de lactate, in functie de diferite criterii dintre care cel mai important este
gradul de pericol pentru siguranta alimentara si legislatia in domeniu.
In cazul analizei ATP, limita admisa de 10 URL a fost stabilita prin testari repetate ale
unei suprafete din inox care a fost igienizata si dezinfectata in laborator, aceasta valoare fiind
considerata limita de detectie ATP. Toate rezultatele ≤10 URL sunt considerate negative.
Pentru analiza ATP nu exista limite maxim admise legiferate.
In cazul analizelor NTG, limitele admise pentru tancul de lapte crud si pentru tancul de
standardizare s-au stabilit intern iar pentru celelalte puncte de recoltare s-au preluat limitele din
legislatie [Ordin MS 976/1998].
Asa cum se poate observa in toate cele trei tabele, toate rezultatele analizelor probelor
recoltate inainte de a se aplica orice procedura de igienizare sunt in afara limitelor admise, atat
in cazul analizelor NTG cat si in cazul analizelor ATP. Acest lucru demonstreaza faptul ca, in
100% din cazuri, acolo unde a existat contaminare microbiana am avut si rezultat ATP pozitiv
(>10URL), datorat atat incarcaturii microbiene cat si reziduurilor de produs lactat care contine
si ATP non-bacterian. In cazul punctelor de recoltare 3-6, fiind vorba despre suprafete care in
timpul procesului de productie trebuie sa fie aseptice, valorile NTG inainte de aplicarea unei
proceduri de igienizare depasesc cu putin limita admisa in timp ce valorile ATP sunt
comparabile cu cele de la punctele de recoltare 1 (lapte crud) si 2 (lapte caruia i s-a aplicat o
pasteurizare joasa). Obtinerea unor valori mari pentru ATP si mici pentru NTG in acest caz ca
se datoreaza faptului ca pe suprafetele respective exista o cantitate mare de produs lactat
pasteurizat ramas de la lotul precedent (care contine ATP non-bacterian) dar o incarcatura
microbiana mica.
In cazul aplicarii procedurii de igienizare A (spalare 2 min. cu apa la 400C), chiar daca
valorile NTG si ATP au scazut (tabel 15), nu s-au plasat in limitele admise. Acest lucru
demonstreaza ca aceasta procedura nu este eficienta nici pentru a indeparta contaminarea
microbiana nici in cazul indepertarii urmelor de produs lactat.
31
Procedura B de igienizare a constat in prespalare cu apa la temperatura de aproximativ
40oC, timp de 2 minute, urmata de dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm.
Valorile rezultatelor analizelor NTG au scazut simtitor in comparatie cu procedura A,
unele dintre ele fiind in limitele admise (puncte de recoltare 2-6) altele nu (punct de recoltare
1) (tabel 16). Acest lucru demonstreaza ca aceasta procedura nu este 100% eficienta in
combaterea contaminarii microbiene.
In cazul analizelor ATP toate valorile obtinute au fost in afara limitelor admise, chiar
daca , pe acelasi punct de recoltare, prin analiza NTG s-au obtinut valori in limitele admise
(tabel 16, pct. 3 si 5 de recoltare). Aceste rezultate se pot explica prin absenta bacteriilor
viabile pe suprafetele respective ( efect datorat cel mai probabil dezinfectantului) si prezenta
de reziduuri de produs lactat steril (care contin ATP nonmicrobian). Deci, chiar daca
dezinfectia a fost eficienta in unele cazuri, indepartarea tuturor resturilor de prodius lactat nu s-
a realizat pentru nici un punct de recoltare, acestea putand deveni suport de crestere pentru o
eventuala post-contaminare microbiana
In tabelul 17 sunt prezentate valorile obtinute in cazul aplicarii procedurii de igienizare
C, in cursul careia au fost parcurse urmatoarele etape:
- indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de
aproximativ 40oC, timp de 2 minute;
- spalarea instalatiilor cu solutie NaOH, solutie de concentratie 1%, incalzita la o
temperatura de 70oC, timp de 25 minute;
- clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica;
- dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;
Toate valorile obtinute, atat pentru NTG cat si pentru ATP s-au incadrat in limitele admise in
proportie de 100%., demonstrand eficienta procedurii de igienizare atat in indepartarea
resturilor de produs lactat cat si la dezinfectie.
32
Tabel l 5: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare A
PROCEDURA A
Nr. punct
de recoltare
Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de
aplicarea procedurii
Rezultate probe recoltate dupa
aplicarea procedurii
NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU) NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU)
1
tanc lapte crud (limite
admise:
NTG<10cfu/cm2; ATP≤20RLU)
>300(foto 1) 8623 >300 3562
>300 5593( vezi foto15) >300 2698
2
tanc standardizare
(limite admise: NTG<10cfu/cm2;
ATP≤20RLU)
254 8002 39 (vezi foto 7) 845
148 (vezi foto 6) 3596 37 (vezi foto 8) 821 (vezi foto 13)
3
tanc aseptic de umplere
(limite admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
9 (vezi foto 5) 8236 3 659
5 2563 2 767 (vezi foto 14)
4
linie aseptica de
ambalare (limite admise: NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
6 8056 2 659
10 6658 5 776
5
cuva umplere masina
ambalat (limite admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
10 3698 4 356
14 8065 6 822 (vezi foto 17)
6
capete de dozare masina
ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
5 3911 2 299
11 8220 4 698
33
Tabel 6: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare B
PROCEDURA B
Nr. punct de recoltare
Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de aplicarea
procedurii
Rezultate probe recoltate dupa aplicarea
procedurii
NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU) NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU)
1
tanc lapte crud (limite admise:
NTG<10cfu/cm2; ATP≤20RLU)
>300 6694 39 1654
>300 4023 ( vezi foto16) 48 1123
2
tanc standardizare
(limite admise: NTG<10cfu/cm2;
ATP≤20RLU)
165 ( vezi foto4) 7694 14 423
236 5110 8 256
3
tanc aseptic de
umplere (limite admise:
NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
2 2658 <1 59
6 5698 <1(vezi foto 2) 59 (vezi foto 12)
4
linie aseptica de
ambalare (limite
admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
2 6894 1 125
3 4986 <1 67
5
cuva umplere masina
ambalat (limite admise:
NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
4 8214 <1 136
2 9123 <1 110
6
capete de dozare
masina ambalat
(limite admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
10 6524 2 98
2 7499 <1 69
34
Tabel 7: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare C
PROCEDURA C
Nr. punct de recoltare
Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de
aplicarea procedurii
Rezultate probe recoltate dupa aplicarea
procedurii
NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU) NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU)
1 tanc lapte crud (limite
admise: NTG<10cfu/cm2;
ATP≤20RLU)
>300 9658 <1 10
>300 6532 <1 10 (vezi foto 9)
2 tanc standardizare (limite
admise: NTG<10cfu/cm2;
ATP≤20RLU)
200 5648 <1 6
166 6894 <1 7 (vezi foto 10)
3
tanc aseptic de umplere
(limite admise: NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
5 5656 <1 10
11 7546 <1 5
4
linie aseptica de ambalare
(limite admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
4 6568 <1 10
10 6689 <1 10
5
cuva umplere masina
ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2;
ATP≤10RLU)
7 3945 <1 9
12 5055 <1 9
6
capete de dozare masina
ambalat (limite admise:
NTG<1cfu/cm2; ATP≤10RLU)
3 5565 <1 8
9 8496 <1 10
Tabel 8. Rezultate obţinute la tratamentul suprafeţelor
Nr. crt. Tratamentul
suprafetelor testate numar probe
NTG ATP
rez. in limite rez. peste limite rez. in limite rez. peste limite
1 fara igienizare 36 0 36 0 36
2 procedura A 12 0 12 0 12
3 procedura B 12 7 5 0 12
4 procedura C 12 12 0 12 0
35
II.4. Concluzii.
1. In cazul probelor recoltate inainte de aplicarea celor trei proceduri de igienizare
testate precum si in cazul probelor recoltate dupa aplicarea procedurii de igienizare
A, exista o corelatie de 100% intre analizele NTG si analizele ATP. Rezultatele
NTG se explica prin prezenta incarcaturii microbiene pe suprafetele testate, iar
valorile foarte mari ale ATP se datoreaza prezentei reziduurilor de produs lactat in
cantitati relativ mari si incarcaturii microbiene (ATP nonmicrobian si ATP
microbian).
2. In cazul aplicarii procedurii de igienizare B, din totalul de 12 probe analizate 7 au
avut rezultate NTG negativ in timp ce rezultatul ATP a fost pozitiv. Acest lucru
demonstreaza ca pe aceste suprafete nu mai exista incarcatura microbiana (NTG
negativ), dar există totusi urme de produs lactat steril, purtator de ATP
nonmicrobial (ATP pozitiv). Analizele de ATP pozitive in cele 7 cazuri si NTG
negativ indica faptul ca procedura B este eficienta in cazul contaminarii microbiene
dar nu si in cazul reziduurilor de produs lactat.
3. La aplicarea procedurii C toate rezultatele pentru NTG si ATP sunt in limitele
admise, fapt ce dovedeste ca aceasta procedura este eficienta pentru ambele
scopuri: indepartarea urmelor de produs si a contaminarii microbiene. Rezultatele
analizelor NTG si ATP au fost în corelaţie de 100%.
4. Testul NTG a fost util la aprecierea dacă suprafata testata are sau nu contaminare
microbiana, dar nu a dat nici un indiciu despre prezenta reziduurilor de produs
lactat steril, care poate deveni sursa de hrana pentru o eventuala contaminare
minora a acelei suprafete.
5. Testul ATP a permis atat detectarea contaminarii microbiene, cat si a prezentei
reziduurilor de produs lactat pe aceste suprafete. Aceste rezultate, alături de
rapiditatea obtinerii rezultatelor, fac din testul ATP un instrument valoros in cadrul
planurilor HACCP din industria lactatelor.
36
Bibliografie
1. Bagur E. (2009), Concurent evaluation of both compendial and rapid method (ATP
bioluminescence) for monitoring water quality, European Pharmaceutical Review, Issue 3.
2. Bautista DA, McIntyre L, Laleye L, and Griffiths MW (1992), The application of ATP
bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene, J. Rapid 091
Methods Automat. Microbiol. 1, 179–93
3. Carrick K, BarneyM, Navarro A, and Ryder D (2001), The comparison of four
bioluminometers and their swab kits for instant hygiene monitoring and detection of
microorganisms in brewery, J. Inst. Brewing 107(1), 31–7.
4. Ceresa L., Ball P.(2006).Using ATP bioluminescence for microbiological measurements in
pharmaceutical manufactutring. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods, Volume
II, 233-250
5. Day, J. C. (2009). Bioluminescent beetles. http://www.bioluminescentbeetles.com (Accesat
14.06.2010)
6. Deininger RA , Lee J (2001), Rapid determination of bacteria in drinking water using
ATP assay , Field analytical chemistry and technology 5(4), 185–9.
7. Dostalek P., Branyik T. (2005) Prospects for rapid bioluminescent detection methods in the
food industry. Czech J. Food Sci, vol 23, no.3: 85-92
8. Griffiths CJ, Davidson CA, Peters AC, and Fielding LM (1997), Towards a strategic
cleaning assessment programme: hygiene monitoring and ATP luminometry, an options
appraisal , Food Sci Technol Today 11, 15–24
9. Griffiths M W (1991), Rapid estimation of microbial numbers in dairy products using ATP
technology.
10. Griffiths M.W, Brovko L. (2003). ATP bioluminescence.
http://www.crcnetbase.com/doi/pdf/ 10.1201/9780203485712.ch8
11. Hawronsky JM, Chittock RS, Wharton CW, and Holah J T (1994), Low level bacterial
contamination measured using a novel Bioluminescent assay’, in Bioluminescence and
Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects, eds. AK Campbell, L J Kricka
and P E Stanley, Chichester, John Wiley & Sons, pp. 411–14.
12. Kyriakides A. L., Costello SM, Easter MC, and Johnson I (1991), ‘Rapid hygiene
monitoring using ATP bioluminescence’, in Bioluminescence and Chemiluminescence:
Current Status, eds. P E Stanley and L J Kricka, Chichester John Wiley & Sons, pp. 519–
22.
37
13. Lynch T. (1999), Bioluminescence in Fireflies. The luciferase-luciferin reaction in
Photinus pyralis. http://www.byteland.org/naturalist/dubois.htm (Accesat 14.10.2010)
14. Martin E., (2003). Hygiene monitoring in support of food safety. Society for food hygiene
technology, UK.
15. Murphy, S.C.; Kozlowski, S.M.; Blander, D.K.; Bandler, D.K.; Boor, K.J. Evaluation of
adenosine triphosphate-bioluminescence hygiene monitoring for trouble-shooting fluid
milk shelf-life problems. J. Food Sci., 81, 817-820, 1998
16. Pater P. (1994) .Rapid analysis techniques in food microbiology .Blackie Academic &
Professional, Westwr Cleddens Road, Bishopbrigges, Glasgow, G64 2NZ, UK.
17. Ramsay C. An overview of rapid hygiene testing using ATP bioluminescence (2002)
http://users.metropolia.fi/~karisv/Nanopinta/ATP-1.pdf
18. Raugel P J (1999).Rapid food analysis and hygiene monitoring. Kits, instruments and
systems.
19. Sakakibara T, Murakami S, Eisaki N, Najajiama M, and Imai K (1999), An enzymatic
cycling method using pyruvate orthophosphate dikinase and firefly luciferase for the
simultaneous determination of ATP and AMP (RNA), Anal. Biochem. 268(1), 94–101.
20. Samkutti P J, Gough RH, Adkinson RW, and McGrew P (2001), ‘Rapid assessment of the
bacteriological quality of raw milk using ATP bioluminescence’, J Food Protec. 64(2),
208–212.
21. Seeger K, and Griffiths M. W. (1994), ATP bioluminescence for hygiene monitoring in
health care institutions, J. Food Protect. 57, 509–12
22. Velasquez M and Feirtag (1997), Quenching and enhancement effects of ATP extractants,
cleansers, and sanitizers on the detection of the ATP bioluminescent signal, J. Food Protec.
60(7), 799–803.
23. ****SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor.Metoda
orizontala pentru enumerarea microorganismelor. Tehnica de numarare a coloniilor la 30
grade C.
24. ***Ordin al Ministrului Sanatatii nr. 976 din 16 decembrie 1998 pentru aprabarea
Normelor de igiena privind productia, prelucrarea, depozitarea, pastrarea, transportul si
desfacerea alimentelor
25. ***Ordinul MAPAM 1106/2003 privind aprobarea Programului de actiuni pentru
îmbunatatirea calitatii si salubritatii laptelui materie prima
26. ***Quick Start Guide UNI-Lite®NG –Biotrace
27. ***SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda
orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC
38
28. ***SR ISO 18593:2007. Microbiologia alimentelor si nutreturilor. Metode orizontale
privind tehnicile de esantionare de pe suprafete folosind placi de contact si tampoane
29. ***User Guide for the 3M™ Clean-Trace™ rapid hygiene monitoring system.
39
ANEXA
Foto 1: Placa Petri
analiza NTG pct.
recoltare 1, fara
igienizare
Foto 2 : Placa
Petri analiza
NTG pct.
recoltare 3,
procedura B
40
Foto 3: Placa
Petri analiza
NTG pct.
recoltare 6, fara
igienizare
Foto 4 : Placa
Petri analiza
NTG pct.
recoltare 2, fara
igienizare
41
Foto 5: Placa Petri
analiza NTG pct.
recoltare 3, fara
igienizare
Foto 6 : Placa Petri
analiza NTG pct.
recoltare 2, fara
igienizare
42
Foto 7: Placa Petri
analiza NTG pct.
recoltare 2,
procedura A
Foto 8: Placa Petri
analiza NTG pct.
recoltare 2,
procedura A
43
Foto 9: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 1,
procedura C
Foto 10: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 2,
procedura C
44
Foto 11: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 3,
procedura C
Foto 12: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 3,
procedura B
45
foto 13: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 2,
procedura A
foto 14: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 3,
procedura A
46
foto 15: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 1, fara
igienizare
foto 16: rezultat
analiza ATP, pct.
recoltare 1, fara
igienizare
Top Related