DETECTIA ATP Prin BIOLUMINISCENTA -Dizertatie Popazu ( Romanciuc) Claudia

1

Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară Bucureşti

Facultatea de Medicină Veterinară

Master: Igiena alimentelor de origine animală şi sănătate publică

LUCRARE DE DIZERTAŢIE

METODE MODERNE DE MONITORIZARE A

IGIENEI IN INDUSTRIA LAPTELUI -

DETECTIA ATP PRIN BIOLUMINISCENTA

Coordonatori:

Şef lucrări Dr. Stelian Bărăităreanu

Conf. Dr. Mihaela Popp

Masterand

POPAZU (ROMANCIUC) CLAUDIA MARIA

Bucureşti - 2011

2

CUPRINS

Introducere 3

1. Partea I-a

STUDIU BIBLIOGRAFIC

5

1.1. Detectia ATP prin bioluminiscenta 5

1.2. Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea

igienei suprafetelor

7

1.2.1. Istoric 7

1.2.2. Principiul metodei 9

1.3. Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea

igienei ( calitatii microbiologice ) a apei ca materie prima

10

1.3.1. Istoric 10

1.3.2. Principiul metodei

1.4. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la

monitorizarea igienei laptelui crud, pasteurizat, ESL

(Extending Shelf Life) si UHT

1.4.1. Istoric


Partea a II-a

CERCETĂRI PERSONALE:

Material si metoda

Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP

/bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor

suprafete din spatiul de productie / ambalare intr-o fabrica de

lactate

Rezultate si discutii

CONCLUZII

Bibliografie

3

INTRODUCERE

Industria alimentara, in general, si industria lactatelor, in special, adopta din ce in ce

mai multe sisteme pentru siguranta alimentelor si managementul calitatii care sunt mai

proactive si preventive decat cele folosite in trecut si care se bazau pe testarea produsului final

si inspectie vizuala [Griffiths et al., 2003].

Ultimii 25 de ani au fost dedicati dezvoltarii de noi metode pentru Asigurarea Calitatii

Managementul Calitatii si sistemul Analiza Riscului si Punctelor Critice de Control ( Hazard

Analysis and Critical Control Point –HACCP) [Dostalek etal., 2005].

In Romania a fost adoptat standadul SR EN ISO 22000/ 2005 (Sisteme de management

al sigurantei alimentelor. Cerinte pentru orice organizatie din lantul alimentar), care

stipulează că o organizatie din lantul alimentar trebuie sa demonstreze capacitatea sa de a

controla pericolele pentru siguranta alimentului, pentru a se asigura ca alimental este sigur in

momentul consumului uman. Acest sistem de management combina urmatoarele elmente

cheie, recunoscute in general, pentru a asigura siguranta alimentelor pe tot lantul alimentar,

pana la consumatorul final:

- comunicare interactiva;

- sistem de management;

- programe preliminare;

- principii HACCP.

Pentru ca sistemul HACCP sa fie eficace sunt necesare metode rapide de analiza

pentru monitorizare si verificare. Monitorizarea uzuala consta in supravegherea parametrilor

fizici si chimici ai procesului (temperature de pasteurizare, timp, pH) in timp ce validarea

performantelor HACCP necesita teste pentru detectia unor patogeni ca Salmonella, Echerichia

coli O157:H7 etc.

Starea de igiena a suprafetelor din zona de productie a produselor lactate este un

element esential in producerea de alimente sigure, de calitate. Igienizarea unor astfel de

suprafete se face fie in mod automat (sistemul „Clean in place" =CIP), fie manual, în funcţie

de natura suprafetelor ce trebuie curatate [Pater P.,1994].

In general, igienizarea cuprinde o etapa de indepartare a reziduurilor de alimente cu

ajutorul unor detergenti si o etapa de dezinfectie pentru a distruge microorganismele. Pentru

a se demonstra eficienta igienizarii, trebuie implementat un sistem de verificare. O igienizare

neeficace poate conduce la esecul indepartarii microorganismelor si / sau resturilor de produs

de pe suprafetele de testat.

4

Microorganismele ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic in urma unui ciclu de

igienizare neeficace reprezinta un risc direct pentru urmatoarele loturi de produs care vor intra

in contact cu aceste suprafete.

Reziduurile de produse ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic, in urma unui ciclu

de igienizare neeficace, contin suficienti nutrienti pentru a transforma, printr-o crestere rapida,

o contaminare initiala mica cu microorganisme, intr-o populatie mare. Acest lucru se poate

intampla in perioada de dupa igienizare si pana la urmatoare utilizare [Pater P.,1994].

Suprafetele care vin in contact (direct sau indirect) cu alimentele si care sunt dificil de

curatat ar trebui sa fie in centrul atentiei in procesul de monitorizare. Suprafetele de contact

direct cu alimentele sunt suprafetele unde prezenta oricarui contaminant va conduce, in final,

la contaminarea produsului finit.

Suprafetele de contact indirect sunt cele in care exista potentialul de a fi imprastiate

alimente, praf sau lichide (prin imprastiere, picurare sau cadere accidentala in produs).

Suprafete dificil de curatat pot include zone care se infileteaza manual, zone cu inele, zone cu

suprafete de forma neregulata, colturi, crapaturi si gauri.

Pana in perioada ‘80, singura metoda disponibila, pentru a evalua starea de igiena a

unei suprafete care vine in contact cu alimentul, era metoda conventionala, in placi, cu mediu

de cultura (agar). Metodele clasice furnizeaza informatii despre numarul de microorganisme

de pe o suprafata si detecteaza microorganisme specifice. In schimb, nu furnizeaza informatii

despre reziduurile de alimente remanente [Martin E.,2003]. Insa, aceasta metoda este legata, in

particular, de eficienta dezinfectiei şi în mai mică măsura de curatenie. Informatiile nu sunt

obtinute intr-un timp care sa permita actiunea de recuratare in timp util, cand rezultatele sunt

inacceptabile [Ramsay C., 2002].

Avantajele testelor microbiologic sunt: identifică microflora prezentă, metodele de

lucru sunt bine documentate şi nivelul de contaminare poate fi cuantificat.

Dezavantajele testelor microbiologice sunt: necesita peste 24 ore pentru rezultate,

rezultatele pot fi variabile, in functie de viabilitatea celulelor şi nu iau in considerare si alte

tipuri de reziduuri (reziduuri de produse alimentare care reprezinta nutrienti pentru bacterii).

Din aceste motive, industria produselor lactate a cautat tehnici rapide si sensibile pentru

a monitoriza starea de igiena a suprafetelor din fluxul tehnologic, ambalajelor, echipamentelor,

apei, produsului finit.

Termenul de valabilitate al produselor lactate, si in special al laptelui de consum si al

altor produse lactate care nu contin culturi lactice, este afectat in principal de contaminarea

bacteriana postpasteurizare

Analiza de ATP cu ajutorul bioluminiscentei determina continutul de ATP atat pe o

suprafata de contact cat si in probe de produse lactate.

5

Aceasta metoda, in contrast cu metoda traditionala, poate transforma monitorizarea

retrospectiva intr-o evaluare practica a tuturor aspectelor legate de igienizare: curatenie si

dezinfectie.

ATP detectat din lapte si produse lactate cat si de pe suprafetele care vin in contact cu

laptele are trei surse: ATP liber, ATP din celulele somatice si ATP microbial [Nelson W.H.,

1991]. Deci, prin această metodă este detectată atât prezenţa reziduurilor alimentare de pe

suprafete, cât şi prezenţa microorganismelor, astfel că metoda reprezintă un indicator bun

pentru aprecierea stării de igienă a suprafeţelor testate.

Deoarece reacţia bioluminiscenta este foarte rapidă, rezultatele testării obţinându-se în

câteva minute, faţă de câteva zile necesare în metodele tradiţionale de determinare a

microorganismelor prin cultivare în plăci, echipa însărcinată cu efectuarea curăţeniei poate

relua operaţiunea, dacă se detectează deficienţe în activitatea ei. Cu alte cuvinte, dacă pe

suprafaţă se găsesc concentraţii ridicate de ATP, suprafeţele pot fi curăţate din nou înainte de

începerea activităţii de producţie. Simplitatea şi rapiditatea metodei de determinare a ATP-ului

prin bioluminiscenţă a condus la dezvoltarea mai multor sisteme pentru monitorizarea stării de

igienă, care în prezent sunt disponibile comercial. Însă, înainte de a implementa în practică

testările pe bază de ATP, pentru evaluarea stării de igienă într-o fabrică, trebuie determinate

criteriile de diferenţiere a suprafeţelor murdare de cele curate, în unităţi RLU (Relative Light

Units). Acest lucru trebuie făcut în timpul procesului de producţie, în momentele în care se

cunoaşte că suprafeţele sunt murdare sau curate.

Lucrarea de faţă abordează ca metodă modernă de monitorizare a igienei in industria

laptelui, detectia ATP prin bioluminiscenta, fiind structurată în două părţi:

- studiu bibliografic: in care se prezintă diferite modalitati de aplicare a analizei ATP

prin bioluminiscenta la determinarea gradului de igiena in industria lactatelor ;

- certcetari personale: care cuprinde un studiu comparativ intre metoda microbiologica

si ATP /bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor suprafete din spatiul de

productie / ambalare intr-o fabrica de lactate.

6

Partea I-a

STUDIU BIBLIOGRAFIC

7

I.1. Detectia ATP-ului prin bioluminiscenta.

Prima explicaţie stiinţifică a bioluminiscenţei a fost elaborată de fizicianul Robert

Boyle, in 1672 [Day , 2009]. Introducând sub un recipient un cotlet de viţel alterat care în

întuneric degaja lumina a remarcat că stralucirea scade progresiv. Când aerul era lăsat să

pătrundă sub recipient, lumina îsi recăpăta intensitatea. Se demonstra astfel că bioluminiscenţa

este în strânsă legatură cu reacţiile chimice care încetează în absenţa oxigenului si că orice

superstiţie legată de acest fenomen nu si găsea justificarea. Abia în 1885 zoologul francez

Raphael Dubois [Lynch T., 1999], a descoperit cele două substanţe din corpul plantelor si

animalelor care dau nastere la lumina printr-o reacţie chimică. Aceste substanţe sunt luciferina

si oxiluciferina.

Bioluminiscenţa este procesul biologic de producere a luminii de către organismele vii.

În organismele bioluminiscente se sintetizează o substanţă fotogenă numită luciferina (Fig 1)

care sub acţiunea O2 si a enzimelor catalizatoare (luciferaze) se oxidează. Reacţia este

exoterma iar modificarea energiei libere este folosită pentru a excita o moleculă la o stare

foarte bogată în energie. Pentru revenirea moleculei astfel excitate la starea de bază se produce

o emisie de lumină.

Fig. 1 Structura luciferinei [ Ceresa L., 2006 ]

ATP-ul este o molecula care actioneaza ca mediu major de stocare a energiei pentru

celulele vii [Ceresa L., 2006]. Molecula de ATP are urmatoarea structura ( Fig. 2) :

Fig.2. Structura ATP

8

Hidroliza gruparilor fosfat elibereaza energie si conduce la o varietate de reactii

biochimice in interiorul celulelor. Deci, molecula de ATP poate fi folosita ca un marker al

contaminarii cu celule [Ceresa L., 200]

Cea mai comuna metoda pentru detectia ATP bazata pe masurarea bioluminiscentei

foloseste sistemul luciferin/luciferaza si consta in oxidarea luciferinei de catre enzima

luciferaza, in prezenta oxigenului si a sarurilor de magneziu, cu emiterea de lumina (Fig 3)

[Griffiths, 2003]:

Fig. 3 Oxidarea luciferinei cu emitere de lumina

ATP reactioneaza cu complexul enzimatic luciferin-luciferaza, lumina emisa fiind

masurata cu ajutorul unui luminometru si exprimata in RLU (Relative Light Units). Cantitatea

de ATP este direct proportionala cu cantitatea de lumina emisa.

Domeniul de aplicare a detectiei ATP prin metoda masurarii bioluminiscentei este

destul de variat. Faptul ca ATP este prezent atat in microorganisme cat si in reziduurile de

produs alimentar este un dezavantaj in cazul in care aceasta tehnica se vrea aplicata la

determinarea incarcaturii microbiene a unor alimente, dar este un mare beneficiu atunci cand

tehnica este aplicata pentru a determina gradul de igienizare al suprafetelor din zona de

productie [Ramsay C., 2002].

Reziduurile de alimente contin o mare cantitate de ATP, fie in celule intacte fie sub

forma libera.

9

I.2. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin

bioluminiscenta la monitorizarea starii de igiena a

suprafetelor

1.2.1. Istoric

Tehnica ATP–bioluminiscenta este din ce in ce mai des folosita pentru masurarea

eficientei igienizarii suprafetelor si ustensilelor folosite. Daca procesul de igienizare nu a fost

eficient, suprafetele vor ramane contaminate cu reziduuri de produs sau microorganisme.

Prin metoda clasica (inoculare in agar) se poate detecta doar contaminarea microbiana

(se poate urmari numai eficienta dezinfectarii) a suprafetei de testat, dar nu se poate obtine nici

o informatie despre gradul de curatare (reziduuri de produs) .

Prin metoda ATP-bioluminiscenta, pe de alta parte, se pot detecta ambele surse de

ATP: microorganisme si /sau reziduuri de produs in doar cateva minute, fiind un indicator mult

mai real al gradului de igienizare.

Cateva studii au comparat rezultatele obtinute prin cele doua metode pentru evaluarea

starii de igiena a suprafetelor. Unele dintre ele au raportat corelatii bune intre metode [Seeger

si Griffiths. 1994; Kiriakides et al., 1991; Bautista et al. , 1992]. Altele au obtinut o slaba

corelatie intre cele doua metode [Griffiths et al., 1997; Carrick et al., 2001].

Cateva din discrepantele gasite pot fi explicate fie prin natura diferita a suprafetelor si a

contaminarii (prezenta sporilor, de exemplu), fie prin capacitatea diferita a tampoanelor

folosite de a colecta microorganismele. Viabilitatea redusa a bacteriilor in timpul uscarii poate

de asemenea sa aiba un impact major in ambele tehnici. Nu in ultimul rand, prezenta

detergentilor , dezinfectantilor sau altor chimicale pot sa interfere cu reactia de bioluminiscenta

[Velasquez, 1997] conducand la rezultate fals negative.

In ciuda acestor dificultati, tehnica ATP-bioluminiscenta a fost folosita cu succces ca

un pas initial in monitorizarea igienei, in special in planurile HACCP.

Cu toate ca kiturile ATP existente sunt suficiente pentru 90% din nevoile industriei

alimentelor (sensibilitate si acuratete satisfacatoare), in cazul unei fabrici de lactate este

nevoie se se detecteze nivele mici de contaminare bacteriana care pot sa fie inca prezente. In

acest caz, se foloseste un amestec de enzime pentru a amplifica nivelul redus de ATP

[Hawronski et al., 1994]. Reactivul de amplificare consta intr-o mixtura de luciferaza,

myokinaza si piruvat-kinaza care, impreuna cu substratele lor (luciferina, AMP si

fosfoenolpiruvat), amplifica, efectiv, tot AMP in ATP (Fig. 4):

10

Fig 4. Schema reactiei de amplificare pentru ATP

Timpul de reactie pentru a se obtine jumatate din maximum de semnal luminos este

direct proportional cu ATP si poate fi folosit ca indicator al curateniei.

O alta metoda a fost propusa de Sakakibara et al. [1999] . Detectia simultana a ATP,

AMP si RNA a fost realizata prin reactia de cuplare a piruvat ortofosfat dikinazei (PPDK) cu

luciferaza (Fig. 5):

Fig.5 Schema reactiei de determinare a bioluminiscentei pentru ATP si AMP.

Limita de detectie a metodei a crescut de aproape o suta de ori fata de metoda uzuala

care folosea ATP ca un index.

1.2.2.Principiul metodei

Indiferent de numele producatorului de luminometre si kitu-uri de analiza a ATP de

pe suprafete prin bioluminiscenta, principiul metodei este acelasi, fiind simplu si implicand

urmatoarele etape [Pater P. ,1994]:

11

- se recolteaza tampoane de sanitatie de pe suprafata de testat si orice

microorganism sau reziduu de produs care s-a recoltat este transferat intr-o eprubeta ce contine

un diluant sau un extractant;

- extractantul distruge peretii celulari ;

- ATP continut in celulele somatice sau microbiene, impreuna cu ATP liber din

reziduurile alimentare, este eliberat in solutie;

- detectia de ATP este realizata prin aditia de complex enzimatic

luciferin/luciferaza, care va conduce la producerea de lumina;

- cantitatea de lumina (exprimata in RLU) este cuantificata cu ajutorul unui

luminometru, fiind direct proportionala cu cantitatea de ATP din proba.

In tabelul 1 sunt cateva kit-uri de analiza a ATP prin bioluminiscenta si cateva

luminometre disponibile comercial.

Tabel 1.Luminometre şi kituri de detectie ATP prin bioluminescenţă

Producator Kit analiza Luminometru detector

Biotrace

LTD

Detergent

rece

Multi-Line Numerator de protoni-fotodioda

Lumac BV Detergent

rece

MI 500 Light fotomultiplicator

12

1.3. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta

la monitorizarea calitatii microbiologice a apei de proces in

industria lactatelor

1.3.1. Istoric

Apa potabila in industria lactatelor se foloseste in mai multe scopuri:

- materie prima in anumite produse ;

- la clatirea finala a tuturor instalatiilor, tancurilor , masinilor de ambalat, cisternelor cu

care se transporta laptele.

Deoarece laptele si produsele lactate reprezinta un mediu optim pentru inmultirea bacteriilor, o

contaminare extreme de mica a apei folosite in procesul tehnologic conduce la o contaminare

de proportii a produsului finit.

Avand in vedere acest lucru, starea de igiena a apei de proces este un punct critic de control

care se monitorizeaza cu mare atentie.

In acest caz, calitatea microbiologica a apei (igiena) trebuie analizata foarte atent si

repede, pentru a avea un raspuns rapid inainte de a o folosi ca si materie prima in productie

[Bagur E., 2009], sau ca si apa la clatirea finala a instalatiilor dupa dezinfectie.

Metoda standardizata de analiza a NTG din apa (EN ISO 6222), cu inoculare in agar,

presupune urmatoarele etape (Fig. 6):

- 1 ml apa de analizat se inoculeaza in mediu nutritiv;

- incubarea probei la temperature specifica metodei, 72 h;

- enumerarea coloniilor;

- exprimarea rezultatului in nr. cfu/ml.

Deoarece limita de detectie este de 1 cfu/ml, s-a imbunatatit aceasta metoda

introducandu-se metoda filtrarii pe membrane (Fig. 6) [SARTORIUS, Controlul microbiologic

al produselor farmaceutice], care consta in urmatoarele etape:

- 100 ml de apa se filtreaza aseptic printr-un filtru cu dimensiunea porilor de

0.45 μm, care va retine toate microorganismele prezente in proba;

- filtrul se transfera aseptic intr-o placa Petri in care se afla fie mediu nutritiv

solidificat (Fig.6) fie un cartonas impregnat cu mediu nutritiv (Fig 7) [SARTORIUS, Controlul

microbiologic al produselor farmaceutice];

- incubarea probei la temperature specifica metodei, timp de 72 h;

- dupa expirarea timpului de incubare se numara coloniile formate si se

raporteaza rezultatul in nr. cfu/100ml .

13

Fig. 6. reprezentarea schematică a metodei microbiologice de analiză a NTG din apă

14

In cazul in care se utilizeaza cartonase impregnate cu mediu , se procedeaza ca mai jos (fig. 7):

Fig. 7 Indicatii de lucru –cartonase impregnate cu mediu nutritive (CMN)

15

In fig. 8 [SARTORIUS, Controlul microbiologic al produselor farmaceutice] sunt

cateva exemple de placi inoculate cu apa potabila, pe care au crescut diverse microorganisme :

Fig.8. NTG - Exemple de placi dupa incubare

Prin aceasta imbunatatire limita de detectie a ajuns de la 1 cfu/ml la 0.01 cfu/ml. Cu

toate ca limita de detectie a fost imbunatatita de 100 de ori, timpul de obtinere a rezultatelor a

ramas acelasi .Intarzierea in obtinerea rezultatelor poate conduce la imposibilitatea de a mai lua

actiuni corective, apa respectiva fiind deja introdusa in produs la momentul obtinerii

rezultatelor.

Astfel, s-a impus de la sine gasirea unei noi metode de analiza a calitatii microbiologice

a apei, cu ajutorul careia sa se obtina rezultate rapide care sa permita luarea unei decizii in ceea

ce priveste utilizarea sau neutilizarea apei ca materie prima, la un lot nou de produs .

ATP/bioluminiscenta incepe sa devina o alternative foarte rapida (<5 min.) pentru

detectia bacteriilor in apa de baut in comparative cu metoda conventionala care dureaza 3 zile

[Deininger et al., 2001].

Ceresa L. ET AL., [2006], descrie un sistem de detectie ATP in apa, Pallchek Rapid

Microbiology System, cu ajutorul caruia este analizata apa de proces, rezultatele exprimandu-

se absent/present.

Acelasi sistem de analiza a apei, dar cu imbunatatiri, este descris si de Bagur E. [2009].

1.3.2. Principiul metodei.

Sistemul Pallachek [Bagur E., 2009] ( Fig. 9 ) consta intr-un luminometru portabil si un

set de reactivi :

- un extractant, care va extrage ATP-ul intracelular al fiecarei celule microbiene

prezente in proba;

16

- substratul luciferin/luciferaza care, in reactia cu ATP va genera o cantitate de

lumina direct proportionala cu cantitatea de ATP .

Fig. 9 Sistemul Pallachek Rapid Microbiology

Cu ajutorul sistemului de mai sus se poate detecta ATP-ul prin bioluminiscenta in doua

moduri: direct si indirect.

Metoda directa are o limita de detectie de 1000cfu/proba [Bagur E., 2009]. Acest lucru

o face aplicabila probelor la care se stie din istoric ca nivelul de contaminare depaseste aceasta

limita. Timpul de analiza este de 1 minut dupa ce proba a fost filtrata.

Etapele de lucru in cazul metodei directe sunt redate schematic in fig. 10 [Bagur E.,

2009], si constau in:

- filtrarea unui anumit volum de apa, in functie de clasa de puritate estimata a

probei (vezi Tabelul 2);

- masurarea imediata a ATP/bioluminiscenta;

- interpretarea datelor obtinute conform tabelului 2.

Fig. 10 Metoda directa de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru

17

Avantajele metodei directe sunt timpul scurt de raspuns (aprox. 30 min) si simplitatea.

Rapiditatea cu care se obtine rezultatul ofera posibilitatea identificarii rapide a unui rezultat in

afara limitelor si aplicarea imediata a unor actiuni corective .

+ = valoarea RLU> 1000cfu/ volum proba filtrata;

- = valoarea RLU< 1000cfu/ volum proba filtrata

Tabel 2 Metoda directa: interpretarea datelor

Cel mai important dezavantaj il reprezinta sensibilitatea metodei, limitand aplicarea sa

la probele cu un nivel relativ ridicat al contaminarii (>1000cfu/proba) [Bagur E., 2009].

Pentru apa de process, folosita in industria lactatelor, limita interna stabilita in marea

majoritate a fabricilor de lactate, este de <1cfu /100ml (aceasta fiind limita de detectie a

metodei ISO-metoda cu filtrare).

Pentru acest caz, se poate folosi metoda indirecta. Este tot o metoda calitativa

(absent/present), in cadrul careia ATP este masurat dupa o preimbogatire a probei. Dupa

filtrarea probei , membrana este incubată peste noapte in mediu nutritiv lichid, pentru a obtine

o crestere microbiana si, in consecinta, o amplificare a semnalului bioluminescent obtinut.

Etapele de lucru sunt urmatoarele (Fig. 11) [Bagur E., 2009]:

- proba de apa este diluata astfel incat sa se obtina 100 ml din dilutiile 1/10 si

1/100;

- 100 ml proba ca atare precum si ambele dilutii sunt apoi filtrate ;

- cele 3 membranele sunt transferate aseptic in cate 10 ml mediu nutritiv lichid

si incubate 24 h;

- se filtreaza 8 ml mediu din fiecare proba si se masoara valoarea ATP ca si la

metoda directa.

Volum proba filtrata Clasa 1 Clasa 2 Clasa 3 Clasa 4

1000 ml - + + +

100 ml - - + +

10 ml - - - +

Nivel estimat de

contaminare

<1 cfu/ml <10 cfu/ml <100 cfu/ml <1000

cfu/ml

18

Fig. 11 Metoda indirecta de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru

Tabelul 3 [Bagur E., 2009] centralizeaza posibilele limite de detectie pentru aceasta

metoda.

Tabel 3. Metoda indirecta de detecţie a ATP-ul prin bioluminiscenta: interpretarea

datelor

+ = valoarea RLU> 1cfu/ volum proba filtrata;

- = valoarea RLU< 1cfu/ volum proba filtrata

Avantajul acestei metode este ca rezultatul este obtinut intr-un timp mai scurt decat prin

metoda clasica.

Aplicarea metodei ATP /bioluminiscenta in analiza probelor de apa intr-o fabrica de

lactate permite aplicarea rapida a unor actiuni corrective , ca [Bagur E., 2009]:

- repetarea recoltarii probelor si reanalizarea lor atunci cand limitele sunt

depasite;

- infirmarea sau confirmarea rapida a unui rezultat in afara limitelor;

- alertarea rapida a departamentului de productie pentru a nu folosi apa cu limite

depasite si pentru a trece la actiuni corective ;

- analiza rapida a probelor de apa dupa ce s-au aplicat actiunile corective de

remediere a neconformitatii (limite depasite).

Volum proba Clasa 1 Clasa 2 Clasa 3 Clasa 4

1 - + + +

1/10 - - + +

1/100 - - - +

Nivel estimat de

contaminare

<1 cfu/100ml 1-10

cfu/100ml

10-100

cfu/100ml

100-1000

cfu/100ml

19

1.4. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta

la monitorizarea igienei laptelui

1.4.1. Istoric

Industria lactatelor, ca si alte sectoare ale industriei alimentare, a cautat sa dezvolte

metode mai rapide pentru controlul calitatii microbiologice a materiei prime principale, laptele,

precum si a produselor lactate.

Conform legislatiei (Ordinul MAPAM 1106/2003), incepand cu 1 ianuarie 2009, NTG

pentru laptele crud trebuie sa fie <100 000 cfu/ml. Deci, metoda de analiza aleasa trebuie sa

aiba o limita de detectie cel putin egala cu aceasta valoare.

Metoda standardizata de analiza a NTG din lapte crud (SR EN ISO 4833-2003) are

limita de detectie de 1cfu/ml si presupune urmatoarele etape de lucru:

- prepararea de dilutii zecimale ( 1/10, 1/100, 1/1000);

- inocularea a cate 1 ml din fiecare dilutie in placi Petri cu mediu nutritiv;

- incubarea placilor la 30°C, timp de 72h;

- enumerarea coloniilor pe placa si exprimarea rezultatelor in nr. cfu/ml.

Dezavantajul major al acestei metode il reprezinta timpul mare de obtinere a

rezultatelor (72 h), fapt ce face imposibil controlul microbiologic al laptelui materie prima

inainte de a fi descarcat din cisterna. Cu aceasta metoda nu se poate face decat o monitorizare

bazata pe istoric.

Prima descriere a unei metode rapide de detectie ATP in lapte contaminat cu bacterii a

fost facuta de catre Sharpe et al., in 1970. Dezavantajul acestei metode il constituie limita de

detectie de 1x106cfu/ml , cu mult peste limita impusa de legislatia actuala.

Cel mai important factor care influenteaza limita de detectie a acestei metode o

reprezinta ATP nonbacterial din lapte. ATP-ul nonbacterial din lapte provine din 2 surse: ATP

nativ secretat in timpul lactatiei si ATP din celule somatice.

Procedurile recente de detectie ATP bacterian din lapte crud prin bioluminiscenta au

limita de detectie de 1x104 iar timpul de analiza este de 5-10 min [Dostalek et al., 2005].


Diferite studii descriu metode de determinare a gradului de contaminare micobiana a

laptelui crud prin tehnica detectiei ATP pe baza bioluminiscentei [Bautista et al, 1992;

Griffiths, 1991; Samkutty et al., 2001]. Principalele etape de lucru in cazul acestor metode

sunt:

20

- incubarea probei de lapte cu un agent de lizare a celulelor somatice, pentru a

elibera ATP din acestea;

- filtrarea probei pe o membrana care va retine microorganismele; in acest mod

se elimina ATP –ul nonbacterial provenit din ambele surse;

- lizarea microorganismelor retinute pe filtru pentru eliberarea ATP microbial;

- analiza ATP prin bioluminiscenta.

Acuratetea acestei metode este destul de redusă (0,2-0,87 log UNITS) [Griffith M W,

2003].

Pentru imbunatatirea acuratetii metodei, se poate introduce o etapa de preincubare a

probei la 15,60C, timp de 18 ore [Samkutty ey al., 2001]. Acest lucru a dus la cresterea

coeficientului de regresie liniara a detectiei ATP comparativ cu metoda standard de la 0,58 la

0,80.

O alta abordare este aceea de a folosi un reactiv de „concentrare”,Enliten, care

„clarifica” laptele , microorganismele fiind apoi separate prin centrifugare. Combinarea acestui

tratament cu detectia ATP/bioluminiscenta a condus la scaderea limitei de detectie la

104cfu/ml, analiza putandu-se efectua in 6-7 min. [Pahuski et al., 1991].

Introducerea unei etape de preincubare inainte de analiza ATP a condus la largirea

ariei de aplicare a metodei si la laptele pasteurizat, UHT, ESL sau sterilizat.[Griffiths M W,

1993].

21

Partea a II-a

CERCETĂRI PERSONALE

Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP /

bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a suprafetelor din

spatiul de productie intr-o fabrica de lactate

22

II.1.Scopul lucrarii

Cercetările proprii au avut ca obiective prezentarea unei metode de detectia a ATP de

pe suprafete care vin in contact direct cu produsul si un studiu comparativ intre rezultatele

obtinute prin metoda microbiologica clasica si metoda de detectie ATP prin bioluminiscenta,

pe probe recoltate de pe suprafete din fluxul de productie al unei fabrici de produse lactate,

inainte si dupa efectuarea procedurilor de sanitizare.

23

II.2. Material si metoda

In cursul lucrarilor practice am folosit un aparat UNI-LITE® NG (producator

BIOTRACE) si teste "CLEAN-TRACE –surface ATP", "CLEAN –TRACE-water –Total

ATP" si "CLEAN –TRACE-water –FREE ATP" ( producator 3M).

Tehnica de detectie ATP prin bioluminiscenta s-a folosit in paralel cu metoda

standardizata de determinare a NTG, la evaluarea procedurilor de curatenie si dezinfectie a

unor suprafete din fluxul tehnologic de fabricatie al produselor lactate, in cadrul unei fabrici

de produse lactate din judetul Ilfov.

2.1.Suprafete testate.

S-au recoltat probe de pe mai multe suprafete care vin in contact direct cu produsul, de

pe fluxul tehnologic de productie al laptelui de consum , pasteurizat la temperatura inalta: tanc

lapte crud, tanc lapte degresat, tanc smantana, tanc standardizare, tanc aseptic de umplere, linia

aseptica de ambalare, cuva umplere masina ambalare, capete de dozare masina de ambalare.

Diagrama de flux a acestui produs este redata in fig. 12.

Fig. 12. Diagrama de flux lapte de consum

24

Probele s-au recoltat inainte si dupa aplicarea unor proceduri diferite de igiena.

2.2. Proceduri de igienizare .

Intregul proces de spalare si dezinfectie a instalatiilor din fluxul tehnologic este

automat, fiind cuprins intr-un sistem CIP (Clean –in –place). Sistemul CIP este constituit din

tancuri care contin solutii de detergenti, acizi, dezinfectanti si apa de clatire de la care solutiile

respective sunt conduse cu ajutorul unor pompe prin toate instalatiile din fluxul tehnologic,

fara ca acestea sa fie deschise.

Ciclul unei igienizari complete cuprinde urmatoarele etape:

1. indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de

aproximativ 40oC, timp de 2 minute;

2. spalarea instalatiilor cu solutie NaOH (soda caustica), 1%, incalzita la o

temperatura de 70oC, timp de 25 minute;

3. clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica ;

4. dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;

In cadrul acestui experiment, s-au aplicat atat cicluri complete de igienizare cat si

cicluri incomplete, pentru a se observa eficienta igienizari, pentru fiecare procedura in parte.

Planul de experiment in ceea ce priveste procedurile de igiena aplicate a fost urmatorul:

Procedura A:

- indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de


Procedura B:



- dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;

Procedura C, ciclul complet.

Procedurile de igienizare A-C s-au aplicat in zile diferite, pe parcursul a 4 luni.

2.3. Plan de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza ATP

prin bioluminiscenta.

Probele s-au recoltat inainte si dupa fiecare procedura A-C, conform planului de

recoltare si analiza din tabelul 4.

25

Tabel 4: Plan de recoltare si analize probe

Nr.

crt

Locul

recoltarii

Procedura

de igienizare aplicata

Procedura A

Procedura B

Procedura C

1

tanc lapte crud

Ziua

1

*inainte **1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG

**1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP

*dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG

1 pb. ATP 1 pb. ATP 1 pb. ATP

Ziua

2

inainte 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG


dupa 1 pb. NTG 1 pb. NTG 1 pb. NTG


2

tanc

standardizare

Ziua

1





Ziua

2





3

tanc aseptic de

umplere

Ziua

1





Ziua

2





4

linia aseptica de

ambalare

Ziua

1





Ziua

2





5

cuva umplere

masina ambalare

Ziua

1





Ziua

2





6

Capete de

dozare masina

ambalat

Ziua

1





Ziua

2





*inainte: inainte de aplicarea procedurii de igienizare respective / dupa: dupa aplicarea procedurii de igienizare respective

** 1 pb. NTG: 1 proba recoltata pentreu analiza NTG / 1pb. ATP: 1 proba recoltata pentru analiza ATP.

In total, s-au recoltat 144 de probe, din care 72 pentru analiza microbiologica NTG

(36 de probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate

dupa aplicare procedurilor de igienizare) si 72 pentru analiza ATP/bioluminiscenta (36 de

probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate dupa

aplicare procedurilor de igienizare).

26

2.4. Proceduri de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza

ATP prin bioluminiscenta.

Probele pentru analiza ATP/bioluminiscenta s-au recoltat cu ajutorul unor teste 3M™ Clean-

Trace™ Surface ATP, pentru ATP de pe suprafete (producator 3M) (Fig. 13).

Testul 3M™ Clean-Trace™ Surface ATP

reprezinta un dispozitiv de unica folosinta

ce contine un tampon pentru colectarea

unei probe de pe o suprafata ( Instructiuni

de utilizare de la producator, pentru Test

3M™ Clean-Trace™ Surface ATP).

Tamponul este pre-umezit cu un agent

cationit care faciliteaza recoltarea probei de

pe suprafata.

Fig. 13 Test Clean-Trace™

Metoda de recoltare este cea specificata in instructiunile de utilizare de la producator si consta

in urmatoarele etape:

-se lasa testele Clean Trace la temperatura camerei pentru cel putin 10 min inainte de

utilizarea lor;

-imediat inainte de utilizare se scoate tamponul de sanitatie din eprubeta testului si se

tamponeaza o suprafata de testat de 10x10 cm , urmand aceleasi reguli ca si in cazul metodei

de recoltare pentru analiza microbiologica;

-se reintroduce tamponul in eprubeta testului , cu manerul inserat in pozitia originala a

dispozitivului neutilizat.

Fig. 14 Luminometru 3M™ Clean-Trace™

27

Probele astfel recoltate s-au analizat imediat, la locul de recoltare , folosind un

luminometru portabil, 3M™ Clean-Trace™ NG Luminometer, producator 3M ( fig. 14), astfel:

Pentru analiza microbiologica, recoltarea probelor s-a executat folosind tampoane de

sanitatie sterile, in tuburi cu capac, sterile (swab tube, Greiner Biotrace , cat no.420161, fig.

15).

Fig. 15 Tampoane

de sanitatie Greiner

Metoda de recoltare este conform SR ISO 18593:2007 si consta in urmatoarele etape:

- se umecteaza vata din varful tamponului prin imersare in eprubeta in care s-au

introdus in prealabil 10 ml solutie de neutralizare sterila;

- se preseaza varful tamponului pe peretii eprubetei pentru a indeparta excesul de lichid;

- se pune varful tamponului pe suprafata de investigat si si se plimba pe o arie de

aproximativ 100cm2, in timp ce se roteste tamponul intre degetul mare si aratator, in doua

directii in unghi drept una fata de cealalta;

- se introduce tamponul in eprubeta cu solutie de neutralizare si se agita pe vortex

10sec ; aceasta reprezinta suspensia initiala ( 10ml).

Probele au fost analizate in maxim 30 min de la recoltare, conform metodei specificate

in SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda

orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC

2.5. Modul de lucru

2.5.1. Analiza ATP prin bioluminiscenta.

Se porneste luminometrul cu 1-2 minute inainte de analiza, pentru a intra in regim de

functionare.

Dispozitivul de unica folosinta in care s-a introdus tamponul dupa recoltare contine la

baza sa reactivul combinat luciferin/luciferaza , sigilat cu o folie penetrabila.

28

Se apasa tamponul pana la baza

dispozitivului, penetrand folia protectoare

iar ATP –ul colectat cu ajutorul tamponului

va reactiona cu reactivul (fig. 16).

Fig. 16

Dupa activare, testul se agita rapid

(5 secunde), ca in fig. 16, dupa care se

introduce imediat in aparat (fig. 14) si se

citeste rezultatul afisat pe ecranul

aparatului, exprimat in RLU (fig. 17)

Fig. 17

La recomandarea producatorului, s-au respectat urmatoarele reguli de utilizare:

- dispozitivul de testare s-a tinut in pozitie verticala in momentul activarii, agitarea

realizndu-se dintr-o parte in alta, nu mai mult de 5 secunde , citirea efectuandu-se imediat;

- nu se agita dispozitivul in nici o alta pozitie decat cea indicata mai sus;

- activarea dispozitivelor s-a realizat pe rand, unul cate unul, imediat inainte de analiza;

- luminometrul s-a tinut in pozitie verticala in momentul in care s-au realizat

determinarile de luminiscenta;

- la finalul analizelor, se verifica sa nu ramana un dispozitiv in camera de citire a

luminometrului.

2.5..2. Analiza NTG (Numar Total de Germeni)

Analiza NTG s-a realizat conform. SR EN ISO 4833-2003.

S-au inoculat cate 2 placi Petri/proba cu cate 1 ml din suspensia initiala obtinuta

conform punctului 1.3.

S-a folosit mediu de cultura PCA ( plate count agar) cu urmatoarea compozitie:

29

Extract de drojdii 2,5 g

Digest pancreatic de caseina 5,0 g

Glucoza 1,0 g

Agar 15,0 g

Apa distilata 1000 ml

S-a verificat pH-ul si s-a ajustat , astfel incat dupa sterilizare acesta sa aiba valoarea

7,0±0,2 la 25ºC. Mediul astfel preparat se sterilizeaza in autoclav la 121ºC timp de 15 minute.

Flacoanele cu mediu se racesc pe baia de apa la 45±1ºC, aceasta fiind temperatura de lucru.

Placile s-au incubat la 370C, timp de 72h.

S-au ales placile care contin mai putin de 300 colonii si s-au numarat aceste colonii.

Exprimarea rezultatelor s-a realizat astfel:

- pentru placile care, dupa incubare, nu contin nici o colonie: <1 cfu/10cm2

- pentru placile care, dupa incubare, contin mai putin de 300 colonii calcularea

numarului de cfu/10cm2 ( N) se realizeaza folosind urmatoarea formula:

C x V

N= x D= C

A

unde:

C - este numarul de colonii pe 1ml lichid de dilutie=10cm2 (pe placa), egal cu media aritmetica

a valorilor celor doua placi utilizate;

V - este volumul de apa deionizata din eprubeta, in ml (=10ml);

A - suprafata investigata (aprox. 100cm2), in cm

2;

D - inversul factorului de dilutie ( D=101=10)

30

II.3. Rezultate si discutii.

Probele recoltate s-au analizat atat pentru NTG cat si pentru ATP. Rezultatele obtinute

sunt cuprinse in tabelele 5,6 si 7, de mai jos.

Limitele admise pentru fiecare loc de recoltare sunt stabilite intern, de catre echipa

HACCP a fabricii de lactate, in functie de diferite criterii dintre care cel mai important este

gradul de pericol pentru siguranta alimentara si legislatia in domeniu.

In cazul analizei ATP, limita admisa de 10 URL a fost stabilita prin testari repetate ale

unei suprafete din inox care a fost igienizata si dezinfectata in laborator, aceasta valoare fiind

considerata limita de detectie ATP. Toate rezultatele ≤10 URL sunt considerate negative.

Pentru analiza ATP nu exista limite maxim admise legiferate.

In cazul analizelor NTG, limitele admise pentru tancul de lapte crud si pentru tancul de

standardizare s-au stabilit intern iar pentru celelalte puncte de recoltare s-au preluat limitele din

legislatie [Ordin MS 976/1998].

Asa cum se poate observa in toate cele trei tabele, toate rezultatele analizelor probelor

recoltate inainte de a se aplica orice procedura de igienizare sunt in afara limitelor admise, atat

in cazul analizelor NTG cat si in cazul analizelor ATP. Acest lucru demonstreaza faptul ca, in

100% din cazuri, acolo unde a existat contaminare microbiana am avut si rezultat ATP pozitiv

(>10URL), datorat atat incarcaturii microbiene cat si reziduurilor de produs lactat care contine

si ATP non-bacterian. In cazul punctelor de recoltare 3-6, fiind vorba despre suprafete care in

timpul procesului de productie trebuie sa fie aseptice, valorile NTG inainte de aplicarea unei

proceduri de igienizare depasesc cu putin limita admisa in timp ce valorile ATP sunt

comparabile cu cele de la punctele de recoltare 1 (lapte crud) si 2 (lapte caruia i s-a aplicat o

pasteurizare joasa). Obtinerea unor valori mari pentru ATP si mici pentru NTG in acest caz ca

se datoreaza faptului ca pe suprafetele respective exista o cantitate mare de produs lactat

pasteurizat ramas de la lotul precedent (care contine ATP non-bacterian) dar o incarcatura

microbiana mica.

In cazul aplicarii procedurii de igienizare A (spalare 2 min. cu apa la 400C), chiar daca

valorile NTG si ATP au scazut (tabel 15), nu s-au plasat in limitele admise. Acest lucru

demonstreaza ca aceasta procedura nu este eficienta nici pentru a indeparta contaminarea

microbiana nici in cazul indepertarii urmelor de produs lactat.

31

Procedura B de igienizare a constat in prespalare cu apa la temperatura de aproximativ

40oC, timp de 2 minute, urmata de dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm.

Valorile rezultatelor analizelor NTG au scazut simtitor in comparatie cu procedura A,

unele dintre ele fiind in limitele admise (puncte de recoltare 2-6) altele nu (punct de recoltare

1) (tabel 16). Acest lucru demonstreaza ca aceasta procedura nu este 100% eficienta in

combaterea contaminarii microbiene.

In cazul analizelor ATP toate valorile obtinute au fost in afara limitelor admise, chiar

daca , pe acelasi punct de recoltare, prin analiza NTG s-au obtinut valori in limitele admise

(tabel 16, pct. 3 si 5 de recoltare). Aceste rezultate se pot explica prin absenta bacteriilor

viabile pe suprafetele respective ( efect datorat cel mai probabil dezinfectantului) si prezenta

de reziduuri de produs lactat steril (care contin ATP nonmicrobian). Deci, chiar daca

dezinfectia a fost eficienta in unele cazuri, indepartarea tuturor resturilor de prodius lactat nu s-

a realizat pentru nici un punct de recoltare, acestea putand deveni suport de crestere pentru o

eventuala post-contaminare microbiana

In tabelul 17 sunt prezentate valorile obtinute in cazul aplicarii procedurii de igienizare

C, in cursul careia au fost parcurse urmatoarele etape:



- spalarea instalatiilor cu solutie NaOH, solutie de concentratie 1%, incalzita la o

temperatura de 70oC, timp de 25 minute;

- clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica;

- dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm;

Toate valorile obtinute, atat pentru NTG cat si pentru ATP s-au incadrat in limitele admise in

proportie de 100%., demonstrand eficienta procedurii de igienizare atat in indepartarea

resturilor de produs lactat cat si la dezinfectie.

32

Tabel l 5: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare A

PROCEDURA A

Nr. punct

de recoltare

Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de

aplicarea procedurii

Rezultate probe recoltate dupa


NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU) NTG ( cfu/cm2) ATP (RLU)

1

tanc lapte crud (limite

admise:

NTG<10cfu/cm2; ATP≤20RLU)

>300(foto 1) 8623 >300 3562

>300 5593( vezi foto15) >300 2698

2

tanc standardizare

(limite admise: NTG<10cfu/cm2;

ATP≤20RLU)

254 8002 39 (vezi foto 7) 845

148 (vezi foto 6) 3596 37 (vezi foto 8) 821 (vezi foto 13)

3

tanc aseptic de umplere

(limite admise:


9 (vezi foto 5) 8236 3 659

5 2563 2 767 (vezi foto 14)

4

linie aseptica de

ambalare (limite admise: NTG<1cfu/cm2;

ATP≤10RLU)

6 8056 2 659

10 6658 5 776

5

cuva umplere masina

ambalat (limite admise:


10 3698 4 356

14 8065 6 822 (vezi foto 17)

6

capete de dozare masina

ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2;

ATP≤10RLU)

5 3911 2 299

11 8220 4 698

33

Tabel 6: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare B

PROCEDURA B

Nr. punct de recoltare

Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de aplicarea

procedurii

Rezultate probe recoltate dupa aplicarea

procedurii


1

tanc lapte crud (limite admise:


>300 6694 39 1654

>300 4023 ( vezi foto16) 48 1123

2

tanc standardizare


ATP≤20RLU)

165 ( vezi foto4) 7694 14 423

236 5110 8 256

3

tanc aseptic de

umplere (limite admise:

NTG<1cfu/cm2;

ATP≤10RLU)

2 2658 <1 59

6 5698 <1(vezi foto 2) 59 (vezi foto 12)

4

linie aseptica de

ambalare (limite

admise:


2 6894 1 125

3 4986 <1 67

5

cuva umplere masina


NTG<1cfu/cm2;

ATP≤10RLU)

4 8214 <1 136

2 9123 <1 110

6

capete de dozare

masina ambalat

(limite admise:


10 6524 2 98

2 7499 <1 69

34

Tabel 7: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare C

PROCEDURA C

Nr. punct de recoltare

Locul recoltarii Rezultate probe recoltate inainte de


Rezultate probe recoltate dupa aplicarea

procedurii


1 tanc lapte crud (limite

admise: NTG<10cfu/cm2;

ATP≤20RLU)

>300 9658 <1 10

>300 6532 <1 10 (vezi foto 9)

2 tanc standardizare (limite

admise: NTG<10cfu/cm2;

ATP≤20RLU)

200 5648 <1 6

166 6894 <1 7 (vezi foto 10)

3

tanc aseptic de umplere


ATP≤10RLU)

5 5656 <1 10

11 7546 <1 5

4

linie aseptica de ambalare

(limite admise:


4 6568 <1 10

10 6689 <1 10

5

cuva umplere masina

ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2;

ATP≤10RLU)

7 3945 <1 9

12 5055 <1 9

6

capete de dozare masina



3 5565 <1 8

9 8496 <1 10

Tabel 8. Rezultate obţinute la tratamentul suprafeţelor

Nr. crt. Tratamentul

suprafetelor testate numar probe

NTG ATP

rez. in limite rez. peste limite rez. in limite rez. peste limite

1 fara igienizare 36 0 36 0 36

2 procedura A 12 0 12 0 12

3 procedura B 12 7 5 0 12

4 procedura C 12 12 0 12 0

35

II.4. Concluzii.

1. In cazul probelor recoltate inainte de aplicarea celor trei proceduri de igienizare

testate precum si in cazul probelor recoltate dupa aplicarea procedurii de igienizare

A, exista o corelatie de 100% intre analizele NTG si analizele ATP. Rezultatele

NTG se explica prin prezenta incarcaturii microbiene pe suprafetele testate, iar

valorile foarte mari ale ATP se datoreaza prezentei reziduurilor de produs lactat in

cantitati relativ mari si incarcaturii microbiene (ATP nonmicrobian si ATP

microbian).

2. In cazul aplicarii procedurii de igienizare B, din totalul de 12 probe analizate 7 au

avut rezultate NTG negativ in timp ce rezultatul ATP a fost pozitiv. Acest lucru

demonstreaza ca pe aceste suprafete nu mai exista incarcatura microbiana (NTG

negativ), dar există totusi urme de produs lactat steril, purtator de ATP

nonmicrobial (ATP pozitiv). Analizele de ATP pozitive in cele 7 cazuri si NTG

negativ indica faptul ca procedura B este eficienta in cazul contaminarii microbiene

dar nu si in cazul reziduurilor de produs lactat.

3. La aplicarea procedurii C toate rezultatele pentru NTG si ATP sunt in limitele

admise, fapt ce dovedeste ca aceasta procedura este eficienta pentru ambele

scopuri: indepartarea urmelor de produs si a contaminarii microbiene. Rezultatele

analizelor NTG si ATP au fost în corelaţie de 100%.

4. Testul NTG a fost util la aprecierea dacă suprafata testata are sau nu contaminare

microbiana, dar nu a dat nici un indiciu despre prezenta reziduurilor de produs

lactat steril, care poate deveni sursa de hrana pentru o eventuala contaminare

minora a acelei suprafete.

5. Testul ATP a permis atat detectarea contaminarii microbiene, cat si a prezentei

reziduurilor de produs lactat pe aceste suprafete. Aceste rezultate, alături de

rapiditatea obtinerii rezultatelor, fac din testul ATP un instrument valoros in cadrul

planurilor HACCP din industria lactatelor.

36

Bibliografie

1. Bagur E. (2009), Concurent evaluation of both compendial and rapid method (ATP

bioluminescence) for monitoring water quality, European Pharmaceutical Review, Issue 3.

2. Bautista DA, McIntyre L, Laleye L, and Griffiths MW (1992), The application of ATP

bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene, J. Rapid 091

Methods Automat. Microbiol. 1, 179–93

3. Carrick K, BarneyM, Navarro A, and Ryder D (2001), The comparison of four

bioluminometers and their swab kits for instant hygiene monitoring and detection of

microorganisms in brewery, J. Inst. Brewing 107(1), 31–7.

4. Ceresa L., Ball P.(2006).Using ATP bioluminescence for microbiological measurements in

pharmaceutical manufactutring. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods, Volume

II, 233-250

5. Day, J. C. (2009). Bioluminescent beetles. http://www.bioluminescentbeetles.com (Accesat

14.06.2010)

6. Deininger RA , Lee J (2001), Rapid determination of bacteria in drinking water using

ATP assay , Field analytical chemistry and technology 5(4), 185–9.

7. Dostalek P., Branyik T. (2005) Prospects for rapid bioluminescent detection methods in the

food industry. Czech J. Food Sci, vol 23, no.3: 85-92

8. Griffiths CJ, Davidson CA, Peters AC, and Fielding LM (1997), Towards a strategic

cleaning assessment programme: hygiene monitoring and ATP luminometry, an options

appraisal , Food Sci Technol Today 11, 15–24

9. Griffiths M W (1991), Rapid estimation of microbial numbers in dairy products using ATP

technology.

10. Griffiths M.W, Brovko L. (2003). ATP bioluminescence.

http://www.crcnetbase.com/doi/pdf/ 10.1201/9780203485712.ch8

11. Hawronsky JM, Chittock RS, Wharton CW, and Holah J T (1994), Low level bacterial

contamination measured using a novel Bioluminescent assay’, in Bioluminescence and

Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects, eds. AK Campbell, L J Kricka

and P E Stanley, Chichester, John Wiley & Sons, pp. 411–14.

12. Kyriakides A. L., Costello SM, Easter MC, and Johnson I (1991), ‘Rapid hygiene

monitoring using ATP bioluminescence’, in Bioluminescence and Chemiluminescence:

Current Status, eds. P E Stanley and L J Kricka, Chichester John Wiley & Sons, pp. 519–

22.

http://www.crcnetbase.com/doi/pdf/10.1201/9780203485712.ch8

37

13. Lynch T. (1999), Bioluminescence in Fireflies. The luciferase-luciferin reaction in

Photinus pyralis. http://www.byteland.org/naturalist/dubois.htm (Accesat 14.10.2010)

14. Martin E., (2003). Hygiene monitoring in support of food safety. Society for food hygiene

technology, UK.

15. Murphy, S.C.; Kozlowski, S.M.; Blander, D.K.; Bandler, D.K.; Boor, K.J. Evaluation of

adenosine triphosphate-bioluminescence hygiene monitoring for trouble-shooting fluid

milk shelf-life problems. J. Food Sci., 81, 817-820, 1998

16. Pater P. (1994) .Rapid analysis techniques in food microbiology .Blackie Academic &

Professional, Westwr Cleddens Road, Bishopbrigges, Glasgow, G64 2NZ, UK.

17. Ramsay C. An overview of rapid hygiene testing using ATP bioluminescence (2002)

http://users.metropolia.fi/~karisv/Nanopinta/ATP-1.pdf

18. Raugel P J (1999).Rapid food analysis and hygiene monitoring. Kits, instruments and

systems.

19. Sakakibara T, Murakami S, Eisaki N, Najajiama M, and Imai K (1999), An enzymatic

cycling method using pyruvate orthophosphate dikinase and firefly luciferase for the

simultaneous determination of ATP and AMP (RNA), Anal. Biochem. 268(1), 94–101.

20. Samkutti P J, Gough RH, Adkinson RW, and McGrew P (2001), ‘Rapid assessment of the

bacteriological quality of raw milk using ATP bioluminescence’, J Food Protec. 64(2),

208–212.

21. Seeger K, and Griffiths M. W. (1994), ATP bioluminescence for hygiene monitoring in

health care institutions, J. Food Protect. 57, 509–12

22. Velasquez M and Feirtag (1997), Quenching and enhancement effects of ATP extractants,

cleansers, and sanitizers on the detection of the ATP bioluminescent signal, J. Food Protec.

60(7), 799–803.

23. ****SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor.Metoda

orizontala pentru enumerarea microorganismelor. Tehnica de numarare a coloniilor la 30

grade C.

24. ***Ordin al Ministrului Sanatatii nr. 976 din 16 decembrie 1998 pentru aprabarea

Normelor de igiena privind productia, prelucrarea, depozitarea, pastrarea, transportul si

desfacerea alimentelor

25. ***Ordinul MAPAM 1106/2003 privind aprobarea Programului de actiuni pentru

îmbunatatirea calitatii si salubritatii laptelui materie prima

26. ***Quick Start Guide UNI-Lite®NG –Biotrace

27. ***SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda

orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC

http://www.byteland.org/naturalist/dubois.htm

http://users.metropolia.fi/~karisv/Nanopinta/ATP-1.pdf

38

28. ***SR ISO 18593:2007. Microbiologia alimentelor si nutreturilor. Metode orizontale

privind tehnicile de esantionare de pe suprafete folosind placi de contact si tampoane

29. ***User Guide for the 3M™ Clean-Trace™ rapid hygiene monitoring system.

39

ANEXA

Foto 1: Placa Petri

analiza NTG pct.

recoltare 1, fara

igienizare

Foto 2 : Placa

Petri analiza

NTG pct.

recoltare 3,

procedura B

40

Foto 3: Placa

Petri analiza

NTG pct.

recoltare 6, fara

igienizare

Foto 4 : Placa

Petri analiza

NTG pct.

recoltare 2, fara

igienizare

41

Foto 5: Placa Petri

analiza NTG pct.

recoltare 3, fara

igienizare

Foto 6 : Placa Petri

analiza NTG pct.

recoltare 2, fara

igienizare

42

Foto 7: Placa Petri

analiza NTG pct.

recoltare 2,

procedura A

Foto 8: Placa Petri

analiza NTG pct.

recoltare 2,

procedura A

43

Foto 9: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 1,

procedura C

Foto 10: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 2,

procedura C

44

Foto 11: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 3,

procedura C

Foto 12: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 3,

procedura B

45

foto 13: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 2,

procedura A

foto 14: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 3,

procedura A

46

foto 15: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 1, fara

igienizare

foto 16: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 1, fara

igienizare

47

foto 17: rezultat

analiza ATP, pct.

recoltare 5,

procedura A

DETECTIA ATP Prin BIOLUMINISCENTA -Dizertatie Popazu ( Romanciuc) Claudia

Documents

Transcript of DETECTIA ATP Prin BIOLUMINISCENTA -Dizertatie Popazu ( Romanciuc) Claudia