UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE DIN BUCUREȘTI …
39
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE „CAROL DAVILA” DIN BUCUREȘTI ȘCOALA DOCTORALĂ DOMENIUL FARMACIE SCREENING FARMACOLOGIC PENTRU COMPUȘI CE ȚINTESC PATOLOGII ALE SISTEMULUI NERVOS CENTRAL REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Conducător de doctorat: PROF. UNIV. DR. NEGREȘ SIMONA Student-doctorand: MIHAI DRAGOȘ-PAUL 2021
Transcript of UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE DIN BUCUREȘTI …
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
„CAROL DAVILA” DIN BUCUREȘTI ȘCOALA DOCTORALĂ
DOMENIUL FARMACIE
SCREENING FARMACOLOGIC PENTRU COMPUȘI CE ȚINTESC
PATOLOGII ALE SISTEMULUI NERVOS CENTRAL
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Conducător de doctorat:
PROF. UNIV. DR. NEGREȘ SIMONA
Student-doctorand:
MIHAI DRAGOȘ-PAUL
2021
Cuprinsul tezei de doctorat
Introducere .......................................................................................................................... 8
I. Partea generală .......................................................................................................... 12
1. Patologii cu componentă demielinizantă ................................................................. 12
1.1. Mielina, demielinizarea și remielinizarea ............................................................ 12
1.2. Tipuri de patologii cu componentă demielinizantă .............................................. 14
1.3. Scleroza multiplă .................................................................................................. 17
1.3.1. Etiologie și epidemiologie ............................................................................. 17
1.3.2. Patogeneză ..................................................................................................... 18
1.3.3. Tablou clinic .................................................................................................. 19
1.3.4. Farmacoterapie .............................................................................................. 21
2. Modele experimentale de inducere a demielinizării ............................................... 23
2.1. Generalități ........................................................................................................... 23
2.2. Modelul cuprizonei .............................................................................................. 23
2.3. Modelul de encefalomielită autoimună experimentală (EAE) ............................. 30
2.4. Combinarea experimentală a modelului cuprizonei cu modelul EAE ................. 33
3. Canalul ionic TRPA1 .............................................................................................. 34
3.1. Generalități ........................................................................................................... 34
3.2. Structură ............................................................................................................... 34
3.3. Expresie și roluri fiziologice în organism ............................................................ 35
3.3.1. Expresie în organe și țesuturi ........................................................................ 36
3.3.2. Roluri fiziologice ........................................................................................... 38
3.4. Agoniști endogeni și exogeni ............................................................................... 39
3.5. Antagoniști ........................................................................................................... 41
3.6. Implicații patologice ............................................................................................. 43
II. Contribuții personale ................................................................................................ 47
4. Ipoteză de lucru și obiective generale ..................................................................... 47
5. Studiu comparativ între algoritmul PASS și tehnici de învățare automată pentru
identificarea de antagoniști TRPA1 ................................................................................ 49
5.1. Introducere ........................................................................................................... 49
5.2. Materiale și metode .............................................................................................. 50
5.2.1. Pregătirea bazelor de date ............................................................................. 50
5.2.2. Generarea descriptorilor ................................................................................ 50
5.2.3. Evaluarea țintelor moleculare utilizând PASS .............................................. 51
5.2.4. Rețele neuronale feedforward ....................................................................... 51
5.2.5. Pădure aleatorie ............................................................................................. 52
5.2.6. Mașini cu suport vectorial ............................................................................. 53
5.2.7. Parametri de performanță .............................................................................. 53
5.3. Rezultate ............................................................................................................... 54
5.3.1. Seturi de date ................................................................................................. 54
5.3.2. Generarea descriptorilor ................................................................................ 54
5.3.3. Parametri de performanță .............................................................................. 55
5.4. Discuții ................................................................................................................. 58
5.5. Concluzii .............................................................................................................. 60
6. Screening virtual bazat pe drug repurposing pentru identificarea unor noi potențiali
antagoniști TRPA1 .......................................................................................................... 61
6.1. Introducere ........................................................................................................... 61
6.2. Materiale și metode .............................................................................................. 62
6.2.1. Pregătirea bazelor de date ............................................................................. 62
6.2.2. Relații structură-activitate pentru inhibitori TRPA1 (SAR) ......................... 63
6.2.3. Protocol de data mining ................................................................................ 64
6.2.4. Modelare prin relații cantitative structură-activitate (QSAR) ....................... 64
6.2.5. Studii de docare moleculară .......................................................................... 65
6.2.6. Clasamentul noilor potențiali inhibitori TRPA1 ........................................... 67
6.2.7. Analiză statistică și parametri de performanță .............................................. 67
6.3. Rezultate ............................................................................................................... 68
6.3.1. Seturi de inhibitori TRPA1 și de repurposing .............................................. 68
6.3.2. Relații structură-activitate pentru inhibitorii TRPA1 .................................... 69
6.3.3. Data mining și stabilirea scorurilor ............................................................... 76
6.3.4. Modele QSAR ............................................................................................... 79
6.3.5. Docare moleculară ......................................................................................... 84
6.3.6. Clasamentul noilor potențiali inhibitori TRPA1 ........................................... 87
6.4. Discuții ................................................................................................................. 96
6.5. Concluzii .............................................................................................................. 98
7. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra deficitelor comportamentale într-un
model animal de scleroză multiplă .................................................................................. 99
7.1. Introducere ........................................................................................................... 99
7.2. Materiale și metode ............................................................................................ 100
7.2.1. Animale de experiență și tratamente ........................................................... 100
7.2.2. Teste farmacologice comportamentale ........................................................ 101
7.2.3. Substanțe și reactivi ..................................................................................... 104
7.2.4. Analiză statistică ......................................................................................... 105
7.3. Rezultate ............................................................................................................. 106
7.3.1. Sinteza cuprizonei ....................................................................................... 106
7.3.2. Mase corporale ............................................................................................ 109
7.3.3. Activitatea locomotorie ............................................................................... 113
7.3.4. Coordonarea motorie ................................................................................... 122
7.3.5. Sensibilitatea dureroasă la stimul rece ........................................................ 131
7.4. Discuții ............................................................................................................... 136
7.5. Concluzii ............................................................................................................ 138
8. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra demielinizării într-un model animal de
scleroză multiplă ........................................................................................................... 139
8.1. Introducere ......................................................................................................... 139
8.2. Materiale și metode ............................................................................................ 139
8.2.1. Animale de experiență și tratamente ........................................................... 139
8.2.2. Prelucrarea țesuturilor și realizarea secțiunilor ........................................... 140
8.2.3. Colorarea secțiunilor ................................................................................... 140
8.2.4. Analiza secțiunilor ....................................................................................... 141
8.2.5. Substanțe și reactivi ..................................................................................... 142
8.3. Rezultate ............................................................................................................. 142
8.4. Discuții ............................................................................................................... 148
8.5. Concluzii ............................................................................................................ 149
9. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra stresului oxidativ într-un model animal
de scleroză multiplă ....................................................................................................... 150
9.1. Introducere ......................................................................................................... 150
9.2. Materiale și metode ............................................................................................ 150
9.2.1. Animale de experiență și prepararea omogenatelor tisulare ....................... 150
9.2.2. Determinarea deficienței redox tisulare ...................................................... 151
9.2.3. Peroxidarea lipidelor membranare mitocondriale ....................................... 151
9.2.4. Determinarea malondialdehidei .................................................................. 152
9.2.5. Activitatea catalazei .................................................................................... 152
9.2.6. Activitatea superoxid dismutazei ................................................................ 152
9.2.7. Determinarea activității nNOS prin metoda Griess..................................... 153
9.2.8. Activitatea MAO-A și MAO-B ................................................................... 153
9.2.9. Determinarea tiolilor totali .......................................................................... 153
9.2.10. Determinarea conținutului de proteine ...................................................... 154
9.2.11. Substanțe și reactivi ................................................................................... 154
9.2.12. Analiză statistică ....................................................................................... 154
9.3. Rezultate ............................................................................................................. 155
9.4. Discuții ............................................................................................................... 167
9.5. Concluzii ............................................................................................................ 169
10. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra activității canalelor ionice TRPA1 și
TRPV1 ........................................................................................................................... 170
10.1. Introducere ....................................................................................................... 170
10.2. Materiale și metode .......................................................................................... 171
10.2.1. Determinarea activității TRPA1 și TRPV1 ............................................... 171
10.2.2. Substanțe și reactivi ................................................................................... 171
10.2.3. Analiză statistică ....................................................................................... 172
10.3. Rezultate ........................................................................................................... 172
10.4. Discuții ............................................................................................................. 176
10.5. Concluzii .......................................................................................................... 177
Concluzii și contribuții personale .................................................................................. 178
Bibliografie ....................................................................................................................... 183
Anexe ................................................................................................................................ 204
Abrevieri și simboluri
AITC – izotiocianat de alil
BHE – bariera hematoencefalică
CAT – catalaza
CC – corpul calos
CDO – creștere a densității optice
CFA – Complete Freund's adjuvant
CGRP – peptida înrudită genetic cu
calcitonina
CPA – celule care prezintă antigen
CPZ – cuprizonă
CTL – lot martor/control
CV – crezil acetat de violet
DDO – descreștere a densității optice
DO – densitate optică
DPPP – difenil-1-pirilenfosfină
EAD – encafalită acută diseminată
EAE – encefalomielită experimentală
autoimună
EDHF – factorul hiperpolarizant derivat din
endoteliu
FEB – febuxostat
FFNN – feedforward neural network, rețea
neuronală feedforward
FW – forward, metode de selecție înainte
GDNF – factorul neurotrofic derivat din
celule gliale
GPCR – receptori cuplați cu proteine G
GSH – glutation
HPC – hidroperoxid de cumen
IC50 – concentrație inhibitoare 50%
IGF-1 – insulin-like growth factor-1
JC – virusul John Cunningham
LFB – Luxol Fast Blue
LHA – leucoencefalie hemoragică acută
LIF – leukemia inhibitory factor
LMP – leucoencefalopatie multifocală
progresivă
MAO – monoaminoxidaza
MDA – malonaldehidă
MEP – mielinoliză extrapontină
MHC – complexul major de
histocompatibilitate
MLP – multilayer perceptron
MLR – multiple linear regression, modele
de regresie liniară multiplă
MNA – Multilevel Neighborhoods of Atoms
MOG – proteine mielinizante
oligodendrocitare
MOSS – testarea secvețială a abilităților
motorii
MPC – mielinoliză pontină centrală
MT – metalotionine
NGF – factorul de creștere nervoasă
nNOS – nitric oxid sintetaza neuronală
OLG – oligodendrocite mature
PASS – Predicția Spectrelor de Activitate
pentru Substanțe
PBS – phosphate-buffered saline, tampon
fosfat salin
PDGF – platelet-derived growth factor
QSAR – quantitative structure-activity
relationships, relații cantitative structură-
activitate
RE – reticul enodplasmatic
RF – random forest, pădure aleatorie
RFU – unitate relativă de fluorescență
RMSD – root mean square deviation,
deviația medie pătratică
RMSE – root mean square error, rădăcina
pătrată a erorii medii pătratice
ROC – receiver operating characteristic,
caracteristica de funcționare a receptorului
ROC AUC – area under receiver operating
characteristic curve, aria de sub curba
caracteristicii de funcționare a receptorului
RSP – risperidonă
SCI – sindromul clinic izolat
SEM – standard error of the mean, eroarea
standard a mediei
SM – scleroză multiplă
SMPP – scleroză multiplă primar progresivă
SMRR – scleroză multiplă recurent remisivă
SMSP – scleroză multiplă secundar
progresivă
SNC – sistem nervos central
SNV – sistem nervos vegetativ
SOD – superoxid dismutaza
SVM – support vector machines, mașini cu
suport vectorial
SW – stepwise, metode de selecție în trepte
TBARS – thiobarbituric acid reactive
substances, substanțe reactive la acidul
tiobarbituric
TNFα – factorul de necroză tumorală
TRH – hormonul care eliberează tirotropina
TRP – transient receptor potential channels,
canale ionice cu potențial tranzitoriu
TRPA1 – transient receptor potential
ankyrin 1
VEB – virusul Epstein Barr
VEN – venlafaxină
Introducere
Scleroza multiplă (SM) este o boală cronică autoimună care afectează sistemul nervos central
(SNC) prin neurodegenerare și demielinizare, producând tulburări neurologice și cognitive.
Conform OMS, un număr mare de adulți tineri suferă de această patologie la nivel global.
Limfocitele autoreactive care traversează bariera hematoencefalică mediază mecanismele
fiziopatologice responsabile de apariția leziunilor în SNC. Răspunsul imun este responsabil de
apariția neuroinflamației cronice, aceasta conducând la demielinizare, apoptoza oligodendrocitelor
mature, leziuni axonale, stres oxidativ, excitotoxicitate, astroglioză și microglioză.
Majoritatea tratamentelor pentru SM necesită administrare parenterală frecventă, având un
impact negativ asupra calității vieții pacienților. Anticorpii monoclonali utilizați prezintă costuri
ridicate de tratament, aceștia fiind prescriși pentru forme ale SM extrem de active sau recidivante-
remitente, la pacienți care nu răspund la terapii imunomodulatoare de primă linie.
Terapii noi pentru SM sunt necesare având în vedere limitările tratamentelor actuale privind
eficiența și siguranța. O țintă moleculară viabilă pentru tratarea SM pare să fie canalul de calciu
TRPA1, a cărui inhibiție s-a dovedit a avea efecte benefice asupra celulelor gliale și protejează
împotriva demielinizării.
Receptorul TRPA1 este un canal de calciu ligand-dependent, activat de o multitudine de
agenți iritanți electrofili din mediu (alicină, acroleină, ulei de muștar), lipide endogene oxidate și
nitrate și specii reactive de oxigen. Canalul de calciu TRPA1 este exprimat în mai multor organe
și țesuturi, inclusiv la nivelul sistemului nervos periferic și central. Astfel, agoniștii TRPA1
prezintă roluri importante în durerea inflamatorie și neuropată, dar și în procesele de demielinizare.
Antagoniștii TRPA1 sunt o alegere promițătoare pentru tratamentul durerii, având o serie de
avantaje față de alegerile terapeutice actuale. De asemenea, blocarea canalului TRPA1 exprimat la
nivelul astrocitelor a fost propusă și ca potențială intervenție terapeutică în SM.
Modelul experimental de demielinizare prin administrarea cuprizonei este unul dintre
modelele larg utilizate pentru studierea fiziopatologiei SM și a medicamentelor cu posibilă utilitate
în această patologie. Cuprizona este un agent toxic ce chelează cuprul și produce apoptoza
oligodendrocitelor (celule gliale responsabile de mielinizarea axonală la nivelul SNC) prin
afectarea homeostaziei cuprului și prin efecte inhibitoare enzimatice. Tratamentul cu cuprizonă
produce la șoareci demielinizare severă la nivelul corpului calos, neuroinflamație, stres oxidativ și
deficite comportamentale.
O mare varietate de metode in silico sunt utilizate în proiectarea medicamentelor pentru a
accelera dezvoltarea de noi compuși activi, cum ar fi studiile de docare moleculară, modelarea prin
relații cantitative structură-activitate (QSAR) și implementarea algoritmilor de clasificare ce
utilizează tehnici de învățare automată. Metodele ce utilizează inteligența artificială pot îmbunătăți
semnificativ procesul de descoperire a medicamentelor și este un domeniu atractiv care poate reuni
informaticieni și experți în dezvoltarea medicamentelor.
Obiectivele generale ale cercetării au fost următoarele:
• implementarea metodelor de screening in silico pentru identificarea de noi potențiali antagoniști
TRPA1, cu posibilă utilitate în tratamentul SM;
• efectuarea unor studii in vitro pentru confirmarea sau infirmarea activității compușilor rezultați
în urma screening-ului;
• evaluarea eficacității compușilor aleși în modelul animal de SM bazat pe intoxicația cu
cuprizonă, efectuând teste farmacologice experimentale, determinări histologice pe țesut
cerebral și determinări biochimice pe omogenat tisular.
I. Partea generală
1. Patologii cu componentă demielinizantă
Scleroza multiplă (SM) este o boală autoimună cronică, debilitantă a sistemului nervos
central (SNC). Aceasta apare la un număr semnificativ de adulți tineri din întreaga lume, afectând
30 din 100.000 de persoane conform OMS [1,2]. Mecanismele patologice responsabile de leziunile
SNC sunt mediate de limfocite reactive care traversează bariera hematoencefalică (BHE) și sunt
activate ulterior. Răspunsul imun adaptiv generează neuroinflamație cronică, ceea ce duce la
demielinizare, pierderea oligodendrocitelor mature, leziuni axonale, stres oxidativ, excitotoxicitate,
astroglioză și microglioză (Fig. 1.1) [3–5].
Din păcate, SM este o patologie care nu beneficiază de o gamă largă de tratamente
farmacologice, spre deosebire de alte boli ale SNC. Terapiile disponibile modificatoare de boală
includ interferoni beta 1a și 1b, peginterferon 1a, glatiramer acetat, mitoxantronă, teriflunomidă,
fingolimod, dimetil fumarat, cladribină, azatioprină, ciclofosfamidă, natalizumab, ocrelizumab și
alemtuzumab [6–8]. Cu toate acestea, majoritatea tratamentelor pentru SM necesită administrare
parenterală frecventă, ceea ce are un impact negativ asupra calității vieții pacienților. Natalizumab,
ocrelizumab și alemtuzumab sunt anticorpi monoclonali cu costuri ridicate de tratament, prescriși
doar ca medicamente pentru forme ale SM extrem de active sau recidivante-remitente, care nu au
putut fi tratate cu terapii imunomodulatoare de primă linie [9,10]. Agenții antineoplazici
(mitoxantronă, ciclofosfamidă), utilizați ca medicamente de a doua linie pentru pacienții cu
patologie extrem de debilitantă și fără alte alternative terapeutice, au un spectru vast de reacții
adverse [6]. Întrucât medicamentele actuale cu moleculă mică au o eficacitate limitată și nu reușesc
să prevină recăderea pe termen lung, comunitatea științifică medico-farmaceutică depune eforturi
continue pentru dezvoltarea de noi medicamente pentru SM, cu profiluri de eficiență și siguranță
favorabile [11].
Fig. 1.1. Mecanisme fiziopatologice implicate în patogenia SM (creat cu BioRender.com).
2. Modele experimentale de inducere a demielinizării
Modelul cuprizonei și encefalomielita autoimună experimentală (EAE) sunt cele mai
frecvent utilizate modele animale pentru a studia compușii activi proiectați pentru a atenua
procesele fiziopatologice ale SM. EAE este indusă prin imunizarea cu peptide specifice mielinei
sau țesut SNC și un adjuvant imunogen (care conține componente bacteriene). Aceste componente
generează caracteristici patologice similare SM, precum infiltrate inflamatorii, pierdere axonală,
demielinizare și glioză [12]. Celălalt model se bazează pe intoxicație cu cuprizonâ, un agent
chelator de cupru [13,14]. Neurotoxicitatea indusă de cuprizonă este cauzată de inhibiție enzimatică
și de perturbarea homeostaziei cuprului la nivel central, ducând la neuroinflamație, stres oxidativ,
degenerarea tecii de mielină, apoptoza oligodendrocitelor, tulburări ale metabolismului
neuromediatorilor, tulburări axonale, activarea microgliilor și astroglioză (Fig. 2.1) [15].
Mai mult, leziunile demielinizante în cazul șoarecilor intoxicați au fost corelate cu afectarea
activității locomotorii, coordonării motorii și a memoriei spațiale, reducerea interacțiunii sociale și
creșterea comportamentului exploratoriu [13,16]. În modelul experimental de scleroză multiplă
indus prin administrarea cuprizonei la șoareci, demielinizarea apare în principal la nivelul corpului
calos (CC) și a scoarței cerebrale și este maximă după 5 săptămâni de intoxicație.
Cercetări anterioare au arătat că agentul chelator afectează selectiv oligodendrocitele mature
(OLG), stresul oxidativ fiind o cauză directă a apoptozei acestora. Unele dintre tulburările balanței
redox care cresc vulnerabilitatea OLG mature în timpul tratamentului cu cuprizonă sunt reducerea
conținutului de glutation (GSH), creșterea peroxidării lipidelor, scăderea activității superoxid
dismutazei (SOD) și a catalazei (CAT) [15]. Activitatea crescută a nitric oxid sintetazei neuronale
(nNOS) a fost, de asemenea, corelată cu demielinizarea indusă de cuprizonă [17].
Fig. 2.1. Reprezentare schematică a procesului demielinizării induse prin administrarea CPZ la șoareci.
CPZ – cuprizonă, SRO – specii reactive de oxigen (creat cu BioRender.com).
3. Canalul ionic TRPA1
Canalele de calciu TRPA1 de la nivel astrocitar reglează apoptoza oligodendrocitelor
indicând faptul că inhibarea farmacologică a TRPA1 ar putea produce efecte protectoare împotriva
demielinizării într-un model animal de SM [18]. TRPA1, un membru al superfamiliei TRP,
acționează în primul rând ca un senzor pentru speciile reactive chimice. Este exprimat în diferite
țesuturi, inclusiv în astrocitele de la nivelul hipocampului, modulând astfel nivelurile de calciu,
transmiterea sinaptică și potențarea pe termen lung. TRPA1 este de asemenea exprimat la rozătoare
și în neuronii hipocampali și corticali, vasele corticale, nucleul supraoptic, corpul striat, amigdala,
bulbul olfactiv și măduva spinării [19–24]. TRPA1 este activat endogen de lipide oxidate și nitrate,
specii reactive de oxigen, 7-dehidrocolesterol, iar blocarea acestuia de către antagoniști ar putea
oferi mijloace noi pentru tratarea inflamației, durerii neuropate și a sclerozei multiple [16,25–29].
TRPA1 este un receptor tetrameric ce formează un singur por, iar din punct de vedere
structural este caracterizat de 14-16 motive repetate de tip ankirină. Aceste motive mediază
interacțiuni de tip proteină-proteină cu proteinele de la nivelul citoscheletului [29,30]. Subunitățile
transmembranare conțin 6 alfa-helixuri, un domeniu intracelular ce conține capătul C-terminal și
un domeniu intracelular ce conține capătul N-terminal. Capătul N-terminal conține resturi de lizină
și cisteină reactive [29]. Au fost identificați o serie de liganzi endogeni ce acționează ca activatori:
lipide oxidate (4-hidroxi-2-nonenal, prostaglandine), lipide nitrate, specii reactive de oxigen și 7-
dehidrocolesterol [25–28]. Agoniștii exogeni pot forma fie aducți covalenți cu resturile de lizină și
cisteină din capătul N-terminal (cinamaldehidă, alicină, acroleină) [29,31,32], fie pot induce
activarea prin legare non-covalentă (mentol, timol, carvacrol, nicotină, clotrimazol, nifedipină,
diclofenac) [33]. Inhibitorul TRPA1 standard A-967079 se leagă de receptor la nivelul unui situs
format din subunitățile 4-6, iar antagonistul HC-30031 interacționează cu reziduul Asn855, la
nivelul linker-ului dintre helixurile transmembranare 4 și 5 [34,35]. Structura cristalină a canalului
TRPA1, determinată prin microscopie electronică, este reprezentată în Fig. 3.1 (PDB 3J9P).
Descoperirea antagoniștilor TRPA1 poate fi un instrument promițător în tratarea anumitor
boli, inclusiv durerea neuropată, inflamația și scleroza multiplă [18,29]. În cadrul eforturile de
descoperire a unor agenți farmacologici noi pentru tratarea durerii, mai mulți antagoniști TRPA1
cu eficacitate in vivo dovedită au fost dezvoltați de industria farmaceutică și mediul academic:
derivați de xantină [36,37], tricloro(sulfanil)etil benzamide [38], ftalimide, și structuri înrudite [39]
Fig. 3.1. Structura cristalină a canalului de calciu TRPA1 și situsurile de legare presupuse pentru
antagoniștii A-967079 și HC-030031 [40].
II. Contribuții personale
4. Ipoteză de lucru și obiective generale
În prezenta lucrare au fost propuse implementarea unor metode de screening virtual pentru
identificarea unor noi antagoniști TRPA1, cu posibilă utilitate în tratamentul sclerozei multiple,
confirmarea sau infirmarea in vitro a activității acestora și testarea eficacității lor într-un model
animal de SM. Metodologia ce descrie screening-ul farmacologic bazat pe drug repurposing
destinat identificării de noi potențiale tratamente pentru SM este schematizată în Fig. 4.1.
Fig. 4.1. Schema generală a metodologiei de screening farmacologic bazat pe drug repurposing.
5. Studiu comparativ între algoritmul PASS și tehnici de învățare automată
pentru identificarea de antagoniști TRPA1
Studiul de față a avut ca obiectiv evaluarea performanței algoritmului PASS în identificarea
cu succes a antagoniștilor canalului de calciu TRPA1, dar și construirea și validarea unor algoritmi
de inteligență artificială pe baza aceleiași clase de descriptori moleculari. De asemenea, a fost
realizat un studiu comparativ între PASS și algoritmii de învățare automată implementați pentru a
identifica metoda de predicție cu parametri de performanță optimi.
Materiale și metode
A fost evaluată eficiența algoritmului PASS (Predicția Spectrelor de Activitate pentru
Substanțe) ca instrument pentru identificarea de noi antagoniști TRPA1, iar parametrii de
performanță au fost comparați cu trei algoritmi de învățare automată utilizați frecvent în cercetarea
descoperirii medicamentelor: rețele neuronale feedforward (FFNN), păduri aleatorii (RF) și mașini
cu suport vectorial (SVM). Toate cele trei metode de învățare automată au folosit aceleași variabile
independente (descriptori MNA) cu cele utilizate de PASS.
Cei trei algoritmi de inteligență artificială au fost antrenați utilizând modulul python keras.
Pentru a valida modelele de clasificare, a fost utilizată o validare încrucișată de 10 ori și a fost
determinată ROC AUC medie pentru valorile obținute după fiecare rundă de validare.
Performanța modelelor a fost evaluată calculând acuratețea globală (ACC, accuracy),
acuratețea echilibrată (bACC, balanced accuracy), sensibilitatea (sensitivity) sau rata de pozitivi
adevărați (TPR, true positive rate), specificitatea (specificity) sau rata de negativi adevărați (TNR,
true negative rate), rata de fals pozitivi (FPR, false positive rate) și valoarea predictivă a negativilor
(NPV, negative predictive value).
Rezultate și discuții
Toate cele trei metode de învățare automată au depășit performanța programului PASS.
Modelul cu cea mai mare acuratețe și cu cei mai optimi parametri de performanță a fost un algoritm
RF, care a avut o acuratețe de 99% și ROC AUC de 0,9936. Astfel, studiul a subliniat că algoritmii
de învățare automată mai simpli și robuști (precum RF) au o performanță mai bună în clasificarea
corectă a antagoniștilor TRPA1, deoarece dimensiunea setului de variabile dependente este relativ
modestă (Tabelul 5.1).
Tabel 5.1. Parametrii de performanță pentru fiecare algoritm.
Algoritm TPR (%) TNR (%) ACC (%) bACC (%) FPR (%) NPV (%) ROC
AUC
RF 100 96 99 98 4 100 0,9936
SVM 92 84 90 88 16 77,78 0,9354
FFNN 90,67 80 88 85,33 20 74,07 0,9354
PASS 48 76 55 62 24 32,76 0,6200
RF – pădure aleatorie; SVM – mașini cu suport vectorial; FFNN – rețea neuronală feedforward; PASS –
Predicția Spectrelor de Activitate pentru Substanțe; TPR – rată de pozitivi adevărați (sensibilitate); TNR –
rată de negativi adevărați (specificitate); ACC – acuratețe; bACC – acuratețe echilibrată; FPR – rată de fals
pozitivi; NPV – valoare predictivă a negativilor; ROC AUC – arie sub curba caracteristicii de funcționare a
receptorului.
6. Screening virtual bazat pe drug repurposing pentru identificarea unor noi
potențiali antagoniști TRPA1
. O preocupare tot mai mare a fost observată la nivel mondial pentru anumite metode
promițătoare și mai puțin costisitoare de descoperire a medicamentelor. Strategiile de drug
repurposing implică explorarea de noi potențiale ținte biologice pentru molecule deja autorizate de
agențiile de reglementare a medicamentului sau în stadii înaintate de dezvoltare, ca mijloc de a
accelera procesul de identificare a unor noi candidați pentru tratarea bolilor de mare interes [41,42].
Metodele de descoperire a medicamentelor asistate de computer au fost îmbunătățite continuu în
ultimii ani, ducând la reducerea costurilor și a timpului necesar pentru identificarea și optimizarea
noilor molecule lead, dar și ca instrumente pentru identificarea de noi utilizări terapeutice pentru
medicamente [43–45]. Având în vedere atractivitatea unor astfel de strategii pentru descoperirea
unor terapii noi [46], am efectuat studii de screening in silico bazate pe data mining, clasificare și
modelare utilizând relații cantitative structură-activitate (QSAR) și tehnici de docare moleculară,
pentru a identifica potențiali antagoniști ai TRPA1 ce pot servi drept soluții terapeutice pentru
pacienții cu SM.
Materiale și metode
Un algoritm de screening ce vizează descoperirea de noi antagoniști TRPA1 a fost
conceptualizat utilizând abordări in silico larg utilizate. Algoritmul propus este rezumat în Fig. 6.1
și a constat în combinarea mai multor metode într-o estimare globală a probabilității unei activități
inhibitoare puternice asupra TRPA1. Metodologia implementată s-a concentrat pe dezvoltarea unui
model predictiv care îmbină mai multe tehnici de screening (data mining, modelarea QSAR de tip
clasificare și regresie și docare moleculară). Potențialii inhibitori TRPA1 identificați au fost filtrați
ulterior pe baza proprietăților fizico-chimice stabilite drept predictori pentru o probabilitate mare
de difuziune prin bariera hematoencefalică (BHE) [47].
Fig. 6.1. Algoritm de screening virtual pentru identificarea de noi potențiali inhibitori TRPA1.
Rezultate și discuții
Analiza scheletelor structurale a inhibitorilor TRPA1 a rezultat în 46 schelete Bemis-Murcko,
51 inele simple și 26 inele cele mai centrale. O parte dintre schelete au fost asociate cu o activitate
biologică semnificativ mai mare, iar pragul de semnificație statistică a fost stabilit p < 0,01, în
vederea creșterii puterii discriminante a testului. Analiza statistică a grupurilor de atomi numărați
de funcția descriptorului Smarts Kier-Hall a arătat că 13 grupuri de atomi au fost regăsite în
structuri cu o potență inhibitoare mai mare. Șase dintre grupurile de atomi identificate au avut
valori medii ale pIC50 mai mari de 7 M.
O strategie de minat grafuri a fost utilizată în continuare pentru a identifica potențiali
inhibitori TRPA1. Baza de date DrugBank a fost scanată în vederea identificării de substanțe
medicamentoase ce conțin scheletele structurale și grupurile de atomi cu relevanță statistică,
stabilită anterior. Niciun compus nu a fost identificat utilizând scheletele Bemis-Murcko, deoarece
acestea sunt probabil foarte specifice pentru blocanții TRPA1. Criteriul de data mining bazat pe
similaritatea descriptorilor de tip flexofori a generat 981 perechi între 203 inhibitori TRPA1
cunoscuți și 356 molecule din DrugBank. Procentele de similaritate au variat între 81,01% și
98,32%.
Scorurile calculate pe baza analizei SAR au însumat prezența similarității, inelului cel mai
central MCR-1, inelelor simple PR-1, PR-3, PR-6-8 grupurile atomice cu valori medii ale pIC50
mai mari de 7 M (AG-4, AG-5, AG-7, AG-8, AG-10, AG-12). Valorile scorului au fost cuprinse
între 1 și 10 (4,82 ± 2,82) pentru setul de inhibitori TRPA1, între 0 și 6 (1,50 ± 0,92) pentru
biblioteca virtuală DrugBank și între 1 și 4 (2,41 ± 0,79) pentru setul decoy. Structurile din
Drugbank ce au prezentat fie o similaritate a flexoforilor înaltă și minimum 2 caracteristici grafice
comune, fie doar caracteristici grafice comune (minimum 3) au fost selectate pentru screening
ulterior, criteriul de includere fiind stabilit la o valoare prag a scorului egală cu 3. Astfel, un total
de 903 structuri au fost selectate pentru repurposing.
Modelul de clasificare generat a prezentat parametri statistici substanțiali cu o bună acuratețe,
atât pentru setul de antrenament (calibrare), cât și pentru cel de testare (validare). Acuratețea
globală a modelului de predicție a clasei de activitate a fost de 83,5%, iar ROC AUC a avut valoarea
0,890 (Fig. 6.11).
Fig. 6.11. (a) curba ROC globală pentru modelul de clasificare generat; (b) curbele ROC pentru
clasificatorii aleși pentru setul de antrenament.
Activitatea biologică exprimată cantitativ prin valoarea negativă logaritmică a IC50
(pIC50pred), pentru biblioteca virtuală de repurposing a fost calculată utilizând regresii liniare
multiple. Zece ecuații de tip pas cu pas și zece ecuații de tip înainte au fost construite, iar un singur
model generat prin ambele metode a fost ales în funcție de parametrii de calitate ai modelului.
Coeficienții de regresie sunt prezentați în următoarea ecuație:
pIC50 = 0,0004 × GRAV4 − 0,3038 × khs. dO − 0,0954 × nHBAcc + 0,2523 × C2SP3 +
0,0117 × DPSA3 − 0,0944 × khs. ssCH2 − 1,1296 × nAcid + 1,2054 × khs. ddsN − 0,0600 ×
C2SP2 − 3,2101 × MDEN13 + 0,0939 × C3SP2 + 4,2769.
Modelele QSAR generate au prezentat valori ale lui R2 cuprinse între 0,671 și 0,744, valori
ale lui R2pred între 0,499 și 0,681, în timp ce reziduurile au variat între -2,367 și -1,735 pentru cele
minime, respectiv între 1.272 și 2,018 pentru cele maxime. Modelul ales a fost identificat prin
ambele metode de selecție a variabilelor independente. Validarea modelului QSAR a fost făcută cu
succes, ținând cont de faptul că valorile coeficienților de determinare pentru ambele seturi au fost
mai mari de pragul de 0,5, acesta fiind considerat un indice al acceptabilității robusteții modelului
(Fig. 6.12).
Un studiu de docare moleculară a fost efectuat pentru a prezice afinitățile de legare pentru
liganzii supuși screening-ului. Protocolul de optimizare și docarea utilizând resturi de aminoacizi
flexibile au generat conformații favorabile a situsurilor active, specifice pentru ambii antagoniști
standard, A-967079 și HC-030031. Valoarea rădăcinii pătrate a deviației medii pătratice (RMSD,
root mean square deviation) a proteinei optimizate față de structura originală a fost 0,7242 Å.
Fig. 6.12. Diagrama de corelație dintre valorile pIC50 experimentale și cele prezise prin regresie liniară
multiplă (pIC50pred) pentru setul de inhibitori TRPA1 (R2global = 0,700).
Scorurile de docare (energii de legare, ΔG) ale inhibitorilor TRPA1 au variat între -9,7 și -
4,9 kcal/mol, cu o valoare medie de -7,37 ± 0,89 kcal/mol. A fost obținut un coeficient de
determinare scăzut între valorile experimentale ale pIC50 și energiile de legare (Fig. 6.16, R2 =
0,226), dar cu înaltă semnificație statistică (testul Pearson, p < 0,0001). [48]. De asemenea, au fost
observate valori medii ale ΔG diferite din punct de vedere statistic între grupurile de inhibitori slabi
și puternici (testul t-Student, p < 0,0001). Acest fapt a confirmat că algoritmul de docare a prezentat
capacități discriminante între compușii activi și cei inactivi, putând fi astfel potrivit pentru
screeningul virtual al candidaților noi. Afinitățile de legare prezise pentru compușii din DrugBank
au variat între -10,4 și -4,1 kcal/mol, cu o valoare medie de -7,30 ± 1,01 kcal/mol.
Un model de regresie logistică multiplă binară a fost construit pentru a crea un clasament al
moleculelor din DrugBank supuse screening-ului, în funcție de probabilitatea de a exercita un efect
antagonist puternic asupra TRPA1. Clasa de activitate prezisă, valorile prezise ale pIC50 și energiile
de legare ale inhibitorilor TRPA1 slabi și puternici au fost utilizate drept variabile independente
pentru generarea și validarea unui model predictiv, pentru estimarea globală a activității biologice.
Modelul rezultat a prezentat o acuratețe înalt satisfăcătoare de 94,3%, demonstrând o capacitate
predictivă crescută a activității inhibitoare pentru setul de validare.
Valori foarte bune ale ROC AUC au fost obținute atât pentru setul de calibrare, cât și pentru
cel de validare, iar performanța globală a fost redată de o valoare ROC AUC egală cu 0,978 (Fig.
6.17). De asemenea, o acuratețe crescută de 92,1% a fost obținută utilizând setul decoy pentru
validare secundară, doar 6 din cele 76 de molecule fiind prezise incorect drept active. Prin urmare,
algoritmul propus a adus o creștere a preciziilor individuale ale modelelor predictive anterioare,
reducând dintre punctele slabe ale acestora, precum valorile scăzute ale coeficientului de
determinare și acuratețea clasificării sub 90%. Modelul matematic al regresiei logistice generate
este reprezentat prin următoarea ecuație:
𝑃 = 11 + exp[−(2,725 × Clasă + 3,967 × pIC50pred − 0,404 × ΔG − 29,986)]⁄
Fig. 6.16. Diagrama de corelație dintre valorile experimentale ale pIC50 (M) și energiile de legare prezise
(kcal/mol) pentru antagoniștii TRPA1 în urma simulărilor de docare moleculară (R2 = 0,226).
Fig. 6.17. (a) curba ROC pentru setul de calibrare (antrenament); (b) curba ROC pentru setul de validare
(testare); (c) curba ROC globală pentru modelul predictiv.
Clasele de activitate prezise, valorile pIC50pred și energiile de legare ale moleculelor din
DrugBank au fost introduse în modelul de predicție generalizat, bazat pe ecuația de regresie
logistică generată anterior. Ulterior a fost realizat un clasament primar al potențialilor antagoniști
și au fost identificați 310 medicamente și substanțe druglike cu probabilități de blocare TRPA1 de
peste 50%. Dintre aceștia, 196 compuși au avut probabilități mai mari de 90%, 160 peste 95% și
107 molecule au prezentat probabilități de peste 99%. Compușii hit rezultați în urma clasamentului
primar au fost filtrați ulterior prin înlăturarea structurilor cu proprietăți fizico-chimice situate în
afara cerințelor necesare unei bune difuziuni prin bariera hematoencefalică. Prin urmare, doar 97
de candidați cu probabilități mai mari de 50% au fost identificați ca potențiali antagoniști TRPA1
cu posibilă utilitate în tratamentul sclerozei multiple.
Molecule hit interesante identificate prin algoritmul de screening combinat ar fi alte 3
medicamente autorizate, 2 fiind molecule destinate afecțiunilor la nivelul SNC, iar una fiind
utilizată într-o patologie non-centrală: desvenlafaxina, metabolitul principal al venlafaxinei
(antidepresiv inhibitor neselectiv al recaptării serotoninei și noradrenalinei), paliperidona,
metabolitul activ al risperidonei (antipsihotic atipic, antagonist al receptorilor dopaminergic D2 și
serotoninergic 5-HT2A), și febuxostat (antigutos, inhibitor necompetitiv al xantin oxidazei). Toate
cele 3 medicamente au prezentat câteva caracteristici structurale identificate prin analiza SAR drept
relevante statistic pentru o inhibiție TRPA1 potentă. Desvenlafaxina și paliperidona au prezentat o
energie de legare prezisă mai mică decât pragul sugerat prin analiza diagramei de dispersie dintre
energia de legare și probabilitatea de inhibare TRPA1. Analiza complexelor proteină-ligand prezise
pentru cele trei molecule a indicat faptul că desvenlafaxina poate fi un blocant allosteric promițător
al porului canalului ionic prin interacțiunea cu situsurile de legare specifice atât pentru A-967079,
cât și pentru HC-030031. Paliperidona și febuxostat au prezentat potențialul de a produce o
inhibiție allosterică prin interacțiunea cu situsul de legare putativ pentru HC-030031.
7. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra deficitelor comportamentale
într-un model animal de scleroză multiplă
În studiul de față am propus investigarea efectelor febuxostatului și ale moleculelor părinte
venlafaxină și risperidonă asupra consecințelor demielinizării acute induse de cuprizonă la șoareci,
prin evaluarea activității locomotorii, performanței motorii și a sensibilității la un stimul rece [49].
Deoarece atât desvenlafaxina, cât și paliperidona sunt metaboliți cu costuri mari de tratament, am
ales investigarea in vivo a efectelor moleculelor lor părinte [50,51].
Materiale și metode
Procedurile experimentale privind manipularea și studierea animalelor de experiență au fost
efectuate în conformitate cu normele de bioetică în cercetarea pe animale de experiență în scop
științific, conform Legii 43/2014 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice și
Directivei 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010, privind
protecția animalelor utilizate în scopuri științifice. Protocolul experimental a fost aprobat de
Comisia de Bioetică a Facultății de Farmacie, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol
Davila” din București, România.
Animalele de experiență utilizată au fost împărțite în 5 loturi experimentale, iar masele
corporale au fost determinate o dată la 2 zile. Toate tratamentele au fost administrate zilnic, timp
de 5 săptămâni prin gavaj oral, astfel: apă distilată 0,1 mL/10g (martor/control, CTL, n = 10);
cuprizonă 400 mg/kg și apă distilată (referință, model experimental de demielinizare, CPZ, n = 10);
cuprizonă și venlafaxină 60 mg/kg (CPZ+VEN, n = 8); cuprizonă și risperidonă 2 mg/kg
(CPZ+RSP, n = 8); cuprizonă și febuxostat 5 mg/kg (CPZ+FEB, n = 8).
La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost eutanasiați pentru analize ulterioare, în
conformitate cu ghidurile standard, prin administrare intraperitoneală de tiopental sodic 200 mg/kg.
Fiecare lot a fost împărțit apoi în două subgrupuri, pentru analize histologice (n = 3-4), respectiv
biochimice (n = 5-6).
O serie de teste comportamentale au fost efectuate pentru determinarea efectelor
demielinizării și evaluarea acțiunii protectoare față de acestea a medicamentelor administrate.
Astfel, au fost evaluate activitatea locomotorie spontană (aparatul Activity Cage), coordonarea
motorie (testul Rotarod) și sensibilitatea la stimul rece (testul de evaporare a acetonei). Studiile
anterioare au raportat că șoarecii intoxicați cu cuprizonă nu au prezentat semne de hiperalgezie
termică sau mecanică [52]. În cercetarea de față s-a investigat dacă pierderile de mielină alterează
sensibilitatea la stimuli reci la șoarecii tratați cu cuprizonă, dar și capacitatea medicamentelor
administrate de a preveni astfel de efecte.
Cuprizona a fost sintetizată în laborator începând de la acid oxalic (Chemical Company, Iași,
România), metanol, acid sulfuric, hidrat de hidrazină și ciclohexanonă (Sigma Aldrich, St. Louis,
MO, SUA).
Analiza statistică a datelor experimentale obținute a fost efectuată utilizând programele
GraphPad Prism v.9.1.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA) și IBM SPSS Statistics
24-26 (Armonk, New York, NY, SUA).. Diferențele dintre loturi au fost analizate utilizând testul
ANOVA unifactorial (pentru date parametrice), urmat de testul post-hoc Bonferroni și testul
Kruskal-Wallis (pentru date nonparametrice), urmat de testul post-hoc Dunn
În cazul rezultatelor obținute la finalul tratamentului (după 5 săptămâni), a fost aplicat testul
ANCOVA unifactorial, utilizând datele inițiale drept covariată și testul post-hoc Bonferroni-Holm
pentru corecție. Rezultatele din testele inițiale ce au servit drept covariate au fost utilizate pentru a
calcula mediile și estimările intervalului de încredere 95%.
Rezultate și discuții
În experimentul de față, cuprizona nu a modificat semnificativ activitatea locomotorie pe
perioada tratamentului, observându-se doar o creștere aparentă, nesemnificativă statistic, a
numărului de mișcări în plan vertical după 4 săptămâni de tratament. Șoarecii tratați cu cuprizonă
au avut mase corporale semnificativ mai mici după 1, respectiv 2 săptămâni, comparativ cu valorile
inițiale, aceste variații fiind similare cu cele raportate în alte studii [53]. Cuprizona a redus
semnificativ statistic performanța motorie a șoarecilor după 3 săptămâni de tratament, iar efectul
s-a menținut până la finalul experimentului. În plus, sensibilitatea dureroasă la stimul rece a fost
afectată de către demielinizare doar după 5 săptămâni de tratament.
Tratamentul concomitent cu venlafaxină 60 mg/kg a produs o scădere ușoară,
nesemnificativă a numărului de mișcări în plan vertical în toate cele 3 săptămâni. De asemenea,
venlafaxina a avut un efect protector atât față de deficitul motor indus de cuprizonă. Venlafaxina a
prezentat cel mai intens efect privind sensibilitatea dureroasă la stimul rece. Studiile anterioare au
raportat că venlafaxina (6, 20 și 60 mg/kg) a redus neuroinflamația în modelul encefalomielitei
autoimune experimentale, prin suprimarea citokinelor proinflamatorii, dar și că mediază
mecanismele imunomodulatoare la nivelul SNC. [54,55]. De asemenea, venlafaxina (16 mg/kg) a
produs efecte anti-apoptotice semnificative prin activarea căii Akt în hipocamp [56].
Risperidona în doze de 2 mg/kg a prevenit deficitul motor și hiposensibilitatea la stimul rece
induse de cuprizonă, după 5 săptămâni de tratament. În schimb, risperidona a produs sedare intensă
după 3, respectiv 4 săptămâni de tratament (comparativ cu cuprizona) și o creștere în greutate după
3, 4, respectiv 5 săptămâni, raportat la valorile inițiale. Aceste variații ale masei corporale și ale
activității motorii sunt în concordanță cu alte raportări din literatura de specialitate [57]. După 5
săptămâni, activitatea locomotorie a șoarecilor tratați cu risperidonă a revenit la normal, instalându-
se probabil o toleranță față de efectul deprimant al acesteia. Risperidona a avut efecte benefice
semnificative după 5 săptămâni, îmbunătățind atât deficitul motor indus de cuprizonă, cât și
sensibilitatea dureroasă. Un studiu anterior a arătat că risperidona (3 mg/kg) a redus activarea
microgliilor și macrofagelor într-un model encefalomielită autoimună experimentală, însă un
studiu clinic recent a indicat faptul că pacienții cu scleroză multiplă progresivă pot prezenta o
sensibilitate crescută la risperidonă [58,59].
Febuxostat în doză de 5 mg/kg a produs o scădere ușoară, nesemnificativă, a numărului de
mișcări în plan vertical după 3, respectiv 4 săptămâni de tratament. Febuxostat a avut un efect
protector semnificativ față de deficitul motor observat după 3 săptămâni, însă acest efect nu a
prezentat semnificație statistică și la finalul tratamentului. Febuxostat a ameliorat semnificativ
sensibilitatea alterată la stimul dureros rece. Studii anterioare au demonstrat că inhibarea xantin
oxidazei de către febuxostat (0,75 mg/kg) previne degradarea axonilor și a mielinei și restabilește
funcția mitocondrială în modelul encefalomielitei autoimune experimentale [60,61].
Activitatea locomotorie determinată la finalul celor 5 săptămâni de tratament este ilustrată în
Fig. 7.14 și Fig. 7.15. Nu au fost constatate modificări semnificative ale numărului de mișcări în
plan orizontal, loturile experimentale prezentând valori medii apropiate ale acestuia (ANCOVA,
F(4, 38) = 0,24, p > 0,05). Nici variațiile numărului de mișcări în plan vertical nu au fost semnificative
statistic (ANCOVA, F(4, 38) = 1,20, p > 0,05). Numărul de mișcări în plan vertical a fost aparent
crescut de cuprizonă cu 10,36%, comparativ cu martorul (p > 0,05), iar asocierile CPZ+VEN,
CPZ+RSP și CPZ+FEB au produs scăderi aparente ale numărului de mișcări în plan vertical cu
29,23, 10,00, respectiv 7,12% (p > 0,05 vs. CPZ).
În
tr
er
up
er
i în
pla
n o
riz
on
ta
l
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
a
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
5 0 0
6 0 0
7 0 0
8 0 0
În
tr
er
up
er
i în
pla
n o
riz
on
ta
l
b
Fig. 7.14. Activitatea locomotorie după 5 săptămâni de tratament – numărul de mișcări (întreruperi) în
plan orizontal. (a) Medie ± S.E.M. (b) Medie ± interval de încredere 95% estimat după tratament
(utilizând datele din testarea inițială drept covariate).
În
tr
er
up
er
i în
pla
n v
er
tic
al
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
a
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
În
tr
er
up
er
i în
pla
n v
er
tic
al
b
Fig. 7.15. Activitatea locomotorie după 5 săptămâni de tratament – numărul de mișcări (întreruperi) în
plan vertical. (a) Medie ± S.E.M. (b) Medie ± interval de încredere 95% estimat după tratament (utilizând
datele din testarea inițială drept covariate).
După 5 săptămâni de tratament s-au putut observa efecte semnificative ale tratamentelor
asupra performanței motorii (ANCOVA, F(4,38) = 2,98, p = 0,031, Fig. 7.22). Tratamentul cu
cuprizonă a redus semnificativ coordonarea motorie, cu 14,46%, comparativ cu lotul martor (p =
0,007, corecție Bonferroni-Holm). Tratamentul cu venlafaxină a produs un efect protector
împotriva acțiunii cuprizonei. Latența pentru lotul CPZ+VEN a crescut cu 17,54%, comparativ cu
grupul CPZ (p = 0,008). Risperidona a prezentat, de asemenea, un efect protector, crescând latența
cu 18,88% comparativ cu cuprizona (p = 0,009). Tratamentul cu febuxostat nu a crescut
semnificativ statistic performanța motorie, observându-se o creștere a acesteia cu 12,26% (p =
0,063).
Tim
p (
s)
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
1 5 0
2 5 0
3 5 0
a
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
2 2 5
2 7 5
3 2 5
Tim
p (
s)
b
* *
# # # #
Fig. 7.22. Coordonarea motorie după 5 săptămâni de tratament – latența (s) căderii de pe tamburul
rotativ. (a) Medie ± S.E.M. (b) Medie ± interval de încredere 95% estimat după tratament (utilizând datele
din testarea inițială drept covariate).
Sensibilitatea la stimul rece a fost afectată semnificativ după cele 5 săptămâni de tratament
(ANCOVA, F(4,38) = 5,19, p = 0,002, Fig. 7.26). Cuprizona a scăzut scorul reacției la durere cu
65,38% față de martor (p = 0,002, corecție Bonferroni-Holm). Loturile tratate concomitent cu
cuprizonă și venlafaxină, risperidonă, respectiv febuxostat au prezentat scoruri ale reacției la durere
semnificativ mai mari față de grupul CPZ. Astfel, venlafaxina a crescut sensibilitatea la durere de
3,4 ori (p = 0,0009), risperidona de 2,8 ori (p = 0,002), iar febuxostat de 2,6 ori (p = 0,006).
Sc
or
to
ta
l
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
a
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
0
4
8
1 2
Sc
or
to
ta
l
b
# # # # ## #
* *
Fig. 7.26. Sensibilitatea dureroasă la stimul rece după 5 săptămâni de tratament – scorul reacției la durere.
(a) Medie ± S.E.M. (b) Medie ± interval de încredere 95% estimat după tratament (utilizând datele din
testarea inițială drept covariate).
8. Evaluarea efectelor unor medicamente asupra demielinizării într-un model
animal de scleroză multiplă
Scopul experimentului de față a fost analiza histologică a probelor de țesut cerebral recoltate
de la animalele de experiență testate în Capitolul 7. În primul rând am urmărit confirmarea
instalării demielinizării corpului calos după 5 săptămâni de tratament cu agentul demielinizant. În
al doilea rând, au fost studiate potențialele efecte anti-demielinizante ale celor 3 medicamente
administrate concomitent cu cuprizona (venlafaxină, risperidonă și febuxostat) și posibilitatea de a
stabili o corelație între nivelul de integritate a tecii de mielină și efectele benefice asupra deficitelor
comportamentale [49].
Materiale și metode
După eutanasiere, șoarecii au fost perfuzați intracardiac cu o soluție de formaldehidă 4% în
tampon fosfat salin, pentru dezlocuirea sângelui din țesuturi. Creierele au fost recoltate ulterior și
au fost secționate cu un bisturiu în plan coronal. Țesuturile au fost apoi fixate în aceeași soluție de
formaldehidă 4% în PBS timp de 72 h, la temperatura camerei. După fixare, probele tisulare au
fost prelucrate și secționate ulterior conform protocoalelor de secționare în parafină, în vederea
colorării probelor cu Luxol Fast Blue (LFB) și crezil acetat de violet (CV).
Secțiunile prelucrate anterior au fost evaluate utilizând un microscop optic, obiectivul x4
(Euromex bScope, Euromex Microscopen BV, Papenkamp, Olanda) și o cameră digitală (C-mount
camera, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania). Severitatea demielinizării a fost
evaluată vizual folosind o scară semicantitativă de 0-3 puncte, descrisă în literatura de specialitate
[62]. Analiza statistică a rezultatelor obținute a fost efectuată utilizând programul GraphPad Prism
v.9.1.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Diferențele dintre loturi au fost analizate
utilizând testul ANOVA unifactorial, urmat de testul post-hoc Bonferroni-Holm.
Rezultate și discuții
Analiza statistică a scorurilor de demielinizare a indicat existența unor diferențe
semnificative între grupurile de tratament (ANOVA unifactorial, F(4,12) = 4,31, p = 0,0217).
Intoxicarea șoarecilor cu cuprizonă timp de 5 săptămâni a produs demielinizări semnificative la
nivelul corpului calos, comparativ cu lotul martor (p = 0,0041, corecție Bonferroni-Holm). Șoarecii
tratați concomitent cu venlafaxină au avut un scor al demielinizării cu 28,57% mai mic, iar cei
tratați cu febuxostat au avut un scor cu 71,43% mai redus (Fig. 8.6), însă diferențele nu au fost
semnificative statistic (p > 0,05 vs. CPZ). În schimb, degradarea mielinei a fost redusă semnificativ
de tratamentul concomitent cu risperidonă (90,48%, p = 0,01 vs. CPZ).
CT L
CP Z
CP Z + V
E N
CP Z + R
S P
CP Z + F E B
0
1
2
3
4
Sc
or
de
mie
lin
iza
re * *
#
Fig. 8.6. Variația scorului de demielinizare în funcție de tratament, după colorație histologică cu LFB și
CV (medie S.E.M.).
9 . Evaluarea efectelor unor medicamente asupra stresului oxidativ într-un
model animal de scleroză multiplă
Obiectivul studiului de față a fost reprezentat de determinarea nivelului de stres oxidativ și
nitrozativ la nivelul țesutului cerebral provenit de la șoarecii tratați cu cuprizonă. De asemenea, a
fost investigată capacitatea celor trei medicamente administrate de a oferi protecție împotriva
efectelor nocive ale agentului demielinizant asupra status-ului redox [49].
Materiale și metode
După eutanasia șoarecilor, au fost recoltate creierele și au fost obținute omogenate de țesut
cerebral, utilizând un raport de 1:10 (m/v) între țesut și sucroză 0,25 M. Țesuturile au fost
omogenizate utilizând un omogenizator RW 14 (IKA, Königswinter, Germania). Mitocondriile au
fost separate de omogenatele tisulare considerând metodele descrise anterior [63,64], în 3 etape
consecutive de centrifugare. Mitocondriile au fost apoi suspendate în PBS într-un raport 1:1 (v/v)
la volumul omogenatului inițial.
Pentru evaluarea status-ului redox tisular a fost utilizată o metodă Amplex Red (AR) descrisă
anterior [63,65]. De asemenea, a fost evaluată deficiența redox utilizând metoda spectrofotometrică
bazată pe Xylenol Orange (metoda FOX), descrisă anterior în literatura de specialitate [63].
Susceptibilitatea membranei mitocondriale la peroxidare lipidică a fost evaluată cu difenil-
1-pirilenfosfină (DPPP, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conform procedurii
descrise de Margină și colab. [66,67].
Nivelurile de malondialdehidă (MDA) din omogenatele cerebrale au fost determinate cu
bine-cunoscuta [68] și anterior descrisă metodă TBARS (thiobarbituric acid reactive substances,
substanțe reactive la acidul tiobarbituric) [69,70].
Pentru a determina activitatea catalazei din omogenatele cerebrale, a fost folosită metoda
descrisă de Hadwan, 2018 [71], adaptată pentru microanalize. Activitatea superoxid dismutazei a
fost evaluată cu un kit de activitate colorimetrică (nr. Cat. 19160, Sigma Aldrich, St. Louis, MO,
SUA), utilizând un sistem generator de anioni superoxid bazat pe xantină oxidază.
Au fost determinat nitriții totali (după reducerea nitraților), ca produși finali ai activității
nitric oxid sintetazei neuronale (nNOS), prin metoda Griess descrisă în studii anterioare [69,72].
Aceasta a fost modificată folosind vanadiu(III) în loc de cadmiu pentru reducerea nitraților la nitriți
[73]. De asemenea, a fost determinată activitatea nNOS prin incubarea probelor de omogenat
tisular cu arginină 0,013%, FAD și NADPH2 timp de 60 minute la 37 °C, urmat de adăugarea de
VCl3 0,8% în HCI 1M și reactiv Griess modificat.
Activitatea enzimatică a celor două izoforme ale monoaminoxidazei (MAO), MAO-A și
MAO-B, a fost determinată prin o metodă modificată a celei descrise de Huang și colab. [74].
Această metodă utilizează 2,4-dinitrofenil hidrazină (2,4-DNF) ca agent de derivatizare pentru a
detecta spectrofotometric aldehidele generate de MAO.
Tiolii totali au fost evaluați folosind o metodă descrisă anterior [75], utilizând un raport de
1:4 între probă (omogenizat tisular/preparat mitocondrial) și reactiv Ellman.
Pentru evaluarea conținutului total de proteine din omogenatele tisulare și preparatele
mitocondriale, a fost utilizată bine-cunoscuta metodă Lowry [76], cu o curbă etalon de albumină
serică bovină de până la 1,5 mg/mL.
Analiza statistică a rezultatelor obținute a fost efectuată utilizând programul GraphPad Prism
v.9.1.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA). Diferențele dintre loturi au fost analizate
utilizând testul ANOVA unifactorial, urmat de testul post-hoc Bonferroni-Holm.
Rezultate și discuții
Administrarea cuprizonei timp de 5 săptămâni a produs o scădere semnificativă a activității
superoxid dismutazei cerebrale, o creștere semnificativă a activității nitric oxid sintetazei neuronale
și o reducere semnificativă a conținutului cerebral de glutation citoplasmatic, aceste rezultate fiind
în conformitate cu datele raportate în literatura de specialitate [15]. De asemenea, intoxicarea cu
cuprizonă a produs un deficit redox tisular la nivel cerebral, a crescut susceptibilitatea lipidelor
membranare mitocondriale la peroxidare și a redus activitatea catalazei cerebrale, însă aceste efecte
nu au prezentat semnificație statistică.
Administrarea cuprizonei timp de 5 săptămâni a produs o scădere semnificativă a activității
superoxid dismutazei cerebrale, o creștere semnificativă a activității nitric oxid sintetazei neuronale
și o reducere semnificativă a conținutului cerebral de glutation citoplasmatic, aceste rezultate fiind
în conformitate cu datele raportate în literatura de specialitate [15]. De asemenea, intoxicarea cu
cuprizonă a produs un deficit redox tisular la nivel cerebral, a crescut susceptibilitatea lipidelor
membranare mitocondriale la peroxidare și a redus activitatea catalazei cerebrale, însă aceste efecte
nu au prezentat semnificație statistică.
Tratamentul concomitent cu venlafaxină a produs cea mai mare compensare a deficitului
redox tisular indus de cuprizonă și a oferit cea mai mare protecție împotriva perodixării lipidelor
membranare mitocondriale. De asemenea, venlafaxina a produs cea mai mare scădere a
concentrației malondialdehidei, deși variațiile au fost minore. Venlafaxina a stimulat capacitatea
antioxidantă a organismului prin creșterea minoră a activității catalazei și creșterea marcantă a
activității superoxid dismutazei cerebrale. Administrarea venlafaxinei nu a modificat activitatea
crescută a nitric oxid sintetazei neuronale și nu a modificat în mod semnificativ conținutul în
glutation. În schimb, venlafaxina a produs o creștere aparentă a activității MAO-A, nesemnificativă
statistic.
Comparativ cu celelalte medicamente administrate, risperidona a produs cea mai mică
compensare a deficitului redox tisular indus de cuprizonă. Risperidona a oferit o protecție aparentă
împotriva perodixării lipidelor membranare mitocondriale și a produs cea mai mică stimulare a
activității catalazei, însă creșterea activității superoxid dismutazei cerebrale a fost mai mare ca cea
produsă de febuxostat. Venlafaxina, de asemenea, nu a produs modificări semnificative asupra
activiății crescute a nitric oxid sintetazei neuronale și a condus la o creștere nesemnificativă statistic
a activității MAO-A. Șoarecii tratați cu risperidonă au avut un conținut de glutation mitocondrial
semnificativ redus, acest rezultat fiind în conformitate cu raportările anterioare care detaliază
efectele sale dăunătoare asupra mitocondriilor [77,78].
Tratamentul cu febuxostat a avut un efect intermediar asupra deficitului redox cerebral, însă
nu a protejat membranele mitocondriale față de peroxidare lipidică. Febuxostat a produs o scădere
ușoară a concentrației malondialdehidei. Medicamentul antigutos a produs cea mai mare creștere a
activității catalazei, nesemnificativă statistic. Febuxostat a stimulat capacitatea antioxidantă a
țesutului cerebral prin creșterea semnificativă a activității superoxid dismutazei, însă efectul a fost
mai redus comparativ cu celelalte 2 medicamente. Activitatea crescută a nitric oxid sintetazei
neuronale nu a fost alterată de tratamentul cu febuxostat. De asemenea, febuxostat iar a produs o
creștere nesemnificativă statistic a nivelului de glutation citoplasmatic. Febuxostat a crescut
semnificativ activitatea MAO-A și nesemnificativ statistic activitatea MAO-B, deși cercetări
anterioare au arătat că acesta a produs efecte antidepresive semnificative la șoareci [79].
10 . Evaluarea efectelor unor medicamente asupra canalelor ionice TRPA1 și
TRPV1
În Capitolul 6 a fost prezentată construirea și aplicarea unei metodologii de screening in
silico bazat pe drug repurposing pentru descoperirea de noi antagoniști TRPA1 cu potențială
utilitate în tratamentul SM. Astfel, desvenlafaxina, paliperidona si febuxostat au fost aleși drept
potențiali candidați pentru studii ulterioare. Astfel, în experimentul de față a fost urmărită
confirmarea sau infirmarea mecanismului de acțiune propus pentru medicamentele prezise, dar și
evaluarea parțială a selectivității, prin determinarea efectului asupra activității canalului de calciu
TRPV1.
Materiale și metode
Determinările in vitro pe linii celulare au fost efectuate în colaborare cu Centrul de Fiziologie
și Farmacologie, Institutul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Viena, Austria.
Pentru a investiga efectele pentru desvenlafaxină, paliperidonă și febuxostat asupra TRPA1
și TRPV1, acestea au fost testate în expresie heterologă, utilizând celule HEK293T ce exprimă fie
hTRPA1, fie hTRPV1, prin intermediul unei analize cu randament mediu. În fiecare experiment,
substanța de interes a fost aplicată înainte de agonistul TRPA1 izotiocianat de alil (AITC), respectiv
agonistul TRPV1 capsaicină, pentru a determina dacă aceasta funcționează ca antagonist sau
agonist.
Rezultate și discuții
Creșterea calciului intracelular a fost similară pentru întregul interval de concentrații, atât în
celulele transfectate, cât și în cele netransfectate pentru paliperidonă și desvenlafaxină (Fig. 10.4).
În schimb, febuxostat a produs o creștere a calciului dependentă de TRPA1 la concentrații mai
mari. Răspunsurile la febuxostat 126 µM au fost inhibate de antagonistul TRPA1 A-967079 într-o
manieră doză-dependentă, cu o IC50 de 0,09 µM (0,05-0,14, CI 95%).
Nici desvenlafaxina, nici paliperidona nu au prezentat efecte antagoniste asupra canalului de
calciu TRPA1. Interesant este faptul că febuxostat a prezentat o activitate agonistă asupra canalului
TRPA1 la concentrații mari (126 µM), dar acest efect nu este relevant pentru capacitatea sa de a
atenua demielinizarea indusă de cuprizonă. Nu este clar dacă o astfel de activitate are efecte
dăunătoare asupra integrității mielinei, deoarece activarea farmacologică a TRPA1 nu a fost
studiată până în prezent în raport cu procesul demielinizării. Mai mult, concentrația plasmatică
maximă a febuxostatului după administrarea orală de 150 mg/kg la șoareci a fost de 4,1 µM, aceasta
fiind sub nivelul concentrației necesare activării TRPA1 [80]. În plus, relevanța clinică a acestui
efect este incertă, întrucât administrarea orală a unei doze unice de 120 mg la subiecți umani
sănătoși a condus la o medie a concentrațiilor plasmatice maxime de 15,4 µM, iar administrarea
zilnică a 80 mg timp de 7 zile a condus la o medie a concentrațiilor plasmatice maxime de 9,35 µM
[81]. De asemenea, nici febuxostat nu a produs efecte semnificative asupra activității receptorului
vaniloid, acesta prezentând selectivitate față de receptorul TRPA1.
Fig. 10.4. Efectele directe pentru desvenlafaxină, paliperidonă și febuxostat asupra hTRPA1 în celule
transfectate față de celule netransfectate. (a-c) Ariile de sub curbă calculate pentru perioada de aplicare a
fiecărui compus, în celule transfectate (roșu) și celule netransfectate (negru) – media a 4 replicate ±
S.E.M. (d) Efectul inhibitor al antagonistului A-967079 asupra febuxostat 126 µM – media a 6 replicate ±
S.E.M.
Concluzii și contribuții personale
A fost testată performanța unei platforme de predicție a activității farmacologice pentru
compuși cu moleculă mică, naturali sau de sinteză. Acest algoritm (PASS) a avut o acuratețe redusă
în ceea ce privește identificarea inhibitorilor receptorului TRPA1 și, prin urmare, nu se pretează
pentru descoperirea de noi liganzi ai TRPA1. Au fost antrenați trei algoritmi de inteligență
artificială, utilizând aceeași clasă de descriptori cu PASS. Performanța celor trei algoritmi a
depășit-o semnificativ pe cea demonstrată de programul PASS. Cei mai buni parametri de
performanță au fost înregistrați pentru algoritmul de tip pădure aleatorie (RF), urmând mașinile cu
suport vectorial (SVM) și rețeaua neuronală feedforward (FFNN). Algoritmii propuși ar putea fi
utilizați pentru predicția activității asupra canalului ionic TRPA1, utilizând descriptorii Multilevel
Neighborhoods of Atoms drept variabile independente.
Un algoritm de screening pas cu pas a fost implementat pentru a identifica noi potențiali
antagoniști TRPA1 și a fost validat prin parametri de calitate și performanță, obținându-se o
acuratețe a predicției foarte bună. Această metodă nu se limitează la această țintă moleculară și ar
putea avea succes în alte studii in silico. Modelul de predicție propus a identificat desvenlafaxina,
paliperidona și febuxostatul drept potențiale soluții terapeutice pentru tratamentul SM, vizând în
principal inhibarea TRPA1 non-covalentă. Au fost recunoscute unele limitări ale modelului
construit, precum redundanța unei variabile independente. Algoritmul ar putea fi îmbunătățit prin
dezvoltarea tehnicilor de învățare automată (machine learning) pentru metodologii de screening
similare, în vederea descoperirii unor noi candidați pentru drug repurposing.
Administrarea zilnică de venlafaxină, risperidonă și febuxostat timp de 5 săptămâni la șoareci
a redus efectele demielinizării asupra sensibilității dureroase. Doar venlafaxina și risperidona au
redus semnificativ efectele cuprizonei asupra deficitului motor la finalul tratamentului. Sunt
necesare cercetări suplimentare pentru a stabili potențiala lor utilitate în bolile demielinizante.
Toate cele 3 medicamente administrate au redus în aparență degradarea mielinei după 5
săptămâni de tratament concomitent cu cuprizonă, însă efectul a fost semnificativ statistic exclusiv
pentru risperidonă. Efectul produs de febuxostat a fost relativ similar cu cel al risperidonei.
Demielinizarea acută indusă de tratamentul cu cuprizonă pe o durată de 5 săptămâni a condus
la dezechilibre redox importante la nivelul țesutului cerebral. Stresul oxidativ produs de cuprizonă
a fost ameliorat în principal de toate cele 3 medicamente administrare, cu excepția activității nNOS
crescute și a nivelurilor scăzute de glutation citoplasmatic. Cel mai bun efect asupra stresului
oxidativ a fost observat pentru venlafaxină, iar risperidona a afectat în sens negativ conținutul în
glutation la nivel mitocondrial.
Doar febuxostat a produs un efect direct asupra canalului TRPA1, acesta funcționând ca
agonist la concentrații mari, însă nu este clar dacă interacționează cu structura receptorului în mod
covalent sau non-covalent. Moleculele cu caracteristici structurale similare ar putea fi investigate
în continuare pentru a identifica noi agoniști TRPA1. Niciunul dintre cele 3 medicamente nu a
produs modificări semnificative ale activității canalului ionic TRPV1, febuxostat fiind prin urmare
un agonist selectiv față de TRPA1.
Contribuțiile personale din cadrul cercetării descrise pot fi considerate următoarele:
• evaluarea performanței predictive a algoritmului PASS pentru identificarea de noi potențiali
antagoniști TRPA1, în vederea stabilirii fezabilității în acest caz particular. PASS a demonstrat
o performanță slabă pentru această țintă specifică (Capitolul 5);
• implementarea și validarea a trei algoritmi de inteligență artificială, utilizând aceeași clasă de
descriptori moleculari cu care operează PASS, în vederea obținerii unor modele de predicție cu
acuratețe superioară. Cei trei algoritmi au avut performanțe mult superioare programului PASS
(Capitolul 5);
• realizarea unei metodologii de screening virtual pentru identificarea de antagoniști TRPA1,
bazate pe drug repurposing. Au fost combinate într-un model predictiv de regresie logistică mai
multe metode in silico, acestea fiind bazate atât pe proprietățile fizico-chimice și farmacologice
ale liganzilor, cât și pe informațiile furnizate de interacțiunea simulată cu receptorul (Capitolul
6);
• modelul predictiv a fost validat și a prezentat o acuratețe satisfăcătoare. Acesta a identificat
desvenlafaxina (metabolitul venlafaxinei), paliperidona (metabolitul risperidonei) și febuxostat
drept potențiali blocanți TRPA1. Modelul respectiv poate fi adaptat și extins și pentru alți
compuși decât cei supuși screening-ului (Capitolul 6);
• efectuarea unui studiu comparativ între venlafaxină, risperidonă și febuxostat, vizând evaluarea
eficacității celor trei medicamente în tratarea șoarecilor demielinizați prin administrarea
cuprizonei (Capitolele 7-9);
• observarea unui efect marcant al demielinizării produse prin administrarea cuprizonei asupra
nocicepției induse de stimul rece, aceasta fiind semnificativ mai redusă la șoarecii demielinizați.
Acest efect a fost observat numai în cadrul testării de după cinci săptămâni de tratament
(Capitolul 7);
• confirmarea eficacității celor trei substanțe în ameliorarea deficitelor comportamentale induse
de cuprizonă (Capitolul 7);
• confirmarea acțiunii anti-demielinizante pentru risperidonă și într-o măsură mai mică pentru
celelalte două medicamente, în modelul cuprizonei de scleroză multiplă (Capitolul 8);
• confirmarea utilității medicamentelor studiate în ameliorarea stresului oxidativ indus de
demielinizarea cu cuprizonă (Capitolul 9);
• descoperirea activității agoniste asupra canalului de calciu TRPA1 pentru febuxostat, la
concentrații mari. Această acțiune a fost selectivă pentru TRPA1, fără să influențeze activitatea
canalului TRPV1 (Capitolul 10).
Bibliografie selectivă
1. Huang W-J, Chen W-W, Zhang X. Multiple sclerosis: Pathology, diagnosis and treatments. Exp Ther Med 2017;
13(6):3163–3166.
2. Koch-Henriksen N, Sørensen PS. The changing demographic pattern of multiple sclerosis epidemiology. Lancet
Neurol 2010; 9(5):520–532.
3. Loma I, Heyman R. Multiple Sclerosis: Pathogenesis and Treatment. Curr Neuropharmacol 2011; 9(3):409–416.
4. Pérez-Cerdá F, Sánchez-Gómez MV, Matute C. The link of inflammation and neurodegeneration in progressive
multiple sclerosis. Mult Scler Demyelinating Disord 2016; 1(1):9.
5. Barnett MH, Prineas JW. Relapsing and Remitting Multiple Sclerosis: Pathology of the Newly Forming Lesion. Ann
Neurol 2004; 55(4):458–468.
6. Triantafyllou NI. Treatment of multiple sclerosis. Arch Hell Med 2003; 20(5):477–483.
7. Gajofatto A, Benedetti MD. Treatment strategies for multiple sclerosis: When to start, when to change, when to
stop? World J Clin Cases 2015; 3(7):545.
8. Giovannoni G. Cladribine to Treat Relapsing Forms of Multiple Sclerosis. Neurotherapeutics 2017; 14(4):874–887.
9. Lycke J. Monoclonal antibody therapies for the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis: Differentiating
mechanisms and clinical outcomes. Ther Adv Neurol Disord 2015; 8(6):274–293.
10. Chirikov V, Ma I, Joshi N, et al. Cost-Effectiveness of Alemtuzumab in the Treatment of Relapsing Forms of
Multiple Sclerosis in the United States. Value Heal 2019; 22(2):168–176.
11. Dargahi N, Katsara M, Tselios T, et al. Multiple sclerosis: Immunopathology and treatment update. Brain Sci 2017;
7(7).
12. Constantinescu CS, Farooqi N, O’Brien K, Gran B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model
for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol 2011; 164(4):1079–1106.
13. Zhan J, Mann T, Joost S, Behrangi N, Frank M, Kipp M. The Cuprizone Model: Dos and Do Nots. Cells 2020;
9(4):843.
14. Zhen W, Liu A, Lu J, Zhang W, Tattersall D, Wang J. An Alternative Cuprizone-Induced Demyelination and
Remyelination Mouse Model. ASN Neuro 2017; 9(4):175909141772517.
15. Praet J, Guglielmetti C, Berneman Z, Van der Linden A, Ponsaerts P. Cellular and molecular neuropathology of
the cuprizone mouse model: Clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev 2014; 47:485–505.
16. Bölcskei K, Kriszta G, Sághy É, et al. Behavioural alterations and morphological changes are attenuated by the
lack of TRPA1 receptors in the cuprizone-induced demyelination model in mice. J Neuroimmunol 2018; 320:1–10.
17. Liñares D, Taconis M, Maña P, et al. Neuronal nitric oxide synthase plays a key role in CNS demyelination. J
Neurosci 2006; 26(49):12672–12681.
18. Sághy É, Sipos É, Ács P, et al. TRPA1 deficiency is protective in cuprizone-induced demyelination-A new target
against oligodendrocyte apoptosis. Glia 2016; 64(12):2166–2180.
19. Moran MM, Xu H, Clapham DE. TRP ion channels in the nervous system. Curr Opin Neurobiol 2004; 14(3):362–
369.
20. Shigetomi E, Jackson-Weaver O, Huckstepp RT, O’Dell TJ, Khakh BS. TRPA1 channels are regulators of astrocyte
basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive d-serine release. J Neurosci 2013; 33(24):10143–
10153.
21. Shigetomi E, Tong X, Kwan KY, Corey DP, Khakh BS. TRPA1 channels regulate astrocyte resting calcium and
inhibitory synapse efficacy through GAT-3. Nat Neurosci 2012; 15(1):70–80.
22. Nilius B, Appendino G, Owsianik G. The transient receptor potential channel TRPA1: From gene to
pathophysiology. Pflugers Arch Eur J Physiol 2012; 464(5):425–458.
23. Kheradpezhouh E, Choy JMC, Daria VR, Arabzadeh E. TRPA1 expression and its functional activation in rodent
cortex. Open Biol 2017; 7(4).
24. Souza Monteiro de Araujo D, Nassini R, Geppetti P, De Logu F. TRPA1 as a therapeutic target for nociceptive
pain. Expert Opin Ther Targets 2020; 24(10):997–1008.
25. Taylor-Clark TE, Nassenstein C, McAlexander MA, Undem BJ. TRPA1: A potential target for anti-tussive therapy.
Pulm Pharmacol Ther 2009; 22(2):71–74.
26. Andersson DA, Gentry C, Moss S, Bevan S. Transient receptor potential A1 is a sensory receptor for multiple
products of oxidative stress. J Neurosci 2008; 28(10):2485–2494.
27. Giorgi S, Nikolaeva-Koleva M, Alarcón-Alarcón D, Butrón L, González-Rodríguez S. Is TRPA1 burning down
TRPV1 as druggable target for the treatment of chronic pain? Int J Mol Sci 2019; 20(12):2906.
28. Babes A, Ciotu CI, Hoffmann T, et al. Photosensitization of TRPA1 and TRPV1 by 7-dehydrocholesterol:
Implications for the Smith-Lemli-Opitz syndrome. Pain 2017; 158(12):2475–2486.
29. Chen J, Hackos DH. TRPA1 as a drug target - Promise and challenges. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol
2015; 388(4):451–463.
30. Bennett V, Baines AJ. Spectrin and Ankyrin-Based Pathways: Metazoan Inventions for Integrating Cells Into
Tissues. Physiol Rev 2001; 81(3):1353–1392.
31. Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, et al. TRPA1 Mediates the Inflammatory Actions of Environmental Irritants and
Proalgesic Agents. Cell 2006; 124(6):1269–1282.
32. Bandell M, Story GM, Hwang SW, et al. Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds
and bradykinin. Neuron 2004; 41(6):849–857.
33. Meents JE, Ciotu CI, Fischer MJM. TRPA1: a molecular view. J Neurophysiol 2018; 121(2):427–443.
34. Gupta R, Saito S, Mori Y, Itoh SG, Okumura H, Tominaga M. Structural basis of TRPA1 inhibition by HC-030031
utilizing species-specific differences. Sci Rep 2016; 6(1):37460.
35. Viana F. TRPA1 channels: molecular sentinels of cellular stress and tissue damage. J Physiol 2016; 594(15):4151–
4169.
36. McNamara CR, Mandel-Brehm J, Bautista DM, et al. TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc Natl Acad Sci
U S A 2007; 104(33):13525–13530.
37. Wei H, Hämäläinen MM, Saarnilehto M, Koivisto A, Pertovaara A. Attenuation of mechanical hypersensitivity by
an antagonist of the TRPA1 ion channel in diabetic animals. Anesthesiology 2009; 111(1):147–154.
38. Klionsky L, Tamir R, Gao B, et al. Species-specific pharmacology of Trichloro(sulfanyl)ethyl benzamides as
transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) antagonists. Mol Pain 2007; 3:39.
39. Preti D, Saponaro G, Szallasi A. Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) antagonists. Pharm Pat Anal
2015; 4(2):75–94.
40. Paulsen CE, Armache JP, Gao Y, Cheng Y, Julius D. Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory
mechanisms. Nature 2015; 520(7548):511–517.
41. Xue H, Li J, Xie H, Wang Y. Review of drug repositioning approaches and resources. Int J Biol Sci 2018;
14(10):1232–1244.
42. Talevi A. Drug repositioning: Current approaches and their implications in the precision medicine era. Expert Rev
Precis Med Drug Dev 2018; 3(1):49–61.
43. Ekins S, Mestres J, Testa B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and
profiling. Br J Pharmacol 2007; 152(1):9–20.
44. Lu P, Bevan DR, Leber A, Hontecillas R, Tubau-Juni N, Bassaganya-Riera J. Computer-aided drug discovery. In:
Bassaganya-Riera J, ed. Accelerated Path to Cures. 1st ed. Cham, Switzerland: Springer International Publishing,
2018:7–24.
45. Falls Z, Mangione W, Schuler J, Samudrala R. Exploration of interaction scoring criteria in the CANDO platform.
BMC Res Notes 2019; 12(1):318.
46. Pushpakom S, Iorio F, Eyers PA, et al. Drug repurposing: progress, challenges and recommendations. Nat Rev
Drug Discov 2018; 18(1):41–58.
47. Mihai DP, Nitulescu GM, Ion GND, Ciotu CI, Chirita C, Negres S. Computational drug repurposing algorithm
targeting TRPA1 calcium channel as a potential therapeutic solution for multiple sclerosis. Pharmaceutics 2019;
11(9):446.
48. Warren GL, Andrews CW, Capelli AM, et al. A critical assessment of docking programs and scoring functions. J
Med Chem 2006; 49(20):5912–5931.
49. Mihai DP, Ungurianu A, Ciotu CI, et al. Effects of venlafaxine, risperidone and febuxostat on cuprizone‐induced
demyelination, behavioral deficits and oxidative stress. Int J Mol Sci 2021; 22(13):7183.
50. Liebowitz MR, Tourian KA. Efficacy, Safety, and Tolerability of Desvenlafaxine 50 mg/d for the Treatment of
Major Depressive Disorder. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2010; 12(3).
51. Morris MT, Tarpada SP. Long-Acting Injectable Paliperidone Palmitate: A Review of Efficacy and Safety.
Psychopharmacol Bull 2017; 47(2):42–52.
52. Sen MK, Almuslehi MSM, Coorssen JR, Mahns DA, Shortland PJ. Behavioural and histological changes in
cuprizone-fed mice. Brain Behav Immun 2020; 87:508–523.
53. Omotoso GO, Olajide OJ, Gbadamosi IT, et al. Cuprizone toxicity and Garcinia kola biflavonoid complex activity
on hippocampal morphology and neurobehaviour. Heliyon 2019; 5(7).
54. Vollmar P, Nessler S, Kalluri SR, Hartung HP, Hemmer B. The antidepressant venlafaxine ameliorates murine
experimental autoimmune encephalomyelitis by suppression of pro-inflammatory cytokines. Int J
Neuropsychopharmacol 2009; 12(4):525–536.
55. Vollmar P, Haghikia A, Dermietzel R, Faustmann PM. Venlafaxine exhibits an anti-inflammatory effect in an
inflammatory co-culture model. Int J Neuropsychopharmacol 2008; 11(1):111–117.
56. Shen P, Hu Q, Dong M, et al. Venlafaxine exerts antidepressant effects possibly by activating MAPK-ERK1/2 and
P13K-AKT pathways in the hippocampus. Behav Brain Res 2017; 335:63–70.
57. Cope MB, Li X, Jumbo-Lucioni P, et al. Risperidone alters food intake, core body temperature, and locomotor
activity in mice. Physiol Behav 2009; 96(3):457–463.
58. O’Sullivan D, Green L, Stone S, et al. Treatment with the antipsychotic agent, risperidone, reduces disease severity
in experimental autoimmune encephalomyelitis. PLoS One 2014; 9(8):e104430.
59. La Flamme AC, Abernethy D, Sim D, et al. Safety and acceptability of clozapine and risperidone in progressive
multiple sclerosis: a phase I, randomised, blinded, placebo-controlled trial. BMJ Neurol Open 2020; 2(1):e000060.
60. Honorat JA, Kinoshita M, Okuno T, et al. Xanthine Oxidase Mediates Axonal and Myelin Loss in a Murine Model
of Multiple Sclerosis. Suzumura A, ed. PLoS One 2013; 8(8):e71329.
61. Honorat JA, Nakatsuji Y, Shimizu M, et al. Febuxostat ameliorates secondary progressive experimental
autoimmune encephalomyelitis by restoring mitochondrial energy production in a GOT2-dependent manner. PLoS
One 2017; 12(11):e0187215.
62. Das Sarma J, Kenyon LC, Hingley ST, Shindler KS. Mechanisms of primary axonal damage in a viral model of
multiple sclerosis. J Neurosci 2009; 29(33):10272–10280.
63. Ungurianu A, Șeremet O, Grădinaru D, Ionescu-Tîrgoviște C, Margină D, Dănciulescu Miulescu R.
Spectrophotometric versus spectrofluorometric assessment in the study of the relationships between lipid peroxidation
and metabolic dysregulation. Chem Biol Drug Des 2019; 93(6):1026–1035.
64. Katyare SS, Rajan RR. Influence of thyroid hormone treatment on the respiratory activity of cerebral mitochondria
from hypothyroid rats. A critical re-assessment. Exp Neurol 2005; 195(2):416–422.
65. Ungurianu A, Şeremet O, Gagniuc E, et al. Preclinical and clinical results regarding the effects of a plant-based
antidiabetic formulation versus well established antidiabetic molecules. Pharmacol Res 2019; 150:104522.
66. Margina D, Gradinaru D, Manda G, Neagoe I, Ilie M. Membranar effects exerted in vitro by polyphenols -
quercetin, epigallocatechin gallate and curcumin - on HUVEC and Jurkat cells, relevant for diabetes mellitus. Food
Chem Toxicol 2013; 61:86–93.
67. Margină D, Olaru OT, Ilie M, et al. Assessment of the potential health benefits of certain total extracts from Vitis
vinifera, Aesculus hyppocastanum and Curcuma longa. Exp Ther Med 2015; 10(5):1681–1688.
68. Tsikas D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological
samples: Analytical and biological challenges. Anal Biochem 2017; 524:13–30.
69. Gradinaru D, Margina D, Borsa C, et al. Adiponectin: possible link between metabolic stress and oxidative stress
in the elderly. Aging Clin Exp Res 2017; 29(4):621–629.
70. Pothiwong W, Laorpaksa A, Pirarat N, Sirisawadi S, Intarapanya J, Jianmongkol S. Autoxidation of brain
homogenates from various animals as measured by thiobarbituric acid assay. J Pharmacol Toxicol Methods 2007;
56(3):336–338.
71. Hadwan MH. Simple spectrophotometric assay for measuring catalase activity in biological tissues. BMC Biochem
2018; 19(1).
72. Zanfirescu A, Cristea AN, Nitulescu GM, Velescu BS, Gradinaru D. Chronic monosodium glutamate
administration induced hyperalgesia in mice. Nutrients 2018; 10(1):1.
73. Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of
nitrate and nitrite. Nitric Oxide - Biol Chem 2001; 5(1):62–71.
74. Huang G, Zhu F, Chen Y, et al. A spectrophotometric assay for monoamine oxidase activity with 2, 4-
dinitrophenylhydrazine as a derivatized reagent. Anal Biochem 2016; 512:18–25.
75. Nitulescu G, Mihai DP, Nicorescu IM, et al. Discovery of natural naphthoquinones as sortase A inhibitors and
potential anti-infective solutions against Staphylococcus aureus. Drug Dev Res 2019; 80(8):1136–1145.
76. Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol
Chem 1951; 193(1):265–275.
77. Cikánková T, Fišar Z, Bakhouche Y, Ľupták M, Hroudová J. In vitro effects of antipsychotics on mitochondrial
respiration. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2019; 392(10):1209–1223.
78. Eftekhari A, Ahmadian E, Azarmi Y, Parvizpur A, Hamishehkar H, Eghbal MA. In vitro/vivo studies towards
mechanisms of risperidone-induced oxidative stress and the protective role of coenzyme Q10 and N-acetylcysteine.
Toxicol Mech Methods 2016; 26(7):520–528.
79. Karve A V., Jagtiani SS, Chitnis KA. Evaluation of effect of allopurinol and febuxostat in behavioral model of
depression in mice. Indian J Pharmacol 2013; 45(3):244–247.
80. Miyata H, Takada T, Toyoda Y, Matsuo H, Ichida K, Suzuki H. Identification of febuxostat as a new strong ABCG2
inhibitor: Potential applications and risks in clinical situations. Front Pharmacol 2016; 7(DEC):518.
81. Zhang M, Di X, Xu L, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of febuxostat under fasting conditions in
healthy individuals. Exp Ther Med 2014; 7(2):393–396.
Lucrări științifice publicate în reviste de specialitate
1. Mihai, DP; Nitulescu, GM; Ion, GND; Ciotu, CI; Chirita, C; Negres, S. Computational Drug
Repurposing Algorithm Targeting TRPA1 Calcium Channel as a Potential Therapeutic Solution
for Multiple Sclerosis. Pharmaceutics 2019; 11(9):446.
https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11090446. FI = 4,421; Q1.
2. Mihai, DP; Ungurianu, A; Ciotu, CI; Fischer, MJM; Olaru, OT; Nitulescu, GM; Andrei, C;
Zbarcea, CE; Zanfirescu, A; Seremet, OC; Chirita, C; Negres, S. Effects of Venlafaxine,
Risperidone and Febuxostat on Cuprizone-Induced Demyelination, Behavioral Deficits and
Oxidative Stress. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22(3):7183.
https://doi.org/10.3390/ijms22137183. FI = 5,923; Q1.
3. Mihai, DP; Trif, C; Stancov, G; Radulescu, D; Nitulescu, GM. Artificial Intelligence
Algorithms for Discovering New Active Compounds Targeting TRPA1 Pain
Receptors. AI 2020; 1(2):276-285. https://doi.org/10.3390/ai1020018.
Lucrări științifice comunicate (postere științifice)
1. Mihai, DP; Trif, C; Radulescu, D; Stancov, G; Nitulescu, GM; Negres, S. In Silico Drug
Repurposing Approaches for Discovery of TRPA1 Inhibitors. Maedica: a Jounal of Clinical
Medicine 2019; 14(17):35. (Congress of the University of Medicine and Pharmacy Carol
Davila, 10-12 October 2019, Bucharest)
2. Trif,.C; Stancov, G; Nitulescu, GM; Olaru, OT; Mihai, DP. Application of PASS Algorithm for
the Discovery of New TRPA1 Antagonists. Proceedings 2019; 29:121. (15th International
Symposium “Priorities of Chemistry for a Sustainable Development” PRIOCHEM, 30 October-
01 November 2019, Bucharest)
