UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE ʺGRIGORE T ...
55
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE ʺGRIGORE T. POPAʺ IAȘI FACULTATEA DE FARMACIE TEZĂ DE DOCTORAT - REZUMAT SUBSTANȚE DE ORIGINE VEGETALĂ – PRECURSORI PENTRU OBȚINEREA PRIN SINTEZĂ / SEMISINTEZĂ A UNOR COMPUȘI CU POTENȚIALĂ ACȚIUNE BIOLOGICĂ Conducător științific, Prof. univ. dr. Ursula Stănescu Doctorand, asist. Alexandra Rotariu (Jităreanu) IAȘI 2012
Transcript of UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE ʺGRIGORE T ...
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
ʺGRIGORE T. POPAʺ IAȘI
FACULTATEA DE FARMACIE
TEZĂ DE DOCTORAT - REZUMAT
SUBSTANȚE DE ORIGINE VEGETALĂ –
PRECURSORI PENTRU OBȚINEREA PRIN SINTEZĂ /
SEMISINTEZĂ A UNOR COMPUȘI CU POTENȚIALĂ
ACȚIUNE BIOLOGICĂ
Conducător științific,
Prof. univ. dr. Ursula Stănescu
Doctorand,
asist. Alexandra Rotariu (Jităreanu)
IAȘI
2012
2
Cuvinte cheie: derivați de acid cinamic, activitate
antimicrobiană, potențial antioxidant, teste fitobiologice
(Phaseolus, Triticum)
3
Lucrarea este structurată în două părți:
Partea generală, care cuprinde 1 capitol
Partea personală, care conține 4 capitole, dintre care capitolele III-
V sunt originale, iar capitolul II, reprezentând Materiale, metode și
tehnici de lucru, a rezultat din aplicarea unor metode și tehnici de
testare cunoscute substanțelor sintetizate de noi.
Cuprinsul tezei este următorul:
CUPRINS
PARTEA GENERALĂ...…………………………………..………………..1
CAPITOLUL I
STADIUL ACTUAL AL CUNOŞTINŢELOR CU PRIVIRE LA UNELE
PRODUSE ŞI SUBSTANŢE DE ORIGINE VEGETALĂ, CU ACŢIUNE
ANTIMICROBIANĂ ŞI ANTIVIRALĂ…………………...........................3
1.1. Cunoştinţe actuale în domeniul fitoterapiei antiinfecţioase.......................3
1.1.1. Introducere…………………..……………………..………...................3
1.1.2. Domenii de utilizare şi principii de tratament………………….............3
1.1.2.1. Infecţiie ale mucoasei bucale şi intestinale...........................................3
1.1.2.2. Infecţii ale aparatului urinar……………………….…………………4
1.1.2.3. Infecţii ale aparatului respirator………………....….………...............5
1.1.2.4. Infecţii cutanate………..…………………………..………….……...6
1.1.3. Produse vegetale utilizate în tratamentul infecţiilor de diverse geneze
……………….…………………………...…………………………………...6
1.1.3.1. Infecţii ale mucoasei bucale şi intestinale............................................7
1.1.3.2. Infecţii ale aparatului urinar……….………………...........…….……9
1.1.3.3. Infecţii ale aparatului respirator.........................................................10
1.1.3.4. Infecţii cutanate….………………………..………………...............12
1.1.4. Mecanisme de acţiune………..……………………….........................14
1.1.4.1. Infecţii ale mucoasei bucale şi gastrointestinale.................................14
1.1.4.2. Infecţii urinare…………….…………………..………………….…15
1.1.4.3. Infecţii ale aparatului respirator…………………....…………….…16
1.1.4.4. Infecţii dermice...................................................................................18
1.1.5. Acţiune şi întrebuinţări…………..……………..…….…………….....19
1.1.5.1. Infecţii ale mucoasei bucale şi gastrointestinale................................19
1.1.5.2. Infecţii urinare……………………………………....………………20
1.1.5.3. Infecţii ale aparatului respirator................ ........................................20
4
1.1.5.4. Infecţii cutanate………………………………..................................22
1.2. Cunoştinţe actuale cu privire la acţiunea biologică a acizilor
polifenolcarboxilici (APFC) şi a derivaţilor lor…………...............………...22
1.2.1. Acţiunea antimicrobiană………………………..........……….…….…22
1.2.2. Acţiunea antioxidantă………………………............………................25
1.2.3. Acţiunea anticarcinogenă……………..................................……….....28
1.2.4. Acţiunea antiinflamatoare………...……………………………...……30
1.2.4.1. Influenţarea nivelului de NO……………..........................................31
1.2.4.2. Intervenţia în cascada acidului arahidonic………..………...............32
1.2.4.3. Inhibarea factorului nuclear de transcripţie (NF-κB) ........................33
1.2.4.4. Inhibarea sau antagonizarea PAF………..................................…….33
1.2.5. Acţiunea hepatoprotectoare………………................…………….......34
1.2.6. Acţiunea dermoprotectoare faţă de radiaţiile UV...….……………….34
1.2.7. Proprietăţi anti-venin……………………….....................……………36
1.3. Concluzii……………………………………...........................................37
PARTEA PERSONALĂ.......................................... ............... ....................38
MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ȘI
OBIECTIVELE URMĂRITE.......................... .................................. ........38
CAPITOLUL II MATERIAL, METODE ŞI TEHNICI DE LUCRU………..................….40
2.1. Obţinerea derivaţilor de sinteză……………........…………..……….….40
2.1.1. Obţinerea derivaţilor de acid cinamic………………………………....40
2.1.2. Obţinerea derivaţilor de acid cinamic dibromuraţi…..........…………..42
2.1.2.1. Obţinerea derivaţilor de acid cinamic dibromuraţi prin bromurare cu
brom……...……………………………………………………..……………42
2.1.2.2. Obţinerea derivaţilor de acid cinamic dibromuraţi cu ajutorul
tribromurii de piridiniu………..............................…………………………..43
2.1.3. Obţinerea derivaţilor acetilaţi ai unor acizi polifenolcarboxilici
(APFC)..... ….…………………….………………………………..………...44
2.1.4. Obţinerea amidelor acidului cinamic şi a unor acizi hidroxicinamici
(acid p-cumaric, acid ferulic, acid cafeic)…...................................................45
2.1.4.1. Obţinerea amidei acidului cinamic cu 4-aminoantipirina
………………………………………………………………………….........46
2.1.4.2. Obţinerea amidelor acizilor p-cumaric, ferulic şi cafeic ……….….46
2.1.5. Obţinerea calconelor cu o grupare cinamoil în structură.......................47
2.1.6. Sinteza derivaţilor dibromuraţi ai calconelor cu o grupare cinamoil în
structură……...............……………………………………………………....49
2.2. Stabilirea structurii compuşilor sintetizaţi şi a unor caracteristici fizico-
chimice ale acestora………………....………………………………………50
5
2.3. Evaluarea activităţii biologice………………………....………………..52
2.3.1. Evaluarea acţiunii antibacteriene şi antifungice………………….…..52
2.3.2. Evaluarea potenţialului antioxidant……………….…..........................54
2.3.2.1. Determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH ...... 54
2.3.2.2. Determinarea puterii reducătoare.........………….………………….56
2.3.3. Evaluarea toxicităţii prin intermediul testelor fitobiologice…………..58
2.3.3.1. Urmărirea toxicităţii unor compuşi de sinteză în testul Phaseolus
…… …………………………………………………………………...….…58
2.3.3.2. Urmărirea toxicităţii unor compuşi de sinteză în testul Triticum
……………….........................................................………………………....59
2.3.3.3. Evaluarea citogenetică şi biochimică a toxicităţii substanţelor
sintetizate asupra organismelor vegetale………………………….…....……60
2.3.3.3.1. Determinări citogenetice……………………………………...…...60
2.3.3.3.2. Cercetări histo-anatomice asupra meristemului radicular al
plantulelor de fasole…………………………………..……………………...60
2.3.3.3.3. Influenţa tratamentului asupra fracţiunii polifenolice sintetizate în
plantulele de grâu şi fasole……………………………………….….............61
CAPITOLUL III
OBŢINEREA ŞI STABILIREA CARACTERISTICILOR FIZICO-
CHIMICE ŞI A STRUCTURII COMPUŞILOR SINTETIZAŢI ......….64
3.1. Introducere…….............................……………………………..….…....64
3.2. Material şi metodă…………………...................................…………….64
3.3. Rezultate şi discuţii……………......……………………….…................67
3.3.1. Stabilirea caracteristicilor fizico-chimice……..…………........…..…..67
3.3.2. Investigarea şi confirmarea structurii chimice a indivizilor sintetizaţi
…………………..............................................……………..……….……....77
3.3.3. Determinarea unor parametri fizico-chimici ai compuşilor sintetizaţi cu
implicaţii deosebite în comportamentul farmacocinetic.………….. ….….102
3.4. Concluzii…………………………………………………………….....109
CAPITOLUL IV
CERCETĂRI PRIVIND EVALUAREA ACTIVITĂŢII BIOLOGICE A
COMPUŞILOR SINTETIZAŢI........................... .....................................111
4.1. Introducere……………………...………..............………….…............111
4.2. Evaluarea acţiunii antibacteriene şi antifungice a compuşilor sintetizaţi
…………………………...........................…………..………………….….113
4.2.1. Introducere.......………………………………………….…...............113
4.2.2. Material şi metodă…………….............…………………….….........115
4.2.3. Rezultate şi discuţii……............................................……….…….....116
4.2.3.1. Activitatea antibacteriană a derivaţilor sintetizaţi…........................116
6
4.2.3.2 Activitatea antifungică a derivaţilor sintetizaţi……..........................121
4.2.3.3. Interrelaţii structură-activitate antibacteriană şi antifungică pentru
substanţele sintetizate…..........................……………………………..…....126
4.2.4. Concluzii…………………………………...................………….…..129
4.3. Evaluarea acţiunii antioxidante…………….....................…..................130
4.3.1. Introducere…………………………..............................….................130
4.3.2. Material şi metodă…………………….............................……….….130
4.3.3. Rezultate şi discuţii………………………......................………..…..131
4.3.3.1. Determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul DPPH
………………………………………………..…………………...………..131
4.3.3.2. Determinarea puterii reducătoare………………..………..….........133
4.3.4. Concluzii…………………………….……………..…………….…..136
4.4. Evaluarea activităţii fitobiologice……………….…..…........................137
4.4.1. Introducere…………………………………………...........................137
4.4.2. Material şi metodă………………………………...…………………137
4.4.3. Rezultate şi discuţii………………………………...........…………..138
4.4.3.1. Testul Phaseolus……......................................……..……...............139
4.4.3.1.1. Evaluarea modificărilor morfologice induse de substanţele
sintetizate …………...................... ....... ....... ....... .......................................139
4.4.3.1.2. Modificări anatomice induse în structura meristemelor radiculare de
fasole prin tratamentul cu substanţele sintetizate...………..……...………148
4.4.3.1.3. Evaluarea modificărilor biochimice induse plantulelor de fasole prin
tratament................ .......................................................................................161
4.4.3.2. Testul Triticum…………………............................................…….166
4.4.3.2.1. Evaluarea modificărilor morfologice induse de substanţele
sintetizate......................... ....... ....... ....... .....................................................166
4.4.3.2.2. Evaluarea modificărilor citogenetice induse de substanţele
sintetizate....................... ....... .......................................................................170
4.4.3.2.3. Evaluarea modificărilor biochimice induse plantulelor de grâu de
către substanţele testate..................................................................................203
4.4.4. Concluzii……………………………………………………….….....205
CAPITOLUL V
CONCLUZII GENERALE. GRADUL DE ORIGINALITATE.
PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................208
5.1. Concluzii generale………………………………..................................208
5.2. Gradul de originalitate. Perspective de cercetare……………………..209
5.3. Integrarea proiectului în priorităţile naţionale……........……………....210
BIBLIOGRAFIE ........................................................................................212
7
Motivarea alegerii subiectului tezei, scopul și obiectivele
urmărite
În anul 1853, chimistul Charles Frederic Gerhardt a sintetizat
pentru prima oară în laboratorul său o substanță care din punct de
vedere chimic era acid acetilsalicilic, cunoscut apoi și sub denumirea
de aspirină, compus care a făcut în terapeutică o carieră egalată doar de
penicilină și care, chiar după aproape 160 de ani de la descoperire,
reprezintă un antiinflamator nesteroidian, febrifug și, în doze mici,
antiagregant plachetar, la care medicina nu va renunța încă mult timp.
Ideea care a stat la baza sintezei acestei substanțe a fost aceea
că tatăl chimistului, suferind de o gonartroză, atroce bea zilnic mai
multe ceaiuri preparate din scoarța de salcie care conține salicozidă, o
glucozidă a alcoolului salicilic, care acționează și ea în modul descris
anterior. Extrăgând din scoarța de salcie salicozida, Gerhardt și-a dat
seama că aceasta era responsabilă de efectul antireumatic și, după
stabilirea apartenenței chimice la derivații de acid salicilic, a trecut la
sinteza derivatului acetilat al acidului salicilic, care și-a făcut astfel
intrarea în terapeutică.
Este doar un exemplu al unei substanțe naturale care a fost
transformată prin semisinteză într-o substanță mai activă, cu
posibilități de dozare și administrare mai eficiente și care, în istoria de
mai puțin de un secol și jumătate a medicamentelor de sinteză, s-a
repetat de multe ori.
Astăzi se caută cu disperare de către companiile farmaceutice
inovative care lucrează în domeniul antibioticelor, substanțe care ar
putea să distrugă microorganismele patogene, fără a induce la
administrare repetată și prelungită fenomene de rezistență.
8
În această direcție se încadrează eforturile noastre, de a obține
prin sinteză sau semisinteză substanțe cu acțiune antibacteriană și
antifungică, plecând de la o serie de modele structurale naturale,
aparținând unor acizi polifenolcarboxilici, cunoscuți a avea astfel de
proprietăți și care acționează în acest sens în organismele vegetale în
care există.
Acizii cinamic, ferulic, p-cumaric și cafeic se găsesc de regulă
în materialul vegetal în cantități mici, fiind incluși într-un fitocomplex
complicat; substanța naturală este foarte scumpă, deoarece extracția și
purificarea reprezintă un procedeu laborios și costisitor. De aceea, nu
am putut apela pentru aceste substanțe la etaloanele oferite de diversele
firme, la prețuri substanțiale, deoarece, în acest caz, derivații de
semisinteză obținuți de noi ar fi ajuns să fie nerentabili din punct de
vedere economic.
Din acest motiv, nu am modificat prin semisinteză numai
substanțele originale în sine, ci am căutat procedee de sinteză care
ne-au permis obținerea acizilor care ar fi trebuit să reprezinte
moleculele precursoare pentru studiul nostru.
În această situație, scopul și obiectivele cercetărilor noastre
le-au reprezentat:
obținerea unor derivați de acid cinamic și a compușilor lor
dibromurați;
obținerea unor derivați acetilați ai acidului p-cumaric, ferulic, 5-
brom-ferulic și cafeic;
obținerea unor amide ale acizilor cinamic, p-cumaric, ferulic și
cafeic;
obținerea unor calcone cu o grupare cinamoil în structură și a
calconelor dibromurate;
stabilirea caracteristicilor fizico-chimice și a structurilor
substanțelor de sinteză și semisinteză;
evaluarea activității biologice.
9
Obiectivele de cercetare din cadrul tezei de doctorat depuse
se referă la:
stabilirea aspectului macroscopic, a punctului de topire, a
solubilității, comportamentului cromatografic pentru substanțele
sintetizate;
realizarea analizei elementale cantitative, apelând pentru
investigarea structurii și la spectrometria în UV, IR, precum și la
cea de rezonanță magnetică nucleară;
determinarea coeficientului de partiție octanol-apă, ariei suprafeței
polare și a volumului molecular;
determinarea acțiunii antibacteriene și antifungice pentru
substanțele sintetizate;
stabilirea acțiunii antioxidante prin două teste in vitro;
evaluarea toxicității și genotoxicității prin teste fitobiologice.
10
II. PARTEA PERSONALĂ
În Capitolul II (Material, metode şi tehnici de lucru) sunt
prezentate materialele, metodele și tehnicile de lucru folosite
pentru obținerea derivaților de sinteză / semisinteză.
Este vorba despre 6 serii de compuși, însumând 50 de derivați,
ale căror scheme generale de reacție sunt prezentate în figurile 1 și 2.
Fig. 1 Schema de obținere a derivaților seriilor I-IV
În cazul seriilor I-IV s-au obținut derivați de sinteză sau
semisinteză ai acidului cinamic, în timp ce seriile V și VI reprezintă
compuși de condensare ai unor aldehide aromatice cu acetofenona /
11
4-brom-acetofenona, rezultând calcone cu o grupare cinamoil în
moleculă.
Fig. 2 Schema de obținere a derivaților seriilor V-VI
Pentru compușii sintetizați au fost stabilite unele caracteristici
fizico-chimice (aspect, punct de topire, solubilitate, comportament
cromatografic), iar structura acestora a fost dovedită prin analiză
elementală, spectrometrie în UV, IR și de rezonanță magnetică
nucleară.
Fiind vorba de compuși eventual medicamentoși, au fost
determinați și unii parametri cu implicații deosebite pentru a anticipa
farmacocinetica substanțelor (coeficientul de partiție octanol-apă, aria
suprafeței polare și volumul molecular).
Compușii sintetizați au fost apoi evaluați din punct de vedere
al acțiunii antibacteriene și antifungice, precum și al potențialului
antioxidant, iar toxicitatea și genotoxicitatea au fost stabilite prin
intermediul a două teste fitobiologice: Phaseolus și Triticum.
În Capitolul III este redată Obţinerea şi stabilirea
caracteristicilor fizico-chimice şi a structurii compuşilor sintetizaţi. În cadrul tezei de doctorat, au fost sintetitizate 50 de
substanţe, împărţite în şase clase diferite. Structurile obţinute derivă
de la trei nuclee de bază importante: acidul cafeic, acidul cinamic şi
acidul ferulic.
Ca precursori pentru sinteza acestor derivaţi am folosit acid
cinamic şi acid cafeic substanţe etalon, produse de firma Fluka, acid
12
ferulic sintetizat din vanilină şi acid cinamic sau derivaţi sintetizaţi de
noi, plecând de la benzaldehidă sau diverse alte aldehide aromatice.
Derivaţii de acid cinamic I1-I10 au fost obţinuţi prin
condensarea acidului malonic cu diferiţi derivaţi de benzaldehidă.
Aceştia au fost folosiţi ca substanţe de plecare pentru obţinerea
analogilor dibromuraţi la nivelul dublei legături din catena laterală a
acidului cinamic, când am obţinut compuşii II1-II8, care au constituit
seria II. Bromurarea derivaților seriei I s-a realizat prin două procedee
(cu brom lichid și cu tribromură de piridiniu), comparându-se
randamentele de reacție.
Seria III (III1-III4) a rezultat la acetilarea directă cu
anhidridă acetică a derivaţilor hidroxi-cinamici.
În cadrul reacţiei de condensare (seria IV), în primă fază a
fost obţinută amida acidului cinamic cu 4-aminoantipirina (IV1),
când, după prepararea clorurii acide, s-a realizat condensarea acesteia
cu 4-aminoantipirina. Într-o a doua etapă am sintetizat amidele
acizilor p-cumaric, ferulic şi cafeic cu aceeaşi aminopirazolonă
(compuşii IV2-IV4), prin condensarea directă a componentelor, sub
acţiunea catalizatorului BOP [benzotriazol-1-il-oxi-tris-
(dimetilamino)-fosfoniu hexafluorofosfat].
Calconele cu grupare cinamoil în moleculă (V1-V13) au fost
sintetizate prin condensarea acetofenonei şi 4-brom-acetofenonei cu
diferite aldehide aromatice. Compușii V1-V13 au fost sintetizați atât în
condiții clasice, cât și sub acțiunea ultrasunetelor, avantajul major în
cazul celui de-al doilea procedeu constând în reducerea considerabilă a
timpului de reacție. Aceste substanţe au reprezentat precursori pentru
obţinerea prin bromurare (cu brom sau cu tribromură de piridiniu) a
calconelor dibromurate corespunzătoare seriei VI (compuşii VI1-
VI11).
13
3.3.1. Stabilirea caracteristicilor fizico-chimice
Dintre caracteristicile fizico-chimice investigate menționăm:
caracteristici organoleptice (aspect, culoare, miros);
solubilitatea (în diverși solvenți – apă, alcool, acetonă, DMSO,
acetat de etil, eter etilic, cloroform) – s-a constatat că majoritatea
compușilor prezintă o solubilitate bună în solvenți organici polari
precum alcool, acetonă și DMSO;
comportamentul cromatografic - CSS a fost folosită pentru a
evalua puritatea substanțelor sintetizate.
Substanţele obţinute au o puritate bună, pe cromatograme fiind
prezente spoturi bine individualizate, evidente (fig.3).
Fig. 3 Cromatograma pe strat subţire a compuşilor seriei III
3.3.2. Investigarea şi confirmarea structurii chimice a indivizilor
sintetizaţi
Seria I (derivații de acid cinamic) cuprinde 10 substanțe
sintetizate - prezentate în tabelul 1, iar în acest caz dovedirea structurii
compușilor s-a făcut cu ajutorul analizei elementale și spectrometriei în
IR și UV.
14
Tabelul 1
Determinarea structurii compuşilor I1-I10
În figurile 4 și 5 sunt prezentate spectrele FTIR și UV ale
acidului 3-brom-cinamic.
Fig. 4 Spectrul FTIR al acidului 3-brom-cinamic (I10)
15
În spectrul FTIR al acidului 3-brom-cinamic pot fi identificate
vibrațiile caracteristice grupărilor funcţionale din molecula
compusului:
o bandă largă în regiunea 3000-2500 cm-1
, determinată de
legătura O-H din gruparea carboxil;
un pic intens la aproximativ 1676 cm-1
, datorat grupării C=O
din acid, care apare deplasat ușor spre frecvențe mai reduse
datorită conjugărilor, fiind vorba despre un acid α,β nesaturat;
la aproximativ 1630 cm-1
poate fi identificată vibrația
caracteristică legăturii C=C din catena laterală.
Fig. 5 Spectrul UV al acidului 3-brom-cinamic (I10) dizolvat în DMSO
Pentru acidul 3-brom-cinamic am determinat un maxim de
absorbţie de 273 nm, datorat în special tranzițiilor electronice π→ π*.
În seria a II-a sunt incluși derivații dibromurați de acid cinamic
(compușii II1-II8), prezentați în tabelul 2.
Wav elength (nm)200 300 400 500 600 700 800 900
Abs
orb
anc
e (
AU
)
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
273
628
16
Tabelul 2
Determinarea structurii compuşilor II1-II8
Spectrele FTIR şi UV ale compuşilor sintetizaţi confirmă,
alături de datele analizei elementale, structura compuşilor dedusă din
ecuaţiile reacţiilor de sinteză.
Analizând spectrul FTIR al compusului II8 (fig. 6), remarcăm
prezenţa următoarelor elemente caracteristice:
la o frecvenţă de 3429 cm-1
apare un pic intens şi larg
corespunzător grupării OH fenolice;
în intervalul de frecvenţă 3000-2500 cm-1
se remarcă prezenţa
unui pic intens şi foarte larg care poate fi atribuit grupării –OH
din acizii carboxilici;
gruparea C=O din acizii carboxilici absoarbe în intervalul 1725-
1700 cm-1
, iar în spectrul FTIR din figura 6 identificăm un pic
intens la 1714 cm-1
;
legătura C=C din alchene absoarbe radiaţiile IR din regiunea
1680-1620 cm-1
; datorită bromurării dublei legături din molecula
17
acidului ferulic, în spectrul FTIR al compusului II8 nu se mai
înregistrează nici o absorbţie în acest interval de frecvenţă;
vibraţia caracteristică legăturii C-Br apare în regiunea
amprentelor, în zona cuprinsă între 600-500 cm-1
, putând fi
deplasată până la 645-690 cm-1
; în spectrul din figura 6 se
evidenţiază un pic intens la aproximativ 677cm-1
care poate fi
atribuit acestei legături.
Fig. 6 Spectrul FTIR al acidului 3-(3’-metoxi, 4’-hidroxifenil)-2, 3-
dibrom-propanoic (II8)
Spectrul înregistrat în domeniul UV pentru compusul II6 (acid
3-brom-cinamic dibromurat la nivelul dublei legături) are aceeaşi alură
cu spectrul analogului său nebromurat (fig. 7). Se observă o scădere a
maximului de absorbţie de la 273 la 261, care poate fi explicată prin
reducerea conjugării din cauza dispariţiei legăturii olefinice din catena
laterală.
Fig. 7 Spectrul UV al acidului 3-(3′-bromfenil)-2, 3-dibrom-propanoic
(II6) dizolvat în DMSO
Wav elength (nm)200 300 400 500 600 700 800 900
Abs
orba
nce
(AU
)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8 261
18
În plus, pentru unii dintre derivații seriei II au fost realizate și
interpretate spectrele 1H-RMN.
Fig. 8 Spectrul
1H-RMN pentru compusul II6 în DMSO-d6
În spectrul 1H-RMN al compusului II6 (fig. 8) puternic
dezecranaţi apar, aşa cum era de aşteptat, protonii aromatici; astfel
protonul H5 este regăsit sub formă de singlet, în timp ce protonul H7
apare sub formă de dublet datorită cuplajului cu protonul H9, care
apare de asemenea ca dublet. Protonul H8 apare sub formă de triplet
datorită cuplajului cu protonii H7 şi H9. Puternic dezecranat apare şi
protonul din gruparea carboxil sub forma unui semnal larg. Ca dublet
pot fi regăsiţi în spectru şi protonii alifatici din catena laterală H2 şi H3.
În mod analog au fost analizați și compușii celorlalte serii
sintetizate, însă în acest rezumat ne vom mai opri în continuare doar
asupra derivațiilor seriei IV, care conține 4 compuși originali, sub
19
forma amidelor unor derivați de acid cinamic cu 4-aminoantipirina
(tabelul 3).
Tabelul 3
Determinarea structurii compuşilor IV1-IV4
În figurile 9 și 10 sunt prezentate spectrele FTIR și UV ale
unor reprezentanți din această serie, putând observa prezența în
spectrul FTIR a elementelor moleculare caracteristice compusului
analizat.
Fig. 9 Spectrul FTIR al (2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-
4-il) cinamamidei (IV1)
20
În spectrul din fig. 9, al amidei acidului cinamic cu 4-
aminoantipirina [(2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-pirazol-4-
il)cinamamida - IV1], se remarcă apariţia unui pic singular intens cu un
maxim la 3439 cm-1
corespunzător legăturii N-H, ceea ce
demonstrează formarea amidei secundare. Vibraţiile din regiunile
3228-3024 cm-1
pot fi atribuite legăturilor C-H sp2 şi C-H sp
3.
4-aminoantipirina, fiind un derivat 1,2,3-trisubstituit de 5-pirazolonă,
nu admite decât o singură formă tautomeră (forma iminică), în care
gruparea C=O absoarbe în regiunea 1675-1655. Prezenţa legăturii
olefinice C=C este vizibilă datorită picului intens identificat la
1629 cm-1
.
Fig. 10 Spectrul UV al 3-(3,4-dihidroxifenil)-(2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-
2,5-dihidro-1H-pirazol-4-il) acrilamidei (IV4) în acetonă
În literatură, în spectrele pentru diverse fenil-pirazolone au fost
semnalate două maxime de absorbţie – în jur de 240 şi de 340 nm. În
mod similar, în spectrul UV al amidei acidului cafeic cu 4-
aminoantipirina [3-(3,4-dihidroxifenil)-(2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-2,5-
dihidro-1H-pirazol-4-il) acrilamida - IV4] au fost identificate două
maxime de absorbție (fig. 10), la 211 și la 337 nm. Primul poate fi
atribuit, cel mai probabil, benzii de absorbție E, determinată de
tranziţiile π→ π*, fiind dată de cele două nuclee benzenice din
structura compusului. La 337 nm apar, probabil, suprapuse banda B
(caracteristică compușilor aromatici) și banda R, determinată de
tranzițiile n→ π* datorate grefării pe unul dintre nucleele benzenice a
două grupări fenolice, în care oxigenul prezintă electroni
neparticipanţi.
Wav elength (nm)200 250 300 350 400 450
Abso
rban
ce (
AU)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
337
211
21
Derivaţii sintetizaţi au fost caracterizaţi şi prin intermediul
rezonanţei magnetice nucleare. S-au analizat spectrele 1H-RMN şi
13C-RMN (fig. 11 - 12).
Fig. 11 Spectrul
1H-RMN al (2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-
pirazol-4-il)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil) acrilamidei (IV3) în DMSO-d6
În spectrul 1H-RMN al compusului IV3 cel mai important
semnal este furnizat de protonul H6, care apare ca singlet, fiind
puternic dezecranat, aşa cum era de aşteptat, datorită grupării –NH
amidice. În zona aromatică, la deplasări chimice mari, apar protonii din
cele două nuclee aromatice, în concordanță cu structura propusă.
Semnale importante sunt furnizate și de protonii din gruparea metil ce
se leagă de nucleul pirazolonic; cei trei protoni din poziția 2 sunt mai
dezecranați decât apar în mod obișnuit protonii alifatici, dezecranarea
datorându-se prezenței în vecinătatea lor a atomilor de azot.
22
Fig. 12 Spectrul
13C-RMN al (2,3-dimetil-5-oxo-1-fenil-2,5-dihidro-1H-
pirazol-4-il)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil) acrilamidei (IV3) în DMSO-d6
În spectrul 13
C-RMN al compusului IV3 (fig. 12), atomul de
carbon C7 aparținând grupării amidice apare la 164.50 ppm, urmat de
atomul de carbon C5 din gruparea cetonică a nucleului pirazolonic la
161.70 ppm. Alocarea semnalelor pentru ceilalți atomi de carbon s-a
făcut în concordanță cu structura propusă a compusului.
3.3.3. Determinarea unor parametri fizico-chimici ai compuşilor
sintetizaţi cu implicaţii deosebite în comportamentul farmacocinetic
Pentru compuşii sintetizaţi s-au determinat o serie de parametri
fizico-chimici, cum ar fi: coeficientul de partiţie octanol:apă (logP),
aria suprafeţei polare (ASP) şi volumul molecular (VM), folosind
programul Molinsipration WebMe Editor 3.0. Determinarea acestor
parametri este foarte utilă pentru a anticipa farmacocinetica
substanţelor.
Cel mai important parametru este logP. Valoarea logP descrie
lipofilia intrinsecă a moleculei (dată de colecţia de grupări funcţionale
şi de scheletul format din atomii de carbon), în absenţa disocierii sau a
23
ionizării. O valoare ridicată a parametrului logP denotă o lipofilie
crescută a moleculei, care determină o permeabilitate mare prin diverse
membrane biologice, dar şi o reducere a solubilităţii compusului în
apă, iar solubilitatea scăzută a compuşilor în apă constituie un factor
limitant în procesul de absorbţie la nivel intestinal. Se consideră că
valoarea optimă pentru log P variază în intervalul 0-3, dar nu trebuie să
fie mai mare de 5. După cum se poate observa din figura 13 (A și B),
valoarea logP pentru majoritatea compușilor seriilor I, II, III și IV se
încadrează în intervalul optim recomandat. Derivații seriilor V și VI
prezintă un grad de lipofilie mai accentuat (logP peste trei), o parte
dintre aceștia depășind pragul limită de 5, ceea ce ar sugera faptul că
substanțele în cauză ar putea pune oarecare probleme de absorbţie la
nivel intestinal, dar mai ales de concentrare intracelulară, unde mediul
este apos.
Fig. 13A Valorile logP pentru derivaţii seriilor I-IV
24
Fig. 13B Valorile logP pentru derivaţii seriilor V - VI
În Capitolul IV sunt descrise Cercetările privind evaluarea
activităţii biologice a compuşilor sintetizaţi.
Creşterea ponderei infecţiilor în rândul populaţiei, extinderea
fenomenului de rezistenţă a microorganismelor patogene şi
preocuparea continuă de a mări eficienţa, de a scădea toxicitatea şi de a
reduce costurile din sistemul sanitar reprezintă doar câteva dintre
motivele pentru care cercetările în domeniul descoperirii unor noi
agenţi terapeutici au căpătat o amploare deosebită.
Scopul principal al lucrării este obţinerea unor derivaţi de sinteză
sau semisinteză cu proprietăţi antimicrobiene. Din acest motiv,
compuşii sintetizaţi au fost evaluaţi în special din punct de vedere al
potenţialului lor antibacterian şi antifungic.
4.2. Evaluarea acţiunii antibacteriene şi antifungice a compuşilor
sintetizaţi
Activitatea antimicrobiană a compuşilor sintetizaţi a fost măsurată
prin metoda difuzimetrică în agar Mueller-Hinton şi respectiv,
Sabouraud pentru fungi. A fost investigat potenţialul antibacterian şi
antifungic al celor 50 de substanţe sintetizate din seriile I-VI şi al
acidului cafeic (codificat I11), procurat de la firma Fluka.
Substanțele testate au fost active, în general, față de bacteriile
Gram pozitive nesporulate.
25
Încercând să stabilim o interrelație între structura chimică și
activitatea antimicrobiană, am constatat că prin bromurarea derivaților
de acid cinamic, activitatea antistafilococică crește foarte mult, fapt
care poate fi observat și în figura 14.
Fig. 14 Diametrele zonelor de inhibiţie la Stapylococcus aureus
ATCC 25923 determinate de compuşii de tip I sintetizaţi, comparativ cu
derivaţii lor de dibromurare
Legendă: A= I1/II1; B= I2/II2; C= I6/II3; D= I8/II4; E= I9/II5; F= I10/II6; G=
I5/II7; H= I4/II8.
De asemenea, bromurarea legăturii olefinice a determinat
lărgirea spectrului de acțiune al compușilor seriei II asupra bacteriei
Gram negative Escherichia coli ATCC 25922 (fig. 15).
Fig.15 Diametrele zonelor de inhibiţie la E. coli determinate de compuşii
de tip I sintetizaţi, comparativ cu derivaţii lor de dibromurare
Legendă: A= I1/II1; B= I2/II2; C= I6/II3; D= I8/II4; E= I9/II5; F= I10/II6; G=
I5/II7; H= I4/II8.
26
Condensarea acizilor cinamic, p-cumaric, ferulic şi cafeic cu
4-aminoantipirina (IV1, IV2, IV3, IV4) are și ea ca efect potenţarea
activităţii antistafilococice a acestor compuşi (fig. 16). În concluzie,
am reușit să obținem patru derivați originali, cu activitate mult
îmbunătățită față de substanțele de plecare.
Fig. 16 Diametrele zonelor de inhibiţie la Stapylococcus aureus ATCC
25923 determinate de compuşii de tip I sintetizaţi, comparativ cu
derivaţii lor de condensare
Legendă: A= I1/IV1; B= I7/IV2; C= I4/IV3; D= I11/IV4;
Dintre cele 51 de substanțe analizate, 14, aparținând seriilor I
și II, au avut o activitate antifungică față de Candida albicans de bună
calitate, comparabilă cu a martorului pozitiv – nistatina (fig. 17, 18).
Fig. 17 Activitatea antifungică faţă de Candida albicans ATCC 10231 a
derivaţilor I1-I11
27
Fig. 18 Activitatea antifungică faţă de Candida albicans ATCC 10231 a
derivaţilor II1-II8
4.3. Evaluarea acţiunii antioxidante
Radicalii liberi de oxigen sunt molecule foarte reactive
generate în mod normal în timpul respiraţiei celulare. Dezechilibrul
apărut între producţia de radicali liberi şi capacitatea organismului de
a-i neutraliza este cunoscut sub denumirea de stres oxidativ şi este
incriminat în producerea unor afecţiuni precum ateroscleroza, diabetul,
cancerul. În procesele infecţioase s-a constatat o creştere a producţiei
de radicali liberi atât în ţesutul infectat, cât şi la nivelul celulelor
imunitare implicate în procesul de apărare. Din acest motiv, în
tratamentul unor astfel de afecţiuni este foarte utilă administrarea unor
molecule dotate atât cu acţiune antimicrobiană, cât și antioxidantă.
Au fost investigaţi din punct de vedere al acţiunii antioxidante
8 compuşi: acizii cinamic, p-cumaric, ferulic şi cafeic şi amidele lor
cu 4-aminoantipirina. Cu excepţia acidului cinamic și a amidei sale,
toate celelalte substanţe testate au conţinut cel puţin o grupare hidroxil
liberă în moleculă.
Evaluarea acţiunii antioxidante s-a efectuat prin două teste:
determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul
stabil DPPH, care cuantifică abilitatea compuşilor de a reduce
radicalii liberi formaţi în exces;
determinarea puterii reducătoare, care evaluează capacitatea
compuşilor activi de a transfera electroni.
28
4.3.3.1. Determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul
DPPH
A fost testată abilitatea compuşilor de a capta radicalii DPPH.
Capacitatea de scavenger a substanţelor a fost exprimată cu ajutorul
parametrului CE50, care reprezintă concentraţia de compus activ care
inactivează 50% din totalul moleculelor de DPPH. Rezultatele obţinute sunt prezentate în tabelul 4.
Tabelul 4
Capacitatea de scavenger faţă de radicalul DPPH a celor 8 compuşi
testaţi
După cum se poate observa din datele prezentate în tabelul 4,
valoarea CE50 variază foarte mult în cazul celor opt substanţe, şi
anume:
în ciuda prezenţei unei grupări fenolice, pentru acidul p-cumaric
potenţialul antiradicalic este de aproximativ 1000 de ori mai mic
decât în cazul acizilor ferulic şi cafeic. Un rezultat asemănător a
fost obţinut şi de alţi cercetători;
în cazul acidului cinamic, concentraţia de compus care inhibă 50%
din totalul moleculelor de DPPH este mai mare de 200 mM,
29
datorită lipsei oxidrililor fenolici sau a altor grupări donoare de
hidrogen din moleculă;
amidele acizilor cinamic şi cafeic cu 4-amino-antipirina au
prezentat activitate antioxidantă mai bună decât acizii liberi
corespunzători;
în cazul amidării acidului ferulic cu 4-aminoantipirina,
constatăm, comparativ cu substanţa-părinte o reducere a
potenţialului antiradicalic, care este încă suficient de ridicat, dar
rămâne sub nivelul celui al vitaminei C (fig. 18);
acidul p-cumaric şi amida sa au dovedit o activitate antioxidantă
similară;
datorită prezenţei pe nucleul aromatic a două grupări fenolice,
pentru acidul cafeic şi amida sa s-au evidenţiat proprietăţi
antiradicalice deosebite, valoarea CE50 fiind în ambele situaţii sub
10 μM, ceea ce înseamnă că substanţele sunt antioxidanţi mai
potenţi decât vitamina C (fig. 19).
Fig. 19 Capacitatea de scavenger faţă de radicalul DPPH exprimată în
CE50 (10-3
mM = µM)
Legendă: A= I4/IV3; B= I11/IV4
în cazul compuşilor IV1 şi IV2 constatăm apariţia unei anomalii:
deşi compusul IV2 prezintă în moleculă o grupare hidroxil de tip
fenolic liberă (fapt confirmat prin analiză elementală şi metode
spectrale), activitatea sa antioxidantă este mai redusă decât cea a
derivatului IV1 care nu conţine o astfel de grupare.
30
4.3.3.2. Determinarea puterii reducătoare
Dacă primul mecanism de acţiune antioxidantă rezidă în
cedarea de atomi de hidrogen către radicalii liberi, polifenolii pot
acţiona ca scavengeri de radicali liberi şi prin transferul de electroni,
care poate fi evaluat cu ajutorul puterii reducătoare, ca măsură a
capacităţii de a ceda electroni.
Pentru a evalua puterea reducătoare, s-a construit pentru
fiecare substanţă testată câte o curbă de etalonare, folosind în acest
scop diluţii diferite, iar prin interpolare liniară s-a identificat
concentraţia pentru care absorbanţa este 0.5 (CE50).
Fig. 20 Puterea reducătoare a derivaţilor de sinteză exprimată în
CE50 (mM)
Legendă: A= I1/IV1; B= I7/IV2; C= I4/IV3; D= I11/IV4;
După cum se poate constata din figura 20, acidul cinamic (I1)
este lipsit de activitate, motiv pentru care valoare sa CE50 iese din
grafic. Pentru ceilalţi 7 compuşi, însă, puterea reducătoare poate fi
măsurată şi apreciată. Amida acidului cinamic (IV1) prezintă o putere
reducătoare mult mai bună. Acizii p-cumaric, ferulic și amidele lor au
avut un potențial reducător de bună calitate, comparabil cu cel al
vitaminei C.
În cele din urmă, acidul cafeic (I11) se dovedeşte a fi cel mai
activ din seria precursorilor, fiind depăşit doar de amida sa.
După cum se poate constata, prin derivatizarea acizilor la
amide, se produce în general potențarea acţiunii reducătoare.
31
4.4. Evaluarea activităţii fitobiologice
Pentru substanţele farmaceutice evaluarea potenţialului lor
toxicologic este foarte importantă. Identificarea unei toxicităţi crescute
într-un stadiu incipient al cercetărilor în procesul de descoperire a unor
medicamente noi poate economisi timp şi resurse materiale, eliminând
candidaţii grevaţi de efecte nedorite, înainte de a fi supuşi unor testări
ulterioare costisitoare.
Testele fitobiologice sunt de obicei utilizate pentru a evalua
impactul agenţilor chimici faţă de mediu, dar tot ele pot oferi prime
informaţii utile cu privire la acţiunea toxică a compuşilor
medicamentoşi asupra materiei vii. Astfel acestea pot reprezenta o
metodă de selecţie a substanţelor bine tolerate, care sunt trecute apoi în
testele in vivo ulterioare, efectuate pe animale de experienţă şi
finalizate în momentul în care ajung în experimentare clinică.
Având în vedere faptul că în cadrul prezentei teze de doctorat
ne-am propus identificarea unor derivaţi de sinteză plecând de la
structuri cunoscute existente în regnul vegetal, am considerat important
să trecem printr-un screening fitobiologic unii dintre compuşii mai
promiţători din punct de vedere al activității biologice, pentru a putea
urmări influenţa pe care aceştia o au asupra organismelor vii. În acest
sens, a fost investigată acţiunea derivaţilor din seriile I şi II asupra a
două specii de plante: Phaseolus vulgaris şi Triticum aestivum.
Seminţele acestor specii au fost crescute pe un suport constituit din
hârtie de filtru, iniţial impregnat cu diluţii diferite ale substanţelor de
testat, iar pentru plantulele rezultate s-au urmărit modificările
morfologice, histo-anatomice de la nivelul meristemelor radiculare şi
biochimice, comparativ cu cele ale unor plantule martor, crescute şi
dezvoltate pe suport neimpregnat. Pe parcursul experimentului probele
au fost udate cu aceeaşi cantitate de apă.
În cazul testelor Phaseolus, substanţele care au fost supuse
screening-ului fitobiologic au fost în număr de 19 (11 din seria I şi 8
din seria II). Au fost testate trei concentrații de substanță activă,
exprimate în µg compus activ / unitatea de suprafață (cm2):
concentraţia A – 28.6 μg/cm2;
32
concentraţia B- 57.3 μg/cm2;
concentraţia C – 114.6 μg/cm2.
Analizând figurile 21 și 22 (procentele de inhibiție ale alungirii
radiculare și ale dezvoltării părților aeriene la plantulele tratate în
comparație cu martorul), putem concluziona că, din punct de vedere al
aspectului morfologic, toți derivații testați din seria I au inhibat atât
creșterea părților aeriene, cât și alungirea radiculară a plantulelor de
fasole la toate cele trei concentrații testate, efectul inhibitor fiind mai
puternic la nivel radicular, comparativ cu partea aeriană.
Fig. 21 Procentele de inhibiţie a alungirii radiculare la plantulele
de fasole determinate de tratamentele cu derivaţii seriei I
Fig. 22 Procentele de inhibiţie a dezvoltării părţii aeriene la plantulele de
fasole determinate de tratamentele cu derivaţii seriei I
33
Și în cazul derivaților seriei II procentul de inhibiție se
dovedește a fi în strânsă corelație cu doza de substanță bioactivă pusă
la dispoziție la impregnarea suportului. Inhibiția cea mai intensă se
înregistrează la concentrația mare de substanță și se păstrează mai
accentuată pentru rădăcini decât pentru tulpini (fig. 23 și 24).
Interesant este faptul că agenții dibromurați au o citotoxicitate mai
redusă decât compușii seriei I și, în plus, în cazul derivatului
dibromurat al acidului ferulic apare o ușoară stimulare a creșterii în
lungime a rădăcinilor, dublată de o ușoară inhibare a dezvoltării părții
aeriene.
Fig. 23 Procentele de inhibiţie a alungirii radiculare la plantulele de
fasole determinate de tratamentele cu derivaţii seriei II
Fig. 24 Procentele de inhibiţie a dezvoltării părţii aeriene la plantulele de
fasole determinate de tratamentele cu derivaţii seriei II
34
Tratamentele efectuate au determinat în anumite cazuri apariția
unor indivizi care au prezentat diverse anomalii în dezvoltare (fig.
25).
Fig. 25 Indivizi anormali rezultaţi după tratamentul cu I3
(7 zile), comparativ cu martorul
În continuarea studiului s-a trecut la urmărirea apariției unor
modificări histo-anatomice în rădăcinile plantulelor tratate, analizate
fiind probele rezultate cu concentrația maximă
(114.6 μg/cm2 ); în acest scop s-au efectuat secțiuni la două nivele ale
rădăciniţei: vârful mersitemului radicular şi la baza hipocotilului.
Structura martorului la nivelul vârfului meristemului
radicular cuprinde: rizoderma, scoarţa și cilindrul central (stelul),
care este relativ gros, de tip tetrarh, cu 4 fascicule de xilem alternând
cu tot atâtea fascicule de floem, separate de raze medulare. La periferia
fiecărui fascicul liberian se găseşte câte un cordon relativ subţire de
fibre liberiene (fig. 26).
Fig. 26 Structura anatomică la nivelul vârfului meristemului
radicular
35
Tratamentul cu acid 4-metil-cinamic (I8) a determinat la
trecerea de la rădăcină la hipocotil un proces de diviziune celulară atât
la nivelul inelului de floem, cât mai ales la nivelul inelului de xilem,
fără ca ţesutul meristematic rezultat să formeze un inel, ci doar insule
cu localizare diferită, care produc local fie elemente conducătoare de
ambele tipuri (floem şi xilem), fie numai xilem, vasele rezultate fiind
netipice (fig. 27).
Fig. 27 Secţiune transversală la nivelul hipocotilului plantulelor de
Phaseolus expuse tratamentului cu acid 4-metil-cinamic (I8)
Modificări în structura normală au fost identificate și la nivelul
vârfului meristemului radicular – tratamentul cu acid
3-brom-cinamic dibromurat (II6), având ca efect apariția unui cilindru
central de tip pentarh, în comparație cu martorul care este tetrarh (fig.
28).
Fig. 28 Secțiune transversală prin meristemul radicular al plantulelor de
Phaseolus crescute pe suport tratat cu II6
Polifenolii reprezintă o clasă importantă de metaboliţi
secundari ai plantelor. Din acest motiv, ne-am propus urmărirea
modificărilor în ceea ce privește biochimismul normal al plantulelor de
fasole sub acțiunea tratamentului cu substanțele investigate, deoarece
B
Greutatea masei vegetale
uscate
(g)
Procentul de apă
36
citotoxicitatea acestora se exprimă cu siguranță și în plan metabolic.
Parametrii urmăriți în cadrul cercetărilor noastre s-au limitat la
determinarea prin cromatografie pe strat subțire a derivaților
polifenolici și dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali.
În cazul tablourilor cromatografice obţinute s-au remarcat
următoarele aspecte:
în extractul obţinut din plantulele martor am identificat
prezenţa acidului clorogenic, a acidului ferulic şi a acidului cafeic,
ultimul fiind slab reprezentat probabil din cauza concentraţiei reduse;
clorofilele, caracterizate printr-o fluorescenţă roşie puternică,
au fost prezente în toate extractele analizate;
compoziţia extractelor din plantulele tratate cu derivaţii seriilor
I și II a fost, în general, similară cu cea a martorului, excepţie făcând
tratamentele cu o parte dintre compuşi, când la unele dintre
concentraţiile aplicate s-a constatat creşterea considerabilă a
biosintezei de acid cafeic.
În urma dozării spectrofotometrice, reducerea conținutului
de polifenoli totali a fost observat la toți indivizii tratați în comparație
cu martorul, scăderea fiind direct proporțională cu concentrația de
substanță activă aplicată. În cazul plantulelor crescute în prezența
derivaților seriei I, doar la cea mai mică concentrație de substanță
activă aplicată a putut fi determinat conținutul în polifenoli pentru toți
compușii seriei, la celelalte concentrații, în anumite cazuri, cantitatea
de produs vegetal fiind insuficientă, pe motivul nedezvoltării
corespunzătoare a plantulelor. În schimb, la seria II s-a putut realiza
această determinare pentru toate cele 8 substante testate la 2 dintre cele
trei concentrații active analizate (fig. 29 și 30).
Dacă în cazul compușilor de sinteză ai seriei I am constat
prezența unei toxicități destul de importante manifestate în plan
anatomic și biochimic, în cazul derivaților dibromurați aceasta este mai
redusă. Acest lucru este important, deoarece din literatura de
specialitate se știe că introducerea halogenilor în moleculă are drept
consecință o potențare a acțiunii antimicrobiene și antifungice, care s-a
37
dovedit reală și în cazul de față, fără a crește însă în aceeași măsură
fitotoxicitatea.
Fig. 29 Conținutul în polifenoli totali determinat în partea aeriană a
plantulelor de fasole tratate cu derivații de sinteză ai seriei I la
concentrația de 28.6 µg/cm2.
Fig. 30 Conținutul în polifenoli totali determinat în partea aeriană a
plantulelor de fasole tratate cu derivații de sinteză ai seriei II la
concentrațiile de 28.6 µg/cm2 și 57.3 µg/cm
2
Testul Triticum permite evaluarea unor aspecte referitoare la
citotoxicitatea şi mutagenitatea compuşilor testaţi. Testul Triticum s-a
efectuat pentru cinci compuși, unul din seria I – acid cinamic (I1) și 4
din seria II (II1 - acidul dibromcinamic, II6 - acidul 3-brom-cinamic
dibromurat, II7- acidul 5-brom-ferulic dibromurat, II8 – acidul ferulic
dibromurat), care la investigarea antimicrobiană și antifungică au
dovedit a avea o acțiune antistafilococică și anti-Candida bună.
38
Am realizat două variante de experiment. În prima variantă s-a
recurs la gonflarea timp de 24 sau 48 de ore a cariopselor în soluție de
substanță test 0.01% (concentrație egală cu valoare CMB determinate
pentru acești compuși), urmărindu-se și influența timpului de
expunere. În paralel, au fost montate variante experimentale în care
cariopsele au fost etalate pe suporturi de hârtie de filtru impregnate cu
concentrații variabile de substanță activă – 63 µg/cm2, 161 µg/cm
2,
322 µg/cm2.
În ceea ce priveşte alungirea radiculară la indivizii trataţi în
comparaţie cu martorul, mărirea timpului de expunere inițială
determină creşterea procentului de inhibiţie în două dintre cele cinci
cazuri (II1 şi II6). În cazul menținerii cariopselor de grâu timp de 48 de
ore în soluția 0.01% a substanței II7, s-a remarcat o stimulare puternică
(46.94%) a dezvoltării radiculare în raport cu martorul (fig. 31).
Expunerea cariopselor pentru 24 respectiv, 48 de ore la
soluţiile de concentraţie 0.01% a determinat în majoritatea cazurilor
reducerea lungimii părții aeriene a plantulelor de grâu, excepție făcând
acidul 5-brom-ferulic dibromurat (fig. 32).
Fig. 31 Procentele de inhibiţie a alungirii radiculare la plantulele
tratate cu soluţii 0.01%
Fig. 32 Procentele de inhibiţie a creşterii părţilor aeriene la
plantulelor tratate cu soluţii 0.01%
39
Dacă în cazul testului Phaseolus tratamentele aplicate au
inhibat în general atât dezvoltarea rădăcinilor cât și a părților aeriene,
pentru testul Triticum, după cum se poate observa și din figurile 33 și
34, rezultatele obținute sunt neomogene și nu se pot formula concluzii
clare privind influența pe care o au din punct de vedere morfologic
substanțele testate asupra plantulelor de grâu.
Fig. 33 Procentele de inhibiţie a alungirii radiculare la plantulele
tratate cu soluţii de concentraţie 63μg/cm2, 161μg/cm
2 şi 322 μg/cm
2
Fig. 34 Procentele de inhibiţie a creşterii părţilor aeriene la
plantulele cultivate pe hârtie impregnată cu 63 μg/cm2, 161 μg/cm
2 şi
322 μg/cm2 substanță activă
Evaluarea modificărilor citogenetice induse de substanţele
sintetizate au vizat impactul celor cinci acizi organici asupra diviziunii
mitotice la un genotip vegetal – Triticum aestivum. În acest scop a fost
analizat indicele mitotic (proporţia de celule meristematice de grâu
aflate în diviziune).
40
Toți acizii organici folosiți în experiment au efect inhibitor
asupra mitozei, în diferite grade, în funcție de concentrație și timp de
acțiune. Timpul de contact dintre cariopse și soluția substanței
bioactive influențează evident diviziunea celulară. Expunerea
cariopselor timp de 48 ore influenței soluțiilor cercetate crește în toate
cazurile nivelul de inhibare a celulelor mitogene, comparativ cu
probele pentru care contactul a fost de doar 24 de ore.
Acidul 3-brom-cinamic dibromurat 322 μg/cm2, acidul
ferulic dibromurat (63 μg/cm2 și 322 μg/cm
2) și acidul 5-brom-
ferulic dibromurat 322 μg/cm2 au avut cel mai accentuat efect
represor asupra indicelui mitotic (fig. 35)
Fig. 35 Proporția celulelor aflate în interfază și diviziune
Celulele aflate în cele patru faze ale diviziunii mitotice au
reacţionat diferit la tratamentele cu substanțele testate. De exemplu,
rezultatele referitoare la repartiţia celulelor din meristemele radiculare
de grâu în diferite faze ale mitozei în cazul tratamentului cu acid
41
3- brom-cinamic dibromurat sunt reprezentate în figura 36 și confirmă
efectul inhibitor foarte accentuat al acestui acid prin proporțiile foarte
scăzute ale celulelor metafazice, anafazice și telofazice, mai ales la
concentrația de 322 μg/cm2.
Fig. 36 Proporţia celulelor din meristemul radicular de Triticum aestivum
aflate în cele patru faze ale mitozei în urma tratamentelor cu acid 3-
brom-cinamic dibromurat (II6)
În cadrul studiului privind aberațiile cromozomiale în
meristemele radiculare de Triticum aestivum, am urmărit doi
parametri, pe care i-am considerat ca fiind importanți:
proporția celulelor aflate în metafaze și ana-telofaze aberante;
tipurile și frecvența aberațiilor cromozomiale.
Se remarcă faptul că nu s-au produs metafaze aberante prin
tratamentele cu acid 3-brom-cinamic dibromurat, indiferent de
concentrație și timp de acțiune (fig. 37).
42
Fig. 37 Proporţia celulelor din meristemul radicular de Triticum aestivum,
aflate în metafaze normale şi aberante, în urma tratamentului cu acid 3-
brom-cinamic dibromurat
În cazul ana-telofazelor, tratamentele cu acid 3-brom-cinamic
dibromurat au indus aberații cromozomiale în absolut toate cazurile
experimentale (fig. 38).
Fig. 38 Proporţia celulelor din meristemul radicular de Triticum aestivum,
aflate în ana-telofaze normale şi aberante, în urma tratamentului cu acid
3- brom-cinamic dibromurat
Acidul 3-brom-cinamic dibromurat, a indus în cazul tuturor
celor trei concentrații testate (63 μg/cm2, 161 μg/cm
2 și 322 μg/cm
2)
doar două tipuri de mutații (aberații) cromozomiale: punți
43
cromozomiale și micronuclei. Micronucleii apar doar la concentrația
maximă, de 322 μg/cm2.
La concentrația de 0.01% apar trei tipuri de aberații
cromozomiale: punți cromozomiale, fragmente cromozomiale și ana-
telofaze multipolare (fig. 39).
. Fig. 39 Proporţia tipurilor de aberaţii cromozomiale în meristemul
radicular de Triticum aestivum tratat cu acid 3-brom-cinamic dibromurat
În figura 40 sunt prezentate câteva dintre aberațiile
cromozomiale observate la tratamentul cu acid 3-brom-cinamic
dibromurat.
Ana-telofază cu punți
rupte (63 μg/cm2)
Anafază cu punți
multiple (161 μg/cm2)
Micronucleu
(322 μg/cm2)
Fig. 40 Aberații cromozomiale observate la tratamentul cu acid 3-
brom-cinamic dibromurat
În mod analog cu testul Phaseolus, a fost evaluat profilul
polifenolic al plantulelor de Triticum, atât din punct de vedere calitativ
44
(prin cromatografie pe strat subţire), cât şi cantitativ (prin determinare
spectrofotometrică).
Analizând tablourile cromatografice obţinute, se pot afirma
următoarele:
se remarcă spoturi intense şi numeroare cu fluorescenţă roșie
corespunzătoare clorofilelor în toate probele supuse analizei;
în proba martor pot fi identificaţi cu certitudine acizii clorogenic şi
ferulic; acidul cafeic pare a fi şi el prezent, dar în cantitate foarte
redusă, în timp ce acidul galic este dificil de reperat din pricina
slabei sale fluorescenţe;
tratamentul cu derivaţii I1, II7 şi II8 a determinat la anumite
concentraţii de substanţă activă intensificarea biosintezei de acid
cafeic în plantulele de Triticum (pentru compuşii II7 şi II8 acest
fenomen fiind observat şi în cazul plantulelor de Phaseolus).
La analiza cantitativă, se constată o scădere a biosintezei de
derivați polifenolici, care merge în paralel cu creșterea cantității de
substanță bioactivă și cu creșterea timpului de contact. Totodată există
diferențe destul de mari de activitate inhibitorie între cele cinci
substanțe, cea mai apropiată de normal părând să fie proba II1, în timp
ce II6 determină cea mai drastică scădere a conținutului în polifenoli
(fig. 41, 42).
Fig. 41 Modificarea conţinutului în polifenoli totali în extractele de
Triticum în cazul tratamentului timp de 24 / 48 h cu soluțiile 0.01% ale
compușilor testați
45
Fig. 42 Modificarea conţinutului în polifenoli totali în extractele de
Triticum în cazul tratamentului cu compușii testați la concentrațiile
63µg/cm2, 161 µg/cm
2, 322 µg/cm
2
5.1. Concluzii generale
Având în vedere faptul că ne-am propus ca în cadrul tezei de
doctorat să sintetizăm sau să transformăm prin semisinteză o serie de
compuşi existenţi în natură, care ar putea fi dotaţi fie cu acţiune
antimicrobiană/antifungică, fie cu acţiune antioxidantă, am obţinut o
serie de rezultate, concluziile generale la care am ajuns putând fi
sistematizate conform celor de mai jos.
Pe linia sintezei / semisintezei am reuşit să obţinem:
un număr de 10 derivaţi de acid cinamic (I1-I10);
prin bromurare cu brom sau cu ajutorul tribromurii de piridiniu, un
număr de 8 derivaţi dibromuraţi (II1-II8), ai căror precursori se
regăsesc între substanţele seriei I;
un număr de patru derivaţi acetilaţi ai unor acizi
polifenolcarboxilici (III1-III4);
patru amide derivate de la precursorii: acid cinamic, acid p-
cumaric, acid ferulic şi acid cafeic (IV1-IV4);
un număr de 13 calcone având o grupare cinamoil în structură (V1-
V13), iar plecând de la acestea;
calconele dibromurate (VI1-VI11).
46
Pentru substanţele de sinteză au fost stabilite condiţiile cele
mai favorabile de lucru, care au condus la obţinerea substanţelor în
discuţie cu randamente convenabile.
Toate cele 50 de substanţe sintetizate au fost caracterizate din
punct de vedere fizico-chimic, stabilindu-se totodată structura lor
chimică:
a fost descris aspectul macroscopic al compuşilor;
s-a stabilit punctul de topire;
s-a determinat solubilitatea în solvenţi organici polari şi nepolari,
precum şi în apă;
s-a controlat puritatea substanţelor prin cromatografie pe strat
subţire;
s-a efectuat analiza elementală;
s-a investigat comportamentul spectroscopic în UV şi au fost
analizate spectrele de vibraţie moleculară în IR;
s-a efectuat analiza RMN pentru un număr de 13 compuşi;
s-au calculat coeficientul de partiţie octanol- apă (logP), aria
suprafeţei polare (ASP) şi volumul molecular (VM), parametri de
care ar putea depinde biodisponibilitatea substanţelor la
administrare pe cale orală.
În continuare, a fost evaluată activitatea biologică a
compuşilor sintetizaţi, când s-a investigat:
acţiunea antibacterienă şi antifungică pentru toate cele 50 de
substanţe sintetizate, la care se adaugă şi acidul cafeic, ca martor,
procurat de la firma Fluka;
compuşii testaţi au prezentat activitate în special asupra bacteriilor
Gram pozitive nesporulate (Staphylococcus aures şi Sarcina lutea);
pentru cinci dintre substanţe, care au dovedit o acţiune
antibacteriană convenabilă, au fost determinate concentraţia
minimă inhibitorie (CMI) şi concentraţia minimă bactericidă
(CMB); substanţele care s-au dovedit a fi cele mai eficiente
antibacterian au fost: I1, II1, II6, II7 şi II8;
47
în cadrul testelor s-a stabilit că, dintre cei 50 de compuşi sintetizati,
un număr mare prezintă o acţiune antifungică de foarte bună
calitate;
potenţialul antioxidant a fost evaluat cu ajutorul a două teste,
primul determinând capacitatea de scavenger a substanţelor faţă
de radicalul DPPH, în timp ce cel de-al doilea stabileşte puterea
reducătoare;
8 substanţe au fost trecute prin filtrul potenţialului antioxidant, când
s-a remarcat faptul că cei mai potenţi agenţi antioxidanţi au fost,
după cum era de aşteptat, acizii ferulic, cafeic şi amidele lor; în
plus, acidul cafeic şi amida sa au prezentat o activitate mai bună
decât martorul pozitiv (vitamina C);
gradul de toxicitate a compuşilor de sinteză faţă de organisme vii,
cum ar fi cele vegetale. În acest scop am apelat la testele
fitobiologice, care s-au realizat pe plantule de Phaseolus vulgaris
şi Triticum aestivum; s-a urmărit influenţa derivaţilor
medicamentoşi asupra unui organism viu în dezvoltare, atât în plan
morfologic, cât şi biochimic. De asemenea, cu ajutorul testului
Triticum ne-am putut face şi o imagine cu privire la
genotoxicitatea acestor substanţe;
din punct de vedere al aspectului morfologic, toţi derivaţii testaţi
în cadrul testului Phaseolus, cu excepţia acidului ferulic dibromurat
(II8), au inhibat atât creşterea părţilor aeriene, cât şi alungirea
radiculară a plantulelor de fasole la toate cele trei concentraţii
testate; în schimb, pentru testul Triticum rezultatele obţinute sunt
neomogene şi nu se pot formula concluzii clare privind influenţa pe
care o au, din punct de vedere morfologic, substanţele testate asupra
plantulelor de grâu;
au fost identificate şi modificări histo-anatomice apărute în
secţiunile realizate prin meristemele radiculare ale plantulelor
tratate; efectele cele mai pronunţate în acest sens au fost înregistrate
pentru plantulele de fasole supuse tratamentelor cu derivaţii seriei I;
din cei 19 derivaţi sintetizaţi care au fost trecuţi prin screening-ul
fitobiologic pe Phaseolus vulgaris, 15 au dovedit că nu influenţează
seminificativ (cu peste ± 20%) activitatea biosintetică în domeniul
48
acizilor polifenolcarboxilici la doza minimă de 28.6 µg/cm2, în timp
ce doza maximă (114.6 µg/cm2) vine, aşa cum era de aşteptat, cu
modificări majore pentru substanţele I5, I8, II2, II4, II5;
din cele cinci substanţe trecute prin testul Triticum, care totodată se
dovediseră a fi cele mai active din punct de vedere al acţiunii
antimicrobiene şi antifungice, toate s-au dovedit a avea un efect
inhibitor asupra diviziunii mitotice; dintre acizii organici utilizaţi în
experiment, amplitudinea cea mai largă a potenţialului mutagen se
datorează acidului cinamic, derivatului său dibromurat şi acidului
3-brom-cinamic dibromurat; acidul ferulic dibromurat şi acidul 5-
brom-ferulic dibromurat au avut un potenţial mutagen redus.
5.2. Gradul de originalitate. Perspective de cercetare.
Originalitatea lucrării constă în încercarea de a obţine (plecând
de la modele chimice naturale, identificate în lumea vegetală)
substanţe de sinteză şi semisinteză cu acţiune antimicrobiană şi
antifungică sau cu un anume potenţial antioxidant.
Deoarece structurile chimice de tip antibiotic sau de sinteză,
cum ar fi chimioterapicele, cu acţiune antibacteriană şi antifungică au
dovedit că induc frecvent rezistenţă la microorganismele iniţial
sensibile, pe plan mondial se caută structuri naturale care, pe lângă o
activitate bună, să vină şi cu o mai bună toleranţă biologică pentru
organismul tratat.
Prin sinteza şi caracterizarea fizico-chimică a 50 de derivaţi,
dintre care originali sunt 13, s-a lărgit gama substanţelor cunoscute.
O parte dintre substanţele sintetizate au avut o activitate
antimicrobiană (antibacteriană şi antifungică) promiţătoare, ceea ce îi
face candidaţi viabili pentru testări ulterioare aprofundate, în vederea
introducerii lor eventuale în terapeutică.
De asemenea, pentru unii compuşi s-a evidenţiat un oarecare
potenţial antioxidant, care îi plasează, în ceea ce priveşte intensitătea
de acțiune, înaintea acidului ascorbic. Este vorba de acidul cafeic şi
amida sa cu 4-aminoantipirina, care însă, pentru a ajunge în
terapeutică, ar trebui trecuți printr-o baterie de teste complementare in
vitro, urmate de cercetări farmacologice şi, eventual, clinice.
49
Tocmai acest aspect considerăm că poate reprezenta un
domeniu de cercetare ulterioară.
Dintre cei 19 derivaţi de acid cinamic supuşi testărilor
fitobiologice prin testele Phaseolus şi Triticum, doar acizii cinamic,
cafeic, ferulic, p-cumaric şi 4-metoxi-cinamic au mai fost analizaţi
anterior din această perspectivă.
Cinci dintre substanţele cu o acţiune antimicrobiană şi
antifungică convenabilă [acidul cinamic (I1), acidul cinamic
dibromurat (II1), acidul 3-brom-cinamic dibromurat (II6), acidul 5-
brom-ferulic dibromurat (II7), acidul ferulic dibromurat (II8)] au fost
investigate şi din punct de vedere al potenţialului genotoxic şi s-a
concluzionat că acidul ferulic dibromurat şi acidul brom ferulic
dibromurat au avut un potenţial mutagen redus.
În schimb, substanțele care au prezentat o citotoxicitate
ridicată, cum este cazul acidului 3-brom-cinamic dibromurat, pot fi
supuse unor testări ulteriore, în vederea evaluării potențialului
antitumoral. Aceasta reprezintă o altă direcție în care pot evolua
cercetările inițiate în cadrul prezentei teze de doctorat.
Cercetările viitoare se vor orienta și spre sinteza de noi
derivați, în special amide ale unor acizi polifenolcarboxilici, deoarece
acestea au dovedit proprietăți antimicrobiene și antioxidante
superioare compușilor de plecare.
5.3. Integrarea proiectului în priorităţile naţionale
Tematica tezei se încadrează în problematica care îi preocupă
pe specialiştii în domeniu, şi anume fundamentarea cunoştinţelor
ştiinţifice privind acţiunile unor substanţe naturale şi utilizarea lor ca
modele structurale pentru obţinerea unor agenţi terapeutici noi lipsiţi
de efecte adverse majore, cum ar fi cito- sau genotoxicitatea.
Totodată se integrează în priorităţile naţionale, cunoscut fiind
că în ţara noastră se exagerează cu consumul antibioticelor care,
frecvent, duc la apariţia de rezistenţă, astfel încât, la nevoie, medicul şi
pacientul nu mai au alte variante terapeutice.
50
Bibliografie selectivă
1. Groβ U. Kurzlehrbuch Medizinische Mikrobiologie und
Infecktiologie, Thieme Verlag, Stutgart, 2006.
2. Cristea AN. Tratat de Farmacologie Ediţia I. Ed. Medicală,
Bucureşti, 2006.
3. Stănescu U, Miron A, Hăncianu M, Aprotosoaie C. Bazele
farmaceutice, farmacologice şi clinice ale fitoterapiei vol. I, Ed. Gr. T.
Popa, Iaşi, 2002.
4. Wolbing RH, Leonhardt K. Local therapy of herpes simplex with
dried extract from Melissa officinalis. Phytomedicine 1994; 1: 25-31.
5. Hăncianu M, Stănescu U, Aprotosoaie C. Bazele farmaceutice,
farmacologice şi clinice ale fitoterapiei vol III. Ed. Gr. T. Popa, Iaşi,
2008.
6. Weber C. Beratung auf Rezept. PTA heute 2008; 22 (12): 34-38.
7. Sandberg F, Corrigan D. Natural Remedies – Their Origins and
Uses. Taylor & Francis, New York, 2001.
40. Šarić-Kundalić B. Traditional Medicine of the Balkans with
Identification and Examination of the Collected Material. Teză de
doctorat, Viena, 2010.
41. Moolla A. A phytochemical and pharmacological investigation of
indigenous Agathosma species. Teză de doctorat, University of the
Witwatersrand, Johannesburg, 2005.
42. Ahrhdt S. Cranberry - Extrakt für eine gesunde Blase. PTA heute
2006; 12: 98.
43. Stothers L. A randomized trial to evaluate effectiveness and cost-
effectiveness of naturopathic cranberry products as prophylaxis against
urinary tract infection in women. Cdn J Urol 2002; 9(3): 1558-1562.
44. Jepson RG, Craig JC. Cranberries for preventing urinary tract
infections. Cochrane Database of Systematic Reviews 2007, Issue 3.
Art. No. CD001321.
45. Santillo VM, Lower FC. Cranberry juice for the prevention and
treatment of urinary tract infections. Drugs today 2007; 43(1): 47-54.
46. Hiller K. Sanicula europaea L.- Sanikel. Z Phytother 2005; 26:
251-254.
51
47. Kolodziej H, Berlin OK. Pelargonium sidoides DC: Latest
findings towards understanding the phytotherapeutic preparation
Umckaloabo. Z Phytother 1998; 19:141-151.
76. Belaiche P. Treatment of vaginal infections of Candida albicans
with essential oil Melaleuca alternifolia. Phytotherapy 1985; 15: 15-
16.
77. Walsh IJ, Longstaff J. The antimicrobial effects of an essential
oil of selected oral pathogens. Periodontology 1987; 8: 11-15.
78. Williams LR, Home VN, Zhang X. The composition and
bactericidal activity of oil of Melaleuca alternifolia (Tea-Tree oil). Int
J Aromatherapy 1988; 1 (3): 15-17.
79. Wolbing RH, Leonhardt K. Local therapy of herpes simplex with
dried extract from Melissa officinalis. Phytomedicine 1994; 1: 25-31.
80. Neubauer N, März RW. Placebo-controlled, randomized double-
blind clinical trial with Sinupret sugar coated tablets on the basis of a
therapy with antibiotics and decongestant nasal drops in acute sinusitis.
Phytomedicine 1994; 1(3): 177-181.
81. Biebach K, Kramer A. Effective treatment of rhinosinusitis in
children. Pad 2004; 10.
82. Kehrl W. Therapy for Acute Nonpurulent Rhinosinusitis with
Cineole: Results of a double-blind randomized , placebo controlled
trail. Laryngoscop 2004; 114 (4): 738-742.
83. Worth H. Concomitent therapy with Cineole (Eucalyptole) reduces
exacerbations in COPD: A placebo controlled double-blind trial.
Respiratory Research 2009; 10: 69.
84. Gillissen A, Juergens UR. Mukopharmaka haben einen
Stellenwert in der COPD Therapie- pro. Atemw-Lungenkrkh 2005;
31(5): 235-248.
85. Juergens UR. Stober M, Vetter H. Steroid-like inhibition of
monocytes arahidonic acid metabolism and IL 1β production by
eucalyptol (1.8 cineol). Atemw-Lungenkrkh 1998; 24: 3-11.
86. Schulz V. Pelargonium sidoides Extrakt EPs 7630 bei 217
Patienten mit akuter Bronchitis: Weitere zulassungsrelevante
Doppelblindstudie publiziert. Z Phytother 2007; 28: 169-170.
87. Berger R. Kennen Sie Umckaloabo. PTA heute 2001; 11: 44-46.
52
99. Narasimhan B, Belsare D, Pharande D. Esters, amides and
substituted derivatives of cinnamic acid: synthesis, antimicrobial
activity and QSAR investigations. Eur J Med Chem 2004; 39 (10):
827-834.
100. Wink M. Wie funktionieren Phytopharmaka? Z Phytother 2005;
26: 262-270.
101. Son S, Lobkowsky EB, Lewis BA, Caffeic acid phenethyl ester
(CAPE): synthesis and X- ray crystallographic analysis, Chem Pharm
Bull 2001; 49(2): 236-238.
102. Valenta C, Schwarz E, Bernkop-Schnürch A. Lysozyme-caffeic
acid conjugates: possible novel preservatives for dermal formulations.
Int J Pharm 1998; 174(1-2): 125-132.
103. Fu J, Cheng K, Zhang Z, Fang R, Zhu H. Synthesis, structure
and structure-activity relationship analysis of caffeic acid amides as
potential antimicrobials. Eur J Med Chem 2010; 45: 2638-2643.
104. Charvat TT, Lee DJ, Robinson WE, Chamberlin AR. Design,
synthesis and biological evaluation of chicoric acid analogs as
inhibitors of HIV-1 integrase. Bioorg Med Chem 2006; 14: 4552-4567.
112. Rajan P, Vedernikova I, Cos P, Vanden Berghe D, Augustyns K,
Haemers A. Synthesis and evaluation of caffeic acid amides as
antioxidants. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 215-217.
113. Kleine-Gunk B. Resveratrol und seine Bedeutung für die Anti-
Aging-Medizin. Z Orthomol Med 2009; 2:11-15.
114. Dirsch V. Naturstoffforschung in Österreich- Zelluläre
Wirkmechanismen. Foliaca 2006; 10 (4): 8-9.
115. Gaspar A, Garrido EM, Esteves M, Quezada E, Milhazes N,
Garrido J, Borges F. New insights into the antioxidant activity of
hydroxycinnamic acids: synthesis and physicochemical
characterization of novel halogenated derivatives. Eur J Med Chem
2009; 44: 2092-2099.
137. Li JT, Yang WZ, Wang SX, Li SH, Li TS. Improved synthesis
of chalcones under ultrasound irradiation. Ultrason Sonochem 2002; 9:
237-239.
53
138. Gupta R, Gupta N, Jain A. Improved synthesis of chalcones and
pyrazolines under ultrasonic irradiation. Indian J Chem 2010; 49B:
351-355.
139. *** Farmacopeea Română ediţia a X-a. Editura Medicală,
Bucureşti, 1993.
140. *** Clinical and Laboratory Standards Institute M02-A11 –
Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;
Approved Standard – Eleventh Edition, National Committee for
Clinical Laboratory Standards,Wayne, 2011.
141. Buiuc D. Microbiologie medicală, Ed. Didactică şi Pedagogică,
Bucureşti, 1992.
142. Brown D, Blowers R. Disk methods of sensitivity testing and
other semiquantitative methods. In: Laboratory methods in
antimicrobial chemotherapy. Churchill Livingstone, London, 1978.
143. *** Clinical and Laboratory Standards Institute. Performace
Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. Approved
standard- Tenth Edition M02-A10 vol. 29, National Committee for
Clinical Laboratory Standards, Wayne, 2009.
144. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of
essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 1999; 86: 985-
990.
149. Yu L, Zhao M, Wang JS, Cui C, Yang B, Jiang Y, Zhao Q.
Antioxidant, immunomodulatory and anti-breast cancer activities of
phenolic extract from pine (Pinus massoniana Lamb) bark. Inno Food
Sci Emer Technol 2008; 9: 122-128.
150. Singh N, Rajini PS. Free radical scavenging activity of an
aqueous extract of potato peel. Food Chem 2004; 85: 611-616.
151. Ferreira ICFR, Baptista P, Vilas-Boas M, Barros L. Free-radical
scavenging capacity and reducing power of wild edible mushrooms
from northeast Portugal: Individual cap and stipe activity. Food Chem
2007; 100: 1511-1516.
152. Abdoulaye D, Martin K, Moussa C, Léopold K, Odile NG, Jean-
Pierre A, Adama S. Antioxidant potentialities of 4-acyl isochroman-
1,3-diones. Res J Chem Sci 2011; 1: 88-90.
54
156. Pădureanu S. Cytogenetic effects induced by sodium nitrite on
mitotic division at Triticum aestivum L. Lucr. st. U.S.A.M.V. Iasi, ser.
Agron. 2008; 51 (1): 3-8.
157. Apostol TV, Draghici C, Dinu M, Barbuceanu SF, Socea LI,
Saramet I. Synthesis, Characterization and Biological Evaluation of
New 5-aryl-4-methyl-2-[para- (phenylsulfonyl)phenyl]oxazoles. Rev
Chim 2011; 62 ( 2): 142-148.
158. Beltagi MS. Phytotoxicity of Methyl Tert-Butyl Ether (MTBE)
to Common Bean (Phaseolus vulgaris L.) Plants. Res J Agric & Biol
Sci 2007; 3(4): 214-219.
159. Singha HP, Batishb DR, Kaurb S, Kohlia RK, Arorab K.
Phytotoxicity of the Volatile Monoterpene Citronellal against Some
Weeds. Z Naturforsch 2006; 61: 334-340.
160. Rugină R., Toma C., Ivănescu L. Morphological and histo-
anatomical aspects at some dicotiledonate seedlings related to the
vascular transition. Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al. I. Cuza”
Iaşi Tomul LII, s. II a. Biologie vegetală 2006: 123-128.
161. Soare LC, Dobrescu CM, Popescu MA. Influenţa Fungicidului
Ridomil Gold Plus asupra creşterii, morfologiei şi anatomiei rădăcinii
de mazăre - Pisum Sativum L. Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al.
I. Cuza” Iaşi Tomul LIV, fasc. 1, supl., s. II a. Biologie vegetală
2008:143-150.
***
Teza cuprinde: 197 de figuri şi 83 de tabele
190 de titluri bibliografice
55
ANEXĂ
Listă de articole publicate din tematica tezei de doctorat
1. Articole publicate în reviste ISI
Jităreanu A., Tătărîngă G., Zbancioc A-M., Stănescu U. Toxicity
of some cinnamic acid derivatives to common bean (Phaseolus
vulgaris). Not Bot Horti Agrobo 2011, 39 (2): 130-134.
2. Articole publicate în reviste B+
Jităreanu A., Tătărîngă G., Zbancioc A-M., Stănescu U. Evaluarea
acțiunii antimicrobiene a unor derivați de acid cinamic. Rev. Med.
Chir. 2011, 115 (3), 965-971.
3. Lucrări publicate în rezumat în volumele unor
conferințe naționale
Jităreanu A., Tătărîngă G., Zbancioc A-M., Tuchiluș C., Stănescu
U. Influența acetilării grupărilor fenolice ale unor acizi
polifenolcarboxilici asupra activității lor antimicrobiene. Conferința
“50 de ani de învățământ farmaceutic la Iași”, 6-8 octombrie 2011,
Editura „Gr. T.Popa”, Iași, 126-129.
Rotariu A., Tătărîngă G., Zbancioc A-M., Tuchiluș C., Stănescu U.
Synthesis and antimicrobial evaluation of some cinnamic acid
derivatives. The XIVth National Congress of Pharmacy from Romania,
13-16 october 2010, Acta Medica Marisiensis, vol. 56, suppl. 2, 10.
