1

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE “CAROL DAVILA” BUCUREȘTI

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

OPTIMIZAREA FORMULĂRII UNOR SISTEME FARMACEUTICE TOPICE

CU KETOPROFEN

Doctorand: CORINA DALIA TRIFA (TODERESCU)

Coordonator știinŃific:

PROF. DR. FARM. DUMITRU LUPULIASA

2016

2

CUPRINS

INTRODUCERE.....................................................................................................................................................6 PARTEA GENERAL TEORETICĂ...................................................................................................................10 CAPITOLUL I. FORME FARMACEUTICE UTILIZATE ÎN ADMINISTRAREA TOPICĂ A MEDICAMENTELOR.........................................................................................................................................11 I.1. FORME FARMACEUTICE CU APLICARE TOPICĂ..............................................................................11 I.1.1. Lichidele pentru aplicare cutanată.........................................................................................................11 I.1.2. Spumele medicamentoase......................................................................................................................12 I.1.3. Preparate semisolide pentru aplicare locală (unguenta).........................................................................13 I.2. SELECTAREA FORMEI FARMACEUTICE ŞI A BAZEI POLIMERICE PENTRU FORMELE FARMACEUTICE CU APLICARE TOPICĂ.......................................................................................................15 I.3. CONTROLUL FARMACOTEHNIC AL FORMELOR FARMACEUTICE CU APICARE TOPICĂ..................................................................................................................................................................17 CAPITOLUL II. STRATEGII DE CREŞTERE A PERMEABILITĂłII DE-A LUNGUL STRATULUI CORNOS................................................................................................................................................................21 II.1. PIELEA – BARIERĂ NATURALĂ PROTECTIVĂ. STRUCTURĂ ŞI FUNCłII .................................21 II.1.1. Structura pielii.....................................................................................................................................22 II.1.2. FuncŃiile pielii......................................................................................................................................25 II.2. CERCETĂRI PRIVIND ELABORAREA UNOR STRATEGII DE CREŞTERE A PERMEABILITĂłII DE-A LUNGUL STRATULUI CORNOS..........................................................................26 II.2.1. Vezicule rigide pentru transportul medicamentelor ...........................................................................28 II.2.1.1. Lipozomii .....................................................................................................................................28 II.2.1.2. Niozomii........................................................................................................................................29 II.2.2. Vezicule ultradeformabile pentru transportul medicamentelor...........................................................29 II.2.2.1. Transferzomii.................................................................................................................................29 II.2.2.2. Etozomii.........................................................................................................................................32 II.3. METODE DE CARACTERIZARE A FORMULĂRILOR NANOSTRUCTURATE..............................36 II.3.1. Investigare prin tehnici de spectroscopie............................................................................................36 II.3.2. Microscopie electronică de baleiaj (SEM)..........................................................................................37 II.3.3 Microscopia electronică prin transmisie.............................................................................................37 II.3.4. Evaluarea stabilităŃii fizice a dispersiilor coloidale ...........................................................................37 II.3.5. Analiza termică...................................................................................................................................38 CAPITOLUL III. ANTIINFLAMATOARE NESTEROIDIENE ...................................................................39 III.1. SELECłIA UNUI ANTIINFLAMATOR NESTEROIDIAN PENTRU FORMULĂRILE TOPICE ...................................................................................................................................39 III.2. STRATEGII ACTUALE DE PREVENIRE ALE EFECTELOR ADVERSE ALE UNOR ANTIINFLAMATOARE NESTEROIDIENE ......................................................................................................42 III.2.1. Încorporarea ketoprofenului în lipozomi rigizi sau ultradeformabili …………………….……......44 III.2.2. Alte modalităŃi de încorporare a ketoprofenului pentru îmbunătăŃirea transportului dermic/transdermic .............................................................................................................................................45 PARTEA EXPERIMENTALĂ ..........................................................................................................................48

3

CAPITOLUL IV. INFLUENłA FACTORILOR DE FORMULARE ASUPRA PROPRIETĂłILOR FIZICO-CHIMICE ALE UNOR GELURI CU KETOPROFEN …………….….....49 IV.1.SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI ÎNTREPRINS ......................................................................49 IV.2.PREPARAREA ŞI CARACTERIZAREA MACROSCOPICĂ A HIDROGELURILOR EXPERIMENTALE CU KETOPROFEN ..........................................................................................................51 IV.2.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................51 IV.2.1.1. Materiale ..................................................................................................................................51 IV.2.1.2. Examenul macroscopic al hidrogelurilor experimentale ........................................................52 IV.2.1.3. Prepararea hidrogelurilor experimentale ..................................................................................52 IV.2.2. Rezultate şi discuŃii ..........................................................................................................................54 IV.3.SCREENING CINETIC AL HIDROGELURILOR EXPERIMENTALE ................................................55 IV.3.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................56 IV.3.2. Rezultate şi discuŃii ..........................................................................................................................58 IV.3.2.1. Determinarea KTP prin spectrofotometrie în UV ....................................................................58 IV.3.2.2. Analiza cinetică a hidrogelurilor proiectate şi industriale ........................................................59 IV.3.2.3. InfluenŃa tipului de alcool asupra profilelor de difuzie şi parametrilor cinetici la cedarea KTP din hidrogelurile experimentale .......................................................................................................68 IV.3.2.4. InfluenŃa modului de încorporare al KTP asupra profilelor de difuzie şi parametrilor cinetici la cedarea din hidrogelurile experimentale ....................................................................................70 IV.3.2.5. Compararea performanŃelor in vitro ale hidrogelurilor experimentale şi tipizate ...................72 IV.3.2.6. Evaluarea mecanismelor de cedare prin modelare matematică ...............................................76 IV.4. ANALIZA PROPRIETĂłILOR REOLOGICE ALE HIDROGELURILOR EXPERIMENTALE........86 IV.4.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................88 IV.4.1.1. Materiale ..................................................................................................................................88 IV.4.1.2. Metode .....................................................................................................................................88 IV.4.2. Rezultate şi discuŃii ..........................................................................................................................88 IV.4.2.1. Profile reologice .......................................................................................................................88 IV.4.2.2. Evaluarea tixotropiei hidrogelurilor analizate ..........................................................................96 IV.5. CONCLUZII .............................................................................................................................................99 CAPITOLUL V. INFLUENłA FACTORILOR DE FORMULARE ASUPRA PROPRIETĂłILOR FIZICO-CHIMICE ŞI STABILITĂłII UNOR VEZICULE ULTRADEFORMABILE CU KETOPROFEN ..................................................................................................................................................101 V.1. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI ÎNTREPRINS ......................................................................101 V.2.PREPARAREA ŞI OPTIMIZAREA NANOSISTEMELOR LIPIDICE ELASTICE DE TIP TRANSFEROZOMI CONłINÂND KTP ...........................................................................................................103 V.2.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................103 V.2.1.1. Reactivi ....................................................................................................................................103 V.2.1.2. Aparatură .................................................................................................................................104 V.2.1.3. Determinarea cantitativă a KTP prin spectrofotometrie în U..................................................104 V.2.1.4. Prepararea transferozomilor ....................................................................................................105 V.2.2. Studiul influenŃei parametrilor de formulare asupra obŃinerii transferozomilor cu KTP.................105 V.2.2.1. Proiectarea experimentelor ......................................................................................................105 V.2.2.2. Fitarea datelor experimentale. Evaluarea validităŃii modelelor ...............................................106 V.2.2.3. Determinarea cantităŃii de substanŃă activă entrapată în transferozomi .................................107 V.2.2.4. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra capacităŃii de entrapare a KTP..............109 V.2.2.5. Determinarea dimensiunilor transferozomilor experimentali .................................................113 V.2.2.6. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra dimensiunii medii a particulelor transferozomilor experimentali ............................................................................................................................114 V.2.2.7. Studii privind cinetica de cedare in vitro a KTP din formulările experimentale selectate ……………………………………………………………………………………………………........117

4

V.2.2.8. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra cedării KPT din transferozomi ........................................................................................................................................................129 V.3. PREPARAREA ŞI OPTIMIZAREA NANOSISTEMELOR LIPIDICE ELASTICE DE TIP ETOZOMI CONłINÂND KTP .............................................................................................................................................134 V.3.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................134 V.3.1.1. React..........................................................................................................................................134 V.3.1.2. Aparatură ..................................................................................................................................134 V.3.1.3. Studiul solubilităŃii ketoprofenului în diferite amestecuri hidroalcoolice ………………...….134 V.3.1.4. Prepararea etozomilor încărcaŃi cu KTP ………………………………………………….......135 V.3.2. Studiul influenŃei parametrilor de formulare asupra obŃinerii etozomilor cu KTP ........................136 V.3.2.1. Proiectarea experimentelor .......................................................................................................136 V.3.2.2. Fitarea datelor experimentale. Evaluarea validităŃii modelelor ................................................137 V.3.2.3. Determinarea cantităŃii de KTP entrapată în etozomi ..............................................................137 V.3.2.4. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra capacităŃii de entrapare a KTP ..............138 V.3.2.5. Determinarea dimensiunilor etozomilor experimentali ...........................................................141

V.3.2.6. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra dimensiunii medii a particulelor etozomilor experimentali…………………………………………………………………………………..141

V.3.2.7. Studii privind cinetica de cedare in vitro a KTP din formulările experimentale selectate ....144 V.3.2.8. Analiza influenŃei factorilor de formulare asupra cedării KPT din etozomi ............................153 V.4. STUDII PRIVIND STABILITATEA NANOTRANSPORTORILOR LIPIDICI ULTRADEFORMABILI CONłINÂND KTP .............................................................................................................................................156 V.4.1. Stabilitatea chimică ...........................................................................................................................156 V.4.2. Stabilitatea fizică ...............................................................................................................................158 V.4.2.1. Studiul stabilităŃii pe termen lung a nanosistemelor lipidice experimentale………………....160 V.4.2.2. InfluenŃa temperaturii de stocare asupra stabilităŃii sistemelor lipidice experimentale .........164 V.4.2.3. InfluenŃa temeperaturii de stocare asupra stabilităŃii transferozomilor …………………......164 V.5. OBTIMIZAREA SISTEMELOR TRANSPORTOARE DE TIP VEZICULE ELASTICE CU KTP.....174 V.5.1. Optimizarea sistemelor transportoare de tip transferozomi cu KTP .................................................174 V.5.2. Optimizarea sistemelor transportoare de tip etozomi cu KTP ..........................................................176 V.6. CONCLUZII ............................................................................................................................................178 CAPITOLUL VI. PREPARAREA ŞI CARACTERIZAREA UNUI HIDROGEL PE BAZĂ DE VEZICULE ULTRADEFORMABILE CU KETOPROFEN ........................................................................183 VI.1.1. Materiale şi metode ..........................................................................................................................183 VI.1.1.1. Prepararea gelurilor bază şi a gelurilor cu veziculele ultradeformabile selectate .................183 VI.1.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a hidrogelurilor proiectate .......................................................184 VI.1.2. Rezultate şi discuŃii ..........................................................................................................................185 VI.1.2.1. Examenul macroscopic al gelurilor .........................................................................................185 VI.1.2.2. Determinarea pH-ului ..............................................................................................................185 VI.1.2.3. Examenul microscopic ............................................................................................................185 VI.1.2.4. Studiul cineticii de cedare in vitro ..........................................................................................185 CONCLUZII GENERALE ...............................................................................................................................190 BIBLIOGRAFIE ................................................................................................................................................198 ANEXE Memoriu de activitate ........................................................................................................................................211 Listă de lucrări ...................................................................................................................................................214 Articole ştiinŃifice elaborate în relaŃie cu tema de cercetare a tezei-publicate în extenso……....220

5

INTRODUCERE

În prezent se acordă un interes din ce în ce mai crescut medicaŃiei antiinflamatoare.

Tratamentul simptomatologic al durerii constă în administrarea de medicamente antalgice, care vor fi selectate funcție de cauza ce produce durerea. AINS fac parte din grupa analgezice-antipiretice-antiinflamatoare și sunt recomandate atât în tratamentul bolilor inflamatorii acute, cât și în cele cronice.

Alegerea temei de cercetare a fost susținută și de analiza evoluției interesului acordat studierii proceselor fizio-patologice ale durerii, în ultimii ani numărul studiilor având ca interes durerea generată de inflamaŃie crescând semnificativ.

Scopul administrării unei forme farmaceutice în tratamentul durerii în bolile inflamatorii este acela de a furniza la locul inflamației o cantitate suficientă de substanță activă, care să fie capabilă astfel să-și manifeste efectul terapeutic în timp util și pe o perioadă de timp suficient de lungă, astfel încât intervalul dintre administrări să fie corect și să se evite, pe cât este posibil, reacțiile adverse.

Ketoprofenul este un antiinflamator nesteroidian ce se încadrează în categoria antiiflamatoarelor minore, derivat al acidului propionic, mult utilzat în terapia actuală atât pentru efectul antiinflamator cât şi pentru efectul analgezic foarte bun. Poate fi administrat pe calea orală, parenterală, rectală, cât şi local prin terapie cutanată. AcŃionează atât prin inhibarea ambelor tipuri de ciclooxigenază cât şi prin inhibarea fosfolipazei şi lipoxigenazei. Datele farmacocinetice arată că pe cale orală, absorbŃia digestivă este bună. Timpul de înjumătățire plasmatic este scurt, de aproximativ două ore. Difuzează în lichidul sinovial, unde se realizează concentraŃii mari. Traversează bariera placentară. Se metabolizează preponderent la nivelul ficatului și se elimină renal.

Administrarea pe cale orală a formelor convenționale cu ketoprofen poate dezvolta o serie de efecte adverse, în mod deosebit datorită iritabilității gastrice pe care acesta o induce. Acesta este unul dintre motivele pentru care, în ultima perioadă, există tendinŃa de a evita administrarea orală a AINS şi înlocuirea acestei căi, pe cât posibil, cu o altă cale de administrare, preferată fiind cea topică. Cercetătorii au încercat să demonstreze că unele antiinflamatoare precum ketoprofenul, naproxenul, tenoxicamul şi celecoxibul au un profil foarte bun de cedare la administrare topică. AINS aplicate topic prezină efecte terapeutice locale similare, dar efectele adverse gastrice sunt mult reduse comparativ cu cele apărute după administrare orală sau injectabilă. De cele mai multe ori, pentru tratarea afecŃiunilor reumatismale se preferă administrarea locală, topică a AINS. Aplicarea topică de antiinflamatoare nesteroidiene oferă mijloace atractive de a reduce reacŃiile adverse prin maximizarea eliberării locale a substanŃei active cu minimizarea răspândirii ei sistemice. De asemenea, preparatele topice prezintă o serie de avantaje comparativ cu formele farmaceutice administrate pe cale orală: aplicare uşoară, tolerabilitate ridicată, incidenŃă mică a reacŃiilor adverse. Dintre AINS cu administrare topică există o serie de produse ce conțin ketoprofen condiționat sub formă de gel, spray local, plasturi cu acțiune locală, unguente lipofile, creme,

6

geluri, spray-uri cutanate, ape de gură, sisteme terapeutice transdermice de tip plasturi, picături oftalmice etc.

În același timp, ținând cont de progresele înregistrate în ultimii ani, se poate institui o terapie sistemică și prin administrare topică, realizându-se nivele plasmatice controlate ale substanței medicamentoase cu un timp de înjumătățire mic și oferind posibilitatea unei aplicări constante ale acesteia. Un mare avantaj al acestor forme farmaceutice ar fi complianța foarte bună, de care depinde obținerea unor rezultate favorabile ale tratamentului. Transferul transdermic este fezabil doar atunci când medicamentul poate să pătrundă în piele şi să ajungă la sistemul circulator în cantitate suficientă pentru a avea efect terapeutic. Pentru a realiza un medicament cu administrare transdermică, trebuie însă rezolvate o serie de dificultăți. Cea mai mare dificultate este chiar penetrarea pielii, deoarece aceasta, prin natura ei, acŃionează ca o barieră în două direcŃii controlând pierderea apei, a electroliŃilor şi a altor constituenŃi şi împiedicând intrarea substanŃelor medicamentoase sau vătămătoare din mediul exterior. Una dintre cele mai controversate metode pentru transportul medicamentelor prin piele este folosirea formaŃiunilor veziculare ca sisteme de transport şi cedare controlată a compusului bioactiv.

SCOP

Obiectivul principal al prezentei teze de doctorat constă în conceperea, dezvoltarea, optimizarea și caracterizarea unor sisteme topice de tip hidrogel cu ketoprofen, care să permită o eliberarea convenabilă, controlată, precum și transportul transdermic al acestuia.

STRUCTURA TEZEI DE DOCTORAT

Teza este organizată după tipicul standard al lucrărilor de doctorat, cuprinzând o parte general-teoretică, structurată pe 3 capitole, care sintetizează stadiul actual al cunoașterii în domeniul abordat, și o parte experimentală, care, pe parcursul a 3 capitole, prezintă cercetările originale efectuate pentru atingerea obiectivului propus. Teza de doctorat se încheie cu capitolul “Concluzii”, urmat de cel referitor la referinŃele bibliografice și anexe. Lucrarea se întinde pe 186 de pagini, este susținută de cele 247 de referințe bibliografice, iar datele experimentale sunt prezentate în 73 de tabele şi 91 de figuri.

În capitolul I “Forme farmaceutice utilizate în administrarea topică a medicamentelor” sunt prezentate date din literatura de specialitate legate de alegerea vehiculului, a modelului de formulare, a formei farmaceutice, precum și de controlul farmacotehnic al formelor administrate topic. Toate aceste aspecte au suferit în ultima vreme o reconsiderare şi o redimensionare semnificativă, modul nou de abordare al problemelor fizico-chimice şi dermatologice au creat posibilitatea obŃinerii de noi date de natură biofarmaceutică, care au lărgit mult sfera de aplicabilitate a preparatelor cu administrare topică.

Capitolul II, “Strategii de creștere a permeabilității de-a lungul stratului cornos” prezintă câteva aspecte privind pielea și funcțiile acesteia, o trecere în revistă a strategiilor de

7

creștere a permeabilităților de-a lungul stratului cornos, precum și a principalelor tipuri de nanotransportori, a metodelor şi tehnicilor de obŃinere și caracterizare a acestora, a avantajelor, dezavantajelor și aplicațiilor lor cu potențial terapeutic.

În ultimul capitol al părții general-teoretice, “Antiinflamatoare nesteroidiene” sunt prezentate date din literatura de specialitate privind această clasă, modul în care se realizează selecția unui AINS, precum și stadiul actual al cercetărilor privind strategiile de prevenire a unor reacții adverse și efecte secundare înregistrate la administrarea unor preparate convenționale cu acești compuși.

Partea a doua, cuprinzând contribuŃiile originale, începe cu prezentarea obiectivelor cercetării, a premiselor și ipotezelor de lucru. Cercetările întreprinse pentru optimizarea, dezvoltarea și caracterizarea unui sistem topic cu cedare controlabilă care să permită obținerea unui efect local/sistemic sunt dezvoltate pe parcursul a 3 capitole.

În capitolul IV “Influența factorilor de formulare asupra proprietăților fizico-chimice

ale unor geluri cu ketoprofen” se prezintă premisele și obiectivele cercetării în scopul formulării unor sisteme medicamentoase de tip hidrogel destínate administrării cutanate,

care să prezinte parametri cinetici convenabili, precum și proprietăți reologice adecvate. S-a studiat atât influenŃa formulării gelurilor, cât și a modului de încorporare a ketoprofenului în acestea, asupra cedării in vitro prin dializă pe membrane de celofan, folosind o celulă de difuzie Franz. De asemenea s-a realizat și un studiu al proprietăților reologice caracteristice curgerii pentru gelurile hidrofile proiectate. Această caracterizare servește la evaluarea proiectării și optimizării sistemelor farmaceutice semisolide pentru utilizarea lor în scopuri specifice, deoarece, este binecunoscut faptul că proprietățile reologice intervin atât în cinetica de cedare a substanței active, cât și în timpul de stază la locul aplicării. Pentru a putea asigura un anumit control al formelor topice experimentale de tip hidrogel, acestea au fost analizate comparativ cu produsul Fastum gel (Menarini Manufacturing Logistics and Services S.R.L.).

Au fost formulate şi preparate cinci hidrogeluri experimentale. Primele trei hidrogeluri conțin același procent de alcool etilic, respectiv izopropilic sau propilenglicol. Ultimele două hidrogeluri experimentale au compoziția identică cu a celui cu alcool izopropilic, dar diferă modul de încorporare al substanței active.

Gelurile experimentale au fost evaluate din punct de vedere al caracteristicilor macroscopice, constatându-se că acestea nu se diferenŃiază între ele.

Studiul cinetic efectuat pe cele cinci hidrogeluri experimentale au fost efectuate utilizând o celulă de difuzie Franz, ce utilizează o membrană artificială de celofan. Am determinat grosimea celofanului îmbibat (0,07mm) folosind un micrometru Starret cu pârghie. Am folosit ca mediu receptor tampon fosfat cu pH 7,4. Cedarea şi difuzia substanŃei active din sistemele farmaceutice topice prin membrana sintetică sunt monitorizate prin colectarea unor probe la diferite intervale de timp. Probele colectate la diferite intervale de timp se evaluează printr-o metodă spectrofotometrică, la λ=254 nm. CantităŃile cedate pe unitatea de suprafaŃă (g/cm2) se reprezintă în funcŃie de rădăcina pătrată de timp, obŃinându-se o linie dreaptă, din a cărei pantă se poate estima coeficientul de difuziune care reprezintă viteza de cedare sau fluxul staŃionar de difuzie.

8

Compararea profilelor cinetice a hidrogelurilor experimentale s-a realizat prin intermediul coeficientului de difuziune, D. Compararea valorilor medii ale D pentru fiecare formulare experimentală a fost realizată utilizând testul Tukey HSD considerând un prag de semnificație p<0.05.

Datele obŃinute în urma derulării experimentelor cinetice privind cedarea KTP din hidrogelurile experimentale și tipizate, utilizând celula de difuziune Franz modificată au fost analizate comparativ cu cele înregistrate pentru produsul comercial Fastum gel.

Tabel 1.Valorile coeficienților de difuziune determinate experimental

Formulare Coeficient difuziune –

D ±SD*105 (cm

2/min)

Timp latenta Tlag (min)

Gel 1 2.81±0.29 28.65

Gel 2 2.09±0.23 25.76

Gel 3 2.77±0.25 22.56

Gel 4 1.62±0.22 21.37

Gel 5 1.23±0.19 27.50

Fastum Gel 2.086±0.26 25.75

Figura 1. Evaluarea comparativă a pofilelor de

difuzie ale KTP din hidrogelurile experimentale G1,

G2 și G3

Figura 2. Intervale de încredere 95%

pentru diferența mediilor coeficienților de

difuziune pentru hidrogelurile testate

9

Figura 3. Evaluarea comparativă a pofilelor de difuzie ale KTP din hidrogelurile testate

Figura 4.Intervale de încredere 95% pentru

diferența mediilor coeficienților de difuziune pentru hidrogelurile testate

Tabel 2.Evaluarea comparativă a profilului cinetic al hidrogelurilor testate pe baza valorilor

coeficienților de difuziune, utilizând Testul Tukey pentru comparații multiple, p<0,05

Test Tukey pentru

comparatii multiple Diferenţa

mediilor Interval încredere

95 % P

Semnificaţie

statistică

Fastum Gel vs. Gel 1 -7.26e-006 -1.303e-005 to -1.489e-006 0.0133 *

Fastum Gel vs. Gel 2 -4.841e-008 -5.819e-006 to 5.723e-006 0.9999 ns

Fastum Gel vs. Gel 3 -6.869e-006 -1.264e-005 to -1.098e-006 0.0188 *

Fastum Gel vs. Gel 4 4.626e-006 -1.144e-006 to 1.04e-005 0.1339 ns

Fastum Gel vs. Gel 5 8.523e-006 2.752e-006 to 1.429e-005 0.0044 **

Profilul de cedare din produsul comercial este intermediar între cele ale gelurilor

experimentale.

Valoarea D este practic identică cu cea a hidrogelului G2, care conține izopropanol în formulare. Profilele de cedare propriu-zise sunt aproape superpozabile până la 5 ore, după care cedarea din produsul tipizat devine mai lentă, iar cea din gelul G2 rămâne constantă urmând o cinetică aparentă de ordinul 0.

Gelurile cu etanol și respectiv propilenglicol prezintă valori ale lui D semnificativ mai mari decăt pentru produsul tipizat, conducând la o cedare mai rapidă, ceea ce le-ar putea recomanda în tratamentul durerilor acute.

Cantitatea de KTP difuzată este semnificativ mai mare în cazul gelurilor G1 și G3, față de produsul comercial Fastum gel (aprox. 70% față de numai 50% după 7 ore).

10

În vederea elucidării mecanismului de cedare a substanței active, profilele cinetice obținute au fost fitate utilizând expresiile matematice ale unor modele cinetice fenomenologice sau empirice. A fost evaluată măsura în care modelele matematice descriu datele experimentale, prin compararea coeficienților de determinare, dar și aplicând diverse criterii informaționale precum Akaike sau Schwartz.

Criteriul lui Akaike (AIC) [190-192] şi criteriul lui Schwartz (MSC) [193], se bazează pe suma “erorilor” corectată printr-o “penalizare” proporțională cu numărul de parametri (p) ai modelului:

ln 2AIC N SS p= + (1)

ln lnSC N SS p N= + (2)

în care SS este suma pătratelor deviațiilor modelului cu p parametri definită ca

( )∑=

−=n

i

calc

iiyySS

1

2exp (3)

Modelul ecuației cu cea mai mică valoare AIC și/sau MSC este cea mai bună modelare a evoluției în timp a modelului [7].

Au fost evaluate următoarele modele cinetice [194-196]: ordinul 0, ordinul I, Higuchi (legea radicalului), Modelul Korsmeyer-Peppas

Tabel 3.Parametrii fitării datelor experimentale privind cedarea KTP din formulările testate

utilizând diferite modele difuzionale

În cele mai multe cazuri modelul Korsmeyer-Peppas a generat datele care au

Parametru Gel 1 Gel 2 Gel 3 Gel 4 Gel 5 Fastum Gel

Ordinul 0

k0 0.182 0.158 0.209 0.162 0.123 0.116

Tlag 3.493 -1.612 2.854 1.673 4.428 -76.664

Rsqr 0.9908 0.9971 0.9941 0.9974 0.9902 0.9517

Ordinul I

k1 0.003 0.002 0.003 0.002 0.002 0.002

Tlag 24.986 17.095 17.005 11.812 16.321 -31.844

Rsqr 0.9814 0.9825 0.9946 0.9845 0.9704 0.9830

Higuchi

kH 3.461 3.055 3.544 2.592 2.302 2.628

Tlag 57.542 57.045 54.177 42.410 57.283 21.491

Rsqr 0.9715 0.9440 0.9579 0.9247 0.9077 0.9792

Korsmeyer-Peppas

kKP 0.554 0.180 0.412 0.088 0.020 1.637

Tlag 26.264 1.184 13.166 -9.034 -36.142 8.997

N 0.894 0.979 0.883 1.103 1.290 0.580

Rsqr 0.9925 0.9971 0.9970 0.9983 0.9945 0.9900

11

aproximat cel mai bine parametrii experimentali, ceea ce era de așteptat ținând cont de faptul că modelul presupune un număr mai mare de parametri față de modelele clasice (H, 1, 0). Pe de altă parte este de menționat faptul că modelul Korsmeyer Peppas este un model empiric, care este însă capabil să descrie mecanisme diferite de cedare. Atribuirea predominantă a unui anume mecanism se face pe baza valorilor exponentului n. Astfel, în cazul gelurilor analizate s-au putut constata următoarele:

• pentru produsul tipizat valoarea de aproximativ 0.5 a lui n sugerează un mecanism de cedare difuzional de tip fickian;

• pentru gelurile G1-G4, valoarea de aproximativ 1 a exponentului n sugerează o cedare cu viteză constantă după o cinetică de ordin 0;

• în cazul gelului G5, valoarea de cca 1.3 a exponentului n sugerează un mecanism complex în care difuziunea propriu-zisă este asociată cu umflarea și destructurarea rețelei hidrogelului, cel mai probabil din cauza sensibilizării acesteia prin acțiunea mecanică exercitată în timpul preparării.

Cinetica de cedare a unei substanŃe active din hidrogeluri depinde de natura chimică a acesteia, dar şi de proprietăŃile reologice ale semisolidelor folosite în formulările topice. Întrucât modelarea cineticii de cedare se poate face şi prin modificarea concentraŃiei de polimer, s-a impus astfel caracterizarea hidrogelurilor testate cinetic şi din punct de vedere reologic. S-a urmărit: evaluarea profilelor reologice ale hidrogelurilor experimentale,

evaluarea influenței tipului de alcool asupra proprietăților reologice ale formulărilor

experimentale, precum și evaluarea tixotropiei hidrogelurilor experimentale. Analiza reologică s-a realizat utilizând un vâscozimetru rotațional MultiVisc – Rheometer, Fungilab, prevăzut cu sonde standard TR 9, TR 10.

Analizând profilele am constatat că toate hidrogelurile proiectate prezintă o comportare nenewtoniană atât la 23oC cât şi la 37oC. Cuantificarea comportării nenewtonieine s-a realizat prin aplicarea diferitelor modele reologice [202], valoarea cea mai mare a coeficientului de determinare R2 obŃinându-se pentru modelul Herschel-Bulkley, la ambele temperaturi de lucru. Cercetările teoretice şi experimentale au urmărit stabilirea unor ecuații ce corelează componentele tensiunii cu componentele deformației și/sau vitezei de deformare şi proprietăŃile corpurilor. EcuaŃiile reologice astfel obținute servesc la abordarea teoretică a problemelor legate de curgere.

Evaluarea tixotropiei se face prin trasarea curbei de histerezis, adică prin înregistrarea tensiunii de forfecare pentru diferite trepte de viteză în ordine crescătoare și apoi în ordine descrescătoare și calcularea ariei de tixotropie, reprezentată de aria cuprinsă între curba ascendentă și cea descendentă [203, 204]. Datele experimentale au demonstrat un caracter tixotrop la ambele temperaturi de lucru, atât pentru hidrogelurile testate, cât și pentru Fastum gel, curba descendentă fiind plasată sub curba ascendentă.

12

Capitolul V, “Influența factorilor de formulare asupra proprietăților fizico-chimice și

stabilității unor vezicule ultradeformabile cu ketoprofen” prezintă cercetările efectuate în scopul optimizării parametrilor experimentali pentru obținerea unor nanotransportori de tip vezicule ultradeformabile, care să poată asigura atât un efect local, cât și unul sistemic după condiționarea acestora într-o formă semisolidă cu administrare topică. Cercetările întreprinse au impus o serie de obiective specifice formei farmaceutice vizate: obținerea veziculelor

elastice încărcate cu ketoprofen, optimizarea parametrilor experimentali de obținere a

acestora, proiectarea experimentelor-caracterizarea fizico-chimică a sistemelor

nanotransportoare, studii privind stabilitatea nanotransportorilor experimentali.

Orientarea cercetărilor spre astfel de nanotransportori s-a bazat pe o atentă analiză a datelor din literatura de specialitate. În ultimii ani, s-au întrevăzut descoperiri deosebit de interesante în domeniul medicamentelor prin eforturile cercetătorilor pentru obținerea de noi forme farmaceutice, care, pe lângă efectul terapeutic scontat, să aibă și un risc minim al reacțiilor adverse. În această direcție se evidențiază preocuparea pentru realizarea unor sisteme farmaceutice capabile să asigure o dirijare selectivă și o cedare controlată a substanței medicamentoase la organul/celula vizată sau să asigure un transport transdermic al acesteia, astfel încât să se limiteze și acțiunea toxică, pe de o parte și să se îmbunătățească și potențialul terapeutic. Se poate asigura astfel individualizarea strictă a tratamentului și se pot evita riscurile terapeutice inerente unei folosiri subiective și deficitare a formelor farmaceutice convenționale. De asemenea am ținut cont de faptul că cea mai mare dificultate în asigurarea transportului transdermic al compușilor bioactivi este chiar penetrarea pielii, deoarece pielea, prin natura ei acŃionează ca o barieră în două direcŃii controlând pierderea apei, a electroliŃilor şi a altor constituenŃi şi împiedicând intrarea substanŃelor medicamentoase sau vătămătoare din mediul exterior. Pentru a mări permeabilitatea pielii pentru transportul transdermic al substanțelor medicamentoase au fost propuse o serie de metode pasive sau active. Una dintre cele mai controversate metode pentru transportul medicamentelor prin piele este folosirea formaŃiunilor veziculare ca sisteme de transport şi cedare controlată a compușilor bioactivi.

Cercetările derulate pentru realizarea unor nanotransportori de tip vezicule ultradeformabile pentru ketoprofen au urmărit și optimizarea parametrilor experimenatali de obținere a acestora, precum și stabilitatea lor. Se prezintă astfel un studiu complex, comparativ dedicat acestor nanotransportori urmărindu-se selectarea celui mai convenabil pentru o formulare topică, care să asigure pe lângă efectul local și transportul transdermic al ketoprofenului.

Au fost preparați nanotransportori lipidici ultradeformabili prin metoda hidratării filmului lipidic subțire sau printr-o modificare a metodei descries în literatura de specialitate de E. Toitou. Aceștia au fost caracterizați fizico-chimic, cinetic și din punct de vedere al stabilității.

Influența temperaturii de stocare asupra stabilității nanosistemelor experimentale a fost evaluată urmărind evoluția gradului de entrapare a KTP în acestea menținute la 3 temperaturi diferite: 4-6ºC (frigider), 25ºC, 32ºC timp de 8 săptămâni.

13

0 20 40 60

50

60

70

80

90

KTPT1KTPT2KTPT3KTPT4KTPT5

KTPT7KTPT8

KTPT6

Timp (zile)

% KTP

0 20 40 60

40

50

60

70

80

KTPT1KTPT2KTPT3KTPT4KTPT5

KTPT7KTPT8

KTPT6

Timp (zile)

% KTP

Figura 5. Modificarea gradului de

încorporare al KTP în transferozomi (MLV,

25ºC)

Figura 6. Modificarea gradului de

încorporare al KTP în transferozomi (SUV,

25ºC)

0 20 40 60

40

50

60

70

80

90

KTPT1KTPT2KTPT3KTPT4KTPT5

KTPT7KTPT8

KTPT6

Timp (zile)

% KTP

0 20 40 60

40

60

80

100

KTPT1KTPT2KTPT3KTPT4KTPT5

KTPT7KTPT8

KTPT6

Timp (zile)

% KTP

Figura 7. Modificarea gradului de

încorporare al KTP în transferozomi (MLV,

32ºC)

Figura 8. Modificarea gradului de încorporare al KTP în transferozomi (SUV, 32ºC)

Se constată faptul că formulările KTPT4, KTPT5 și respectiv KTPT6 sunt instabile in timp, după mai puțin de 4 săptămâni separându-se în două faze distincte.

Pentru aceeași formulare, formele MLV sunt mai stabile decât cele SUV. Creșterea temperaturii accentuează degradarea formulărilor experimentale atât în cazul

formelor MLV, cât și al celor SUV.

14

Capitolul VI, “Influența factorilor de formulare asupra proprietăților fizico-chimice și

stabilității unor vezicule ultradeformabile cu ketoprofen” prezintă materialele, metodele de obținere și caracterizare a unui hidrogel pe bază de carbopol conținând o anumită formulare de vezicule ultradeformabile cu KTP, selectată pe baza rezultatelor cercetărilor experimentale prezentate în capitolul V.

Scopul acestui studiu a fost realizarea unui sistem cu aplicare topică pe bază de Carbopol 940, conținând ketoprofen încapsulat în formularea ce a rezultat în urma optimizării nanotransportorilor de tip vezicule ultradeformabile, care să poată permite asigurarea unui efect local, dar și sistemic al compusului încapsulat.

Pentru atingerea scopului formulat au fost stabilite câteva obiective specifice pentru cercetările experimentale: prepararea gelurilor experimentale pe bază de carbopol, analiza

macroscopică și investigarea proprietăŃilor cinetice ale gelurilor experimentale.

Gelurile experimentale sunt transparente, alb-gălbui, cu aspect neted, fără miros caracteristic. pH – ul gelurilor experimentale a variat între 6 – 6,6.

Analiza cinetică a KTP din formulările topice permite evidenŃierea mecanismului de eliberare a substanŃei active din sistemul proiectat, precum şi a disponibilităŃii pentru absorbŃia cutanată.

Datele obŃinute în urma derulării experimentelor cinetice privind cedarea KTP din hidrogelurile experimentale și tipizate, utilizând celula de difuziune Franz modificată, sunt înscrise pentru exemplificare în Tabelul nr.77.

Tabel 4.Statistica descriptivă a cedării KTP din hidrogelul experimental G1

Timp (ore) Cantitate difuzată % Difuzat

mg SD % SD

0 0.0 0.00 0 0.00

0.5 2.2 0.14 9 0.55

1 3.0 0.17 12 0.67

4 4.8 0.16 19 0.65

5 5.5 0.15 22 0.62

6 6.5 0.23 26 0.94

9 7.5 0.32 30 1.26

10 8.8 0.30 35 1.21

12 10.5 0.33 42 1.30

18 14.0 0.36 56 1.46

24 19.3 0.42 77 1.69

15

0 10 20 30

0

20

40

60

80

Timp (h)

% Difuzat

Cantitate difuzata (mg)

Figura 9.Pofilele de difuzie ale KTP din hidrogelul experimental G1 (D=5.35*10-6

cm2/min)

În vederea elucidării mecanismului de cedare a substanței active, profilele cinetice obținute au fost fitate utilizând expresiile matematice ale unor modele cinetice fenomenologice sau empirice (Figura 10).

16

Tabel 5. Parametrii modelării matematice a datelor experimentale pentru hidrogelul experimental

G1utilizând diferite modele difuzionale

Parametru Ordin 0 Ordin I Higuchi Korsmeyer-Peppas

kmodel 2.795 0.044 14.900 1.588 0.013

Tlag -2.781 -0.945 2.943 -4.549 -1.339

n - - - 1.155

Performanţa fitării

N_obs 10 10 10 10 10

DF 8 8 8 7 8

R_obs-pre 0.9971 0.9785 0.9624 0.9978 0.9865

Rsqr 0.9942 0.9563 0.9016 0.9955 0.9728

Rsqr_adj 0.9935 0.9509 0.8893 0.9943 0.9694

MSE 2.85 21.55 48.56 2.51 13.40

MSE_root 1.69 4.64 6.97 1.58 3.66

SS 22.83 172.39 388.45 17.58 107.22

WSS 22.83 172.39 388.45 17.58 107.22

AIC 35.28 55.50 63.62 34.67 50.75

MSC 4.75 2.73 1.92 4.81 3.21

0 10 20 30

0

20

40

60

80

100

Cinetica ordin 0

Timp (h)

0 10 20 30

0

20

40

60

80

100

Cinetica ordin I

Timp (h)

17

Figura 10.Fitarea profilului cinetic experimental al hidrogelului experimental G1 pe baza modelelor

matematice selectate

Profilul cinetic al KTP din hidrogelul experimental se caracterizează printr-o cedare rapidă

(“burst”) a aproximativ 10% din cantitatea de substanță activă, urmată de o cedare lentă, cu viteză constantă, timp de 24 de ore (Figura 9). Modelarea matematică a datelor a confirmat faptul că încorporarea KTP în hidrogel sub formă de nanotransportori lipidici asigură o cedare susținută a substanței active, după o cinetică de ordinul 0 (Figura 10).

18

CONCLUZII GENERALE

Teza de doctorat constituie un studiu biofarmaceutic amplu al cărui scop a fost dezvoltarea, optimizarea şi caracterizarea unei formulări farmaceutice cu acŃiune antiinflamatoare, cu administrare topică (pentru cedarea locală/transdermică), care să permită transportul şi cedarea controlată a ketoprofenului.

Obiectivele majore urmărite au fost:

I. Formularea unor sisteme topice semisolide de tip hidrogel cu parametri cinetici

convenabili și proprietăți reologice adecvate II. Proiectarea, optimizarea, obținerea și caracterizarea unor nanotransportori de tip

vezicule ultradeformabile conținând ketoprofen, care să poată asigura atât un efect

local, cât și unul sistemic după condiționarea într-o formă semisolidă cu administrare

topică III. Realizarea unui sistem cu aplicare topică pe bază de Carbopol 940, conținând

ketoprofen încapsulat în formularea ultradeformabilă optimizată, care să poată permite

asigurarea unui efect local, dar și sistemic al compusului încapsulat

I Formularea unor sisteme topice semisolide de tip hidrogel cu parametri cinetici convenabili și proprietăți reologice adecvate

Pentru atingerea acestui obiectiv s-a studiat atât influenŃa formulării gelurilor, cât și a modului de încorporare a ketoprofenului în acestea, asupra cedării in vitro prin dializă pe membrane de celofan, folosind o celulă de difuzie Franz. De asemenea s-a realizat și un studiu al proprietăților reologice caracteristice curgerii pentru gelurile hidrofile proiectate.

Pentru a putea asigura un anumit control al formelor topice experimentale de tip hidrogel, acestea au fost analizate comparativ cu produsul Fastum gel (Menarini Manufacturing Logistics and Services S.R.L.).

Cercetările intreprinse au permis formularea următoarelor concluzii:

Au fost proiectate trei baze de gel de concentraŃie 1% Carbopol 940, ce au servit ca

vehicul pentru încorporarea ketoprofenului. Diferența în compoziția calitativă a acestor

baze este natura diferită a alcoolilor utilizați la preparare. Aceștia au fost aduși în

aceeași proporție în baza de gel și, de fiecare dată, s-a încorporat în gel aceeaşi masă

de ketoprofen;

Gelurile finale preparate au avut aspect omogen, culoare alb strălucitor, fără miros

caracteristic și proprietatea de a se etala pe piele foarte bună;

Testele reologice efectuate asupra hidrogelurilor au arătat că toate prezintă o

comportare nenewtoniană, pseudoplastică şi de subŃiere prin forfecare la ambele

temperaturi de lucru (23ºC, temperatura de condiŃionare a hidrogelurilor, respectiv

32ºC, temperatura de derulare a experimentelor cinetice);

19

Pentru toate gelurile experimentale, pentru aceeaşi viteză de forfecare, punctele de pe

curbele de revenire corespund la tensiuni de forfecare mai joase decât de pe curbele

directe, ceea ce a evidențiat caracterul tixotrop al acestora;

Analiza cinetică a hidrogelurilor experimentale, precum și a gelului tipizat Fastum a

fost realizată utilizând o celulă de difuzie Franz modificată, mediu receptor tampon

fosfat pH 7.4,, debit de lucru 2mL/min, temperatura operațională 32±0.1oC, membrană

de celofan. Celula Franz originală a fost adaptată în studiile noastre astfel încât

lichidul din compartimentul receptor (circuit închis) să aibă o circulaŃie continuă, care

să permită omogenizarea suplimentară a concentraŃiei în adaos la cea realizată de

agitatorul magnetic. Datele experimentale ne-au permis formularea următoarelor

concluzii:

Valoarea coeficientului de difuziune, D crește în ordinea G2 < G3< G1. De asemenea, difuziunea din gelul G2 (D=2.09±0.23 cm2/min) este semnificativ mai lentă atât față de G1 (D=2.81±0.29 cm2/min), cât și față de G3 (D=2.77±0.25 cm2/min), în timp ce între gelurile G1 și G3 nu s-au înregistrat diferențe semnificative. În concluzie, hidrogelul formulat cu alcool izopropilic a prezentat cea mai lentă cedare a KTP, în timp ce gelurile conținând etanol și respectiv propilenglicol s-au comportat similar, cedând aproximativ 60% din substanța încorporată după 5 ore. Pe baza datelor experimentale obținute putem recomanda pentru formularea gelurilor cu KTP atât alcoolul etilic, cât și propilenglicolul;

Profilul de cedare din produsul comercial este intermediar între cele ale gelurilor experimentale. Valoarea D este practic identică cu cea a hidrogelului G2, care conține izopropanol în formulare. Profilele de cedare propriu-zise sunt aproape superpozabile până la 5 ore, după care cedarea din produsul tipizat devine mai lentă, iar cea din gelul G2 rămâne constantă urmând o cinetică aparentă de ordinul 0. Gelurile cu etanol și respectiv propilenglicol prezintă valori ale lui D semnificativ mai mari decât pentru produsul tipizat, conducând la o cedare mai rapidă, ceea ce le-ar putea recomanda în tratamentul durerilor acute. Cantitatea de KTP difuzată este semnificativ mai mare în cazul gelurilor G1 și G3, față de produsul commercial Fastum gel (aprox. 70% față de numai 50% după 7 ore);

Ordinul de mărime al constantelor de difuziune (10-5cm2·min-1) este în acord cu datele din literatură pentru cedarea din hidrogeluri;

A fost evaluată măsura în care modelele matematice descriu datele experimentale, prin compararea coeficienților de determinare, dar și aplicând diverse criterii informaționale precum Akaike sau Scwartz. În cele mai multe cazuri modelul Korsmeyer-Peppas a generat datele care au aproximat cel mai bine parametrii experimentali, ceea ce era de așteptat ținând cont de faptul că modelul presupune un număr mai mare de parametri față de modelele clasice (Higuchi, ordinul 1, ordinul 0);

Pe de altă parte este de menționat faptul că modelul Korsmeyer Peppas este un model empiric, care este însă capabil să descrie mecanisme diferite de cedare.

20

Atribuirea predominantă a unui anume mecanism se face pe baza valorilor exponentului n. Astfel, în cazul gelurilor analizate s-au putut constata următoarele:

- pentru produsul tipizat valoarea de aproximativ 0.5 a lui n sugerează un mecanism de cedare difuzional de tip fickian;

- pentru gelurile G1-G4, valoarea de aproximativ 1 a exponentului n sugerează o cedare cu viteză constantă după o cinetică de ordin 0;

- în cazul gelului G5, valoarea de cca 1.3 a exponentului n sugerează un mecanism complex în care difuziunea propriu-zisă este asociată cu umflarea și destructurarea rețelei hidrogelului, cel mai probabil din cauza sensibilizării acesteia prin acțiunea mecanică exercitată în timpul preparării.

Rezultatele obŃinute au confirmat faptul că cinetica de cedare in vitro a KTP este influenŃată de natura alcoolului din baza de gel, precum și de modul de încorporare în bază, aceste variabile putând chiar modifica mecanismul de cedare al compusului bioactiv. Se poate aprecia că formulările corespunzătoare gelurilor cu valorile cele mai mari ale coeficientului de difuziune pot constitui baze de gel de referință pentru proiectarea ulterioară a unor alte hidrogeluri cu același conținut de substanță activă și cu caracteristici îmbunătățite de cedare a acesteia.

Cercetările au servit și la selectarea bazei de gel pentru încorporarea nanotransportorilor de tip vezicule ultradeformabile cu ketoprofen.

II Proiectarea, optimizarea, obținerea și caracterizarea unor nanotransportori de tip vezicule ultradeformabile conținând ketoprofen, care să poată asigura atât un efect local, cât și și unul sistemic după condiționarea într-o formă semisolidă cu administrare topică

Cercetările derulate s-au constituit într-un studiu complex, comparativ, dedicat acestor nanotransportori, care, în final a permis selectarea celui mai convenabil în ceea ce privește proprietățile fizico-chimice, profilul cinetic și stabilitatea.

În urma cercetărilor efectuate am formulat următoarele concluzii:

Am evaluat influența variabilelor de formulare asupra proprietăților fizico-chimice și

profilului cinetic ale nanotransportorilor de tip vezicule ultradeformabile

Au fost preparate folosind metoda hidratării filmului lipidic;

Au fost investigate efectele diferitelor variabile de formulare (cantitatea de material lipidic, cantitatea de colat de sodiu, cantitatea de substanță activă) asupra entrapării, dimensiunii, precum și asupra cedării utilizând un plan experimental de tip factorial cu 3 factori la 2 nivele de variaŃie (23);

A fost stabilită ecuaŃia polinomială a modelului care descrie influenŃa variabilelor de formulare asupra eficienŃei entrapării KTP. Validarea modelului s-a realizat

21

prin evaluarea coeficientului de corelaŃie multiplă, prin trasarea curbelor de dependenŃă a valorilor rezultate (observate) în funcŃie de valorile estimate de model, prin examinarea rezidualelor și prin analiza de varianță ANOVA;

Dintre cei trei factori investigaŃi, doar % FC și % Co prezintă o influenŃă semnificativă asupra răspunsului sistemului, în timp ce influenŃa concentraŃiei de substanŃă activă este nesemnificativă;

Se observă că mărirea concentraŃiei de colat de sodiu și a concentraŃiei de fosfatidilcolină conduc la o entrapare mai eficientă a compusului activ, în timp ce mărirea concentraŃiei KTP nu influenŃează gradul său de entrapare. Un alt aspect interesant este acela că între efectele variabilelor studiate nu există interacŃiuni semnificative;

S-a demonstrat faptul că procesul de filtrare a transferozomilor înaintea analizei a atenuat influența factorilor de formulare asupra dimensiunilor particulelor;

Profilele de cedare in vitro ale KTP din formulările experimentale au fost determinate uilizând metoda dializei. Mediul de cedare a fost reprezentat de o soluŃie de tampon fosfat salin cu pH =7.4, utilizând saci de dializă cu cut-off de 12500 D;

În vederea elucidării mecanismului de cedare a substanței active, profilele cinetice obținute au fost fitate utilizând expresiile matematice ale unor modele cinetice fenomenologice sau empirice.

- În cele mai multe cazuri modelul Korsmeyer Peppas a generat datele care au aproximat cel mai bine parametrii experimentali, ceea ce era de așteptat ținând cont de faptul că modelul presupune un număr mai mare de parametri față de modelele clasice (Higuchi, ordinul 1, ordinul 0, Hixson Crowell). Pe de altă parte este de menționat faptul că, modelul Korsmeyer Peppas este un model empiric, care este însă capabil să descrie mecanisme diferite de cedare. Atribuirea predominantă a unui anume mecanism se poate face pe baza valorilor exponentului n. Astfel, în cazul formulărilor KTPT3 și KTPT8, valoarea apropiată de 1 a lui n a sugerat o cedare cu viteză constantă;

- Pe baza indicelui Akaike au fost selectate modelele care fitează cel mai bine datele experimentale: formulările KTPT3 și respectiv KTPT8 urmează o cinetică de ordin 0, KTPT2 și respectiv KTPT7 urmează o cedare după modelul Hixson Crowell, iar în cazul KTPT1 discutăm despre un mecanism complex de tip difuzie anomală;

A fost stabilită ecuaŃia polinomială a modelului care descrie influenŃa variabilelor de formulare asupra cineticii de cedare a KTP din nanotransportorii ultradeformabili dezvoltați

- Validarea modelului s-a realizat prin evaluarea coeficientului de corelaŃie multiplă, prin trasarea curbelor de dependenŃă a valorilor rezultate

22

(observate) în funcŃie de valorile estimate de model, prin examinarea rezidualelor și prin analiza de varianță ANOVA;

- Dintre toŃi cei trei factori investigaŃi, doar % FC și % Co influenŃează semnificativ răspunsul sistemului, în timp ce nici una dintre interacŃiile lor nu este semnificativă. Aşa cum era de așteptat, componenta lipidică (fosfatidil colina) influenŃează negativ cedarea substanŃei active din transferozomi, în timp ce creșterea concentraŃiei de colat de sodiu favorizează eliberarea acesteia.

În urma cercetărilor efectuate s-a constatat că entraparea ketoprofenului nu a ridicat probleme, ea având loc în proporŃie convenabilă la majoritatea formulărilor, demonstrând astfel că acest tip de nanotransportori reprezintă o alegere potrivită pentru încorporarea acestui AINS;

Am evaluat influența variabilelor de formulare asupra proprietăților fizico-chimice și

profilului cinetic ale nanotransportorilor de tip etozomi

Veziculele de tip etozomi au fost preparate prin modificarea metodei propuse de E. Toitou;

În scopul optimizării compoziŃiei etozomilor a fost utilizat un plan experimental de tip D optimal, utilizând subrutina „Mixture”din pachetul software Design-Expert, v.7 (StatEase, USA), impunând restricŃia ca % FC + % Etanol + % Apa = 100 pentru etozomii blank. S-a urmărit influența a 3 variabile independente, respectiv cantitatea de fosfatidil colină exprimată procentual (% FC), cantitatea de etanol (% Etanol), și cantitatea de apă (% Apă) asupra profilului de calitate al etozomilor rezultaŃi, selectând ca variabile dependente (răspunsuri) eficiența de entrapare (EE%) – Y1, dimensiunea particulelor (Y2) și respectiv cantitarea de substanŃă activă cedată, exprimată procentual (Y3);

Validarea modelelor s-a realizat prin evaluarea coeficientului de corelaŃie multiplă, prin trasarea curbelor de dependenŃă a valorilor rezultate (observate) în funcŃie de valorile estimate de model, prin examinarea rezidualelor și prin analiza de varianță ANOVA;

S-a constat că variaŃia compoziŃiei sistemului între limitele impuse de design a influențat semnificativ valoarea EE. În ceea ce privește influenŃa componentelor individuale, se poate concluziona că etanolul este componentul care defavorizează encapsularea KTP în etozomi, în timp ce creșterea cantităŃii de fosfatidil colină și apă au influenŃă pozitivă asupra EE;

VariaŃia compoziŃiei sistemului între limitele impuse de design a influențat semnificativ dimensiunile medii ale etozomilor rezultaŃi. Astfel, etanolul a determinat creșterea dimensiunilor etozomilor, apa a determinat obținerea unor etozomi cu dimensiuni mai mici, iar fosfatidil colina a influențat într-o mai mică măsură acest parametru;

23

Profilele de cedare in vitro ale KTP din formulările experimentale au fost determinate uilizând metoda dializei. Mediul de cedare a fost reprezentat de o soluŃie de tampon fosfat salin cu pH =7.4, utilizând saci de dializă cu cut-off de 12500 D;

- În vederea elucidării mecanismului de cedare a substanței active, profilele cinetice obținute au fost fitate utilizând expresiile matematice ale unor modele cinetice fenomenologice sau empirice;

- În cele mai multe cazuri modelul Korsmeyer Peppas a generat datele care au aproximat cel mai bine parametrii experimentali, dar valorile apropiate de unitate ale exponentului n sugerează o cedare de ordin 0, adică o cedare cu viteză constantă.

VariaŃia compoziŃiei sistemului între limitele impuse de design a influențat semnificativ cedarea KTP din etozomi. S-a constat că fosfatidil colina are o puternică influenŃă negativă asupra cedării KTP din etozomi, în timp ce etanolul favorizează semnificativ eliberarea acestuia;

În urma cercetărilor efectuate s-a constatat că entraparea ketoprofenului în etozomi a avut valori convenabile la majoritatea formulărilor, fiind superioară în toate cazurile celei obținute pentru transferozomi.

Pe baza analizei profilului de stabilitate al nanotransportorilor lipidici ultradeformabili

evaluată prin intermediul EE și al distribuŃiei după dimensiuni a populaŃiei

experimentale am constat că:

S-a remarcat o polidispersitate mare a veziculelor elastice preparate, dimensiunea medie variind între 70 şi 150 nm pentru transferozomii SUV analizaŃi, 180 – 500 nm în cazul transferozomilor MLV și respectiv între 100 și 250 nm pentru etozomi;

Stabilitatea veziculelor elastice analizate este mult influenŃată de temperatură – conŃinutul de substanŃă activă scade semnificativ la creşterea temperaturii (ex.: la creşterea temperaturii de la 250C la 320C are loc o scădere a eficienŃei de entrapare cu aprox. 5% într-o perioadă de 8 săptămâni). Formulările menŃinute la frigider au prezentat cea mai bună stabilitate - pierderea de substanŃă activă încorporată fiind foarte mică (peste 95% din substanŃa încorporată găsindu-se încă în vezicule), iar dimensiunile veziculelor au crescut cu 5 – 10%;

Transferozomii care au un conținut 1,5% Co sunt practic instabili, în mai puțin de o săptămână realizându-se separarea în două faze distincte a lor, indiferent de temperatura la care au fost menținute;

Dimensiunea veziculelor elastice preparate influențează semnificativ stabilitatea acestora. Indiferent de temperatura la care au fost păstrați transferozomii s-a înregistrat o stabilitate mai mică pentru formele SUV față de cele MLV. În intervalul considerat, unele formulări au suferit o mărire a dimensiunii particulelor populației experimentale de cel puțin 2 ori, cele mai stabile fiind formulările

24

KTPT3 și KTPT7 pentru transferozomi, respectiv KTPE3 și KTPE4 pentru etozomi.

A fost urmarită optimizarea sistemelor transportoare de tip nanotransportori lipidici

ultradeformabili. Identificarea unui set de condiții experimentale care optimizează toate

răspunsurile sau cel puțin le menține într-un interval dorit s-a realizat prin utilizarea

funcției d (“dezirabilitate”) a lui Derringer, care permite un compromis între diferitele

răspunsuri.

În cazul transferozomilor, în scopul obținerii unor formulări optime, au fost impuse următoarele restricții: eficiența entrapării KTP maximă, un minim 60% substanță cedată și utilizarea cantității maxime posibil de colat de sodiu (dată fiind instabilitatea formulărilor conținând 1.5% colat de sodiu). CondiŃiile experimentale care asigură valorile optime ale răspunsurilor au fost: FC=17.73%, Co= 3.00% și respectiv KTP=6.00%. Pentru acestea, valoarea

funcției d a fost de 0.897, indicând un grad satisfăcător de obținere a tuturor

răspunsurilor urmărite. Am remarcat că modelul a oferit putere de predicție ridicată pentru cele două răspunsuri principale (EE% și % cedat) (- 1.99, respectiv 3.73%);

În cazul etozomilor în scopul obținerii unor formulări optime, au fost impuse următoarele restricții: eficiența entrapării KTP maximă, un minim 80% substanță cedată și dimensiune minimă a veziculelor. Compoziția optimă a etozomilor a fost: FC=10%, Etanol= 31.50% și respectiv Apă=58.50%. Pentru acestea,

valoarea funcției d a fost de 0.908, indicând un grad satisfăcător de obținere a

tuturor răspunsurilor urmărite. Am remarcat că modelul a oferit putere de predicție ridicată pentru toate răspunsurile studiate (deviații mai mici de 3% între valorile prezize și cele experimentale). Etozomii preparați după formula optimizată au avut EE=92.6%, un diametru mediu al veziculelor de 103.3 nm și au cedat 81.6% din KTP după 11 ore.

Pe baza datelor experimentale s-a demonstrat că etozomii prezintă proprietăți

superioare transferozomilor: grad de entrapare net superior (cu mai mult de 10%), o

cedare mai eficientă a substanței active (cu aproximativ 20%), dar și un profil de

stabilitate superior. Toate aceste rezultate au indicat formularea etozomală ca fiind cea optimă pentru obținerea unui hidrogel pe bază de vezicule ultradeformabile care să

permită o eliberarea convenabilă, controlată, precum și transportul transdermic al

substanței active.

III Realizarea unui sistem cu aplicare topică pe bază de Carbopol 940, conținând ketoprofen încapsulat în formularea optimizată, care să poată permite asigurarea unui efect local, dar și sistemic al compusului încapsulat

25

A fost obținut un gel de Carbopol 940 în care a fost încorporată o suspensie

nanoparticulată preparată conform formulării optimizate astfel încât să se asigure un

conținut de 2.5% KTP;

Gelul preparat a prezentat caracteristici organoleptice corespunzătoare, un pH cuprins

între 6 și 6.6, iar examenul microscopic a evidențiat prezența și menținerea integrității

etozomilor;

Analiza cinetică a hidrogelului experimental a evidențiat o cedare rapidă (“burst”) a

aproximativ 10% din cantitatea de ketoprofen, urmată de o cedare lentă, cu viteză

constantă, a aproximativ 67% KTP într-un interval de 24 de ore;

Modelarea matematică a datelor a confirmat faptul că incorporarea KTP în hidrogel

sub forma de etozomi asigură o cedare susținută a substanței active, după o cinetică de

ordinul 0.

Rezultatele obținute și prezentate în această lucrare oferă noi oportunităŃi pentru îmbunătăŃirea transportului şi eliberării ketoprofenului, iar soluŃiile propuse pot servi ulterior la dezvoltarea unor sisteme inovative şi pentru alți compuși biologic activi.

26

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Capitolul I

1. Popovici I., Lupuleasa D. – Tehnologie farmaceutică, vol.1, ediŃia a-III-a, Ed. Polirom, Iaşi, colecŃia BIOS, 2011 2. *** European Pharmacopoeia, 7 ed., Council of Europe-European Directorate for the Quality of Medicines, Strasbourg, 2011

3. GafiŃeanu E. – Forme farmaceutice. Sisteme disperse eterogene, Ed. Cernei, Iaşi, 2000

4. Popovici I., Lupuliasa D. – Tehnologie farmaceutică, Ed. Polirom, Iaşi, colecŃia BIOS, vol. 1, 2001

5. Stanescu, V. Tehnica Farmaceutica, Editura Medicala, Bucuresti, 1983, 277-278, 304

6. R. Daniels, Pharmaceutical technology: gels for dermal application, 2002, Pharm. Zeit. 147, 16–20

7. Jagur-Grodzinski J., Polymeric gels and hydrogels for biomedical and pharmaceutical applications, 2010, 21 (1): 27–47

8. Dhillon SG, Surinder Kaur S., Sarma SJ, Brar SK, Verma M, Surampalli RY, Recent Development in Applications of Important Biopolymer Chitosan inBiomedicine, Pharmaceuticals and Personal Care Products, Current Tissue Engineering, 2013, 2:20-40

9. K.R. Stevens, N.J. Einerson, J.A. Burmania, W.J. Kao, In vivo biocompatibility of gelatin-based hydrogels and interpenetrating networks, 2002, J. Biomat. Sci. 13, 1353–1366.

10. T. Cerchiara, B. Luppi, F. Bigucci, I. Orienti, V. Zecchi, Physically cross-linked chitosan hydrogels as topical vehicles for hydrophilic drugs, 2002, J. Pharm. Pharmacol. 54, 1453–1459.

11. M. Schiller, P.C. Schmidt, Transdermal therapeutic systems: drugs for adhesion, Pharm. Zeit., 2002, 147, 18–26

12. Handbook of Pharmaceutical Excipients, Washington DC, American Pharmaceutical, Association / Pharmaceutical Society of Great Britain, 1986,41-42

13. Martindale – The Complete Drug Reference, 33rd Edition 2002 (1499).

14. Rathapon A, Anuvat S, Panida V. Viscoelastic Properties of Carbopol 940 Gels and their Relationships to Piroxicam Diffusion Coefficients in Gel Bases, 2005, Pharmaceutical Research, Vol. 22(12), 2134-2170

15. Anlar S, Capan Y, Hincal A A, Physico-Chemical and Bioadhesive Properties of Polyacrylic Acid Polymers, Pharmazie, 1993, 48(4), 285-287

16. Islam MT, Rodríguez-Hornedo N, Ciotti S, Ackermann C, Rheological characterization of topical carbomer gels neutralized to different Ph, Pharmaceutical Research, 2004; 21(7):1192–1199

17. Briede R H: Application of Carbomer water Gel 1%”, Pharm. Week,1983, 118(9), 170-174

18. Berney B M, Deasy P B, Evaluation of Carbopol 934P as a suspending agent for Sulfademidine suspensions, Int. J. Pharm., 1979, 3(2-3), 73-80

19. Keleb E., Sharma R. K., Mosa E. B., Aljahwi A.-A. Z. Transdermal drug delivery system-design and evaluation. International Journal of Advances in Pharmaceutical Sciences, 2010; 1(3): 36-43

20. Barnhart KT, Pretorius ES, Marunich R, Vaginal distribution of miconazole nitrate suspension from administration of a single vaginal insert, J Reprod Med, 2004;49 : 83–8.

21. R. Gurny, J.M. Meyer, N.A. Peppas, Bioadhesive intraoral release systems: design,testing and analysis, Biomaterials, 2004, 5 (6), 336–340.

22. D. Quiñones, E.S. Ghaly, Formulation and characterization of nystatin gel, P. R. Health Sci. J., 2008, 27 (1), 61–67

23. Finnin BC, Morgan TM. Transdermal penetration enhancers: applications, limitations, and potential. J Pharm Sci., 1999; 88(10): 955-58

24. Rolland, A., Demichelis, G., Jamoulle, J.C., Shroot, B. Influence of formulation, receptor fluid and occlusion, on in vitro drug release from topical dosage forms, using an automated flow-through diffusion cell, Pharm. Res. 1992, 9 (1), 82-86

27

Capitolul II

29. Prausnitz MR, Mitragotri S, Langer R. Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nature Reviews 2004; 3: 115-124

30. Langer R., Transdermal drug delivery: past progress, current status, and future prospects. Advanced Drug Delivery Reviews, 2004; 56: 557-58.

31. Prausnitz MR, Mitragotri S, Langer R. Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nature Reviews 2004; 3: 115-124

32. Jain N, Talegonkar S, Jain N K., New ways to enter the blood stream: Emerging strategies in transdermal drug delivery, The Pharma Review, 2004: 41- 59

33. Mélissopoulus A., Levacher C. La peau. Structure et physiologie, Technique & Documentation Lavoisier Paris, 1998, pag. 3-25, 27-36, 37-38, 47-52, 53-56, 67-69, 77-78, 84-87, 101-108

34. Gordon L, Cutaneous transdermal delivery. In: Banker GS, Rhodes CT, editors. Modern pharmaceutics. 3rd edn. New York: Marcel Dekker Inc., 2002

35. Menon, Gopinathan K, Skin Basics; Structure and Function, in Pappas A, Lipids and Skin Health, Springer ed., 2015, Cap. 1: 9-23

36. Proksch E., Brandner J.M., Jensen J.M., 2008. The skin: an indispensable barrier. Experimental Dermatology 17(12), 1063-72

37. Madison K.C., 2003: Barrier function of the skin: “La raison D’etre” of the epidermis. J. Invest Dermatol 121(2), 231-41

38. Tobin, D. J., 2006. Biochemistry of human skin-our brain on the outside. Chemical Society Reviews 35, 52-67

39. Labouta, H. I. & Schneider, M., 2013. Interaction of inorganic nanoparticles with the skin barrier: current status and critical review. Nanomedicine: nanotechnology, biology and medicine, 9, 39-54

40. Chilcott, R. P., Price, S. & Interscience, W., 2008. Principles and practice of skin toxicology. (Wiley Online Library).

Capitolul III

146. Birmingham B, Buvanendran A, Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs, Acetaminophen and COX-2 Inhibitors, Practical Manangement of Pain (Fifth Edition), 2014, 553-568

147. Kure-Buer J., Origins and impact of the term ”NSAID”,Inflammopharmacol, 2014, 22: 263-267 148. Proksch E, Brandner JM, Jensen JM., The skin: an indispensable barrier. Experimental Dermatology, 2008, 17(12): 1063-1072

149. Hadgraft J, du Plessis J, Collen G, The selection of non-steroidal antiinflamatory agents for dermal delivery, International Journal of Pharmaceutics, 2000, 207:31-37

150.Mor Alireza J, AboofaleziR, Aninvestigationintothe effectofvarious penetrationsenhancersonpercutaneousabsortionof piroxicam,IranianJournalof Pharmaceutical Research, 2003: 135-140

151. Aurelia Nicoleta Cristea – Tratat de Farmacologie, ediŃia I, Bucureşti, 2013, 617-634

152. Lullmann H, Mohr K, Hein L, Atlas de Farmacologie, editura Farmamedia, Târgu Mureş, 2011: 186-187

153. Păunescu H, Dragomir P, Voiosu R, Fulga I, Coman OA, Efecte adverse ale medicamentelor la nivelul stomacului -actualitãþi privind acþiunea antiinflamatoarelor, Medicină modernă, 2010, XVII(8): 431-437

154. Baibhav J, Rana G, Vikas S, Comprehensive review on the recent advances in topical drug delivery, Int Res. J. Pharm,. 2011: 66

28

Capitolul IV

190. Yamaoka K, Nakagawa T, Uno T, Application of Akaike's information criterion (AIC) in the evaluation of linear pharmacokinetic equations, Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, 1978;6(2):165-75 191. Akaike H, A New Look at Statistical Model Identification, IEEE Transactions on Automatic Control, 1974;19(716):723 192. Akaike H, A Bayesian Analysis of the Minimum AIC Procedure, Ann Inst Statist Math, 1978;30:9-14 193. Scwartz G, Estimating the Dimension of a Model, Ann Statist, 1978;6(2):461-464 194. Landaw EM, Distefano JJ, III, Multiexponential, multicompartmental, and noncompartmental modeling. II. Data analysis and statistical considerations, Am J Physiol, 1984 May;246(5 Pt 2):R665-R677 195. Ramchandani U., Sangameswaran B., Formulation and Evaluation of Topical Gel of Ketoprofen Using Different Polymers, International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 2013; 4(2): 323-326 196. Ambala R., Vemula SK, Formulation and Characterization of Ketoprofen Emulgels, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2015, 5(07):112-117

Capitolul V

205. Touitou E., Barry WB, Enhancement in Drug Delivery, Taylor & Francis Group, LLC, 2007 206. Cevc G, Vierl U, Nanotechnology and the transdermal route: A state of the art review and critical appraisal, Journal of Controlled Release, 2010, 141: 277–299 207. Wim H. de Jong, Paul JAB, Drug delivery and nanoparticles: Aplications and hazards, International Journal of Nanomedicine, 2008, 3(2): 133-149 208. Bergstrand N, Liposomes for Drug Delivery from Physico-chemical Studies to Applications, Uppsala, 2003 209. Lipid vesicles penetrate into intact skin owing to the transdermal osmotic gradients and hydration force, Biochim Biophys Acta, 1992;1104(1):226-232 210. Cevc G., Vierl U., Nanotechnology and the transdermal route: A state of the art review and critical appraisal, Journal of Controlled Release, 2010, 141:277–299

Capitolul VI

246. Reza MS, Quadir MA, Haider SS, Comparative evaluation of plastic, hydrophobic and hydrophilic polymers as matrices for controlled-release drug delivery, J Pharm Pharm Sci, 2003 May;6(2):282-91

247. Korsmeyer RW, Gurny R, Doelker E, Buri P, Peppas NA, Mechanisms of potassium chloride release from compressed, hydrophilic, polymeric matrices: effect of entrapped air, J Pharm Sci, 1983 Oct;72(10):1189-1191.

29

LUCRĂRI ŞTIINłIFICE ELABORATE ÎN RELAłIE CU TEMA DE CERCETARE A TEZEI-PUBLICATE ÎN EXTENSO

1. C. D. Toderescu, C. Dinu-Pîrvu, M. V. Ghica, V. AnuŃa, D. E. Popa, L. Vlaia, D. Lupuliasa, Influence of formulation variables on ketoprofen diffusion profiles from

hydroalcoholic gels, Farmacia, 2016, 64(5): 728-734

2. Toderescu C.D., Dinu-Pîrvu C.E., Ghica M.V., AnuŃa V., Vlaia L., Lupuliasa D., Qualitative assessment of some hydrogels containing ketoprofen, Studia Universitatis “Vasile Goldiş”, Seria ŞtiinŃele VieŃii, 2016, 26(3): 317- 321

3. Răzvan Prisada, Cristina Dinu Pîrvu, Mariana Ferdeş, Alina OrŃan, Corina Dalia Toderescu, Dumitru Lupuliasa, Preparation and physicochemical characterization of poorly

soluble drug-loaded lipid nanoparticles, Studia Universitatis “Vasile Goldis”, Life Sciences Series, 2012, 22(4): 519-524