TEZĂ DE DOCTORAT · Mecanisme de rezistență la antibiotice ..... 34 Capitolul 8. Alte opțiuni...

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila” din Bucureşti

Facultatea de Medicină Generală

TEZĂ DE DOCTORAT

O nouă abordare în managementul

pacienților cu opțiuni terapeutice limitate

REZUMAT

Coordonator ştiinţific,

Prof. Dr. Mircea Ioan POPA

Doctorand,

Asist. univ. Alina Cristina NEGUȚ

2016

CUPRINS

INTRODUCERE .................................................................................................. 6

PARTEA GENERALĂ ......................................................................................... 7

Capitolul 1. Germenii problemă ......................................................................... 7

Capitolul 2. Staphylococcus spp. ...................................................................... 8

2.1 Microbiologie și taxonomie .................................................................................... 8

2.2 Epidemiologie .......................................................................................................... 9

2.3 Patogenia infecțiilor stafilococice ....................................................................... 10

2.4 Interacțiune gazdă – patogen în infecțiile stafilococice ................................... 12

2.5 Sindroame clinice .................................................................................................. 13

Capitolul 3. Pseudomonas spp. ....................................................................... 17

3.1 Microbiologie și taxonomie .................................................................................. 17

3.2 Epidemiologie ........................................................................................................ 18

3.3 Patogenia infecțiilor cu piocianic ........................................................................ 18

3.4 Interacțiune gazdă – patogen în infecțiile cu P. aeruginosa ............................ 21

3.5 Sindroame clinice .................................................................................................. 21

Capitolul 4. Virulența bacteriană ..................................................................... 23

4.1 Virulența Staphylococcus spp. ............................................................................ 23

4.2 Reglarea virulenței stafilococului ........................................................................ 26

4.3 Virulența Pseudomonas spp. ............................................................................... 27

4.4 Reglarea virulenței Pseudomonas aeruginosa ................................................. 29

Capitolul 5. Biofilmul bacterian ........................................................................ 30

Capitolul 6. Comunicarea interspecii bacteriene ........................................... 33

Capitolul 7. Mecanisme de rezistență la antibiotice ...................................... 34

Capitolul 8. Alte opțiuni terapeutice – direcții de cercetare .......................... 36

Capitolul 9. Bacteriofagii, trecut – prezent ..................................................... 37

9.1 Tratamentul cu bacteriofagi în lume ................................................................... 37

9.1.1 Începuturile terapiei cu bacteriofagi în lume ................................................................ 37

9.1.2 Contextul actual internațional în terapia cu bacteriofagi .......................................... 39

9.2 Tratamentul cu bacteriofagi în România ............................................................ 41

9.2.1 Primele studii românești în acest domeniu ................................................................... 41

9.2.2 Terapia cu bacteriofagi în România, în perioada 1960-1975 ..................................... 41

PARTEA SPECIALĂ ......................................................................................... 42

Capitolul 10. Fundamentarea studiului ........................................................... 42

Capitolul 11. Ipoteza de lucru .......................................................................... 45

11.1 Scopul cercetării .................................................................................................. 45

11.2 Obiectivul principal ............................................................................................. 45

11.3 Obiectivele secundare ........................................................................................ 45

Capitolul 12. Material și metode ...................................................................... 46

12.1 Designul studiului ................................................................................................ 46

12.2 Cercetarea in vitro ............................................................................................... 46

12.2.1 Lotul de studiu .................................................................................................................... 46

12.2.2 Informații despre pacienți ................................................................................................ 46

12.2.3 Informații despre tulpini ................................................................................................... 47

12.2.3.1 Evaluarea caracterelor fenotipice .......................................................................... 47

12.2.3.2 Evaluarea caracterelor genotipice ......................................................................... 48

12.2.4 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu solid ....................................................... 50

12.2.5 Susceptibilitatea la bacteriofagi în mediu de cultură lichid ................................... 52

12.2.6 Capacitatea de formare a biofilmului ............................................................................ 53

12.2.7 Capacitatea de distrugere a biofilmului ....................................................................... 55

12.3 Cercetarea in vivo ................................................................................................ 55

12.3.1 Lotul de studiu ........................................................................................................................ 55

12.3.2 Metodologia de lucru ........................................................................................................ 56

12.3.3 Vizitele de studiu ................................................................................................................ 57

12.3.3.1 Vizita de selecţie ......................................................................................................... 57

12.3.3.2 Vizita iniţială ................................................................................................................. 57

12.3.3.3 Vizitele din timpul spitalizării și vizita din ziua externării ................................ 58

12.3.3.4 Vizitele de urmărire .................................................................................................... 58

12.3.4 Riscurile terapiei ................................................................................................................ 58

12.4 Controlul calității ................................................................................................. 59

12.5 Etica studiului ...................................................................................................... 59

12.6 Analiza statistică .................................................................................................. 60

12.7 Finanțarea proiectului ......................................................................................... 61

12.8 Studii pilot............................................................................................................. 61

Capitolul 13. Rezultate ..................................................................................... 63

13.1 In vitro – Studiul Staphylococcus spp. ............................................................. 63

13.1.1 Lotul de studiu .................................................................................................................... 63

13.1.2 Informații despre pacienți ................................................................................................ 63

13.1.3 Informații generale despre tulpinile izolate ................................................................. 66

13.1.4 Profilul fenotipic al tulpinilor izolate ............................................................................. 67

13.1.5 Profilul genotipic al tulpinilor izolate ............................................................................ 72

13.1.6 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu solid Mueller-Hinton .......................... 81

13.1.7 Susceptibilitatea la bacteriofagi în mediu de cultură lichid ................................... 93

13.1.7.1 Experimentul INTESTI (EI) ........................................................................................ 93

13.1.7.2 Experimentul PYO (EP) ............................................................................................. 95

13.1.8 Formarea biofilmului ......................................................................................................... 96

13.1.8.1 Experimentul INTESTI (EI) ........................................................................................ 96

13.1.8.2 Experimentul PYO (EP) ............................................................................................. 99

13.1.9 Capacitatea de distrugere a biofilmului ..................................................................... 103

13.2 In vitro – Studiul Pseudomonas aeruginosa.................................................. 105

13.2.1 Lotul de studiu .................................................................................................................. 105

13.2.2 Informații despre pacienți .............................................................................................. 105

13.2.3 Informații generale despre tulpini ............................................................................... 107

13.2.4 Profilul de rezistență la antimicrobiene al tulpinilor testate ................................. 107

13.2.5 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu solid Mueller Hinton ......................... 109

13.2.6 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu lichid .................................................... 113

13.2.6.1 Experimentul INTESTI ............................................................................................. 113

13.2.6.2 Experimentul PYO .................................................................................................... 114

13.2.7 Formarea biofilmului ....................................................................................................... 115

13.2.7.1 Experimentul INTESTI (EI) ...................................................................................... 115



13.3 Rezultate in vivo ................................................................................................ 121

13.3.1 Endocardită infecțioasă pe corp străin ...................................................................... 121

13.3.2 Osteomielită cronică fistulizată de etiologie S. aureus și P. aeruginosa .......... 123

13.3.3 Infecție periprotetică de țesuturilor moi cu Staphylococcus aureus ................. 125

13.3.4 Infecție cutanată cronică polimicrobiană (P. aeruginosa, E. coli și S. simulans)

la nivelul bontului de amputație ............................................................................................... 129

13.3.5 Hidrosadenită axilară recidivantă cu Proteus mirabilis și S. epidermidis ........ 130

13.3.6 Osteomielită cronică fistulizată cutanat de etiologie S. aureus meticilino-

rezistent .......................................................................................................................................... 132

Capitolul 14. Discuții ....................................................................................... 135

14.1 Studiul Staphylococcus spp. ........................................................................... 135

14.1.1 Caracteristicile lotului studiat ...................................................................................... 135

14.1.2 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu solid Mueller-Hinton ........................ 138

14.1.3 Susceptibilitatea la bacteriofagi în mediu de cultură lichid ................................. 139





14.2 Studiul Pseudomonas aeruginosa .................................................................. 142

14.2.1 Caracteristicile lotului de studiu .................................................................................. 142

14.2.2 Susceptibilitatea la bacteriofagi pe mediu solid Agar Mueller Hinton .............. 143

14.2.3 Susceptibilitatea la bacteriofagi în mediu lichid ..................................................... 144





14.3 Studiul in vivo .................................................................................................... 145

CONCLUZII ...................................................................................................... 147

Referințe ........................................................................................................... 152

REZUMAT

Introducerea lucrării prezintă problematica infecțiilor bacteriene dificil de tratat din

cauza apariției multi-rezistenței la antibiotice. Introducerea oferă o alternativă la terapia clasică

introducând bacteriofagii. Aceștia sunt cea mai numeroasă formă de viață de pe planetă, având

rolul de a menține echilibrul între speciile bacteriene în nișa ecologică, astfel, atunci când o

bacterie se multiplică în exces, aceștia vor determina distrugerea ei.

La 100 de ani de la descoperirea bacteriofagilor înțelegem că același efect îl dezvoltă și în

procesul infecțios, încercând prin ciclul litic să restabilească echilibrul și să anihileze bacteriile

patogene atât formele sesile cât și formele planctonice.

Ținând cont de necunoscutele existente la momenul actual în mecanismul de acțiune al

bacteriofagilor, dar și de locul fruntaș al României în acest domeniu în secolul XX, am decis

elaborarea unei protocol pentru reluarea și relansarea experienței României în cercetarea

bacteriofagilor.

Partea generală prezintă „germenii problemă”, punând accent pe Staphylococcus spp. și

Pseudomonas aeruginosa.

Capitolul 1 (Germenii problemă) descrie încadrarea germenilor problemă de către CDC

(Center for Disease Control and Prevention) în trei categorii: URGENT, SERIOUS și

CONCERNING, pentru a trage un semnal de alarmă, dar și pentru a pregăti măsuri riguroase de

prevenire și monitorizare. Societatea Americană de Boli Infecțioase definește bacteriile

periculoase sub acronimul ESKAPE.

Capitolul 2 (Staphylococcus spp.) prezintă informații despre Genul Staphylococcus,

pornind de la noțiuni de microbiologie și taxonomie până la sindroame clinice produse.

S. aureus este microorganismul din acest gen cel mai frecvent întâlnit în patologia

umană, având capacitatea de a produce atât infecții nosocomiale cât și comunitare, cauzând un

grad înalt de mortalitate și morbiditate în ciuda numeroaselor antibiotice antistafilococice

existente.(1, 2)

Stafilococii coagulazo-negativi (SCN), mai rar incriminați în patologia umană, pun

probleme în infecțiile asociate materialelor protetice. Dintre aceștia, S. epidermidis este cel mai

întâlnit SCN implicat în patologia umană, fiind un germene din flora comensală cutanată.(3)

Este descrisă și capacitatea stafilococului de a determina fenotipul small colony variants

(SCV)(4), rezultat ca urmare a mutațiilor la nivelul genelor metabolice. SCV prezintă ritm de

creștere lent, cu un timp de generație de 6-9 ori mai lung și colonii cu un diametru de 10 ori mai

mici.(5, 6)

Aceste subpopulații pot fi auxotrofe pentru hemină (alterarea genei hemB sau ctaA),

menadionă (alterarea genei menD), afectând sistemul de transport al electronilor, sau auxotrofe

pentru timdină (alterarea genei thyA, codificatoare a thymidylate synthase).(7, 8) SCV au

capacitatea de a internaliza și a persista intracelular, determinând infecții cronice și persistente

prin scăparea de sistemul imun și scăderea expunerii la antibiotice.(9) Aceste mutante sunt

capabile să realizeze infecții greu de tratat.(10)

Capitolul 3 (Pseudomonas aeruginosa) descrie informații despre bacilul piocianic

pornind de la noțiuni de microbiologie până la sindroame clinice produse. Fenotipul SCV a fost

descris inclusiv la P. aeruginosa, cel mai frecvent întâlnit în fibroza chistică. Acesta, este foarte

aderent la suprafață, are motilitate redusă și are rezistență crescută la antibiotice.(11)

Tot în acest capitol a fost descrisă capacitatea P. aeruginosa de a produce fenotipul

mucoid prin secreției în exces a alginatului exopolizaharidic. Acesta poate fi identificat la

tulpinile izolate din căile aeriene ale pacienților cu bronșiectazii, diskinezie ciliară, urină la

pacienții cu infecție urinară sau de la nivel otic în otite. Fenotipul alginat predomină în populația

sesilă, împiedicând penetrarea neutrofilelor sau a antibioticelor. Prin formarea capsulei

peribacteriene, este împiedicată atât opsonizarea cât și fagocitoza.(12)

Capitolul 4 (Virulența bacteriană) prezintă principalii factori de virulență pentru cele

două microorganisme, dar și mecanismele de reglare ale acestora.

Pentru Staphylococcus spp. sunt descrise proteinele de suprafață, polizaharidele

capsulare, citotoxinele, enzimele și superantigenele. Toate acestea sunt controlate de diverse

sistemele care reglează virulența stafilococului, cum ar fi agr („accessory gene regulator”), sar

(„staphylococcal accessory regulator”), saeRS („S. aureus exoprotein expression”), srrAB

(„staphylococcal respiratory response”), arlSR („autolysis-related locus sensor”), factorul Sigma

(σ) și fragementele mici de material nuclear.(13)

Sunt prezentate și pentru P. aeruginosa factorii de virulență reprezentați de: factori de

suprafață (pili, flageli, endotoxine) și factori solubili, secretați în mediul extracelular prin diverse

sisteme: Tipul I (T1SS) (proteaza alcalină), Tipul II (T2SS) (exotoxina A, fosfolipaza A,

proteaza IV, elastaza - cu rol în colonizare, inflamație, citotoxicitate), Tipul III (exotoxinele S, T,

U, Y - producând leziuni tisulare), Tipul V (T5SS), Tipul VI (T6SS). Alți factori de virulență

sunt pioverdina (rol în legarea fierului), piocianina (inhibă proliferare limfocitelor, produce

leziuni tisulare), alginatul cu rol antifagocitar și moleculele de QS (quorum sensing) care au rol

atât în formarea biofilmului cât și reglarea sintezei factorilor de virulență.(14)

Cele mai folosite sisteme de reglare sunt Las, Rhl și PQS (Pseudomonas quinolone

signal), conferind bacteriei capacitatea de a se adapta diferitelor condiții din mediu.(15)

Capitolul 5 (Biofilmul bacterian) descrie procesul de formare a biofilmului bacterian

atât pe substrat inert, cât și celular. Acesta se formează în mai multe etape: 1) atașarea la substrat

în monostrat și agregarea intercelulară a bacteriilor planctonice formând microcolonii; 2)

maturarea biofilmului formând structuri cu diverse forme; 3) detașarea bacteriană cu invazia

altor teritorii.(16) La nivelul biofilmului bacteriile sun înglobate într-o matrice extracelulară

formată preponderent din polizaharide, proteine și acizi nucleici.(17) La nivelul biofilmului

există un sistem circulator prin care nutrienții ajung la celulele bacteriene și o arhitectură

specifică în care bacteriile sunt organizate sub formă de “coloane” sau “ciuperci”.(18)

Quorum sensing (QS) este o modalitate de comunicare interbacteriană care modifică

expresia genelor în funcție de densitatea bacteriană.(19) Bacteriile secretă molecule de semnal,

autoinductori (AI), ulterior concentrația acestora este detectată de bacteriile din aceeași

comunitate prin receptori specifici, pentru ca ulterior acestea să secrete la rândul lor AI. QS are

rol atât în formarea biofilmului cât și în sinteza factorilor de virulență.(20)

În cazul bacteriilor Gram pozitive moleculele de semnal sunt reprezentate de peptide

autoinductoare (AIPs), iar în cazul bacteriilor Gram negative sunt molecule mici autoinductoare

cum ar fi acyl-homoserine lactones (AHLs) sau N- butyryl homoserine lactone.(21)

Capitolul 6 (Comunicarea interspecii bacteriene) prezintă exemple de interacțiuni

interspecii. Bacteriile pot coexista și comunica la nivelul microbiomului uman, dar și la nivelul

biofilmului, potențându-și efectul prin sinergism.(22) Alte studii consideră că apare o creștere a

formării biofilmului datorită unui efect cumulativ, și nu datorită sinergismului.(23) Alte opinii

sugerează că în afară de sinergism, între bacteriile sesile poate exista și o competiție pentru

nutrienți care determină inhibarea creșterii și a producerii de biofilm pentru una din specii.(24)

Capitolul 7 (Mecanisme de rezistență la antibiotice) descrie mecanismele de rezistență

la antibiotice atât pentru Staphylococcus spp., cât și pentru P. aeruginosa.

Cea mai importantă insulă de rezistență a stafilococului meticilino-rezistent este caseta

stafilococică cromozomală mec (staphylococcal cassette chromosome (SCC) mec).(25) Genele

cele mai importante din SCCmec sunt mecA ce conferă rezistență la betalactamine prin

codificarea PBP2A (penicillin-binding protein 2A), ccrA/ccrB și ccrC care permit mobilizarea

casetei.(26)

În cazul P. aeruginosa profilul de rezistență la antibiotice este înalt datorită multitudinii

de mecanisme de rezistență, cum ar fi scăderea capacității de penetrare al antibioticului până la

situsul de acțiune (alterarea porinelor), alterarea țintei, inactivarea antibioticelor prin producerea

de enzime, prezența pompelor de eflux.(14)

Capitolul 8 (Alte opțiuni terapeutice – direcții de cercetare) exprimă potențiale terapii

antimicrobiene împotriva S. aureus sau P. aeruginosa, cum ar fi autolizinele din componența

bacteriofagilor, extractul antimicrobian din planta Melaleuca alternifolia, folosirea S.

epidermidis ca și probiotic, bacteriocinele produse de stafilococii comensali, folosirea peptidelor

antimicrobiene, a probioticelor și vaccinurilor anti-P. aeruginosa.(26, 27)

O altă soluție ar putea fi țintirea strategiilor de adaptare bacteriană sau a operonilor

reglatori, cum ar fi sistemul agr sau operonul sigmaB pentru tratamentul infecțiilor stafilococice

cronice și dificil de tratat datorită rezistenței la antibiotice.(28)

Ingineria biomedicală încearcă să identifice noi strategii de inhibare a formării

biofilmului pe materialul protetic, prin impregnarea acestuia cu diverse substanțe

antistafilococice care să împiedice aderarea bacteriană.(3)

Terapia experimentală pentru P. aeruginosa încearcă distrugerea acestuia prin

interferarea cu QS prin inhibarea celui mai important reglator LasR. Moleculele identificate

pentru acest proces au fost furanonele și patulina. Se încearcă inclusiv inhibarea sistemului

RhlR.(20)

Capitolul 9 (Bacteriofagii, trecut – prezent), ultimul capitol al părții generale face

trecerea spre partea specială, prezentând instrumentul central al tezei, bacteriofagii. Aceștia au

fost identificați pentru prima dată în 1896 de către bacteriologul englez Ernest Hankin, care

descrie activitatea antibacteriană „a râurilor indiene Gange și Jumna” împotriva Vibrio

cholerae.(29)

La 2 ani distanță unul de celălalt, bacteriologii Frederick Twort (1915) și Felix d'Hérelle

(1917) au identificat agentul cauzator al efectului Hankin, numindu-l virusurile bacteriilor,

respectiv bacteriofagii.(29) D'Hérelle a observat formarea plajelor de liză după cultivarea pe

medii solide a Shigella spp. și a produsului abacterian obținut prin filtrarea materiilor fecale de la

pacienții cu dizenterie din timpul epidemiei de dizenterie din armata franceză în 1915.(30)

În momentul apariției antibioticelor, fagii își restrâng mult aplicabilitatea, fiind folosiți

doar în febra tifoidă refractară la tratamentul antibiotic.(31)

Terapia cu bacteriofagi continuă în fostele țări URSS și Polonia, fără a fi influențată de

contextul internațional. În Republica Georgia terapia cu bacteriofagi este considerată terapie

standard. În alte țări, cum ar fi SUA, interesul pentru bacteriofagi reapare în anii ’90.(32)

Pentru a extinde cercetarea, începând cu ianuarie 2016, National Institute of Allergy and

Infectious Diseases a decis să finanțeze 24 de proiecte americane de dezvoltare a unor noi

modalități antimicrobiene, majoritatea având ca temă principală bacteriofagii.(33)

Primul român care a studiat bacteriofagii este profesorul Mihai Ciucă, care în anul 1921

împreună cu profesorul Jules Bordet a descris lizogenizarea la Institutul Pasteur din Bruxelles.

Cei doi descriu procesul de obținere a plajelor de liză în articolul „Autolyse microbienne et sérum

antilytique” publicat în 1921. De la acest protocol, alți cercetători au obținut bacteriofagi

specifici și au identificat inclusiv rezistența la liză.(34) Ulterior bacteriofagii au atins apogeul în

România în perioada 1960-1975, când Institutul „Cantacuzino” deținea o baterie importantă de

bacteriofagi, utilizați împotriva bacteriilor implicate în patologia digestivă și urinară.(34)

Partea specială expune fundamentarea studiului, scopul, obiectivele, metodele,

rezultatele și discuțiile studiului efectuat. Cercetarea a vizat identificarea unei alternative de

tratament pentru pacienții cu patologie de boli infecțioase cu opțiuni terapeutice limitate.

Capitolul 10 (Fundamentarea studiului) descrie mecanismul de acțiune al

bacteriofagilor atât pe bacteriile planktonice, cât și pe cele sesile.

Capitolul bacteriofagilor se redeschide în întreaga lume datorită contextului actual

(profilul crescut de rezistență antimicrobiană, capacitatea germenilor de a forma biofilm, dar și

limitarea farmacokineticii și farmacodinamiei antibioticelor în infecțiile cronice), dar și datorită

siguranței dovedite de ultilizarea îndelungată în unele regiuni ale lumii.(35) Studiile de până

acum au dovedit eficacitatea mai mare a bacteriofagilor litici combinați cu terapia antibiotică,

față de terapiile individuale.(36)

Dezavantajul acestora poate fi reprezentat de capacitatea acestora de integrare la nivelul

genomului bacterian și transformare în profagi, care pot fi transmiși generațiilor următoare.(32)

În acest context, în care potențialul bacteriofagilor nu este suficient explorat, am decis

elaborarea unei metodologii de cercetare, reluarea și relansarea experienței României în

cercetarea bacteriofagilor. Am debutat prin testarea tulpinilor semnificative clinic din Institutul

de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș” pentru susceptibilitatea la bacteriofagii comerciali

descoperiți în altă regiune a lumii, testarea efectului acestora pe formarea biofilmului, dar și pe

biofilmul preformat. Am realizat și un studiu terapeutic pilot pentru a evalua siguranța și efectul

bacteriofagilor din alt areal.

Capitolul 11 (Ipoteza de lucru) prezintă scopul lucrării (să evaluez efectul

bacteriofagilor produși în Republica Georgia asupra tulpinilor de S. aureus și P. aeruginosa cu

impact clinic din țara noastră și să evaluez efectul sinergismului bacteriofagi-antibiotice la

pacienții cu opțiuni terapeutice limitate), obiectivele principale ale studiului: caracterizarea in

vitro a impactului bacteriofagilor asupra tulpinilor de S. aureus și P. aeruginosa cu impact clinic

din țara noastră, evaluarea siguranței bacteriofagilor comerciali la pacienții cu opțiuni terapeutice

limitate, și obiectivele secundare: determinarea caracterelor genotipice și fenotipice ale

Staphylococcus spp. izolate în clinică, evaluarea impactului profilului de rezistență la antibiotice

asupra susceptibilității la bacteriofagi, evaluarea susceptibilității tulpinilor la bacteriofagi în

mediu de cultură lichid, cuantificarea efectului bacteriofagilor asupra formării biofilmului, dar și

asupra biofilmului preformat, evaluarea corelației dintre profilul de rezistență la antibiotice și

influența diverselor diluții de bacteriofagi asupra formării biofilmului, identificare factorilor de

risc pentru susceptibilitatea la bacteriofagi, caracterizarea factorilor de risc pentru influența

diferitelor diluții de fagi asupra formării biofilmului, evaluarea impactului bacteriofagilor

comparativ la pacienții cu scor Carmeli diferit, evaluarea impactului bacteriofagilor comparativ

pe S. aureus și SCN, evaluarea recidivelor și a perioadei dintre recidive, evaluarea efectului

terapiei combinate bacteriofagi-antibiotice, evaluarea calității vieții pacienților.

Capitolul 12 (Material și metode) descrie metodologia de lucru pentru cele trei sub-

studii, două in vitro și unul in vivo elaborate în colaborare cu Universitatea de Medicină și

Farmacie Carol Davila (catedrele Microbiologie II – Inst. Dr. I. Cantacuzino și Boli infecțioase I

– Inst. Nat. de Boli Inf. Prof. Dr. Matei Balș), Institutul de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei

Balș”, Institutul de Cercetare din cadrul Universității București și Institutul de Virusologie

„Ştefan S. Nicolau”.

Cele două sub-studii in vitro sunt studii longitudinale, prospective, non-intervenționale,

prin designul cărora am evaluat caracteristicile tulpinilor de Staphylococcus spp. și influența

bacteriofagilor asupra acestora în primul sub-studiu, iar în celălalt caracteristicile tulpinilor de

Pseudomonas aeruginosa și influența bacteriofagilor asupra lor.

Am inclus în studiile in vitro 117 tulpini de Staphylococcus spp. și 44 tulpini de P.

aeruginosa. Am identificat diferite informații de la pacienți, precum: vârsta, data nașterii, sexul,

antecedentele personale patologice, durata spitalizării, diagnosticul de externare, valorile

analizelor de laborator (hemoleucograma, probe inflamatorii), produsele patologice recoltate,

data recoltării, microorganismele identificate, tratamente antibiotice primite și durata acestora,

evoluția pacienților, scorul Carmeli.

Pentru o parte dintre tulpinile de Staphylococcus spp. am evaluat prezența factorilor de

virulență (producerea de hemoliză, lipază, lecitinază) și a caracterelor genotipice cu privire la

rezistența la antibiotice, dar și la profilul de virulență.

Am testat 62 tulpini pentru prezența genelor: mecA și a altor elemente din caseta

cromozomală stafilococică (SCCmec), ermA și ermC (gene de rezistență pentru rezistența la

macrolide), clfA, clfB (gene pentru exprimarea clumping factor A și B), fnbA (genă pentru

sinteza proteinei A de legare a fibronectinei), luk-PV (gena cu rol în sinteza leukocidinei Panton-

Valentine), hlg (gena pentru exprimarea hemolizinei γ), bbp (gena pentru sinteza bone

sialoprotein-binding protein) și tst (gena ce codifică toxina sindromului șocului toxic).

Pentru ambele genuri bacteriene am testat profilul fenotipic de rezistență la antibiotice și

profilul de susceptibilitate la mixturile de bacteriofagi PYO, INTESTI și STAPHYLOCOCCAL

(Eliava BioPreparations, Tbilisi, Georgia), PHAGYO și PHAGESTI (JSC "Biochimpharm",

Tbilisi, Georgia).

Fiecare tulpină bacteriană a fost însămânțată liniar pe mediu Mueller-Hinton, iar ulterior

20 μL din fiecare mixtură de bacteriofagi a fost aplicată prin tehnica spot test.(37) Plăcile au fost

incubate pentru 24 ore la 35±2°C în aerobioză.(38)

Pentru o parte dintre bacterii a fost evaluată susceptibilitatea în mediu lichid a tulpinilor

bacteriene la diverse diluții binare de bacteriofagi, dar și efectul fagilor pe formarea biofilmului,

ultilizând metoda Christensen(39) adaptată.

Bacteriile aderate la pereții godeurilor au fost fixate și colorate cu cristal violet 1%, iar

ulterior colorantul a fost resuspendat cu acid acetic 33%, suspensia obținută fiind a fost măsurată

spectrofotometric (A492 nm) cu HumaReader HS (HUMAN, Wiesbaden, Germania).

Intensitatea culorii suspensiei colorate (densitatea optică) este direct proporţională cu capacitatea

de aderenţă la substratul inert.

Biofilmul a fost definit ca orice valoare OD492nm peste valoarea mediei martorilor negativi

(godeurile în care a fost adăugat doar bulion) din aceeași placă. A fost definit biofilmul puternic

ca toate valorile OD492nm cu peste 50% peste OD492nm a martorilor negativi; biofilm slab ca toate

OD492nm cu sub 10% peste OD492nm a martorilor; biofilm moderat restul valorilor între 10 – 50%.

Am calculat inclusiv rata de scădere (rate of change) (ROC) ca fiind procentul cu care a

scăzut OD492nm în godeurile cu diluții de fagi față de godeul care conține doar cultură bacteriană.

Valoarea OD492nm a suspensiei din godeurile resuspendate cu acid acetic este definită ca

și modalitate de exprimare a valorii biofilmului din acel godeu. Am definit abrevierile: OD_1/64

= OD492nm în godeul ce conține diluția de fag 1/64 (echivalență cu valorarea biofilmului din acest

godeu), OD_1/32, OD_1/16, OD_1/8, OD_1/4, OD_1/2 au aceeași semnificație doar că în

godeul respectiv este altă diluție de bacteriofag, OD_cultura = OD492nm în godeul în care este

însămânțată tulpina bacteriană în bulion Mueller Hinton (echivalență cu valorarea biofilmului

din acest godeu).

Am evaluat inclusiv efectul bacteriofagilor pe biofilmul preformat, prin adăugarea

bacteriofagilor după ce tulpinile au fost cultivate și incubate timp de 24 ore în mediu lichid.

Cercetarea in vivo a fost un studiu pilot, prospectiv, experimental desfășurat în Institutul

de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș” . Au existat criterii de includere și excludere, iar

pacienții incluși în studiu au îndeplinit toate criteriile de includere și niciunul de excludere.

Bacteriofagii au fost folosiţi pentru tratamentul infecţiilor bacteriene trenante la pacienții

care după tratamentul antibiotic au suferit recidive. Bacteriofagii sunt condiționați în formă

lichidă şi se pot administra pe diverse căi; în acest studiu aceștia au fost administraţi: topic şi/sau

oral.

Pe cale orală, bacteriofagii au fost administrați în doze de 10-20 mL de 3 ori pe zi, cu cel

puţin 30 min înaintea meselor. Cu 20 min înainte de administrare, pacientul bea 10 mL suspensie

soluţie alcalină, pentru a preveni inactivarea bacteriofagilor de către sucul gastric. Pe calea

topică, aceștia au fost aplicaţi la nivelul plăgii/fistulei de 2 ori pe zi, cantitatea utilizată a fost în

funcție de dimensiunile leziunii.

Antibioticele asociate s-au administrat conform antibiogramei și protocoalelor clinice de

tratament în vigoare pe plan local și internațional. A fost respectată calea şi modul de

administrare menţionate în prospectul acestora.

Toți pacienții au efectuat o vizită de selecție și una de inițiere, dar doar după semnarea în

mod voluntar și în cunoștință de cauză a formularului de informare și consimțământ informat.

Vizitele ulterioare au fost programate în funcție de patologia și răspunsul la terapie al

pacientului. A fost evaluată în primul rând siguranța pacienților, dar și răspunsul la terapie.

Pentru cercetările in vitro toate experimentele au fost lucrate în triplicat, valoarea finală

fiind media celor trei. Pentru fiecare experiment am avut martor negativ, care în cazul formării

biofilmului a fost bulionul.

În cercetările in vitro, dar fără a le număra în cercetare am folosit două tulpini etalon: o

tulpină etalon pentru Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach

ATCC ® 29213 (bioMérieux, Marcy L’Étoile, Franța) și o tulpină etalon pentru Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula ATCC ® 27853 (bioMérieux, Marcy

L’Étoile, Franța).

Toate testele de laborator au fost realizate pe aparatură calibrată de către personal

calificat. Cercetarea microbiologică a fost realizată sub hotă cu flux de ventilație laminar, cu

nivel de biosecuritate clasa II. Toate materialele folosite au fost în perioada de valabilitate și au

fost însoțite de certificate de calitate.

Toate documentele necesare cercetării au obținut avizul Comisiei de Bioetică a

Institutului Național de Boli Infecțioase „Prof. Dr. Matei Balș” pe 02.10.2014 (nr c/5101) și al

Comisiei de Etică a Cercetării Științifice a Universității de Medicină și Farmacie „Carol Davila”

pe 26.01.2015, aviz numărul 47.

Analiza statistică a fot realizată în SPSS Statistics for Windows (version 22.0, IBM Corp,

Armonk, NY, USA), cu nivel de semnificație statistică stabilit la p<0.05. Distribuția variabilelor

continue a fost evaluată cu testul de normalitate Shapiro-Wilk, ulterior aplicând diferite funcții

statistice.

Rezultate și discuții

In vitro – Studiul Staphylococcus spp.

Lotul de studiu a inclus 117 pacienți cu infecții cu Staphylococcus spp. cu o mediană a

vârstei de 47 ani (28.5 ani, 64 ani), din care 17 pacienți (14.5%) au avut vârsta sub 18 ani în

momentul efectuării studiului. Peste 60% dintre pacienții incluși în studiu au fost Carmeli 3, deci

pacienți imunodeprimați, peste 30% din aceștia având ca și cauză de imunodepresie diabetul

zaharat. Alte cauze de imunodepresie fiind infecția HIV și diversele neoplazii.

Cele mai multe tulpini stafilococice izolate au fost din specia S. aureus (80.3%), acesta

având o incidență a infecțiilor mai crescută față de SCN (p=0.000).(26, 40) Ca și în literatură,

stafilococul a fost identificat cel mai frecvent din infecțiile cutanate (45.3%), urmate de

bacteriemii (23.9%) și infecții respiratorii (13.7%). (41-43) În grupul S. aureus, tulpinile au

prezentat o rată de virulență semnificativ mai mare față de SCN, prin producerea zonelor de

hemoliză (56.3% vs. 23.1%, p=0.026), dar și a lecitinazei (87.2% vs. 0%, p=0.000).

În rândul tulpinilor din acest studiu am înregistrat următorul profil de rezistență:

meticilină 48.3%, eritromicină 61.4%, clindamicină 62.3%, rifampicină 24.5%, levofloxacin

22.9%, gentamicină 14.5%, pentru restul antibioticelor rezistența a fost sub 10.0%. Nu s-a

înregistrat rezistență pentru vancomicină sau linezolid.

Spre deosebire de virulență, rezistența la antibiotice este semnificativ mai crescută în

rândul SCN față de S. aureus pentru levofloxacin (40.1% vs. 18.1%, p=0.023), acid fusidic

(37.5% vs. 0.0%, p=0.000), gentamicină (40.9% vs. 8.0%, p=0.000), teicoplanină (14.3% vs.

0.0%, p=0.000) și cotrimoxazol (25% vs. 3.3%, p=0.000).

Tulpinile recoltate de la nivelul torentului sangvin au profil de rezistență mai cresut față

de cele recoltate prin tampon nazal, având pentru meticilină un procent de rezistență de 64.3%

vs. 25.0% (p=0.012), pentru levofloxacin 38.4% vs. 0.0% (p=0.009), pentru eritromicină 64.3%

vs. 26.7% (p=0.018).

Pentru unele dintre antibioticele testate, rezistența tulpinilor de la nivel cutanat este

semnificativ mai crescută față de cele de la nivel nazal, fiind pentru clindamicină 76.4% vs.

26.7% (p=0.000), iar pentru eritromicină 68.6% vs. 26.7% (0=0.003).

Pentru trimetoprim/sulfametoxazol rezistența a fost semnificativ diferită între tulpinile

recoltate de la nivel cutanat față de cele din torentul sangvin (1.9% vs. 21.5%, p=0.003)

Nu am înregistrat semnificație statistică pentru corelația dintre rezistența la meticilină și

prezența genei mecA (p=0.147), am identificat 6/34 (17.6%) din tulpinile susceptibile la

meticilină vs. 10/28 (35.7%) din cele rezistente la meticilină. A fost înregistrată corelație între

rezistența la meticilină și prezența genei ccrB2 sau a SCCmecVJ1 (p=0.034, OR= 4.167,

CI95%=1.137 – 15.265, respectiv p=0.000, OR= 13.867, CI95%=2.772 – 69.378).

Rezistența la eritromicină se corelează cu prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.034, OR=

0.218, CI95%=0.054 – 0.890), dar și cu absența genei hlg (p=0.033, OR= 3.643, CI95%=1.201 –

11.054). O proporție mai mare din tulpinile susceptibile la eritromicină au avut gena ermA

prezentă față de cele rezistente la eritromicină (7/28, 25% vs. 3/31, 9.7%). La fel ca și la

eritromicină, rezistența la clindamicină se corelează cu prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.041), cu

absența hlg (p=0.019).

Rezistența la levofloxacin se corelează cu absența genelor clfA și clfB (p=0.048), în

consecință prezența celor 2 gene sunt factori protectori pentru sensibilitate la quinolone.

Din cele 62 microorganisme, 17.6% tulpini Staphylococcus spp. meticilino-sensibile au

prezentat gena mecA, proprietate explicată prin faptul că gena nu este exprimată fenotipic în

absența supresiei. Orice exprimare a genelor de rezistență sau virulență se efectuează cu consum

de energie, astfel bacteria neavând organit producător de energie realizează fenomenul mai sus

menționat ca și mecanism de protecție. In vivo, în momentul supresiei antibiotice, bacteria

activează exprimarea ca și mecanism de evadare.

Un total de 10/28 (35.7%) tulpini meticilino-rezistente au prezentat gena mecA, iar orice

genă din caseta SCCmec a fost întâlnită la 19/28 (67.8%) tulpinile meticilino-rezistente ceea ce

sugerează diversitatea elementelor SCCmec ce pot determina rezistența la meticilină în tulpinile

studiate.(44) Din cele 62 tulpini testate, un total 7/10 (70%) tulpini pozitive pentru gena ermA

sunt sensibile la eritromicină, având aceeași explicație ca pentru absența exprimării genei mecA

la tulpinile meticilinosensibile.

Un total de 61.3% tulpini testate prezintă gene clfA și clfB, 58.1% pentru hlg, restul

genelor de virulență fiind prezente în procent mai scăzut. Cele 2 gene sunt frecvent întâlnite la

tulpinile stafilococice și în alte cercetări, fiind extrem de importante în procesul de aderare,

colonizare (gena pentru clumping factor A/B) și în procesul de liză a hematiilor și leucocitelor

prin producerea de către gena hlg a unei leucocidine (γ hemolizină).(45)

Gena fnbA a fost întâlnită la 4/62 (6.4%) tulpini provenite de la pacienți Carmeli 3 cu

infecții cutanate sau osoase. Toate tulpinile cu gena fnbA au asociată și gena luk-PV. Pentru 2

dintre tulpinile cu această genă a fost evaluată capacitatea de a forma biofilm, ambele formând

biofilm puternic, proprietate care a fost inhibată de adăugarea bacteriofagilor în diluția 1/2.

Frecvența genei fnbA în populația de stafilococ studiată este mult mai scăzută față de cea

identificată de alți autori de 21.4 – 72.5%.(46)

Literatura de specialitate sugerează o asociere între rezistența la meticilină și prezența

genelor pentru proteinele de suprafață precum fnb,(47) în această cercetare din cele 4 tulpini cu

gena fnbA, 2 aveau profil fenotipic MRSA și a treia prezenta gena mecA în evaluarea genotipică,

dar care nu este exprimată in vitro.

Genele clfA/B și fnbA, codând proteine cu rol în prima etapă a formării biofilmului au rol

important în infecțiile cutanate sau osoase, fapt confirmat și în cercetarea noastră.

Asocierea dintre genele fnbA și luk-PV dovedește că cele 4 tulpini pot deveni foarte

virulente atât prin capacitatea de a forma biofilm, cât și prin liza leucocitelor și determinarea de

necroză tisulară.(48)

Încă un potențial factor de prognostic negativ la aceste tulpini este asocierea dintre

prezența genei hlg și rezistența la meticilină, 41.6% dintre tulpinile cu această genă având

asociată și rezistența la meticilină.

Un număr de 6 tulpini au avut și gena bbp, care codifică bone sialoprotein-binding

protein, cu rol în infecțiile osteoarticulare prin formarea biofilmului la nivel osos. În studiul

nostru, acestea au fost izolate de la nivel nazal (4 tulpini) și de la nivel cutanat, respectiv din

torentul sangvin (câte 1 tulpină). Știind că de la nivel nazal tulpinile pot fi propagate foarte ușor

și izolând de la acest nivel 4/6 tulpini cu gena bbp este important să evaluăm importanța

eradicării tulpinilor virulente din portajul nazal.

Studiile dovedesc o asociere între rezistența la meticilină și gena bbp, fapt neconfirmat și

de această cercetare, 5 din cele 6 tulpini fiind sensibile la meticilină. Literatura sugerează

inclusiv o asociere între prezența genei bbp și cea a genei luk-PV, observație neconfirmată în

acest studiu, nicio tulpină cu bbp nu prezintă gena luk-PV.(49)

Toate tulpinile cu gena bbp au avut capacitate de a forma biofilm, 2 formând biofilm

slab, 2 moderat și 2 puternic; după adăugarea fagilor în diluția 1/2 capacitatea a fost inhibată

pentru toate cele 6 tulpini.

Gena luk-PV (gena pentru leukocidina Panton-Valentine) apare la 5 dintre tulpinile

testate (8.1%), 4 din acestea fiind S. aureus, iar a cincea S. epidermidis, frecvență similară cu cea

identificată și de alți autori.(50) Tulpinile provin din infecții cutanate (3), una din infecție oculară

și o bacteriemie. Două dintre tulpini sunt meticilino-rezistente, proprietate care nu se corelează

cu literatura unde este specificat că tulpinile cu gena luk-PV sunt meticilino-rezistente.(51)

Gena tst a fost identificată la 3 tulpini de stafilococ auriu, fiind recoltate în 2/3 cazuri de

la nivel nazal și una de la nivel cutanat. Toate cele 3 tulpini prezentau și gena hlg, dar aveau un

profil bun de sensibilitate la antibiotice (sensibile la meticilină, rifampicină, etc.). Localizarea

infecției sugerează că aceste 3 tulpini extrem de virulente pot fi foarte ușor răspândite în mediul

intraspitalicesc.

Sensibilitatea la meticilină (51.7%) este mai scăzută față de susceptibilitatea la

bacteriofagii PYO (53%) și mai crescută față de susceptibilitatea la bacteriofagii INTESTI

(51.3%). Dacă însumăm susceptibilitățile PYO și INTESTI procentul va crește la 60.7%.

Tulpinile susceptibile la bacteriofagii PYO au fost semnificativ mai frecvent recoltate de

la nivel nazal față de cele de la nivel cutanat sau torent sangvin (p=0.012, respectiv p=0.001), la

fel și pentru cele susceptibile la INTESTI (p=0.022, respectiv p=0.013). Inclusiv

susceptibilitățile la PHAGYO și PHAGESTI sunt influențate de produsul patologic, fiind

semnificativ statistic mai susceptibile cele de la nivel nazal, față de cele care provin de la nivel

cutanat sau torent sangvin (p=0.010, p=0.003; p=0.010, p=0.001). Și susceptibilitatea la

STAPHYLOCOCCAL este mai crescută în cazul tulpinilor provenite de la nivel nazal vs.

cutanat/torent sangvin. (p=0.035, p=0.011).

Pentru toate cele 5 mixturi fagice (PYO, INTESTI, PHAGYO, PHAGESTI,

STAPHYLOCOCCAL) sensibilitatea la meticilină a fost semnificativ statistic corelată cu

susceptibilitatea la fagi (p=0.003, p=0.000, p=0.016, p=0.016, p=0.009). Sensibilitatea la

eritromicină s-a corelat semnificativ statistic cu susceptibilitatea pentru PHAGYO (p=0.000) și

cu cea pentru PHAGESTI (p=0.038).

Susceptibilitatea la PYO a fost corelată cu prezența S. aureus (p=0.000), absența genei

SCCmecVJ1 (p=0.002), valori normale ale proteinei C reactive (p=0.048). De asemenea,

susceptibilitatea la INTESTI a fost corelată cu prezența S. aureus (p=0.002) și absența genei

SCCmecVJ1 (p=0.001). Inclusiv susceptibilitățile la PHAGYO și STAPHYLOCOCCAL sunt

corelate cu prezența S. aureus (p=0.031, respectiv p=0.040), iar cele la PHAGYO și PHAGESTI

sunt corelate favorabil cu Carmeli 1 (p=0.022).

Un total de 82 de tulpini au fost utilizate pentru testarea susceptibilității la INTESTI în

mediul lichid, fiind evaluate diluțiile binare de PYO 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea

evaluată atât macroscopic cât și prin cultivarea a 10 µL din fiecare godeu pe mediu solid a fost

semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de martorul

pozitiv (p=0.000).

În experimentul INTESTI (EI), creșterea bacteriană în godeul cu diluția INTESTI 1/2 a

fost corelată cu rezistența la meticilină (p=0.021), rezistența la meticilină fiind factor de risc

pentru creșterea bacteriană la această diluție (OR=2.636, CI95%= 1.060 – 6.560).

Un total de 79 de tulpini au fost folosite pentru testarea susceptibilității la PYO în mediul

lichid fiind evaluate diluțiile de PYO 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea evaluată ca și în

EI a fost semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de

martorul pozitiv (p=0.000). În experimentul PYO (EP), creșterea în niciuna dintre diluții, nu se

corelează semnificativ statistic cu profilul de rezistență la meticilină.

În experimentul INTESTI, 12.2% dintre tulpini nu au dezvoltat biofilm, 4.9% au

dezvoltat biofilm slab, 32.9% biofilm mediu, iar 50.0% biofilm puternic. Un total de 36 tulpini

au avut capacitatea de a forma biofilm cantitativ peste tulpina ATCC folosită. În momentul

adăugării diluției 1/64, 52 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/64 peste valoarea tulpinei ATCC

în aceleași condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 62 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/2 peste

ATCC. Adăugarea bacteriofagilor INTESTI în diverse diluții a inhibat semnificativ statistic

formarea biofilmului (p=0.004). (Tabel 13. 1)

Adăugarea diluției de INTESTI 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea

biofilmului (p=0.000), un număr de 34 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au

avut această proprietate inhibată la adăugarea fagilor.

Tabel 13. 1 Mediana valorilor OD492nm biofilm EI și comparație cu OD492nm cultură

Mediana (IQ25, IQ75) Z (Wilcoxon Signed Ranks Test)* p-value

OD_Cultură 0.17575 (0.14375, 0.21575) NA NA

OD_1/64 0.16500 (0.13075, 0.18825) -2.888 0.004

OD_1/32 0.15200 (0.12775, 0.17575) -4.752 0.000

OD_1/16 0.16800 (0.12275, 0.19325) -4.234 0.000

OD_1/8 0.15700 (0.11725, 0.18150) -4.632 0.000

OD_1/4 0.15600 (0.11638, 0.18400) -4.995 0.000

OD_1/2 0.11300 (0.10100, 0.13188) -6.654 0.000

* comparație între mediana densității optice cultură și mediana densității optice a diluțiilor de

fagi. Cifre aldine (bold) – rezultat semnificativ statistic

În experimentul EI a fost evaluat ROC pentru 29 tulpini non-susceptibile la INTESTI și

53 susceptibile. Valoarea ROC la diluția 1/2 a fost semnificativ diferită între cele două grupuri,

fiind mai crescută în grupul susceptibil față de cel non-susceptibil (mean ranks 47.92 vs. 29.76,

U=428, p=0.001).

Pentru a înlătura interferența scăderii valorilor doar datorită distrugerii bacteriene de către

bacteriofagi, am analizat statistic tulpinile nonsusceptibile la INTESTI pe mediu solid (absența

zonelor de liză pe mediu solid). Evaluând mediana densității optice cultură față de densitățile

optice ale diluțiilor de fagi, am observat că aceasta a scăzut semnificativ statistic pentru diluțiile

1/32 și 1/2 (p=0.042, respectiv p=0.003).

Am decis și evaluarea influenței fagilor asupra biofilmului exclusiv pentru tulpinile la

care a fost evidențiată creșterea bacteriană la diluția INTESTI 1/2. Formarea biofilmului a fost

semnificativ influențată de toate diluțiile, mai puțin 1/64, chiar dacă în godeuri a fost identificată

creșterea planktonică (p=0.002, p=0.012, p=0.005, p=0.005, respectiv p=0.000).

Aceste rezultate ne ajută să concluzionăm că indiferent de susceptibilitatea tulpinilor la

fagi sau de rata creșterii planktonice, formarea biofilmului este inhibată de prezența diverselor

diluții de bacteriofag INTESTI.

În experimentul PYO, 7.6% dintre tulpini nu au dezvoltat biofilm, 2.5% au dezvoltat

biofilm slab, 35.4% biofilm mediu, iar 54.4% biofilm puternic. Un total de 49 tulpini au avut

capacitatea de a forma biofilm cantitativ peste tulpina ATCC folosită. În momentul adăugării

diluției 1/64, 40 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/64 peste cea a tulpinii ATCC în aceleași

condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 74 dintre tulpini au avut valoarea peste ATCC.

Adăugarea diluției de PYO 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea biofilmului

(p=0.000), un număr de 33 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au avut această

proprietate inhibată de adăugarea fagilor. Adăugarea bacteriofagilor PYO în diverse diluții a

inhibat semnificativ statistic formarea biofilmului (p=0.001). (Tabel 13. 2)

Tabel 13. 2 Mediana valorilor OD492nm biofilm EP și comparație cu OD492nm cultură

Mediana (IQ25, IQ75) Z (Wilcoxon Signed Ranks Test)* p-value

OD_Cultură 0.19600 (0.13400, 0.22400) NA NA

OD_1/64 0.1600 (0.1310, 0.1900) -5.395 0.000

OD_1/32 0.16381 (0.12700, 0.18450) -4.859 0.001

OD_1/16 0.16700 (0.12700, 0.20200) -3.205 0.000

OD_1/8 0.14600 (0.12500, 0.19000) -5.355 0.000

OD_1/4 0.1490 (0.1210, 0.1850) -5.154 0.000

OD_1/2 0.11850 (0.10500, 0.14400) -6.278 0.000



În experimentul PYO au fost folosite 22 tulpini nonsusceptibile la PYO și 57 susceptibile.

Valoarea ROC la diluția 1/2 a fost semnificativ diferită între cele două grupuri, fiind mai crescută

în grupul susceptibil față de cel non-susceptibil (mean ranks 43.65 vs. 30.55, U=419, p=0.023)

Pentru a înlătura posibilitatea scăderii biofilmului doar datorită distrugerii bacteriene de

către bacteriofagi am evaluat doar tulpinile nonsusceptibile la PYO pe mediu solid (absența

zonelor de liză pe mediu solid). Evaluând mediana densității optice cultură comparativ cu

densitățile optice ale diluțiilor de fagi, am observat că aceasta a scăzut semnificativ statistic

pentru diluțiile 1/64, 1/8, 1/4 și 1/2 (p=0.018, p=0.024, p=0.035, respectiv p=0.038).

Am decis evaluarea influenței fagilor asupra biofilmului exclusiv pentru tulpinile la care

a fost evidențiată creșterea bacteriană la diluția PYO 1/2. Formarea biofilmului a fost

semnificativ influențată de diluțiile 1/64, 1/32, 1/8, 1/4, 1/2, chiar dacă în godeuri a fost

identificată creșterea planktonică (p=0.000, p=0.002, p=0.000, p=0.001, respectiv p=0.000).

Aceste rezultate ne ajută să concluzionăm că indiferent de susceptibilitatea tulpinilor la

fagi sau de rata creșterii planktonice, formarea biofilmului este inhibată de prezența diverselor

diluții de bacteriofag PYO.

Nu s-a înregistrat corelație între diversele gene de rezistență sau virulență și formarea

biofilmului în niciunul dintre experimente, cel mai probabil din cauza numărului redus de tulpini

pentru care am realizat evaluare genotipică.

Formarea biofilmului sau gradarea acestuia nu sunt dependente de specie sau de scorul

Carmeli în niciunul dintre experimente. Nu am găsit corelații semnificative statistic pentru

formarea biofilmului și factorii de virulență (lipaza, lecitinază) în niciunul dintre experimente.

În experimentul care evaluează efectul asupra biofilmului preformat pe 24 tulpini, am

observat că adăugarea bacteriofagilor (PYO și INTESTI) după 24 ore de creștere bacteriană au

modificat valorile OD492nm semnificativ statistic (p=0.009, respectiv 0.000), fapt ce conclude că

bacteriofagii au capacitatea de a distruge biofilmul preformat atât prin infectarea celulelor

bacteriene din stratul superficial al biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, dar și

prin sinteza de depolimeraze care ajută la penetrarea fagilor profund în biofilm.(52, 53)

In vitro – Studiul Pseudomonas aeruginosa

Lotul de studiu a inclus 44 pacienți cu infecții cu P. aeruginosa, cu o mediană a vârstei

de 64 ani (48.25 ani, 73.75 ani). A fost evaluat scorul Carmeli, 59.1% dintre pacienții fiind

pacienți Carmeli 3. Dintre pacienții imunodeprimați, 26.9% au avut ca și cauză de imunodepresie

diabetul zaharat. Alte cauze de imunodepresie au fost infecția HIV și diversele neoplazii.

Un total de 38.6% pacienți au prezentat infecții plurimicrobiene. Cel mai frecvent, P.

aeruginosa a fost asociat cu Proteus spp., E. coli, S. aureus, Candida spp., etc. Studiile au

dovedit că P. aeruginosa are capacitatea de inhibare a biofilmului produs de stafilococ prin

producerea moleculelor specifice de semnal QS și distrugere a biofilmului prin producerea

EPS.(54) Alte studii dovedesc interacțiunea dintre piocianic și stafilococ, tipul sălbatic PAO1

stimulând formarea microcoloniilor de stafilococ.(55) Majoritatea pacienților cu infecții

plurimicrobiene au fost pacienți Carmeli 3.

Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate au fost preponderent de la nivel urinar

(38.6%), urmate de cele de la nivel cutanat (34.1%), spută (15.9%), etc.

Toate tulpinile testate au fost sensibile la colistin (41/41) și nici una dintre tulpinile

testate la cotrimoxazol (0/11). A fost înregistrată rezistență crescută la majoritatea antibioticelor

52.6% la cefemip, 51.4% la ciprofloxacin, 43.2% la imipenem, 46.1% la meropenem, 47.5% la

ceftazidim și piperacilină/tazobactam, 48.6% la piperacilină și gentamicină.

Tulpinile recoltate de la nivel urinar și cutanat față de cele din spută avut profil de

rezistență mai înalt la piperacilină (60%, 50% vs. 0%, p=0.048) și piperacilină/tazobactam

(62.5%, 46.2% vs. 0%, p=0.044), afirmație care nu se corelează cu literatura, tulpinile izolate din

pneumoniile de ventilație fiind cele mai rezistente, iar cele din infecțiile postchirurgicale cele

mai sensibile.(14) Cel mai probabil rezultatele studiului nostru nu se corelează cu cele din

literatură deoarece nu am avut cazuri din secția de terapie intensivă, cu pacienți ventilați

mecanic.

Nonsusceptibilitatea la bacteriofagii PYO și INTESTI a fost mai scăzută față de

rezistența la antibiotice (cefepim, ciprofloxacin, imipenem, meropenem, ceftazidim,

piperacilină), fiind 31.8%, 34.1% vs. 52.6%, 51.4%, 43.2%, 46.1%, 47.5%, 48.6%.

Nonsusceptibilitatea la PHAGYO (63.6%) și PHAGESTI (63.6%) a fost mai crescută față de

rezistența la antibiotice.

Așa cum tulpinile din spută aveau sensibilitate 100% la piperacilină și

piperacilină/tazobactam, așa au avut și 100% susceptibilitate la bacteriofagii PYO și INTESTI.

Susceptibilitatea la bacteriofagi a fost corelată semnificativ statistic cu situsul din care a fost

recoltată tulpina, fiind 100% în spută atât pentru PYO cât și pentru INTESTI, față de 53.3%

(p=0.028) pentru PYO și 60% (p=0.05) pentru INTESTI la nivel cutanat.

Susceptibilitatea la PYO este corelată semnificativ statistic cu profilul de rezistență al

unor antibiotice: cefepim (p=0.033); imipenem (p=0.001), meropenem (p=0.008), gentamicină

(p=0.003), ciprofloxacin (p=0.013). Susceptibilitatea la INTESTI este corelată semnificativ

statistic cu profilul de rezistență al unor antibiotice: cefepim (p=0.033), imipenem (p=0.001),

meropenem (p=0.008), gentamicină (p=0.003), ciprofloxacin (p=0.013). Inclusiv

susceptibilitatea la PHAGYO este corelată semnificativ statistic cu profilul de rezistență al unor

antibiotice: imipenem (p=0.002), meropenem (p=0.002), gentamicină (p=0.030), ciprofloxacin

(p=0.008).

Un total de 34 de tulpini au fost folosite pentru testarea susceptibilității la INTESTI în

mediul lichid fiind evaluate diluțiile de INTESTI 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea

evaluată atât macroscopic cât și microscopic prin cultivarea a 10 µL din fiecare godeu pe mediu

solid a fost semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de

martorul pozitiv (p=0.000).

Un total de 33 de tulpini au fost folosite pentru testarea susceptibilității la PYO în mediul

lichid fiind evaluate diluțiile de PYO 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea evaluată ca și în

EI a fost semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de

martorul pozitiv (p=0.000).

În EI, din cele 34 tulpini testate, 76.5% au dezvoltat biofilm puternic, 20.6% dintre

tulpini au dezvoltat biofilm moderat, iar 2.9% nu au avut capacitatea de a forma biofilm. Un total

de 6 tulpini au avut capacitatea de a forma biofilm cantitativ peste valoarea ATCC. În momentul

adăugării diluției 1/64, 6 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/64 peste valoarea tulpinei ATCC

în aceleași condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 26 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/2 peste

ATCC.

Adăugarea diluției de INTESTI 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea

biofilmului (p=0.001), un număr de 11 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au

avut această proprietate inhibată la adăugarea fagilor.

Adăugarea bacteriofagilor INTESTI în diverse diluții a inhibat semnificativ statistic

formarea biofilmului (p=0.001) prin modificarea semnificativă a medianelor densităților optice.

(Tabel 13. 3)

Tabel 13. 3 Mediana valorilor OD492nm biofilm EI și comparație cu OD492nm cultură

Mediana (IQR) Z (Wilcoxon Signed Ranks Test)* p-value

OD_Cultură 0.24050 (0.144) NA NA

OD_1/64 0.15800 (0.059) -3.915 0.000

OD_1/32 0.16000 (0.060) -3.980 0.000

OD_1/16 0.17800 (0.085) -3.563 0.000

OD_1/8 0.17250 (0.106) -3.980 0.000

OD_1/4 0.18850 (0.110) -3.243 0.001

OD_1/2 0.13000 (0.079) -4.079 0.000



În EI, formarea biofilmului nu a fost corelată cu scorul Carmeli, dar gradarea biofilmului

a fost corelată semnificativ statistic cu acest scor, astfel: pacienții Carmeli 3 au format în

proporție de 70% biofilm puternic față de 25% biofilm moderat (p=0.004); iar pacienții Carmeli

2, 84.6% biofilm puternic vs. 15.4% biofilm moderat (p=0.001). Formarea biofilmului puternic a

fost corelată semnificativ statistic cu localizarea infecției, 83.3% tulpini cutanate formează

biofilm puternic 42.9% din cele din spută (p=0.067). Toate tulpinile recoltate din secreție

mamară, secreție otică și lichid articular, au format biofilm puternic.

În EP, din cele 33 de tulpini testate, 78.8% au dezvoltat biofilm puternic, 18.1% biofilm

moderat, iar 3.1% biofilm slab. Un total de 17 tulpini au avut capacitatea de a forma biofilm

cantitativ peste valoarea ATCC. În momentul adăugării diluției 1/64, 10 dintre tulpini au avut

valoarea OD_1/64 peste valoarea ATCC în aceleași condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 32

dintre tulpini au avut valoarea OD_1/2 peste ATCC.

Adăugarea diluției de PYO 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea biofilmului

(p=0.019), un număr de 5 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au avut această

proprietate inhibată la adăugarea fagilor.

Adăugarea bacteriofagilor PYO în diverse diluții a inhibat semnificativ statistic formarea

biofilmului (p=0.001) prin modificarea semnificativă a medianelor densităților optice. (Tabel 13.

4)

Pentru 19 tulpini a fost evaluată capacitatea bacteriofagilor PYO și INTESTI la diluția 1/4 să

distrugă biofilmului deja format.

Adăugarea bacteriofagilor INTESTI după 24 ore de creștere bacteriană au modificat

valorile OD492nm semnificativ statistic (p=0.011) fapt ce conclude că bacteriofagii INTESTI au

capacitatea de a distruge biofilmul preformat atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul

superficial al biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, dar și prin sinteza de liaze

de către bacteriofagi, care au rol în penetrarea biofilmului, dezorganizarea și distrugerea

acestora.(52, 53)

Tabel 13. 4 Mediana valorilor OD492nm biofilm EP și comparație cu OD492nm cultură

Mediana (IQR) Z (Wilcoxon Signed Ranks Test)* p-value

OD_Cultură 0.22150 (0.111) NA NA

OD_1/64 0.15450 (0.052) -3.249 0.001

OD_1/32 0.15300 (0.052) -4.086 0.000

OD_1/16 0.16150 (0.078) -3.813 0.000

OD_1/8 0.15900 (0.070) -3.343 0.001

OD_1/4 0.15700 (0.066) -3.497 0.000

OD_1/2 0.13000 (0.051) -4.343 0.000



In vivo – proiect pilot

Au fost tratați în clinică 6 pacienți cu terapie combinată bacteriofagi și antibiotice. Toate

cele 6 cazuri au dovedit siguranța administrării bacteriofagilor, neînregistrându-se reacții adverse

locale sau sistemice legate de aceștia.

Pentru 5 pacienți culturile au devenit negative în timpul terapiei, redevenind pozitive

după încetarea acesteia, astfel putem conclude că tratamentul a fost inclusiv eficient prin

inhibarea creșterii bacteriene, dar nu a avut eficiență susținută după întreruperea terapiei.

Toate cazurile m-au ajutat să înțeleg importanța cunoașterii atât a caracterelor genotipice

cât și fenotipice pentru rezistența la antibiotice și virulență pentru a putea decide managementul

terapeutic al pacienților cu opțiuni terapeutice limitate.

Pentru un caz am reușit să obținem răspuns terapeutic susținut atât prin adăugarea

bacteriofagilor la terapia antibiotică, cât și prin buna colaborare interdisciplinară. Pacienta a fost

un caz dificil datorită statusului polialergic, dar și a tijelor metalice de susținere a coloanei care

nu au putut fi îndepărtate. Pentru a nu compromite terapia cu bacteriofagi și a nu risca ca

pacienta plurialergică, cu capacitate de sensibilizare rapidă la orice substanță, să dezvolte alergie

și la bacteriofagi am decis administrarea acestora doar topic.

Consider că răspunsul bacteriologic susținut s-a datorat bacteriofagilor deoarece terapia

cu cefuroxim nu a reușit sterilizarea culturilor, acestea menținându-se pozitive pentru S. aureus.

După adăugarea bacteriofagilor, inflamația de la nivel cutanat și subcutanat s-a remis

considerabil, motiv ce accentuează și mai mult rolul bacteriofagilor. Din cunoștințele mele acesta

este primul caz tratat cu succes în Romania prin asocierea bacteriofagi – antibiotice din anii ’70

până în prezent.

În infecțiile greu de tratat datorită prezenței germenilor multirezistenți, a infecțiilor

multibacteriene, a germenilor cu capacitate de formare a biofilmului pe material viu sau inert și

cu capacitate de invazie intracelulară sau a pacienților greu de tratat datorită patologiei asociate,

a prezenței corpilor străini sau a localizării infecției în locuri greu de sterilizat, antibioticele au

nevoie de un adjuvant pentru a reuși să distrugă focarul infecțios.

Soluția propusă de mine prin această teză este reprezentată de bacteriofagi, studiile pe

care intenționez să le dezvolt în continuare vor avea rolul de a identificat bacteriofagii specifici

regiunii noastre și de a identifica alte tehnici de administrare ai bacteriofagilor (ex. atașarea

bacteriofagilor de nanoparticule) (56).

Concluzii

IN VITRO

Staphylococcus spp.

1. Cel mai frecvent agent etiologic din genul Staphylococcus a fost S. aureus (p=0.000),

producând infecții cutanate, urmate de bacteriemii și infecții respiratorii.

2. Evaluată fenotipic, rata potențială de virulență a S. aureus a fost mai înaltă comparativ cu

SCN, atât prin producerea de hemoliză (p=0.026), cât și prin producera de lecitinază

(p=0.000). Clasamentul se inversează în cazul profilului fenotipic de rezistență

antimicrobiană, când stafilococii coagulazo-negativi au rezistență semnificativ mai

crescută față de S. aureus pentru: levofloxacin (p=0.023), acid fusidic (p=0.000),

gentamicină (p=0.000), teicoplanină (p=0.000) și cotrimoxazol (p=0.000).

3. Tulpinile izolate din hemoculturi au profil de rezistență pentru meticilină (p=0.012),

levofloxacin (p=0.009), eritromicină (p=0.018) mai crescut față de cele izolate de la nivel

nazal. Inclusiv rezistența la clindamicină (p=0.000) și eritromicină (p=0.003) este

semnificativ mai crescută în rândul tulpinilor de la nivel cutanat comparativ cu cele

izolate de la nivel nazal.

4. Am identificat corelație între rezistența la meticilină și prezența genelor ccrB2 (p=0.034)

sau SCCmecVJ1 (p=0.000). Rezistența la eritromicină și clindamicină s-a corelat cu

prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.034, respectiv 0.041), dar și cu absența genei hlg

(p=0.033, respectiv p=0.019). Rezistența la levofloxacin se corelează cu absența genelor

clfA și clfB (p=0.048).

5. Din cele 62 microorganisme, 17.6% tulpini Staphylococcus spp. meticilino-sensibile au

prezentat gena mecA, neexprimată fenotipic în absența supresiei antibioticelor pentru a-și

conserva energia. Același fenomen se întâmplă și în cazul genei ermA.

6. În rândul tulpinilor noastre am observat variabilitatea elementelor SCCmec ce pot

determina rezistența la meticilină, astfel simpla prezență a casetei SCCmec nu conduce la

argumentarea severității unui proces infecțios cu această etiologie.

7. Cele mai frecvente gene de virulență întâlnite în acestă cercetare sunt clfA/B și hlg, fiind

gene extrem de importante în procesul de aderare, colonizare (gena pentru clumping

factor A/B), dar și în procesul de liză a hematiilor și leucocitelor prin producerea de către

gena hlg a unei leucocidine (γ hemolizină).

8. Bacteriofagii s-au dovedit mult mai eficienți în realizarea bacteriolizei față de stafilococul

izolat de la nivel nazal comparativ cu cei izolați de la nivel cutanat sau din hemoculturi.

Prima opțiune de verificare a sensibilității este PYO, urmată de INTESTI, PHAGYO,

PHAGESTI și STAPHYLOCOCCAL.

9. Portajul nazal de stafilococ meticilino-rezistent poate beneficia de decontaminare prin

utilizarea de bacteriofagi, concluzie de luat în considerație în special în secțiile de Terapie

Intensivă în vederea diminuării portajului nazal de MRSA la personalul medico-sanitar

de îngrijire.

10. Sensibilitatea la eritromicină se corelează cu susceptibilitatea la PHAGYO și

PHAGESTI (p=0.000, respectiv p=0.038), în timp ce sensibilitatea la meticilină se

corelează cu toți bacteriofagii testați (p=0.003, p=0.000, p=0.016, p=0.016, p=0.009).

Rezultă că în context clinic, dacă dorim să testăm utilizarea fagilor în tratamentul

pacienților cu infecții stafilococice, ne putem orienta după sensibilitatea celor două

antibiotice.

11. La un stafilococ auriu, fără gena SCCmecVJ1 la nivelul casetei SCCmec, cu infecție

neivazivă (proteina C reactivă normală) putem utiliza cu șanse mari de succes PYO sau

INTESTI (p=0.048). Din punct de vedere practic un pacient cu scorul Carmeli 1 are o

rată de răspuns favorabilă la terapia cu PHAGYO și PHAGESTI (p=0.022).

12. Adăugarea bacteriofagilor atât PYO cât și INTESTI în orice diluție a inhibat semnificativ

statistic formarea biofilmului (p=0.004, p=0.001).

13. Rata de scădere a valorilor biofilmului între lotul susceptibil vs. non-susceptibil la

INTESTI sau PYO în momentul adăugării diluției 1/2 a fost mai crescută în primul lot

față de al doilea (mean ranks 47.92 vs. 29.76, U=428, p=0.001; respectiv mean ranks

43.65 vs. 30.55, U=419, p=0.023). Rezultă că bacteriofagii diminuează dezvoltarea

biofilmului indiferent de nivelul de susceptibilitate.

14. Expunera stafilococului la bacteriofagi, indiferent de profilul de susceptibilitate, reduce

agresivitatea prin diminuarea capacității de formare de biofilm și nu neapărat prin liză

bacteriană.

15. Biofilmul preformat a fost semnificativ diminuat după adăugarea bacteriofagilor PYO și

INTESTI (p=0.009, respectiv 0.000), atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul

superficial al biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, cât și prin sinteza de

depolimeraze care ajută la penetrarea fagilor în stratul profund al biofilmului.

16. Evaluarea la 48, respectiv 72 de ore a magnitudinii biofilmului arată în mod clar

diminuarea grosimii acestuia la 72 ore în comparație cu 48 ore (p=0.000).

Pseudomonas aeruginosa

17. P. aeruginosa a fost mai frecvent incriminat ca și agent etiologic în infecțiile urinare

(38.6%) și cutanate (34.1%). Tulpinile izolate de la nivel urinar și cutanat au avut profil

de rezistență mai crescut față de cele din spută, atât pentru piperacilină (p=0.048), cât și

piperacilină/tazobactam (p=0.044).

18. S-a înregistrat susceptibilitate de 16.2% la bacteriofagul STAPHYLOCOCCAL, cu toate

că acesta conține doar bacteriofagi pentru Staphylococcus spp. Cel mai probabil acesta

acționează pe un receptor întâlnit și la unele tulpini de P. aeruginosa. Sunt necesare studii

de secvențiere atât a bacteriofagilor cât și a tulpinilor susceptibile la

STAPHYLOCOCCAL.

19. Susceptibilitatea la bacteriofagi PYO și INTESTI se corelează cu situsul de recoltare al

tulpinilor bacteriene (p=0.028, respectiv 0.05), dar și cu profilul de rezistență la

antibiotice: cefepim (p=0.033); imipenem (p=0.001), meropenem (p=0.008), gentamicină

(p=0.003), ciprofloxacin (p=0.013). Susceptibilitatea la PHAGYO se coreleză

semnificativ statistic cu profilul de rezistență al unor antibiotice: imipenem (p=0.002),

meropenem (p=0.002), gentamicină (p=0.030), ciprofloxacin (p=0.008). Rezultă că în

context clinic dacă dorim să testăm utilizarea fagilor în tratamentul pacienților cu infecții

stafilococice, ne putem orienta după sensibilitatea la antibiotice.

20. Adăugarea bacteriofagilor INTESTI sau PYO în diverse diluții a inhibat semnificativ

statistic formarea biofilmului (p=0.001) prin modificarea semnificativă a medianelor

densităților optice.

21. Biofilmul preformat a fost semnificativ diminuat după adăugarea bacteriofagilor

INTESTI (p=0.011) atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul superficial al

biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, cât și prin sinteza de liaze care au

rol în penetrarea biofilmului, dezorganizarea și distrugerea acestora.

22. Evaluarea la 48, respectiv 72 de ore a magnitudinii biofilmului arată în mod clar

diminuarea grosimii acestuia la 72 ore în comparație cu 48 ore (p=0.011).

23. Bacteriofagii par a reprezenta opțiuni fezabile în profilaxia infecțiilor peri-protetice, prin

rolul lor demonstrat de inhibare a formării biofilmului. Aceștia ar putea fi utilizați în

prevenirea recăderilor din osteomielită prin diminuarea biofilmului local via instilații cu

bacteriofagi prin traiectul de fistulă.

24. În contextul unei determinări bacteriene pe material protetic utilizarea bacteriofagilor

poate fi benefică prin diminuarea biofilmului preformat și expunerea germenilor la

antibioticele sistemice.

25. Pentru ambele genuri bacteriene, bacteriofagii georgieni au un procent satisfăcător de

acțiune asupra tulpinilor autohtone, dar sunt necesare studii ulterioare de evaluare a

efectului bacteriofagilor izolați din România.

IN VIVO

26. Toate cele 6 cazuri tratate au dovedit siguranța terapiei, neînregistrându-se reacții adverse

locale sau sistemice corelate cu fagoterapia.

27. La 5 din 6 cazuri s-a înregistrat inițial răspuns bacteriologic favorabil prin negativarea

culturilor, urmat după oprirea terapiei cu bacteriofagi de repozitivarea creșterii

bacteriene.

28. Unicul răspuns bacteriologic susținut, a fost al pacientei pluri-alergice care datorită

statusului alergic, dar și a tijelor metalice de susținere a coloanei care nu au putut fi

îndepărtate a necesitat o alternativă de tratament pentru vindecare. Pentru a nu

compromite terapia cu bacteriofagi și a nu risca ca pacienta plurialergică, cu capacitate de

sensibilizare rapidă la orice substanță, să dezvolte alergie și la bacteriofagi, am decis

administrarea acestora doar topic.

29. Consider că răspunsul susținut s-a datorat bacteriofagilor deoarece terapia cu cefuroxim

nu a reușit sterilizarea culturilor, acestea menținându-se pozitive pentru S. aureus. După

adăugarea bacteriofagilor, inflamația de la nivel cutanat și subcutanat s-a remis

considerabil, motiv ce accentuează și mai mult rolul bacteriofagilor.

30. În infecțiile greu de tratat din cauza prezenței germenilor multirezistenți, a infecțiilor

multibacteriene, a germenilor cu capacitate de formare a biofilmului pe material viu sau

inert și cu capacitate de invazie intracelulară sau a pacienților greu de tratat în contextul

patologiei asociate, a prezenței corpilor străini sau a localizării infecției în locuri greu de

sterilizat, antibioticele au nevoie de un adjuvant pentru a reuși să distrugă focarul

infecțios.

31. Un rol important într-un management terapeutic corect la pacienții cu infecții dificil de

tratat îl are și colaborarea interdisciplinară.

32. Aceste studii constituie piatra de temelie pentru viitoarele cercetări cu privire bacteriofagi

și fagoterapie în România.

33. Datele prezentate dovedesc importanța cunoașterii profilului complet, atât genotipic cât și

fenotipic, al bacteriei incriminate pentru a putea decide managementul terapeutic corect

al pacienților cu opțiuni terapeutice limitate.

Referințe

1. Miller LG, Kaplan SL. Staphylococcus aureus: a community pathogen. Infectious disease clinics of North America. 2009;23(1):35-52. 2. Song KH, Kim ES, Sin HY, Park KH, Jung SI, Yoon N, et al. Characteristics of invasive Staphylococcus aureus infections in three regions of Korea, 2009-2011: a multi-center cohort study. BMC infectious diseases. 2013;13:581. 3. Rupp M, Fey P. Staphylococcus epidermidis and Other Coagulase-Negative Staphylococci

Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. Eight edition: Churchill Livingstone Elsevier; 2015. p. 2272-82. 4. Kahl BC. Small colony variants (SCVs) of Staphylococcus aureus--a bacterial survival strategy. Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. 2014;21:515-22. 5. Amato SM, Fazen CH, Henry TC, Mok WW, Orman MA, Sandvik EL, et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in microbiology. 2014;5:70. 6. Proctor RA, Kriegeskorte A, Kahl BC, Becker K, Loffler B, Peters G. Staphylococcus aureus Small Colony Variants (SCVs): a road map for the metabolic pathways involved in persistent infections. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2014;4:99. 7. Sifri CD, Baresch-Bernal A, Calderwood SB, von Eiff C. Virulence of Staphylococcus aureus small colony variants in the Caenorhabditis elegans infection model. Infection and immunity. 2006;74(2):1091-6. 8. Proctor RA, von Eiff C, Kahl BC, Becker K, McNamara P, Herrmann M, et al. Small colony variants: a pathogenic form of bacteria that facilitates persistent and recurrent infections. Nature reviews Microbiology. 2006;4(4):295-305. 9. Tande AJ, Osmon DR, Greenwood-Quaintance KE, Mabry TM, Hanssen AD, Patel R. Clinical characteristics and outcomes of prosthetic joint infection caused by small colony variant staphylococci. mBio. 2014;5(5):e01910-14. 10. Tuchscherr L, Kreis CA, Hoerr V, Flint L, Hachmeister M, Geraci J, et al. Staphylococcus aureus develops increased resistance to antibiotics by forming dynamic small colony variants during chronic osteomyelitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2015. 11. Schneider M, Muhlemann K, Droz S, Couzinet S, Casaulta C, Zimmerli S. Clinical characteristics associated with isolation of small-colony variants of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis. Journal of clinical microbiology. 2008;46(5):1832-4. 12. Hentzer M, Teitzel GM, Balzer GJ, Heydorn A, Molin S, Givskov M, et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of bacteriology. 2001;183(18):5395-401. 13. Painter KL, Krishna A, Wigneshweraraj S, Edwards AM. What role does the quorum-sensing accessory gene regulator system play during Staphylococcus aureus bacteremia? Trends in microbiology. 2014;22(12):676-85. 14. D’Agata E. Pseudomonas aeruginosa and Other Pseudomonas Species

Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases Eighth edition: Churchill Livingstone Elsevier; 2015. p. 2518-31. 15. Goncalves-de-Albuquerque CF, Silva AR, Burth P, Rocco PR, Castro-Faria MV, Castro-Faria-Neto HC. Possible mechanisms of Pseudomonas aeruginosa-associated lung disease. International journal of medical microbiology : IJMM. 2015. 16. Lopez D, Vlamakis H, Kolter R. Biofilms. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2010;2(7):a000398. 17. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nature reviews Microbiology. 2010;8(9):623-33. 18. Lazăr V. Aderența microbiană: Editura Academiei Române; 2003. 19. Allen RC, McNally L, Popat R, Brown SP. Quorum sensing protects bacterial co-operation from exploitation by cheats. The ISME journal. 2016.

20. Rutherford ST, Bassler BL. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2012;2(11). 21. Wei Y, Perez LJ, Ng WL, Semmelhack MF, Bassler BL. Mechanism of Vibrio cholerae autoinducer-1 biosynthesis. ACS chemical biology. 2011;6(4):356-65. 22. Jayaraman A, Wood TK. Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and disease. Annual review of biomedical engineering. 2008;10:145-67. 23. Thornton RB, Rigby PJ, Wiertsema SP, Filion P, Langlands J, Coates HL, et al. Multi-species bacterial biofilm and intracellular infection in otitis media. BMC pediatrics. 2011;11:94. 24. Mottola C, Mendes JJ, Cristino JM, Cavaco-Silva P, Tavares L, Oliveira M. Polymicrobial biofilms by diabetic foot clinical isolates. Folia microbiologica. 2016;61(1):35-43. 25. Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2000;44(6):1549-55. 26. Que Y, Moreillon P. Staphylococcus aureus(Including Staphylococcal ToxicShock Syndrome). Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases Eighth edition: Churchill Livingstone Elsevier; 2015. p. 2237-71. 27. Becker K, Heilmann C, Peters G. Coagulase-negative staphylococci. Clinical microbiology reviews. 2014;27(4):870-926. 28. Tuchscherr L, Bischoff M, Lattar SM, Noto Llana M, Pfortner H, Niemann S, et al. Sigma Factor SigB Is Crucial to Mediate Staphylococcus aureus Adaptation during Chronic Infections. PLoS pathogens. 2015;11(4):e1004870. 29. Dublanchet A. Des Virus Pour Combattre les Infections: La Phagothérapie: Favre; 2009.

p. 30. Sulakvelidze A, Alavidze Z, Morris JG, Jr. Bacteriophage therapy. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2001;45(3):649-59. 31. Miedzybrodzki R, Borysowski J, Weber-Dabrowska B, Fortuna W, Letkiewicz S, Szufnarowski K, et al. Clinical aspects of phage therapy. Advances in virus research. 2012;83:73-121. 32. Kutter E, Gvasalia G, Alavidze Z, Brewster E. Phage Therapy. In: Grassberger M, editor. Biotherapy – History, Principles and Practice: A Practical Guide to the Diagnosis and Treatment of Disease Using Living Organisms: Springer Science 2013. 33. http://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-nih-awards-will-support-development-therapeutic-alternatives-traditional-antibiotics. [cited 2016 25 Februarie]. 34. M Sefer MS. La 10 ani de la moartea profesorului Mihai Ciuca (18.VIII.1883-20.II.1969) Mihai Ciucă și studiul bacteriofagului, însemnări în caietele de lucru. Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia. 1979;XXIV(2). 35. Kutter EM, Kuhl SJ, Abedon ST. Re-establishing a place for phage therapy in western medicine. Future microbiology. 2015;10(5):685-8. 36. Chatterjee M, Anju CP, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. International journal of medical microbiology : IJMM. 2016;306(1):48-58. 37. Hyman P, Abedon ST. Bacteriophage host range and bacterial resistance. Advances in applied microbiology. 2010;70:217-48. 38. Negut AC, Sandulescu O, Popa M, Streinu-Cercel A, Alavidze Z, Berciu I, et al. Experimental approach for bacteriophage susceptibility testing of planktonic and sessile bacterial populations - Study protocol. Germs. 2014;4(4):92-6. 39. Waters EM, McCarthy H, Hogan S, Zapotoczna M, O'Neill E, O'Gara JP. Rapid quantitative and qualitative analysis of biofilm production by Staphylococcus epidermidis under static growth conditions. Methods in molecular biology. 2014;1106:157-66. 40. Herchline T. Staphylococcal Infections 2015 [cited 2015 25 Noiembrie]. Available from: http://emedicine.medscape.com/article/228816-overview#a5. 41. Staph infections [cited 2015 22 Decembrie]. Available from: http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/staph-infections/basics/definition/con-20031418.

http://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-nih-awards-will-support-development-therapeutic-alternatives-traditional-antibiotics

http://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-nih-awards-will-support-development-therapeutic-alternatives-traditional-antibiotics

http://emedicine.medscape.com/article/228816-overview#a5

http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/staph-infections/basics/definition/con-20031418

http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/staph-infections/basics/definition/con-20031418

42. Staphylococcal infections [cited 2015 23 Decembrie]. Available from: http://www.nhs.uk/conditions/Staphylococcal-infections/Pages/Introduction.aspx. 43. Meddeb, Zaraa I, Zribi M, Trojjet S, El Euch D, Mebazaa A, et al. [Staphylococcus aureus skin infections: a hospital study]. La Tunisie medicale. 2009;87(11):778-81. 44. Hill-Cawthorne GA, Hudson LO, El Ghany MF, Piepenburg O, Nair M, Dodgson A, et al. Recombinations in staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. PloS one. 2014;9(6):e101419. 45. Alonzo F, 3rd, Torres VJ. The bicomponent pore-forming leucocidins of Staphylococcus aureus. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2014;78(2):199-230. 46. Khoramian B, Jabalameli F, Niasari-Naslaji A, Taherikalani M, Emaneini M. Comparison of virulence factors and biofilm formation among Staphylococcus aureus strains isolated from human and bovine infections. Microbial pathogenesis. 2015;88:73-7. 47. McCarthy H, Rudkin JK, Black NS, Gallagher L, O'Neill E, O'Gara JP. Methicillin resistance and the biofilm phenotype in Staphylococcus aureus. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2015;5:1. 48. Adler A, Temper V, Block CS, Abramson N, Moses AE. Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus. Emerging infectious diseases. 2006;12(11):1789-90. 49. Wisniewska K, Piorkowska A, Kasprzyk J, Bronk M, Swiec K. Clonal distribution of bone sialoprotein-binding protein gene among Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infections. Folia microbiologica. 2014;59(6):465-71. 50. McClure JA, Conly JM, Lau V, Elsayed S, Louie T, Hutchins W, et al. Novel multiplex PCR assay for detection of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of methicillin-susceptible from -resistant staphylococci. Journal of clinical microbiology. 2006;44(3):1141-4. 51. Voyich JM, Otto M, Mathema B, Braughton KR, Whitney AR, Welty D, et al. Is Panton-Valentine leukocidin the major virulence determinant in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease? The Journal of infectious diseases. 2006;194(12):1761-70. 52. Azeredo J, Sutherland IW. The use of phages for the removal of infectious biofilms. Current pharmaceutical biotechnology. 2008;9(4):261-6. 53. Abedon ST. BACTERIOPHAGES AND BIOFILMS: ECOLOGY, PHAGE THERAPY, PLAQUES: Nova Science Publishers; 2011. 54. Qin Z, Yang L, Qu D, Molin S, Tolker-Nielsen T. Pseudomonas aeruginosa extracellular products inhibit staphylococcal growth, and disrupt established biofilms produced by Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 2009;155(Pt 7):2148-56. 55. Yang L, Liu Y, Markussen T, Hoiby N, Tolker-Nielsen T, Molin S. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS immunology and medical microbiology. 2011;62(3):339-47. 56. Shrestha A, Shi Z, Neoh KG, Kishen A. Nanoparticulates for antibiofilm treatment and effect of aging on its antibacterial activity. Journal of endodontics. 2010;36(6):1030-5.

http://www.nhs.uk/conditions/Staphylococcal-infections/Pages/Introduction.aspx

TEZĂ DE DOCTORAT · Mecanisme de rezistență la antibiotice ..... 34 Capitolul 8. Alte opțiuni...

Documents

Transcript of TEZĂ DE DOCTORAT · Mecanisme de rezistență la antibiotice ..... 34 Capitolul 8. Alte opțiuni...