UUNNIIVVEERRSSIITTAATTEEAA DDEE MMEEDDIICCIINNĂĂ ŞŞII FFAARRMMAACCIIEE DDIINN CCRRAAIIOOVVAA

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDIU IMUNOHISTOCHIMIC ŞI BIOCHIMIC AL

CĂILOR PATOGENICE IMPLICATE ÎN

HIPERCREŞTEREA GINGIVALĂ INDUSĂ DE

MEDICAMENTE

-- RREEZZUUMMAATT--

CCoonndduuccăăttoorr şşttiiiinnţţiiffiicc,,

PPrrooff.. uunniivv.. ddrr.. FFlloorriiccaa PPooppeessccuu

DDooccttoorraanndd,,

CCĂĂTTĂĂLLIINNAA GGAABBRRIIEELLAA PPIISSOOSSCCHHII

22001111

- 2 -

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

CUPRINS 3 ABREVIERI 5 INTRODUCERE 7 STADIUL CUNOAŞTERII 1. MORFOLOGIA ŞI HISTOFIZIOLOGIA GINGIEI 11

1.1. Structura mucoasei gingivale 11 1.2. Funcţiile mucoasei gingivale 16

2. HIPERCREŞTEREA GINGIVALĂ INDUSĂ DE MEDICAMENTE 18

2.1. Definirea conceptului de hipercreştere gingivală 18

2.2. Factori de risc în hipercreşterea gingivală indusă de medicamente 19

2.3. Importanţa clinică a hipercreşterii gingivale induse de medicamente 22

2.4. Mediatorii mecanismelor patogenice potenţiale ale hipercreşterii gingivale induse de medicamente

26

2.4.1. Matrix metaloproteinaze şi inhibitori tisulari naturali 27

2.4.2. Factori de creştere şi citokine 31

2.4.3. Efectorii tranziţiei epitelio-mezenchimale 34

2.4.4. Liganzii receptorilor Toll-Like 37

CONTRIBUŢII PERSONALE

3. MOTIVAREA STUDIULUI ŞI IPOTEZE DE LUCRU 43 4. OBIECTIVELE STUDIULUI 46 5. MATERIALE ŞI METODE 47

5.1. Materiale 47 5.1.1. Reactivi 47 5.1.2. Materiale biologice 48 5.1.3. Protocol de recoltare a probelor 49

5.2. Metode 50 5.2.1. Metode histologice 50 5.2.2. Metode imunohistochimice 57 5.2.3. Metode ELISA 66 5.2.4. Izolarea ARN pentru PCR şi metoda RT-PCR 68 5.2.5. Metode de analiză statistică 73

6. REZULTATE 74

6.1. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra morfologiei şi compoziţiei mucoasei gingivale

74

6.2. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra fenotipului fibroblastelor din mucoasa gingivală

81

6.3. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei unor mediatori ai balanţei sinteză/degradare a matricei extracelulare

90

6.4. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei unor mediatori ai tranziţiei epitelio-mezenchimale

98

6.5. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra localizării receptorilor de imunitate înnăscută Toll-like (TLR)

102

6.6. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei genice a TGFβ1, Smad3, TLR2 şi TLR4

106

- 3 -

6.7. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra nivelului salivar al unor mediatori ai balanţei sinteză/degradare a colagenului

107

7. DISCUŢII 111 7.1 Alterarea balanţei sinteză/degradare a componentelor MEC consecutiv influenţei unor factori de creştere profibrogenetici asupra echilibrului MMP/TIMP şi a

fenotipului fibroblastelor gingivale în HG indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de alciu tip dihidropiridină

113

7.2 Modularea fenomenului de tranziţie epitelio-mezenchimală în hipercreşterea gingivală indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină

124

7.3 Contribuţia receptorilor de imunitate înăscută TLR la medierea interrelaţiei inflamaţie-tranziţie epitelio-mezenchimală-fibroză gingivală indusă secundar acţiunii fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină

128

8. CONCLUZII 131 9. BIBLIOGRAFIE 133 10. LISTA PUBLICAŢIILOR 147

CUVINTE CHEIE: fenitoină, dihidropiridine blocante ale canalelor de calciu, hipercreştere

gingivală, TGF-β1, CTGF, MMP, TIMP, tranziţie epitelio-mezenchimală, TLR.

LISTĂ DE ABREVIERI

ABC Avidin Biotin Complex (complex avidină biotină) ADNc Acid dezoxiribonucleic complementar AEC Aminoetilcarbazol ARNm Acid ribonucleic mesager BMP Bone morphogenetic protein (proteină morfogenetică osoasă) BSA Bovine serum albumin (albumină serică bovină) CCN Cyr CTGF NOV CsA Ciclosporină A CTGF Connective tissue growth factor (factor de creştere a ţesutului conjunctiv) CYP Citocrom P450 DAB Diaminobenzidine tetrachloride (clorhidrat de diaminobenzidină) dsRNA double-stranded RNA (ARN dublu catenar) EDTA Acid etilendiaminotetraacetic EGF Epidermal Growth Factor (factor de creştere epidermică) EIA Enzyme immuno assay (tehnică imunoenzimatică) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (tehnică cu enzimă imunoadsorbită) FGF Fibroblast growth factor (factor de creştere a fibroblastelor) FITC Fluorescein isothiocianate (izotiocianat de fluoresceină) GAG Glicozaminoglicani GTP Guanozin trifosfat FCG Fluid crevicular gingival FIB-CL Fibroblast collagenase (colagenaza interstiţială) FSP-1 Fibroblast specific protein-1 (proteina specifică fibroblastelor-1) HG Hipercreştere gingivală HRP Horseradish Peroxidase (peroxidaza din hrean)

- 4 -

HE Hematoxilină eozină HLA Human Leukocyte Antigens (Antigene leucocitare umane) HSP Heat Shock Protein (proteină de şoc termic) IA Impregnaţie argentică Ig Imunoglobulină IGF Insulin-like growth factor (factor de creştere asemănător insulinei) IL Interleukină kDa kilodalton KGF Keratinocyte growth factor (factor de creştere a keratinocitelor) LPS lipopolizaharid LSAB Link Streptavin Biotin (punte streptavidină biotină) MAPK Mitogen activated protein kinase (protein kinază activată mitogen) MDR Multidrug resistance (rezitenţa la medicamente) MEC Matrice extracelulară MMP Matrix metalloproteinase (metaloproteinază matricială) NLR Nucleotide binding oligomerization domain like (asemănător domeniului de oligomerizare a nucleotidului) PAMPs Pathogen-associated molecular patterns (tipare moleculare asociate patogenilor) PAS Periodic Acid Schiff (Acid periodic Schiff) PCR Polymerase Chain Reaction (reacţie de polimerizare în lanţ) PDGF Platelet derived growth factor (factor de creştere derivat din plachete) pHPPH p-5-hydroxyphenyl-) 5-phenylhydantoin PMN polimorfonucleare RLR Retinoic acid inducible gene-like (asemănător genei induse de acidul retinoic) RT-PCR Real time polymerase chain reaction (reacţie de polimerizare în lanţ în timp real) SMA Smooth muscle actin (actina de muşchi neted) ssRNA Single stranded RNA (ARN monocatenar) TEM Tranziţie epitelio-mezenchimală TEnM Tranziţie endotelio-mezemchimală TME Tranziţie mezenchimal-epitelială TFS Tampon fosfat salin TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase (inhibitor tisular al metaloproteinazei matriciale) TGF-β1 Transforming growth factor- β1 (factor de creştere transformată beta) TMB - 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidină TNFα Tumor Necrosis Factor α (factor de necroză tumorală alfa) Tris – Tris-hidroximetilaminometan NF-kB Nuclear factor kappa B (factor nuclear kB) TLR Toll-like receptor VEGF Vascular endothelial growth factor (factor de creştere vasculară endotelială) ZO-1 Zonula occludens 1

- 5 -

INTRODUCERE De-a lungul timpului s-a dovedit că, pentru multe dintre medicamentele ce au fost supuse cu

foarte mare entuziasm uzului terapeutic, au apărut la intervale de timp variate efecte secundare nebănuite în studiile ce au precedat avizarea, prezenţa acestora cu incidenţă crescută determinând uneori scoaterea din uz a medicamentelor incriminate.

Hipercreşterea gingivală (HG) este una dintre reacţiile adverse induse de medicamente. Acest termen este recent folosit pentru a face referire la denumirile folosite anterior „hipertrofie” sau „hiperplazie gingivală”, dovedindu-se faptul că nici unul dintre aceşti termeni nu defineşte complet modificările care apar în cazul în care anumiţi factori de risc există, hipercreşterea mucoasei nefiind rezultatul unei creşteri a numărului de celule sau a dimensiunilor acestora ci, mai degrabă, o îngroşare a mucoasei datorită unei creşteri a volumului matricei extracelulare [Academy Report, 2004]. Printre factorii etiologici multipli care determină HG detectabilă la examenul clinic (ereditari, congenitali, afecţiuni sistemice, hormonali, genetici), medicamentele de tip anticonvulsivante (fenitoină, acid valproic, vigabatrină), antihipertensive (verapamil, diltiazem, dihidropiridine) şi imunosupresoare (ciclosporina A) reprezintă factori de risc importanţi, HG apărută ca efect secundar al tratamentului cu aceste medicamente având o incidenţă crescută.

Aspectele clinice şi histopatologice comparative ale HG induse de diferiţi factori de risc sunt prezentate pe larg în numeroase lucrări de specialitate [Marshall şi Bartold, 1999; Seymour şi colab., 2000; Kataoka şi colab., 2005; DeAngelo şi colab., 2007; Baniţă şi colab., 2008, 2011; Pisoschi şi colab., 2012]. Studiile au arătat că indiferent de factorul etiologic determinant, modificările histologice în HG sunt nespecifice (creşterea grosimii epiteliului şi depunerea masivă de ţesut conjunctiv, cu grade variabile de inflamaţie, la nivelul laminei propria). Se pare însă că acest aspect morfologic nespecific este datorat activării unor mecanisme moleculare diferite, sub acţiunea factorilor etiologici, ceea ce determină depunerea în exces a ţesutului conjunctiv.

Factorii biologici celulari şi moleculari implicaţi în dezechilibrul turnoverului ţesutului conjunctiv din HG par a acţiona via două căi patogenice diferite: (i) depunere în exces prin sinteză exagerată şi (ii) inhibarea degradării ţesutului conjunctiv. În ambele căi, rolul central este deţinut de fibroblaste şi de partenerii lor celulari (celulele epiteliale, proinflamatorii, endoteliale).

Cercetările din această lucrare s-au concentrat pe completarea datelor referitoare la mecanismele prin care agenţi farmacologici, precum anticonvulsivantul fenitoină şi antihipertensivele de tip blocante de canale de calciu din clasa dihidropiridinelor – nifedipină, amlodipină, deţin acţiune farmacodinamică modificată şi au ca efect secundar alterarea homeostaziei ţesutului conjunctiv gingival, din perspectiva unor căi patogenice care asociază interrelaţia factorilor de creştere mediatori ai fibrozei cu fenomenul de tranziţie epitelio-mezenchimală şi cu funcţionarea sistemelor de imunitate înnăscută.

Deoarece, datorită uşurinţei cu care poate fi colectată şi a compoziţiei asemănătoare cu cea a plasmei, în ultimii ani a devenit de interes utilizarea analizei salivei în vederea diagnosticării unor afecţiuni sistemice sau locale, studii de specialitate arată posibile relaţii între prezenţa şi concentraţia salivară a unor citokine şi factori de creştere şi factorii etiologici ce determină HG [Buduneli şi colab., 2001; Wright şi colab., 2001; Ruhl şi colab., 2004; Gurkan şi colab., 2008; Pisoschi şi colab., 2010].

Un astfel de studiu are ca impact imediat deschiderea unor noi direcţii de cercetare în domeniu şi, ca perspectivă pe termen lung, fundamentarea unor strategii terapeutice non-invazive prin administrarea unor topice locale care pot interfera în procesul de fibroză.

Această lucrare reprezintă eforturile combinate ale unui grup de persoane generoase, fără de care nu aş fi putut realiza cât mai mult din ceea ce mi-am propus. De aceea, aş dori să exprim recunoştinţa mea sinceră pentru timpul şi efortul pe care acestea mi le-au pus la dispoziţie.

De asemenea, menţionez că studiul a fost posibil şi datorită susţinerii financiare acordate de Consiliului Naţional al Cercetării Ştiinţifice în Invăţământul Superior proiectului ID_563, finanţat prin contractul nr.1137/2009, din al cărui colectiv de cercetare am făcut parte.

- 6 -

STADIUL CUNOAŞTERII

1. MORFOLOGIA ŞI HISTOFIZIOLOGIA GINGIEI

În acest capitol sunt descrise principalele caracteristici histologice, biochimice şi fiziologice a celor două ţesuturi principale din mucoasa gingivală – epiteliul şi lamina propria (Fig.1.1).

Fig.1.1 Structura mucoasei gingivale normale: E-epiteliu; Mb-membrana bazală; Lp-lamina propria;

Cs-chorion superficial; Cp-chorion profund (HE x10).

2. HIPERCREŞTEREA GINGIVALĂ INDUSĂ DE MEDICAMENTE

În acest capitol este descris conceptul de hipercreştere gingivală şi factorii de risc asociaţi acestuia, precum şi date referitoare la prevalenţa şi consecinţele clinice ale hipercreşterii gingivale indusă, în particular, de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină. Totodată, sunt prezentate acţiunile farmacodinamice şi mecanismele biochimice postulate pentru efectele secundare ale acestor medicamente. De asemenea, sunt descrise aspecte structurale şi funcţionale ale principalilor mediatori implicaţi în remodelarea matricei extracelulare: factori de creştere şi citokine, matrix metaloproteinaza (MMP) şi inhibitori tisulari naturali ai acestora (TIMP), efectori şi markeri ai tranziţiei epitelio-mezenchimale (TEM), precum şi importanţa TLR ca receptori implicaţi în răspunsul imun înnăscut.

Fenitoina (5,5-difenil-2,4-imidazolidindiona, difenilhidantoina) este un medicament antiepileptic cu structură asemănătoare barbituricelor, a cărui acţiune farmacodinamică este legată de blocarea canalelor de voltaj pentru sodiu prin creşterea efluxului sau scăderea influxului acestui ion prin membrană în cortexul motor în timpul generării impulsurilor nervoase, împiedicând depolarizarea membranei neuronale.

NH

N OO

Fenitoina

H

- 7 -

Biotransformarea fenitoinei se face în ficat prin hidroxilare sub acţiunea CYP2C9 şi CYP2C19 cu formare de p-(5-hidroxifenil)-5-fenilhidantoină (pHPPH). pHPPH se poate metaboliza la catecol care spontan se oxidează la semichinonă şi chinonă ce pot să se lege de proteine şi să le modifice covalent. Intermediarul reactiv poate fi inactivat de epoxid hidrolază sau de către glutation transferază [Cuttle şi colab., 2000].

Mecanismul biochimic al inducerii HG este legat de toxicitatea fenitoinei şi a pHPPH (Fig.2.1). Deoarece nu toţi pacienţii trataţi cu fenitoină dezvoltă HG, această susceptibilitate individuală a fost asociată predispoziţiei genetice, presupunându-se că fenitoina şi metabolitul major, HPPH, pot reacţiona cu o subpopulaţie de fibroblaste distincte fenotipic (Fig.2.1).

Ca-blocantele sau blocantele canalelor de calciu tip 1,4-dihidropiridină au devenit agenţi

farmacologici prescrişi în tratamentul multor afecţiuni cardiace, fiind eficienţi în managementul hipertensiunii, anginei, aritmiei atriale. Acţiunea farmacodinamică este legată de blocarea influxului de calciu în celulă la apariţia potenţialului de acţiune prin canalele de calciu dependente de voltaj lente (L), deprimând funcţiile celulare dependente de calciu [Cristea şi colab., 2005]. Dihidropiridinele sunt predominant vasodilatatoare care cresc aportul de oxigen cu reducerea ischemiei miocardice şi efect antianginos, scad rezistenţa periferică şi tensiunea arterială.

N CH3

COOCH3

NO2

H3C

H3COOC

Nifedipina

HN CH2OCH2CH2NH2

COOC2H5

Cl

H3C

H3COOC

Amlodipina

HN CH3

COOC2H5

Cl

H3C

H3COOC

Felodipina

H

Cl

Biotransformarea dihidropiridinelor este complexă, se face la nivel hepatic, prin oxidare sub

acţiunea membrilor subfamiliei CYP3A, cu efect înalt al primului pasaj şi mare variabilitate interindividuală. HG a fost raportată în anii ’80 pentru toate tipurile de blocante ale canalelor de calciu: fenilalchilamine (verapamil), benzotiazepine (diltiazem) şi dihidropiridine (nifedipină), dar s-a observat şi la monitorizarea tratamentului cu dihidropiridine din generaţia a 2-a (felodipină) şi a 3-a (amlodipină) [Barack şi colab., 1987; Marshall şi Bartold, 1999; Academy Report, 2004; Lafzi şi colab., 2006]. Cazurile de HG indusă de terapia cu nifedipină sunt cel mai frecvent raportate, ceea ce poate reflecta, mai degrabă, utilizarea crescută decât o caracteristică intrinsecă a medicamentului.

Mecanismul biochimic al inducerii HG este asociat modificării concentraţiei ionilor Ca2+ la nivel local (Fig.2.2).

- 8 -

CONTRIBUŢII PERSONALE

3. MOTIVAREA STUDIULUI ŞI IPOTEZE DE LUCRU

HG reprezintă nu doar o problemă de estetică şi de confort individual, ci formele moderate sau severe afectează sănătatea indivizilor. În timp ce menţinerea unei bune igiene orale poate reduce HG în cazul factorilor etiologici locali, cea apărută ca o consecinţă a administrării medicamentelor incriminate, cea de cauză sistemică şi idiopatică, depăşesc posibilităţile actuale de tratament conservativ, gingivectomia fiind singura modalitate de rezolvare.

Parametrii clinici uzuali pentru diagnosticare (adâncimea şanţului gingival, sângerarea la atingere, pierderea contactului clinic, indicele de placă dentară, modificări radiografice) sunt adesea limitaţi ca informaţie şi nu permit diferenţierea între afectarea anterioară şi un proces în evoluţie.

De aceea, este necesară dezvoltarea de noi teste de diagnostic care să permită detectarea unui proces activ, să prognozeze evoluţia acestuia şi să permită evaluarea răspunsului la terapia parodontală, îmbunătăţind astfel managementul clinic al pacienţilor cu afectare parodontală.

Cercetările recente în acest domeniu sunt orientate spre metodele prin care pot fi identificaţi şi cuantificaţi biomarkeri specifici afectării parodontale din HG, în ultimii ani suscitând interes utilizarea salivei în vederea diagnosticării unor afecţiuni sistemice sau locale.

Factorii biologici implicaţi în controlul turnover-ului ţesutului conjunctiv par a acţiona cel puţin via două căi patogenice diferite:

(i) stimularea mecanismelor de control al sintezei componentelor matricei extracelulare determinând depunerea excesivă de ţesut conjunctiv;

(ii) inhibarea degradării acestora, ducând la acumularea ţesutului conjunctiv. Prin această lucrare se propune un studiu interdisciplinar care să permită dobândirea de noi

cunoştinţe referitoare la căile patogenice implicate în vicierea metabolismului colagenului în cazul HG induse de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină.

Ipotezele de lucru propuse vizează evaluarea exprimării unor mediatori implicaţi în principalele mecanisme patogenice responsabile de alterarea homeostaziei ţesutului conjunctiv:

i). Alterarea balanţei sinteză/degradare a componentelor MEC consecutiv influenţei unor factori de creştere profibrogenetici asupra echilibrului MMP/TIMP şi a fenotipului fibroblastelor gingivale în HG indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină;

ii). Modularea fenomenului de tranziţie epitelio-mezenchimală în HG indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină;

iii). Contribuţia receptorilor de imunitate înnăscută TLR la medierea interrelaţiei inflamaţie - tranziţie epitelio-mezenchimală - fibroză gingivală secundar acţiunii fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină.

4. OBIECTIVELE STUDIULUI

Obiectivele specifice ale acestei teze de doctorat au fost următoarele: 1. Investigarea echilibrului dintre componentele ţesutului gingival în cazul HG indusă de

medicamente din clasa anticonvulsivantelor (fenitoină) şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină (amlodipină şi nifedipină) ca efect advers, printr-un studiu bazat pe tehnici histologice uzuale şi speciale.

2. Investigarea modificării raportului dintre fibroblastele diferite fenotipic din ţesutul conjunctiv gingival şi a proliferării acestora, în raport cu factorul de risc ce induce HG.

3. Investigarea exprimării tisulare a unor markeri celulari şi moleculari (factori de creştere - CTGF, citokine – TGF-β1, matrix metaloproteinaze – MMP-1, MMP-2 şi inhibitori tisulari ai acestora – TIMP-1 şi TIMP-2) implicaţi în dezechilibrul metabolismului ţesutului conjunctiv, în raport cu factorul medicamentos ce induce HG.

- 9 -

4. Investigarea ipotezei că efectele medicamentelor asupra homeostaziei MEC din ţesutul gingival hipertrofiat presupun implicarea mecanismului de tranziţie epitelio-mezenchimală, prin studiul exprimării E-caderinei, FSP1, Smad şi Snail.

5. Investigarea expresiei şi localizării receptorilor TLR în mucoasa gingivală hipertrofiată ca rezultat al administrării medicamentelor incriminate.

6. Testarea ipotezei că în salivă există biomarkeri specifici ce se corelează cu alterarea metabolismului colagenului în HG şi validarea corelaţiilor între prezenţa biomarkerilor la nivel tisular şi în fluidul salivar.

5. MATERIALE ŞI METODE

În acest capitol sunt prezentate materialele şi metodele folosite pentru realizarea cercetării.

5.1. Materiale Studiile au fost realizate pe ţesut gingival şi salivă recoltate de la 43 de subiecţi de ambele

sexe în cadrul Clinicii de Chirurgie Oro-Maxilo-Facială a Spitalului Judeţean de Urgenţă din Craiova în perioada 2008-2011. Materialele obţinute au fost repartizate în mai multe loturi, în funcţie de factorii de risc: lotul I (control normal) – material biologic provenit de la subiecţi fără modificări gingivale recoltat în urma tratamentului ortodontic; lotul II – material recoltat de la pacienţi care prezentau în măsură variată semnele clinice ale HG datorate tratamentului cu medicamente defalcat în subloturi (II.a–blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină; II.b-fenitoină); lot III (control patologic)–material recoltat de la pacienţi cu HG detectabilă clinic indusă de inflamaţie şi cu fibromatoză gingivală. A fost exclus din studiu materialul care provenea de la subiecţi care aveau HG determinată de boli sistemice, diabet, endocrinopatii, precum şi de la cei care au făcut tratament cu corticosteroizi, contraceptive orale şi antibiotice în ultimele 6 luni. 5.2. Metode

Studiul histologic s-a bazat pe utilizarea unor tehnici histologice uzuale (includere în parafină, coloraţii pentru evidenţierea aspectului general – hematoxilină-eozină şi pentru evidenţierea componentelor ţesutului conjunctiv – tricromic Masson, impregnaţie argentică Gömöri, PAS-Alcian) şi speciale (tehnici imunohistochimice bazate pe utilizarea metodelor ABC, LSAB şi EnVision pentru marcarea antigenelor evaluate în diferitele etape ale studiului cu anticorpii din tabelul 5.1 şi cu reactivii prezentaţi în subcapitolul 5.1.1).

Tabel 5.1. Anticorpii folosiţi pentru studiile de imunohistochimie

Anticorp Diluţie Cod Metoda Monoclonal mouse anti-human α-SMA (1A4) 1:100 M0851

EnVision

Monoclonal mouse anti-human vimentin (V9) 1:50 M0725

LSAB

Monoclonal mouse anti-Ki67 (MIB1) 1:50 M7020 ABC Monoclonal mouse anti-human TGF-β1, (TB21) 1:200 sc 52893 ABC

/EnVision Monoclonal mouse anti-human CTGF (6B13) 1:300 sc-101586 ABC Monoclonal mouse anti-human MMP-1 (3B6) 1:200 sc-21731 ABC Monoclonal mouse anti-human MMP-2 (8B4) 1:200 sc-13595 ABC Monoclonal mouse anti-TIMP-1 (2A5) 1:200 sc-21734 ABC Monoclonal mouse anti-human TIMP-2 (3A4) 1:100 sc-21735 ABC Monoclonal mouse anti-human E-cadherin (NCH38) 1:100 M3612 ABC Polyclonal rabbit anti-human S100A4 1:200 A5114 ABC Rabbit polyclonal to N Cadherin 1µg/ml ab18203 ABC Rabbit polyclonal to TLR2 2µg/ml ab 24192 ABC Rabbit polyclonal to TLR4 2µg/ml ab13556 ABC Rabbit polyclonal to Smad3 2,5 µg/ml ab51451 ABC Rabbit polyclonal to SNAIL+SLUG 1µg/ml ab85936 ABC

- 10 -

Studiul biochimic s-a bazat pe utilizarea unor tehnici EIA/ELISA pentru determinarea cantitativă a concentraţiei salivare a factorilor de creştere TGF-β1 şi CTGF, precum şi a TIMP-2, dar şi pe determinarea expresiei genice a TGF-β1, Smad3, TLR-2 şi TLR-4 prin RT-PCR.

Referitor la analiza statistică realizată este descris modul în care au fost prelucrate rezultatele cuantificabile obţinute şi metodele de calcul de analiză statistică folosite (teste non-parametrice de comparare a grupurilor - testul Mann-Whitney şi testul Kruskal-Wallis la un nivel de semnificaţie de 5%, realizate cu softurile GraphPad Instat 3.0 şi Prism 5.04).

6. REZULTATE 6.1. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra morfologiei şi compoziţiei mucoasei gingivale

Evaluarea microscopică a preparatelor obţinute de la pacienţii cu HG indusă de medicamente a evidenţiat modificări similare remarcându-se îngroşarea mucoasei gingivale prin akantoză şi aspecte histologice specifice de inflamaţie. Frecvent, în ariile de akantoză a fost observată şi akantoliza. S-au remarcat creste epiteliale pătrunzând adânc în ţesutul conjunctiv şi formând aşa numitele “rete pegs”, cu variaţii de incidenţă şi amplitudine, mai numeroase şi mai adânci pe preparatele de HG indusă de fenitoină.

Fig.6.2. HG indusă de amlodipină. De remarcat îngroşarea epiteliului, zone de akantoză şi hiperkeratoză cu acumulare excesivă de MEC în lamina propria (HEx10). Fig.6.4. HG indusă de fenitoină. Se remarcă crestele epiteliale adânci, proliferare papilară în epiteliu, dar şi infiltrat inflamator (tricromic Masson x10). Fig.6.6. HG indusă de nifedipină. Se remarcă îngroşarea epiteliului, akantoză, acumulare de colagen şi capilare de neoformaţie în lamina propria (tricromic Masson x10).

Modificările particulare au fost legate de faptul că aspectul HG indusă de fenitoină a fost mai fibrotic iar în cazul dihidropiridinelor mai inflamator, precum şi de raportul componenta colagenică/ necolagenică şi între tipurile de colagen. PAS-Alcian a evidenţiat, în cazul mucoaselor cu HG indusă de fenitoină, o creştere a densităţii componentei colagenice comparativ cu cea necolagenică la nivelul laminei propria, precum şi a proporţiei de GAG sulfataţi comparativ cu HG indusă de dihidropiridine, unde a fost crescută proporţia de GAG nesulfataţi (mai ales în cazul nifedipinei).

Fig.6.10. Prezenţa majoritară a colagenului tip I în HG indusă de dihidropiridine (IA x10). Fig.6.11. Raport colagen tip III (negru)/tip I crescut (galben) în HG indusă de fenitoină (IA x10).

6.2 6.4 6.6

6.10 6.11

- 11 -

Fig.6.12. Proporţie crescută de fibre şi GAG sulfataţi în HG indusă de fenitoină (PAS-Alcian x10). Fig.6.13. Raportul dintre componenta colagenică/necolagenică HG indusă de nifedipină (PAS-Alcian x10).

6.2. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra fenotipului fibroblastelor din mucoasa gingivală au fost evaluate în funcţie de: a. expresia vimentinei – marker al celulelor de origine mezenchimală; b. expresia Ki67 – marker al proliferării celulare din mucoasa gingivală; c. expresia α-SMA – marker al fibroblastelor cu fenotip înalt sintetizant de colagen, miofibroblaste; d. expresia FSP-1 – marker al fibroblastelor provenite din tranziţia epitelio-mezenchimală.

6.2.1. Expresia şi localizarea vimentinei Analiza preparatelor obţinute de la pacienţii trataţi cu fenitoină şi dihidropiridine a evidenţiat

un număr crescut de celule vimentin-pozitive comparativ cu lotul de control, mai mare în cazul HG indusă de fenitoină care a fost mai fibrotică.

Fig.6.14. Reacţie vimentin-pozitivă în celule din mucoasa gingivală normală (x10). Fig.6.15.Reacţie vimentin-pozitivă în celule din mucoasă în HG indusă de nifedipină (x10). Fig.6.17. Reacţie vimentin-pozitivă în numeroase celule din mucoasă în HG indusă de fenitoină (x10).

6.2.2. Evaluarea gradului de proliferare celulară prin marcare cu Ki67 Marcarea Ki67 a evidenţiat pe majoritatea preparatelor de la pacienţii cu HG indusă de

dihidropiridine, un pattern similar celei de natură inflamatorie: număr variabil de celule pozitive în epiteliu, însă mai mic comparativ cu lotul fără HG, şi absenţa pozitivităţii în lamina propria. În HG indusă de fenitoină au fost remarcate unele celule Ki-67 pozitive în lamina propria.

6.2.3. Expresia şi localizarea α-SMA α-SMA a fost folosită pentru marcarea miofibroblastelor (”fibroblaste de stres”), celule apte să

sintetizeze în cantitate crescută componentele proteice ale MEC. În HG indusă de nifedipină şi amlodipină, rezultatele marcării pentru α-SMA au fost similare, remarcându-se un număr redus de miofibroblaste. În HG indusă de fenitoină s-a evidenţiat un număr mai mare de fibroblaste α-SMA pozitive, însă numărul a fost redus comparativ cu cel din HG indusă de inflamaţie, ceea ce confirmă că în inflamaţie unul dintre mecanismele de inducere a fibrozei este stimularea miofibroblatelor, în timp ce în cazul HG indusă de medicamente pot funcţiona preponderent alte mecanisme.

6.12 6.13

6.14 6.15 6.17

- 12 -

Fig.6.19. Reacţie pozitivă pentru Ki67 în stratul bazal epitelial al mucoasei gingivale în HG indusă de nifedipină (x20). Fig.6.20. Numeroase celule pozitive Ki67 în epiteliul mucoasei din HG inflamatorie (x20). Fig.6.21Celule Ki67 pozitive puţine în epiteliul din HG indusă de fenitoină; redusă pozitivitate în lamina propria (x20).

Fig.6.24. HG indusă de nifedipină. Rare fibroblaste α-SMA pozitive în lamina propria (x20). Fig.6.26. HG indusă de fenitoină. Miofibroblaste în lamina propria (x40). Fig.6.27. HG indusă de inflamaţie. Număr crescut de miofibroblaste în lamina propria (x20).

6.2.4. Expresia şi localizarea FSP-1 Marcarea pentru FSP-1 a fost realizată pentru a evalua incidenţa fibroblastelor provenite din

provenite eventual din epiteliu prin TEM. Număr mare de fibroblaste FSP-1 pozitive am remarcat în ambele tipuri de HG indusă de medicamente. Am remarcat multe celule epiteliale pozitive pentru FSP-1 în vecinătatea membranei bazale ceea ce prezintă importanţă pentru evaluarea contribuţiei TEM ca mecanism patogenic al HG.

Fig.6.28. HG indusă de nifedipină. Celule epiteliale FSP-1 pozitive în straturile bazal şi parabazal (x20). Fig.6.30. HG indusă de fenitoină. Număr important de celule epiteliale pozitive care „trec prin” membrana bazală (x40).

6.19 6.20 6.21

6.24 6.26 6.27

6.28 6.30

- 13 -

6.3. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei unor mediatori ai balanţei sinteză/degradare a matricei extracelulare au fost evaluate prin: a. expresia şi localizarea unor factori de creştere profibrogenetici – TGF-β1 şi CTGF; b. expresia unor MMP şi a inhibitorilor tisulari – MMP-1, MMP-2, TIMP-1 şi TIMP-2.

6.3.1. Expresia şi localizarea factorilor de creştere profibrogenetici TGF-β1 şi CTGF În cazul HG indusă de nifedipină şi amlodipină, numeroase celule epiteliale prezentau

pozitivitate citoplasmatică, în lamina propria reacţia fiind pozitivă în celule endoteliale, unele fibroblaste, mastocite şi celule proinflamatorii. Pe mucoasele cu HG indusă de fenitoină, reacţia pozitivă pentru TGF-β1 s-a extins la numeroase celule din epiteliu şi lamina propria: keratinocite, celule endoteliale şi fibroblaste, numărul acestor elemente pozitive fiind mai mare comparativ cu celelalte loturi.

Fig.6.32. Reacţie TGF-β1 variabilă în mucoasa gingivală normală (x10). Fig.6.33. HG indusă de nifedipină. Celule epiteliale TGF-β1 pozitive, dar şi elemente celulare din lamina propria (x10). Fig.6.35. HG indusă de fenitoină. Se remarcă pozitivitate mai ales epitelială pentru TGF-β1 şi în unele fibroblaste (x20).

Reacţiile imunohistochimice pentru CTGF au evidenţiat absenţa exprimării proteinei în mucoasa gingivală normală. Pattern similar dihidropiridine: expresia intensă în straturile bazal şi parabazal epiteliale, precum şi în celule dispersate în lamina propria. În mucoasa din HG indusă de fenitoină, CTGF a fost prezent în cantitate mai mare decât în HG indusă de dihidropiridine. Exprimarea extracelulară a fost predominantă în celulele endoteliale şi în ariile de fibroză perivasculară, similar ca în fibromatoza gingivală.

Fig.6.37. HG indusă de dihidropiridine. Numeroase celule CTGF-pozitive în straturile bazal şi parabazal epiteliale şi în MEC (a. nifedipină, x10; b. amlodipină, x4,5). Fig.6.38. Expresia CTGF în HG indusă de fenitoină. (x4,5.

6.3.2. Expresia şi localizarea matrix metaloproteinazelor MMP-1 şi MMP-2 Expresia MMP-1 şi MMP-2 a fost diferită în HG indusă de fenitoină şi dihidropiridine

comparativ cu HG indusă de inflamaţie şi cu mucoasele gingivale normale: MMP-1 absentă, în timp ce MMP-2 a fost mai intensă în HG indusă de nifedipină decât în cazul celorlalte medicamente.

6.32 6.33 6.35

6.37a 6.37b 6.38

- 14 -

6.3.3. Expresia şi localizarea inhibitorilor tisulari ai MMP TIMP-1 şi TIMP-2 A fost remarcată exprimarea diferită a celor doi inhibitori. TIMP-1, o proteină inductibilă, s-a

dovedit absent. Intensitatea expresiei TIMP-2 a fost mai mare pe preparatele de HG indusă de fenitoină şi nifedipină, cu exprimare în epiteliu, fibroblaste, celule proinflamatorii în lamina propria.

Fig.6.41. Expresia TIMP-2 în HG. Reacţie pozitivă în epiteliu (x10) şi în celule endoteliale, fibroblaste şi celule pro-inflamatorii din lamina propria în HG indusă de nifedipină (d, x40); pattern similar în HG indusă de fenitoină.

6.4. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei unor mediatori ai tranziţiei epitelio-mezenchimale au fost evaluate în funcţie de: a. expresia E-caderinei – marker al fenotipului epitelial; b. expresia N-caderinei – marker al fenotipului mezenchimal; c. expresia Smad 3 şi Snail – mediatori ai TEM pe calea dependentă de TGFβ; d. expresia FSP-1 – marker al transformării celulelor epiteliale prin TEM.

6.4.1. Expresia şi localizarea E-caderinei Comparativ cu mucoasa normală, ţesuturile cu HG indusă de medicamentele studiate au

prezentat o reducere variabilă a expresiei E-caderinei în epiteliul gingival, mai accentuată în cazul HG indusă de nifedipină şi fenitoină.

Fig.6.42. Expresia E-caderinei în HG. Reacţie intens pozitivă în epiteliul mucoasei normale (a, x20); expresie scăzută a proteinei în HG indusă de amlodipină (b, x20), nifedipină (c,d) şi fenitoină (e, x10); în HG inflamatorie exprimare similară mucoasei normale (f, x20).

6.4.3. Expresia şi localizarea Smad3 A fost remarcată exprimarea factorului de transcripţie Smad3 în mod diferit de mucoasa

normală. În probele de mucoasă cu HG indusă de nifedipină şi fenitoină, cele mai multe celule pozitive au fost evidenţiate în straturile epiteliale parabazal şi bazal, pozitivitatea fiind atât citoplasmatică cât şi nucleară, iar în probele de mucoasă cu HG indusă de amlodipină în straturile granular şi spinos.

a b e

c d

- 15 -

Fig.6.44. Imunolocalizarea Smad3 în HG indusă de nifedipină (a, x40) şi fenitoină (d, x40).

6.4.4. Expresia şi localizarea Snail Analiza preparatelor de mucoasă obţinute de la pacienţii cu HG datorată diferiţilor factori de

risc a indicat o supraexprimare a factorului de transcripţie Snail comparativ cu mucoasa normală. Cele mai multe celule pozitive au fost evidenţiate în straturile epiteliale profunde, iar în probele de mucoasă cu HG indusă de medicamente şi cu fibromatoză gingivală şi în lamina propria. În mucoasa normală a fost observat un număr redus de celule cu pozititivitate citoplasmatică, în timp ce în cazul HG induse de medicamente pozitivitatea a fost mai ales nucleară, numărul celulelor pozitive fiind în creştere. Adesea, celulele pozitive erau alungite sau rotunde înconjurate de un halou, ceea ce dovedea pierderea contactelor de adeziune celulară şi posibilitatea de a invada MEC.

Fig.6.45. Imunolocalizarea Snail în gingia normală (a, x10), HG indusă de nifedipină (d, x20), fenitoină (f, x40). Pozitivitate în epiteliu, nucleară şi citoplasmatică în d, f dar şi în lamina propria. 6.5. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra localizării receptorilor de imunitate înnăscută Toll-like (TLR)

6.5.1. Imunolocalizarea TLR2

Expresia TLR2 în mucoasa gingivală normală a fost mai scăzută ca intensitate decât în cazul mucoaselor hipertrofiate datorită inflamaţiei, dar şi comparativ cu mucoasele din HG indusă de fenitoină şi dihidropiridine. În mucoasele inflamate, dar şi în cele cu HG indusă de dihidropiridine şi fenitoină, expresia TRL2 a fost intensificată la nivelul straturilor cornos, granular şi spinos ale epiteliului, prezentând totodată intensitate crescută şi în lamina propria.

6.5.2. Imunolocalizarea TLR4 În mucoasele inflamate, expresia TRL4 a fost intensificată la nivelul straturilor cornos,

granular şi spinos ale epiteliului prezentând totodată intensitate crescută şi în lamina propria. Aceeaşi intensificare a expresiei TLR4 a fost remarcată şi în cazul mucoaselor gingivale din HG indusă de dihidropiridine şi fenitoină, cu menţiunea că, în cazul nifedipinei proteina a fost localizată mai ales în stratul cornos, spinos şi bazal, iar în cazul fenitoinei, prezenţa în cantitate mai mare a fost observată în straturile spinos şi bazal, dar şi în ţesutul conjunctiv şi endoteliu.

a d f

a

- 16 -

Fig.6.46. Imunolocalizarea TLR2 în gingia normală inflamată (b,x10) şi în HG indusă de nifedipină (c, x10) şi fenitoină (d, x4,5). Reacţie crescută ca intensitate faţă de mucoasa normală în straturile epiteliale cornos, spinos şi bazal dar şi în ţesutul conjunctiv, dependent de factorul de risc pentru HG.

Fig.6.47. Imunolocalizarea TLR4 în gingia cu HG indusă de inflamaţie (b, x10), nifedipină (c, x10) şi fenitoină (d, x20).

6.6. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra expresiei genice a TGF-β1, Smad3, TLR2 şi TLR4

6.6.1. Expresia genică a factorului profibrogenetic TGF-β1 Deşi imunohistochimic exprimarea TGF-β1 nu a fost remarcată, rezultatele studiului de

expresie genică au arătat exprimarea genei şi la subiecţii din lotul de control. TGF-β1 a avut o expresie genică mai mare la pacienţii cu HG indusă de fenitoină şi nifedipină decât la cei din lotul de control fără HG şi cei cu HG indusă de inflamaţie, valorile fiind însă mai mici decât în cazul fibromatozei gingivale (Fig.6.48), însă diferenţele nu au fost semnificative statistic (p>0.05).

6.6.2. Expresia genică a Smad3 Expresia genică a Smad3 a evidenţiat valori mai mari la pacienţii din lotul tratat cu

medicamente decât la cei din lotul de control şi cu HG indusă de medicamente, dar mai mici în cazul fibromatozei gingivale (Fig.6.49). Diferenţele nu au fost însă semnificative (p>0.05).

6.6.3. Expresia genică a TLR2 şi TLR4 Rezultatele au arătat că ambii receptori s-au exprimat în probele de control fără HG (Fig.6.50).

Expresia TLR2 cea mai mare a fost observată la pacienţii HG indusă de inflamaţie. La pacienţii cu HG indusă de fenitoină şi nifedipină, gradul de expresie genică pentru TLR2 a fost nesemnificativ crescut faţă de lotul de control (p>0.05).

Expresia TLR4 a variat astfel: media valorilor obţinute pentru pacienţii cu HG indusă de medicamente a fost mai mare decât la lotul de control, însă mai mică în comparaţie cu valorile obţinute în cazul HG inflamatorii şi în fibromatoza gingivală. Diferenţele între loturi nu au fost însă semnificative (Fig.6.50).

b c d

b c d

- 17 -

Fig.6.50. Variaţia expresiei genice a TLR2 (a) şi TLR4 (b) în HG indusă de medicamente (II) şi de inflamaţie (III) vs. control (I) şi fibromatoza gingivală.

6.7. Efectele fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină asupra nivelului salivar al unor mediatori ai balanţei sinteză/degradare a colagenului

Dintre biomarkerii cu rol în HG a căror exprimare a făcut obiectul studiului nostru morfologic, TGF-β1, CTGF şi TIMP-2 au fost dozaţi în fluidul salivar.

După cum se observă în tabelul 6.1, la pacienţii din lotul de control valorile markerilor dozaţi prin tehnica ELISA au fost foarte heterogene, fapt demonstrat de valorile mari ale deviaţiei standard comparativ cu media pentru fiecare lot.

Aceasta sugerează că ceea ce reprezintă normalitatea din punct de vedere clinic nu este confirmat din punct de vedere al omogenităţii determinărilor biochimice. Aceeaşi variabilitate mare interindividuală a fost observată şi pentru parametrii urmăriţi în cazul celorlalte loturi, cu excepţia valorilor obţinute pentru CTGF în cazul probelor recoltate de la pacienţii din sublotul II.b (fenitoină). Media valorilor TGF-β1 salivar a fost crescută la toate loturile cu HG comparativ cu lotul de control, valorile cele mai mari fiind remarcate în cazul sublotului II.b (Fig.6.51).

Tabel 6.1 Valorile biomarkerilor salivari evaluaţi

Control fără HG HG indusă de dihidropiridine

HG indusă de fenitoină

Fibromatoză gingivală

TGF-β1 (ng/ml)

93,76±31,94* 462,13±418 714±149,91 143,6±13,56

CTGF (pg/ml)

1706,36±1604,45 4450±4404,82 7251±493,56 3618,33±3065,82

TIMP-1 (ng/ml)

146,25 ±117,22 626,66±200,33 661±56,56 186,66±47,62

* Rezultatele sunt prezentate ca medie ± deviaţia standard

Fig.6.5. Variaţia TGF-β1 salivar şi CTGF în HG (II.a-dihidropiridine, II.b-fenitoină) vs. control (I) şi fibromatoza gingivală. Fig.6.52. Variaţia CTGF salivar în HG (II.a-dihidropiridine, II.b-fenitoină) vs. control (I) şi fibromatoza gingivală.

- 18 -

Comparând mediile valorilor TGF-β1 pentru pacienţii cu HG cu cea a subiecţilor fără HG, am obţinut diferenţe semnificative atât între sublotul cu fenitoină şi normal (p<0.01) cât şi între sublotul cu dihidropiridină şi normal (p<0.001) însă diferenţele între cele două loturi nu au fost semnificative (p>0.05).

La analiza CTGF salivar cele mai mari valori le-am obţinut pentru probele provenite de la pacienţii trataţi cu fenitoină, aceştia prezentând şi cea mai mică dispersare a valorilor comparativ cu media pentru sublot.

Comparând mediile valorilor CTGF pentru pacienţii cu HG cu cea a subiecţilor fără HG, am obţinut diferenţe semnificative atât între sublotul cu fenitoină şi normal (p<0.05) cât şi între sublotul cu dihidropiridină şi normal (p<0.01). Diferenţa între cele două subloturi cu HG indusă de medicamente nu a fost semnificativă (p=0.52).

Media valorilor concentraţiei TIMP-2 a fost mult mai mare la pacienţii cu HG indusă de fenitoină şi de blocantele de canale de calciu faţă de intervalul de referinţă pentru acest marker şi faţă de media obţinută pentru lotul fără HG, după cum se poate remarca din tabelul 6.1 şi Fig.6.53.

Comparând mediile valorilor TIMP-2 pentru pacienţii cu HG cu cea a subiecţilor fără HG, am obţinut diferenţe semnificative atât între sublotul cu fenitoină şi normal (p<0.05) cât şi între sublotul cu dihidropiridină şi normal (p<0.001) însă nici în cazul acestui parametru diferenţele între cele două loturi nu au fost semnificative (p>0.05).

Corelând valorile obţinute la determinarea biomarkerilor evaluaţi am obţinute, în general, rezultate nesemnificative. S-a obţinut o corelare directă pozitivă între nivelurile salivare de TGF-β1 şi CTGF la pacienţii cu HG indusă de fenitoină şi fibromatoză gingivală (r=1, respectiv r=0,68), însă semnificaţia acestora o considerăm redusă având în vedere numărul mic de pacienţi din cele două loturi.

De asemenea, corelarea valorilor obţinute la determinarea biomarkerilor salivari cu modul de exprimare tisulară a acestor markeri nu a oferit rezultatele pe care le-am aşteptat la începutul acestui studiu, astfel că cercetări ulterioare ar putea conduce la completarea acestor observaţii.

Coroborând rezultatele obţinute la determinarea concentraţiei markerilor TGF-β1 şi CTGF în salivă cu incidenţa şi intensitatea exprimării acestora la nivelul structurilor din mucoasa gingivală, am remarcat o slabă corelaţie între nivelul salivar şi cel tisular doar pentru CTGF la pacienţii din lotul cu HG indusă de fenitoină, totuşi nesemnificativă, fiind posibil ca proteina să sufere o clivare care să vicieze rezultatul determinărilor biochimice.

7. DISCUŢII

Cercetările realizate în această lucrare îşi aduc contribuţia la studiul mecanismelor patogenice responsabile de efectele secundare ale fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu de tip dihidropiridină, nifedipină şi amlodipină, asupra metabolismului gingival. Rezultatele obţinute sunt discutate integrat, în raport cu implicarea lor în diversele căi patogenice potenţial implicate:

1. Alterarea balanţei sinteză/degradare a componentelor MEC; 2. Modularea fenomenului de tranziţie epitelio-mezenchimală; 3. Contribuţia receptorilor de imunitate înnăscută TLR la medierea interrelaţiei inflamaţie-

tranziţie epitelio-mezenchimală-fibroză gingivală. 7.1. Alterarea balanţei sinteză/degradare a componentelor MEC consecutiv influenţei unor factori de creştere profibrogenetici asupra echilibrului MMP/TIMP şi a fenotipului fibroblastelor gingivale în HG indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină

Modificările morfologice observate în HG indusă de fenitoină şi dihidropiridine blocante de canale de calciu (nifedipină şi amlodipină) au fost (reprezentate de îngroşarea epiteliului şi depunerea masivă de ţesut conjunctiv, cu grade variabile de inflamaţie) cu modificări la nivelul MEC între componenta colagenică şi cea necolagenică, HG indusă de fenitoină fiind mai fibrotică.

Remodelarea MEC implică două evenimente majore: sinteza şi depunerea componentelor matriciale de către fibroblastele active, pe de o parte, şi degradarea lor proteolitică pe de alta.

- 19 -

Perturbarea homeostaziei MEC a fost datorată, în principal, suprareglării mecanismelor de

sinteză a colagenului, şi, secundar, inhibării mecanismelor de degradare a acestei proteine. Metabolismul fibroblastelor este esenţial în turnover-ul colagenului, proliferarea şi

diferenţierea lor, precum şi producerea de colagen fiind controlate de citokine care iniţiază cascade de semnalizare mediate de receptori specifici [Arora şi colab., 2001].

În toate tipurile de HG indusă de medicamente am remarcat heterogenitatea fenotipului fibroblastelor, ceea ce sugerează participarea coroborată a acestora la HG, fiind necesară activarea unor mecanisme care să determine „recrutarea” de fibroblaste susceptibile să reacţioneze particular la acţiunea medicamentelor prin sinteza excesivă de colagen. Mecanismele moleculare implicate în recrutarea acestor celule cu sinteză înaltă au la bază interacţiunea dintre limfocite şi fibroblaste (acumularea de TGF-β, prezenţa proteinelor specializate din MEC), dar şi stresul extracelular, proprietăţile mecanice ale MEC contribuind la selectarea şi diferenţierea fibroblastelor cu fenotip înalt sintetizant [Kessler şi colab., 2001; Schild şi Trueb, 2002; Hinz şi colab., 2007].

Celulele fibromucoasei gingivale au exprimat o combinaţie între MMP şi TIMP diferită în funcţie de factorul de risc, pattern controlat prin mecanisme complexe, dezechilibrul balanţei reprezentând o cale patogenică importantă pentru acumularea MEC.

TGF-β1 deţine rol pivotal în fibrogeneza din HG indusă de medicamente prin implicarea în controlul MMP/TIMP şi prin potenţarea acţiunii CTGF.

Corelarea exprimării TGF-β1 cu gradul de fibroză şi cu prezenţa anumitor tipuri de fibroblaste înalt sintetizante de colagen (α-SMA) sugerează că activarea miofibroblastelor şi reducerea balanţei MMP/TIMP nu sunt singurele căi patogenice implicate în efectele celulare gingivale ale fenitoinei, nifedipinei şi amlodipinei.

Deoarece corelarea între nivelul TGF-β1 şi CTGF din saliva totală şi gradul de exprimare a acestor proteine în mucoasa gingivală nu a fost semnificativă sunt necesare determinări suplimentare pe loturi mai mari de pacienţi pentru a valida aceşti biomarkeri. 7.2. Modularea fenomenului de tranziţie epitelio-mezenchimală în hipercreşterea gingivală indusă de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină

Profilul anormal al exprimării citokinelor TGF-β1 şi CTGF ca rezultat al acţiunii medicamentelor asupra sistemelor de imunitate celulare conduce la activarea mai multor căi patogenice prin care aceştia stimulează şi întreţin modificările MEC în HG indusă de fenitoină şi dihidropiridine blocante ale canalelor de calciu.

Diferenţele între modul de exprimare a E-caderinei, FSP-1 şi Snail (Slug) susţin ideea că TEM poate fi unul din mecanismele patogenice în HG indusă de medicamentele incriminate. TGF-β1 deţine rol pivotal în medierea TEM în HG indusă de medicamente prin implicarea sa în controlul căii de semnalizare Smad-Snail.

Relaţia temporală exactă între mediatorii TEM este dificil de pus în evidenţă in vivo având în vedere că cei mai mulţi dintre aceştia sunt markeri precoce ai fenomenului. 7.3. Contribuţia receptorilor de imunitate înnăscută TLR la medierea interrelaţiei inflamaţie-tranziţie epitelio-mezenchimală-fibroză gingivală secundar acţiunii fenitoinei şi blocantelor de canale de calciu tip dihidropiridină

În această lucrare am evaluat modul de exprimare a TLR2 şi TLR4 în mucoasele gingivale hipertrofiate ca efect secundar al fenitoinei, nifedipinei şi amlodipinei, în încercarea de a integra exprimarea lor în interrelaţia TEM-fibroză gingivală.

HG indusă de fenitoină şi blocantele de canale de calciu tip dihidropiridină este însoţită de un profil anormal de citokine, ca rezultat al alterărilor induse de medicamente sau de produşii de degradare ai acestora asupra sistemelor de răspuns imun înnăscut sau dobândit. Ţesutul gingival hipertrofiat conţine subpopulaţii de macrofage şi alte celule inflamatorii diferite în funcţie de medicamentul administrat, dar şi faţă de ţesutul gingival normal [Trackman şi Kantarci, 2004].

Studii recente au arătat că macrofagele sunt activate de către citokinele care mediază Th1 şi Th2 şi dobândesc fenotipuri distincte, cel mai important fiind cel asociat implicării în fibroza ce urmează inflamaţiei [Meneghin şi Hogaboam, 2007].

- 20 -

Celulele proinflamatorii, fibroblastele şi celulele epiteliale din mucoasele gingivale au exprimat TLR2 şi TLR4, indiferent de factorul de risc care a indus HG. În HG indusă de fenitoină şi, mai puţin, în cazul celei indusă de nifedipină şi amlodipină, am remarcat o supraexprimare a acestora comparativ cu mucoasele normale şi cu cele ce prezentau HG determinată de inflamaţie.

Acest pattern de exprimare poate fi asociat faptului că receptorii TLR se supraexprimă în cazul mucoaselor supuse acţiunii medicamentelor nu doar pentru a reacţiona faţă de PAMP produşi de micoorganismele ce populează cavitatea orală chiar şi în condiţii normale, ci şi pentru a recunoaşte aducţii proteici formaţi prin legarea produşilor de catabolism ai medicamentelor. S-a arătat recent că proteinele modificate prin oxidare şi nitrare, precum şi proteinele de şoc termic eliberate în timpul inflamaţiei acute sau din celulele lezate pot reprezenta PAMP pentru TLR [Rifkin şi colab., 2005].

În consecinţă, insuficienţa de a epura agenţii patogeni şi/sau produşii lor furnizează o sursă permanentă de lezare celulară şi inflamaţie cronică. Aceasta are ca rezultat fibroza, ceea ce este un final nedorit al unei supraactivări a sistemului imun înnăscut.

Deoarece TGF-β1 este un participant cheie în toate căile de semnalizare ce controlează inflamaţia, TEM şi fibroza, direct sau prin factorul profibrotic CTGF, putem spune că, în funcţie de ambientul celular, cele trei evenimente interrelaţionează în medierea alterărilor induse de medicamentele luate în discuţie la nivelul mucoasei gingivale. 8. CONCLUZII

Studiul căilor patogenice implicate în controlul homeostaziei ţesutului conjunctiv în hipercreşterea gingivală indusă de medicamentele studiate - fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină (nifedipină şi amlodipină) - a condus la formularea următoarelor concluzii:

Răspunsul particular al mucoasei la prezenţa factorilor de risc pentru hipercreştere gingivală, reprezentaţi de fenitoină şi blocante ale canalelor de calciu tip dihidropiridină (nifedipină şi amlodipină), este indus de dialogul permanent dintre cele două tipuri principale de celule - epiteliale şi mezenchimale.

Perturbarea homeostaziei matricei extracelulare este datorată suprareglării mecanismelor de sinteză a colagenului, în principal şi, secundar, inhibării mecanismelor de degradare.

TGF-β1 deţine rol pivotal în patogenia fibrozei din hipercreşterea gingivală indusă de fenitoină, nifedipină şi amlodipină acţionând prin mai multe mecanisme: controlul fenotipului fibroblastelor, reglarea balanţei MMP/TIMP, potenţarea acţiunii profibrotice a CTGF, medierea inflamaţiei şi a tranziţiei epitelio-mezenchimale.

Celulele fibromucoasei gingivale exprimă o combinaţie între MMP şi TIMP diferită în funcţie de factorul de risc, pattern controlat prin mecanisme complexe, dezechilibrul balanţei între aceştia reprezentând o cale patogenică importantă pentru acumularea MEC în hipercreşterea gingivală indusă de fenitoină, nifedipină şi amlodipină.

Vicierea turnoverului matricei extracelulare în cazul hipercreşterii gingivale induse de fenitoină, nifedipină şi amlodipină implică asocierea efectului direct al medicamentelor şi/sau al produşilor de catabolism cu influenţa exercitată de prezenţa concomitentă a inflamaţiei.

Tranziţia epitelio-mezenchimală indusă de TGF-β poate fi considerată punct de convergenţă între răspunsul imun înnăscut şi fibroză în HG indusă de fenitoină şi blocantele canalelor de calciu tip dihidropiridină.

Corelaţiile între nivelul factorilor de creştere TGF-β1 şi CTGF şi gradul de fibroză tisulară indusă de medicamentele incriminate sunt încurajatoare, însă validarea unor biomarkeri salivari ai fibrozei care să ”oglindească” ambientul celular rămâne unul dintre dezideratele studiilor ulterioare. 9. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ Abdollahi M, Rahimi R, Radfar M, Current Opinion on Drug-Induced Oral Reactions: A comprehensive review, J Contemporary Dental Practice 2008, 9(3):1-32.

- 21 -

Academy Report, Drug-Associated Gingival Enlargement, J Periodontol 2004, 75:1424-1431. Akiyama S, Amano A, Kato T, Takada Y, Kimura KR, Morisaki I, Relationship of periodontal bacteria and porphyromonas gingivalis fimA variations with phenytoin-induced gingival overgrowth, Oral Dis 2006, 12(1):51-56. Arancibia SA, Beltrán CJ, Aguirre IM, Silva P, Peralta AL, Malinarich F, Hermoso MA. Toll-like receptors are key participants in innate immune responses, Biol Res 2007, 40:97-112. Arora PD, Silvestri L, Ganss B, Sodek J, McCulloch CA, Mechanism of cyclosporin-induced inhibition of intracellular collagen degradation, J Biol Chem, 2001, 276:14100-14109. Avery JK, Steele PF, Avery N, Oral development and histology, Third edition. Thieme - Medical, 2002. Baker AH, Edwards DR, Murphy G, Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities, J Cell Sci 2002, 115:3719-3727. Barrallo-Gimeno A, Nieto MA, The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cancer, Development 2005, 132:3151-3161. Bartold MP, Narayanan AS, Molecular and cell biology of healthy and diseased periodontal tissues, Periodontology 2000, 2006, 40:29-49. Beklen A, Hukkanen M, Richardson R, Konttinen YT, Immunohistochemical localization of TLRs in periodontitis, Oral Microbiol Immunol 2008, 23:425–431. Beutler B, Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signaling, Nature 2004; 430:257-263. Birkedal-Hansen H, Role of matrix metalloproteinases in human periodontal diseases. J Periodontol 1993, 64:474-484. Bitu CC, Sobral LM, Kellermann MG, Martelli-Junior H, Zecchin KG, Graner E, Coletta RD, Heterogeneous presence of myofibroblasts in hereditary gingival fibromatosis, J Clin Periodontol 2006, 33(6):393-400. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH, Key M, Welcher R, Harvey R, Atwood KN, Immunochemical Staining Methods Handbook, DakoCytomation, Carpinteria, California, 2001. Bostanci N, Ilgenli T, Pirhan DC, Clarke FM, Marcenes W, Attila G, Hughes FJ, McKay IJ, Relationship between IL-1A polymorphisms and gingival overgrowth in renal transplant recipients receiving cyclosporin A, J Clin Periodontol 2006, 33:771-778. Brigstock DR, The CCN family: a new stimulus package, J Endocrinol 2003, 178(2):169-175. Brunet L, Miranda J, Roset P, Berini L, Farre M, Mendieta C, Prevalence and risk of gingival enlargement in patients treated with anticonvulsant drugs, Eur J Clin Invest 2001, 31:781-788. Buduneli N, Kütükçüler N, Aksu G, Attila G, Evaluation of transforming growth factor-beta 1 in crevicular fluid of cyclosporine A-treated patients, J Periodontol 2001, 72(4):526-531. Castro LA, Elias LSA., Oton-Leite AF, de Spidula-Filho JV, Leles CR, Batista AC, Long-term effects of nifedipine on human gingival epithelium a histopathological and immunohistochemical study, J Oral Science 2010, 52(1):55-62. Clocheret K, Dekeyser C, Carels C, Willems G, Idiopathic gingival hyperplasia and orthodontic treatment case report. J Orthodontics 2003, 30(1):13-19. Coletta R, Graner E, Hereditary gingival fibromatosis: a systematic review, J Periodontol 2006, 77(5):753-764. Corrêa JD, Queiroz-Junior CM, Costa JE, Teixeira AL, Silva TA, Phenytoin-Induced Gingival Overgrowth: A Review of the Molecular, Immune, and Inflammatory Features, ISRN Dentistry 2011, Article ID 497850, 8 pages, doi:10.5402/2011/497850. Cristea AN, Negreş S, Marineci CD, Turculeţ IL, Chiriţă C, Brezină A, Popescu FD, Pavelescu M, Hriscu A, Dogaru MT, Vari CE, Mogoşan C, Popescu F, Cristescu C, Ţarălungă G, Tratat de farmacologie, Ediţia 1, Editura Medicală, Bucureşti, 2005. Cuttle L, Munns AJ, Scott JR, Hooper WD, Dickinson RG, Gillam EM, Phenytoin metabolism by human cytochrome P450: involvement of P450 3A and 2C forms in secondary metabolism and drug-protein adduct formation, Drug Metab Dispos 2000, 28(8):945-950.

- 22 -

De Angelo S, Murphy J, Claman L, Kalmar J, Leblebicioglu B, Hereditary gingival fibromatosis: a review, Compend Contin Educ Dent 2007, 28(3):138-143. Diamond ME, Sun L, Ottaviano AJ, Joseph MJ, Munshi HG, Differential growth factor regulation of N-cadherin expression and motility in normal and malignant oral epithelium, J Cell Sci 2008, 2197-2207. Drozdzik M, Mysliwiec K, Lewinska-Chelstowska M, Banach J, Drozdzik A, Gabarek J, P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene polymorphism in renal transplant patients with and without gingival overgrowth, J Clin Periodontol 2004, 31: 758-763. Ellis JS, Morgan CL, Kirby JA, Taylor JJ, Thomasson JM, Plasma TGF-β1 as a risk factor for gingival overgrowth, J Clin Periodontol 2004, 31(10):863-868. Giannobile WV, Committee on Research, Science and Therapy of The American Academy of Periodontology. The Potential Role of Growth and Differentiation Factors in Periodontal Regeneration, J Periodontol 1996, 67:545-553. Gurkan A, Afacan B, Emingil G, Toz H, Başkesen A, Atilla G, Gingival crevicular fluid transforming growth factor- β1 in cyclosporine and tacrolimus treated renal transplant patients without gingival overgrowth, Arch Oral Biol 2008, 53:723-728. Hallmon WW, Rossmann JA, The role of drugs in the pathogenesis of gingival overgrowth. A collective review of current concepts, Periodontol 2000, 1999, 21:176-196. Hinz B, Phan SH, Thannickal VJ, Galli A, Bochaton-Piallat ML, Gabbiani G, The myofibroblast. One function, multiple origins, Am J Pathol 2007, 170:1807-1816. Kalluri R, Weinberg RA, The basics of epithelial-mesenchymal transition, J Clin Invest 2009, 19:1420–1428. Kantarci A, Black SA, Xydas CE, Murawel P, Uchida Y, Yucecal-Tuncer B, Atilla G, Emingil G, Uzel MI, Lee A, Firatli E, Sheff M, Hasturk H, Van Dyke TE, Traskman PC, Epithelial and Connective Tissue Cell CTGF/CCN Expression in Gingival Fibrosis, J Pathol 2006, 210(1):59-66. Kantarci A, Nseir Z, Kim Y-S, Sume SS, Trackman PC, Loss of Basement Membrane Integrity in Human Gingival Overgrowth, J Dental Res 2011, 90(7):887-893. Kataoka M, Kido J, Shinohara Y, Nagata T, Drug-Induced Gingival Overgrowth-a Review, Biol Pharm Bull 2005, 28(10):1817-1821. Katzung BG, Basic & Clinical Pharmacology, ediţia a 10-a, McGraw Hill, New York, 2006. Kozak M, Kurzawski M, Wajda A, Lapczuk J, Lipski M, Dziewanowski K, Drozdzik M, TGF-β1 gene polymorphism in renal transplant patients with and without gingival overgrowth, Oral Dis 2011, 17:414–419. Kumar H, Kawai T, Akira S, Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun 2009, 388:621-625. Kessler D, Dethlefsen S, Haase I, Plomann M, Hirche F, Frieg T, Fibroblasts in mechanically stressed collagen latices assume a synthetic phenotype, J Biol Chem 2001, 276:36575-36585. Lafzi A, Zadeh Farahani RM, Shoja MM, Amlodipine-induced gingival hyperplasia, Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2006, 11:E480-482. Leask A, Abraham DJ, The role of connective tissue growth factor, a multifunctional matricellular protein, in fibroblast biology, Biochem Cell Biol 2003, 81(6):355-363. Lee JM, Dedhar S, Kalluri R, Thompson EW, The epithelial–mesenchymal transition: new insights in signaling, development and disease, J Cell Biol 2006, 172(7):973–981. Lopez-Novoa JM, Nieto MA, Inflammation and EMT: an alliance towards organ fibrosis and cancer progression, EMBO Mol Med 2009, 1:303-314. Mariotti A, Dental plaque induced gingival diseases, Ann Periodontol 1999, 4:7-17. Marshall RI, Bartold PM, A clinical review of drug induced gingival overgrowth, Aust Dent J 1999, 44:219-232. Martins RC, Werneck CC; Rocha LA, Feres-Filho EJ, Silva LC, Molecular size distribution analysis of human gingival glycosaminoglycans in cyclosporin- and nifedipine-induced overgrowths, J Periodontal Res 2003, 38:182-189.

- 23 -

McCullogh CA, Drug-induced fibrosis: interference with the intracellular collagen pathway, Curr Opin Drug Discov Devel 2004, 7:720-724. Meneghin A, Hogaboam CM, Infectious disease, innate immmune response and fibrosis, J Clin Invest 2007, 117:530-538. Müssig E, Steinberg T, Kohl A, Chamulitrat W, Komposch G, Tomakidi P, Discrimination of epithelium-like and fibroblast-like phenotypes derived from ethanol-treated immortalised human gingival keratinocytes in epithelial equivalents, Cell Tissue Res 2008, 332(1):57-71. Nanci A, Ten Cate’s Oral Histology, Development, structure and function, Sixth Edition, Ed. Mosby, USA, 2003. Navazesh M, Methods of collecting saliva, Ann NY Acad Sci 1993, 694:72-77. Okada H, Danoff TM, Kalluri R, Neilson EG, Early role of Fsp1 in epithelial-mesenchymal transformation, Am J Physiol 1997, 273:F563-F574. Palaiologou AA, Yukna RA, Moses R, Lallier ThE, Gingival and periodontal ligament fibroblasts express different extracellular matrix receptors, J Periodontol 2001, 72:798-807. Presland RB, Dale BA, Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease, Crit Rev Oral Biol Med 2000, 11:383-408. Prime SS, Pring M, Davies M, Paterson IC, TGF-β signal transduction in oro-facial health and non-malignant disease (part I), Crit Rev Oral Biol Med 2004, 15(6):324-336. Rifkin IR, Leadbetter EA, Busconi L, Viglianti G, Marshak-Rothstein A, Toll-like receptors, endogenous ligands, and systemic autoimmune disease, Immunol Rev 2005, 204(1):27-42. Rojo-Botello NR, Garcia Hernandez AL, Moreno-Fierros L, Expression of toll-like receptors 2,4 and 9 is increased in gingival tissue from patients with type 2 diabetes and chronic periodontitis, J Periodont Res 2012, 47:62-73. Ruhl S, Hamberger S, Betz R, Salivary proteins and cytokines in drug-induced gingival overgrowth, J Dent Res 2004, 83:322-326. Sarah SM, Tamilselvan S, Kamatchiammal S, Suresh R, Expression of Toll-like receptors 2 and 4 in gingivitis and chronic periodontitis, Indian J Dent Res 2006, 17:114-116. Schild C, Trueb B, Mechanical stress is required for high–level expression of connective tissue growth factor, Exp Cell Res 2002, 274:83-91. Seymour RA, Effects of medications on the periodontal tissues in health and disease, Periodontology 2000, 2006, 40:120-129. Sume SS, Kantarci A, Lee A, Hasturk H, Trackman PC, Epithelial to mesenchymal transition in gingival overgrowth, Am J Pathol 2010, 177(1):208-218. Takeda K, Akira S, Toll-like receptors in innate immunity, Int Immunol 2005, 17:1-14. Taylor BA, Management of drug-induced gingival enlargement, Austr Prescrib 2003, 26(1):11-13. Thiery JP, Sleeman JP, Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions, Moll Cell Biol 2006, 7:131-141. Trackman PC, Kantarci A, Connective tissue metabolism and gingival overgrowth, Crit Rev Oral Biol Med 2004, 15(3):165-175. Uzel MI, Kantarci A, Hong HH, Uigur C, Sheff MC, Firatli E, Connective tissue growth factor in phenytoin induced gingival overgrowth, J Periodontol 2001, 72:921-931. Vaughan S, Drug-induced gingival hyperplasia, RGH Pharmacy E-Bulletin 2009, 35(10):28 Verstappen J, Von de Hoff JW, Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMPs): their Biological Functions and Involvment in Oral Disease, J Dent Res 2006, 85(12):1074-1084. Wright HJ, Chapple ILC, Matthews JV, TGF-β isoforms and TGF-β receptors in drug induced and hereditary gingival overgrowth, J Oral Pathol Med 2001, 30:281-289. Wright HJ, Chapple IL, Blair F, Matthews JB, Crevicular fluid levels of TGFbeta1 in drug-induced gingival overgrowth, Arch Oral Biol 2004, 49:421-425. Wynn TA, Cellular and molecular mechanisms of fibrosis, J Pathol 2008, 214:199–210. Xu J, Lamouille S, Derynck R, TGF-β-induced epithelial to mesencymal transition, Cell Res 2009, 19:156-172.

- 24 -

Yamada H, Nishimura F, Naruishi K, Chou HH, Takashiba S, Albright GM, Nares S, Iacopino AM, Murayama Y, Phenytoin and cyclosporin A suppress the expression of MMP-1, TIMP-1, and cathepsin L, but not cathepsin B in cultured gingival fibroblasts,J Periodontol 2000, 71(6):955-960. Yoshimatsu Y, Watanabe T, Roles of TGF-β signals in Endothelial Mesenchymal Transition during Cardiac Fibrosis, Int J Inflammation 2011, Article ID 724080, 8 pagini Zia A, Khan S, Bey A, Gupta ND, Mukhtar-Un-Nisar S, Oral biomarkers in the diagnosis and progression of periodontal diseases, Biology and Medicine 2011, 3(2):45-52. www.graphpad.com 10. LISTA PRINCIPALELOR LUCRĂRI PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI

11.. Growth Factors and Connective Tissue Homeostasis in Periodontal Disease, Cătălina Pisoschi, Camelia Stănciulescu, Monica Baniţă. Chapter in the book: Pathogenesis and Treatment of Periodontitis, InTech Open Acces Publisher (published online from January 2012) 2. Evidence for the epithelial mesenchymal transition as a pathogenic mechanism of phenytoin induced gingival overgrowth, C Pisoschi, C Stănciulescu, C Munteanu, A M Fusaru, M Baniţă, Farmacia (in press), ISSN 0014-8237 3. Role of Transforming Growth Factor β1-Connective Tissue Growth Factor pathway in gingival overgrowth induced by dihydropiridine calcium channel blockers, C Pisoschi, C Stănciulescu, A M Fusaru, C Munteanu, M Baniţă, Rom J Morphol Embriol (in press), ISSN (print) 1220-0522 4. Phenytoin-induced gingival overgrowth – an immunohistochemical study of TGF-β1 mediated pathogenic pathways, Baniţă M, Pisoschi C, Stănciulescu C, Mercuţ V, Scrieciu M, Hâncu M, Crăiţoiu M, Farmacia 2011;59(1):24-33, ISSN (print) 0014-8237

5. Correlation between salivary level and tissue expression of connective tissue growth factor in gingival overgrowth. Pisoschi C, Baniţă M, Stănciulescu C, Fusaru AM, Ene M, Proceedings of the 41st Congress of Turkish Society of Periodontology, 168, Istanbul, May 2011 6. Salivary Transforming Growth Factor β1 – a possible risk factor for gingival overgrowth, Pisoschi C, Banita M, Gheorghita L, Stanciulescu C, Craitoiu M, Fusaru A.M., Archives of the Balkan Medical Union 2010, 45(1):18-22, ISSN 1583-6258 7. Myofibroblast involvement in collagen synthesis in gingival overgrowth, Monica Baniţă, Cătălina Pisoschi, Ana Marina Fusaru, Camelia Stănciulescu, Annals of the Romanian Society for Cell Biology 2010, XV(1): 129-135, ISSN 1583-6258 8. Influence of some mediators of extracellular matrix remodeling on angiogenesis in diabetic gingival overgrowth, C. Pisoschi, M. Baniţă, C. Stănciulescu, M. Fusaru, M. Gheorghiţă, FEBS Journal 2009, 276 (Suppl.1), 217, ISSN 1742-464X 9. Idiopathic gingival overgrowth – a morphological study and review of the literature, Monica Baniţă, Cătălina Pisoschi, Camelia Stănciulescu, Monica Scrieciu, Irina -Draga Căruntu. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 112(4):1076-1083, ISSN 0300-8738