Fluxurile metabolice celulare - mod de determinare in regimstationar (de crestere echilibrata a celulelor) - exemple

Fluxurile metabolice celulare - mod de determinare in regimstationar - - exemple -Cuprins1. Introducere2. Funcionarea fluxului metabolic3. Fluxometria 13C4. Dinamicia metabolic a analizei de flux5. Analiza universal a metabolismului staionar cu izotopi marcai 13C (13C MFA)6. Ratele fluxului metabolic local (RF)7. Fluxuri ale diferitelornivele de dezvoltare biologic i complexitate8. Observaii conclusive9. Bibliografie

IntroducereFluxurile metabolice i controlul acestora au ocupat atenia cercettorilor biochimiti de peste 40 de ani. Printre primele cercetri publicate se numr i cele ale lui Henrik Kacser (biochimist romn educat la Berlin) efectuate mpreun cu Burns (1973)

Fluxurile metabolice contribuie fundamental la intelegerea noastr asupra fenotipului metabolic i asupra mecanismelor de reglare celular. Analiza fluxurilor bazat pe izotopi stabili integreaz date experimentale ale reelelor biochimice i modelare matematic pentru msurarea fluxurilor invivo fr a fi necesar observarea direct a unui organism. n ultimii ani tehnicile fluxometrice bazate pe 13C au evoluat mult, posednd o diversitate experimental, analitic i matematic.

Funcionarea fluxului metabolicMetabolismul se definete ca fiind interacia dintre metabolii i enzime. Fluxurile metabolice asigur o citire cantitativ a funciilor celulare i, astfel, contribuie la inelegerea creterii celulare i a mentenanei acesteia, n aceeai msur n care celulele rspund la schimbrile mediului. Noiunea de flux metabolic este utilizat ca sinonim pentru toate reaciile i reelele de transport ale celulelor vii. Harta fluxurilor reflect funcionarea real a metabolismului celular i este un instrument analitic unic pentru toate domeniile de cercetare.Fluxurile metabolice nu pot fi msurate direct, dar pot fi deduse din alte elemente observabile. n cazul reaciilor de transport simplu ntre mediul celular i citosol, ratele brute de flux pot fi derivate din echilibrarea schimbrilor concentraiilor metaboliilor extracelulari. Cu toate acestea, folosind aceast metod de aproximare a fluxului, nu se obin informaii detaliate legate de fluxul intracelular sau de complexitatea tipologic i reglarea reelelor biologice. Funcionarea fluxului metabolicMonitorizarea profilului izotopilor stabili marcai a aprut ca o tehnologie cheie ce furnizeaz indicatori de flux bogai n informaii.n ultimii ani, fluxometria bazat pe izotopi stabili a evoluat ntr-o metodologie cu o mare diversitate de tehnici de marcare i abordri matematice, de multe ori chiar prin intermediul propriilor tehnologii care nu fuseser clasificate ntr-un concept unitar.

n figura 1 este prezentat taxonomia tehnicilor fluxometrice13C. Se pot observa principiile de baz, informaii despre int, ct i despre datele de intrare i ieire. Abordrile sunt prezentate pornind de la strategii cuprinztoare care s integreze toate datele disponibile, pn la simple metode ce put fi aplicate atunci cnd sunt disponibile sau dorite informaii limitateFigura 1. Taxonomia tehnicilor fluxometrice bazate peanaliza 13C

Fluxometria 13CTrasorii izotopici (2H,13C,14C,15N si alii) au fost utilizai nc din 1930 pentru a descoperi ci metabolice active, precum i mecanisme enzimatice n toate tipurile de organisme. n perioada imediat urmtoare a fost inventat termenul de fluxometrie 13C. Acesta este definit ca elucidarea detaliat a ratelor de flux metabolic intracelular utiliznd experimente cu izotopi 13C marcai (ILE = isotope labeling experiment). n prezent, termenul se refer la o clas de tehnici, pentru care analiza fluxului metabolic utiliznd 13C este un reprezentant specific.ILE pornete cu ajustarea cu precizie a parametrilor mediului de cultur, urmat de schimbarea substratului cu unul ce conine trasori. Dup ndeplinirea acestor condiii, sunt prelevate probe att n timpul dezvoltrii celulare, ct i dup moartea celulei. Metaboliii intra- i extracelulari sunt extrai i analizai n ceea ce privete concentraia i etichetarea lor, utiliznduse Spectrometria de Mas i Rezonana Magnetic Nuclear.Fluxometria 13CDate experimentale ce pot fi extrase:

Enzimele, metaboliii i maprile atomilor de carbon ce redau scheletul reelei atomice i rangul cinetic al reaciilor n care sunt implicate enzimele;

Moleculele etichetate i rspndirea spaial a acestora la diferite momente;

Ratele proceselor de extracie extracelular / formare, ce constituie un echilibru nchis la carbonului, respectiv compoziiabiomasei i rata de cretere

Fluxometria 13CMetoda este utilizat de mai bine de dou decenii, ns nu a fost lansat oficial niciun protocol standard. Un motiv major este dependena incert dintre cele trei subprotocoale implicate: cel biologic, cel analitic i cel de calcul.

Sistemul biologic care face obiectul investigaiei determin configurarea experimentului, trasorii i metodele de prelevare a probelor, precum i condiiile experimentale ale ILE (ex: lot, lotul nutrienilor, chemostratul). Toate acestea trebuie s fie reprezentative pentru starea metabolic de interes. n cele din urm, precizia i domeniul de aplicabilitate al rezultatelor scontate conduc la cadrul de evaluare matematic.

Fluxometria 13COdat ales, cadrul impune constrngeri asupra procedurilor experimentale i analitice. Echipamentele tehnice (eantionare), protocoalele (rcire imediat, lipsa pierderilor n procesele de extracie i separare) i metodele analitice (de identificare i cuantificare a metaboliilor) trebuie validate ntocmai, pentru a permite reproductibilitatea, calitatea i cantitatea datelor. n cadrul acestei ultime etape poate aprea riscul inaccesibilitii unor componente, ceea ce conduce la reconsiderarea cadrului experimentului.

Complexitatea modelelor utilizate determin puterea informaional a harilor de flux obinute. De cele mai multe ori, ns, se face un compromis ntre precizia rezultatelor, domeniul de aplicabilitate i costul de operare, compromis ce dicteaz alegerea final a tehnicii de lucru.Dinamicia metabolic a analizei de fluxCel mai solicitant tip de analiz de flux ncearc s estimeze fluxurile n conformitate cu condiiile metabolice i ale dinamicii izotopice. n cazul unei dinamici metabolice rapide, poate fi util doar o combinaie ntre modelul izotopic i cel mecanicistic, care se bazeaz pe ecuaiile de bilan corespunztoare: ecuaia cinetic i cea de etichetare. Din pcate, exist foarte puine date de ncredere legate de cinetica enzimatic in vivo, astfel, pentru efectuarea unui astfel de experiment este necesar recurgerea la presupuneri.n cazul unei dinamici moderate, profilele fluxurilor pot fi aproximate prin funcii de tipul PWA. Aceast metod deduce interpolri ale profilului fluxurilor, pornind de la marcare i variaia concentraiilor n timp, depinznd de explicitarea cineticii enzimatice. Cu toate acestea, PWA este o metod de calcul complicat, deoarece sistemele de ecuaii difereniale ordinare neliniare sunt implicate n estimarea comun a profilelor de dependen de timp ale fluxului i dezvoltrii celulare.Analiza universal a metabolismului staionar cu izotopi marcai 13C (13C MFA)Presupunnd o stare metabolic pseudo-staionar (fluxuri i dimensiuni constante), categoria mai puin complex de tehnici de analize ale metabolismului staionar 13C MFA vizeaz transportorii izotopici i regimurile staionare. Din nou sunt integrate ntr-o procedur global trei caracteristici: rspndirea n reea a izotopilor, ratele de flux extracelular i modelele de etichetare. n cazul aplicrii metodei n regim nestaionar, este necesar ncorporarea unui numr mai mare de trasori, pentru a se pune n comun parametrii modelului.Pentru a reduce i mai mult eantionul experimental i sarcina analizei, se poate presupune o independen a dimensiunilor n starea staionar, astfel fiind necesar prelevarea unei singure probe. n acest caz, amestecul de substrat ales devine extrem de important pentru calitatea informaiilor pe care le ofer.Analiza universal a metabolismului staionar cu izotopi marcai 13C (13C MFA)Pn n prezent, IST 13C MFA (Isotopic stationary 13C Metabolic Flux Analysis) este cea mai avansat tehnic, fiind frecvent utilizat n fluxometrie.

Pe pia sunt disponibile mai multe variante de software ce calculeaz fluxurile de marcare izotopic i ofer asisten n design-ul experimental. Algoritmii moderni de nalt performan faciliteaz investigarea dimensiunii reelelor genomice cu mai mult de 2000 de reacii i un milion de variabile de stare.

Ratele fluxului metabolic local (RF)Abordarea ratei de flux metabolic ofer acces intuitiv atunci cnd doar anumite puncte de ramificaie sunt de interes. Echilibrele masice ale izotopomerilor sunt formulate pentru metaboliii aflai pe ci convergente. Discrepana distribuiei masice ntre precursori i produse permit calcularea direct a fluxurilor relative.

Abordarea ratei de flux este nerealizabil atunci cnd tipologia reelei este neclar, iar evaluarea ratelor de flux extracelulare sunt dificil de realizat. Cu toate acestea, analiza ratelor fluxurilor sunt foarte adaptate la tipologiile specifice de reele, ipotezele direcionalitii fluxului i la compoziia substratului marcat. Prediciile celor mai muli trasri informaionali necesit un model mai vast, ceea ce exclude designul experimental realizat prin intermediul ratelor fluxului metabolic local.

Fluxuri ale diferitelor nivele de dezvoltare biologic i complexitateInvestigaiile fluxometrice tradiionale se ocup cu planificarea experimentelor nalt performante i standardizate, de obicei pentru un singur organism cultivat n bioreactor. De fapt, multe sisteme biologice implic medii reale mult mai puin controlate. Complexitatea crete cu nivelul de organizare biologic a celulelor unice din esuturi i organe, respectiv a ntregului organism. Modelarea acestor sisteme este ngreunat de prezena gradienilor fizico-chimici i a interaciilor celulare. Aceste nivele de complexitate biologic trebuie s fie reprezentate de modele mai vaste, altfel trebuiesc formulate cerine mai mici legate de precizia i rezoluia rezultatelor. Dezvoltarea tehnologic i tendinele recente devin evidente din schema bidimensional prezentat n continuare.

Figura 2. Clasificarea bidimensional a nivelelor de dezvoltare celular

Observaii conclusivePn n prezent, principalul obstacol n fluxometria izotopic este reprezentat de lipsa rezoluiei spaiale a msurtorilor.

Pentru a rezolva fluxurile structurilor biochimice complexe, precum esuturile, organele i transportul ntre diferite celule, acestea trebuiesc tratate spaio-temporal. Aici intervin tehnicile de imagistic precum NanoSIMS i SRS.

Noi tehnici automatizate pentru laborator, ce vor permite msurarea fluxurilor metabolice celulare cu un randament sporit, sunt n curs de dezvoltare. BibliografieSebastian Niedenfhr, How to measure metabolic fluxes: a taxonomic guide for13C fluxomics, Current Opinion in Biotechnology, 34, 2015; 82-90.

Christopher P Long, Metabolic flux analysis ofEscherichia coliknockouts: lessons from the Keio collection and future outlook, 28, 2014; 127-133.

Wolfgang Wiechert, Mechanistic pathway modeling for industrial biotechnology: challenging but worthwhile, 22, 2011; 604-610.

Nicola Zamboni, Novel biological insights through metabolomics and13C-flux analysis, 12, 2009; 553-558.

V MULUMESC PENTRU ATENIE!