Tehnici Avansate În Biologie Moleculară_ver.4
-
Upload
mariana-darii -
Category
Documents
-
view
131 -
download
7
description
Transcript of Tehnici Avansate În Biologie Moleculară_ver.4
1
Universitatea Academiei de Ştiinţe a Moldovei
OLEG BUDEANU şi VICTOR CROITORU
TEHNICI AVANSATE ȋn BIOLOGIA MOLECULARĂ
Chisinau, 2013
2
CUPRINS:
ȊNTRODUCERE ............................................................................. 6
CAPITOLUL 1. ............................................................................... 7
Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ........................................................................... 7
1.1. Amplificarea genei de interes. .............................................. 8
1.2. Enzime de restricţie ................................................................ 14
1.3. Ligarea fragmentelor de ADN ................................................ 16
1.4. Vectori de clonare ................................................................... 17
1.5. Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă .......... 22
1.6. Electroforeza acizilor nucleici ................................................ 24
1.7. Exprimarea genelor în sistem procariot .................................. 30
1.8. Purificarea proteinelor recombinate ....................................... 32
1.9. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare .......................................... 34
CAPITOLUL 2. ............................................................................. 37
Tehnici moleculare utilizate in selecţia asistată de markeri genetici ....................................................................................................... 37
2.1. TEHNICA PCR ..................................................................... 37
2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR ........................................ 41
2.2.1. Tehnica RFLP ...................................................................... 41
2.2.2. Tehnica AFLP...................................................................... 44
2.2.3. Tehnicile MAAP.................................................................. 48
2.2.3.1. Tehnica RAPD .................................................................. 49
3
2.2.3.2. Tehnica DAF .................................................................... 52
2.2.3.3. Tehnica AP – PCR ............................................................ 52
2.2.4. Tehnica RT – PCR ............................................................... 53
2.2.5. Tehnica microsateliţilor - SSR ............................................ 54
2.2.6. Tehnica EST ........................................................................ 55
2.2.7. Tehnica SCAR ..................................................................... 56
2.2.8. Tehnica SNP ........................................................................ 56
2.2.9. Tehnica STS ........................................................................ 57
2.2.10. Tehnica ARMS –PCR ....................................................... 58
2.3. TEHNICA SSCP ................................................................... 59
2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENŢIERE .............................. 60
CAPITOLUL 3. ............................................................................. 64
Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare ............................................................................. 64
3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze ................ 64
3.2. Producerea de proteine recombinate ....................................... 66
3.3. Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor ......................... 67
3.4. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N ..................................... 69
3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizaţi ....................................... 70
3.6. Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă 71
3.7. Sinteza de aminoacizi marcaţi ................................................ 72
3.8. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor................ 75
3.9. Aplicaţii ale bionanotehnologiilor .......................................... 75
3.10. Diagnostic ............................................................................. 76
CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE ..................................... 81
4
4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale ..................... 81
4.2. Culturi primare ....................................................................... 83
4.3. Culturi secundare .................................................................... 83
4.4. Culturi de celule imortalizate ................................................. 84
4.5. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu ......................................................................................... 84
4.6. Anticorpii monoclonali ........................................................... 85
4.7. Celule stem ............................................................................. 88
CAPITOLUL 5. ............................................................................. 92
Aparatajul disponibil şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente .......................... 92
5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ............................. 92
5.2. Strategii de lucru ..................................................................... 95
5.3. Instruirea personalului ............................................................ 97
5.4. Asigurarea asepsiei şi antisepsiei ........................................... 98
5.5. Cultivarea celulelor ................................................................. 99
5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora ....................................................... 100
5.7. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor ....................................... 101
5.8. Subclonarea şi tripsinizarea .................................................. 103
CAPITOLUL 6. Producerea şi izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere ........................................................................... 104
6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi ................. 105
6.2. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii a culturilor celulare. ................................................. 111
CAPITOLUL 7. ........................................................................... 119
5
Cromatografia şi cromatofocalizarea. Principii și metode .......... 119
7.1. Cromatografia de schimb ionic............................................. 119
7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. ............................................. 121
7.3. Interacțiunea hidrofobă ......................................................... 124
BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 126
6
ȊNTRODUCERE Clonarea genelor a devenit o tehnică indispensabilă în
laboratoarele de biologie moleculară. Tehnica PCR sau reacţia în lanţ a polimerazei, dezvoltată la mijlocul anilor ’80, a revoluţionat genetica moleculară, făcând posibilă studierea şi analiza genelor prin metode mult mai accesibile şi uneori foarte simple.
Una dintre aplicaţiile clonării genelor, importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii interdisciplinare, este utilizarea clonării în scopul obţinerii de proteine recombinate. Astfel, clonarea genelor şi exprimarea lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. Ulterior, aceste proteine recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice, unde biomoleculele sunt etalonate folosind tehnici cromatografice care le separă potrivit diferențelor în proprietățile lor biochimice specifice. Se disting cateva variațiuni ale tehnicilor cromatografice ca gel filtrarea, interacțiunea hidrofobă, afinitatea cromatografică si faza cromatografică reversă.
In aceasta ediție, in paralel cu biosinteza proteinelor la procariote, prezentăm producerea si izolarea proteinelor recombinate din celule eucariote, cum ar fi culturile celulare primare, secundare, producerea anticorpilor monoclonali si policlonali, utilizarea celulelor stem in propagarea ADN-ului manipulat genetic.
In final, tendinţele actuale în aplicarea bionanotehnologiilor sunt prezentate, prin aplicații in diagnosticul molecular, implicații in medcina legala, genetica umana, markerii genetici, si diverse aspecte practice ale geneticii moleculare interdisciplinare.
Aceasta ediţie are ca auditoriu-ţinta tineri specialişti in biologia moleculară si genetica aplicată cu aspiraţii ȋnalte spre realizări de performanţa ȋn domeniul ales.
7
CAPITOLUL 1.
Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ADN în sine are doar două funcţii importante şi anume păstrarea
informaţiei genetice şi furnizarea acesteia pentru biosinteza de proteine.
Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o
generaţie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN-ului şi
împărţirea egală a celor două copii în timpul diviziunii celulare. A doua
funcţie este legată de descifrarea informaţiei pentru biosinteza de
proteine. Mesagerul informaţiei între ADN şi proteine este ARN-ul,
care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o enzimă
numită ARN polimeraza. ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul
de traducere a ADN-ului, prin biosinteza proteinelor, care are loc în
ribozomi. Practic ARN-ul este purtatorul informaţiei din nucleu în
citoplasmă unde are loc biosinteza proteinelor. Dogma centrală a
biologiei moleculare presupune transmiterea unidirecţională a
informaţiei de la ADN – la proteine, prin intermediul ARN. Informaţia
genetică nu poate fi transmisă invers, de la proteine la ADN. Uneori,
informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul
retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu există cazuri de
transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine [2].
Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi
introducerea ei în alte celule gazdă pentru multiplicare şi în unele cazuri
pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot
8
obţine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonării
constă din următoarele etape:
• amplificarea genei de interes
• introducerea genei de interes într-un vector de clonare
• introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă
• selecţia celulelor transformate (purtătoare ale moleculei
recombinate)
• verificarea moleculelor recombinate
1.1.Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie
într-o moleculă de ARN. Moleculele de ARN rezultate în urma
transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii: ARN funcţional si ARN
informaţional.
ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte
anumite funcţii în celulă (în cea mai mare parte participă la procesul de
traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă: ARN
ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). Pentru asamblare in
ribosomi maturi ARNr are nevoie de proteine ribosomale structurale si
de ARN chaperoni [18].
ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un
polipeptid şi serveşte ca matriţă în procesul de traducere (biosinteză a
proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul
clonării codifică un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este
obligatoriu o genă, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat
dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. Din
9
această cauză în continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN
de interes pentru a evita confuziile [2].
Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un
genom este necesară extragerea acestuia. Există două modalităţi de a
obţine fragmentul dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin
copierea acestuia. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă
deoarece necesită prezenţa unor situsuri (secvenţe specifice) la capetele
fragmentului, care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente
generate, iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică.
A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea
mai des utilizată. În acest scop se utilizează tehnica PCR (Polymerase
Chain Reaction) [44]. Această tehnică poate fi considerată un adevărat
copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă
deoarece necesită cantităţi foarte mici de ADN matriţă. O condiţie
obligatorie pentru o amplificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă,
în special la capetele acesteia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci
se vor analiza cel puţin secvenţe ADN omoloage de la alte specii sau
secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă.
Principiul tehnicii PCR este o imitaţie a procesului de replicare a ADN
care are loc în celule. Dacă în celule pentru replicare se foloseşte o
întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii
factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN [2].
Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene.
Procesul este reversibil, catenele complementare formând molecula
10
dublu catenară după înlăturarea agentului de denaturare. Reacţia de
amplificare este una ciclică, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:
• denaturarea ADN
• alinierea amorselor
• sinteza catenei complementare de către ADN polimeraza.
Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene.
Ca agent denaturant se utilizează temperaturi înalte de 94-98ºC.
Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece
pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari,
e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare după primul ciclu sunt
mai scurte, doar de 30-45 sec.
Amorsele (termenul englez este primer), denumite şi
oligonucleotide, sunt secvenţe scurte de ADN monocatenar. Aceste
amorse sunt complementare cu extremităţile secvenţei ţintă şi
formează cu acestea porţiuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea
amorselor la secvenţele complementare, temperatura este coborâtă la
40-60ºC timp de câteva zeci de secunde. Această etapă este numită de
aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabileşte la câteva
grade (2-5ºC) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei.
Temperatura de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei
şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de calcul, cea mai simplă
formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:
Tm=4(G+C)+2(A+T),
unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze
azotate. Numărul de G şi C se înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece
11
între acestea există trei legături de hidrogen, în consecinţă moleculele
bogate în G şi C au o temperatură mai mare de topire [2].
Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:
• numărul de nucleotide este de 15-35,
• temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 ºC şi 70ºC,
• conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%,
• la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoarece oferă o
stabilitate mai mare,
• amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă, în caz
contrar amorsa poate forma secvenţe interne dublu ca-tenare care au
aspect de stem sau buclă,
• cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu tre-buie sa
fie complementare între ele, altfel se vor forma porţi-uni dublu catenare
sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica porţiunile scurte
rămase monocatenare.
De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă
şi amorsa ADN, polimeraza poate iniţia sinteza catenei complementare.
ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia
5'→3' (Figura 1.1). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea
fragmentului amplificat, dar şi ca punct start pentru ADN polimerază,
care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'.
Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza
izolată din bacteria Escherichia coli, care are activitatea optimă de
sinteză la 37°C. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era
inactivarea termică în timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de
12
reacţie trebuiau schimbate de la o temperatură la alta şi după fiecare
ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază.
Astfel, amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte
costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi
descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima
revoluţionară în acest sens, pe larg utilizată şi astăzi este Taq
polimeraza. Această enzimă este o ADN polimerază, izolată din o
bacterie termofilă Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei),
care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat într-un lanţ
polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Taq polimeraza are activitatea optimă
la 72°C şi nu se denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C
foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de activitate este
nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de
aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongării necesare
sinte-zei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă. Pentru un
fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un
fragment de 2000 de nucleotide – două minute [2].
Prin implementarea tehnicilor de mai sus este posibil de generat
mutații in ADN-ul genomic şi plasmidic, deleții ale genelor esenţiale si
caracterizarea mutanților funcţionali in gene esenţiale pentru viabilitatea
prokariotelor [16].
13
Figura 1.1. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.
Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere
inversă. Acest tip este asemănător PCR obişnuit, doar că foloseşte o
matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de
această sinteză este transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN
polimerază ARN-dependentă. Taq polimeraza este o ADN polimerază
deoarece sintetizează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează
o matriţă ADN pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la
virusurile care au material genetic ARN şi în momentul intrării în celulă
necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. RT-PCR se
utilizează pentru obţinerea copiilor de gene eucariote care nu conţin
introni şi analiza exprimării de gene. În ambele cazuri se porneşte de la
ARNm, fiind ARN informaţional care codifică proteine.
14
1.2. Enzime de restricţie Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie
molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri
specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN.
Restrictazele recunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri
specifice de recunoaştere, se fixează de acestea şi taie legăturile
fosfoesterice între nucleotide.
Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că
funcţia lor este de apărare contra bacteriofagilor (virusuri ale
bacteriilor). În momentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de
restricţie digeră aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat
contra enzimelor de restricţie prin metilarea unor baze azotate, enzimele
de restricţie, în general, nu taie ADN metilat. Până acum au fost
descrise 4000 de enzime de restricţie de la câteva sute de specii
bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I, II şi III. Această
clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de
recunoaştere. Enzimele cele mai utilizate în tehnicile moleculare sunt
cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi
utilizează ioni de Mg2+ ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită
din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele catene în direcţia 5′→3′ este
identică.
Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea
bacteriei de la care a fost izolată. Astfel, HindIII este izolată de
Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli
tulpina RY13 [2].
15
Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi
de 2 tipuri: coezive sau drepte. Enzima BamHI şi EcoRI generează
capete coezive după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează
capete drepte sau netede (Figura 1.2).
Figura 1.2. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi
SmaI (B) şi capetele libere după tăiere. Locurile de restricție sunt
indicate cu săgeţi [2].
Cu ajutorul unor programe specializate se pot alcătui hărţi de
restricţie care reprezintă situsurile de recunoaştere pentru diferite
restrictaze într-o secvenţă (Figura 1.3).
16
Figura 1.3. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces
cerevisiae. Cu cifre în parantezesunt indicate situsurile enzimelor de
restricţie [2].
1.3. Ligarea fragmentelor de ADN Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea
nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu există nici un lipici special.
Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită
ADN ligaza. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între
gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3′) şi gruparea fosfat de la
nucleotidul altui fragment (capătul 5′) (Figura 1.4). Funcţia ligazei în
celule vii este legarea fragmentelor în timpul replicării, recombinării şi
după repararea ADN. Cea mai des utilizată este ADN ligaza T4 izolată
din bacteriofagul T4. In acțiune, ADN ligaza T4 utilizează ATP-ul ca şi
cofactor.
17
Figura 1.4. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a
două fragmente ADN care au capete netede [2].
1.4. Vectori de clonare Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN
transportatoare ale fragmentului de ADN străin în celulele gazdă.
Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi
vectori artificiali. Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul
clonării. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o
moleculă dublu catenară de ADN, care este circulară, închisă şi capabilă
de replicare autonomă în celule gazdă. Plasmidele comerciale utilizate
pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost
modificate. Plasmidele au nişte secvenţe specifice necesare replicării,
clonării, selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pentru replicarea
autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa ori, care este
originea de replicare. Nici o moleculă de ADN nu poate fi replicată fără
o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei
de ADN de unde poate începe replicarea şi care este recunoscută de
anumite proteine care iniţiază replicarea.
18
O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este
Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning
Site). În această regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu
ajutorul enzimelor de restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi
fragmentul ADN sunt tăiate cu aceleaşi enzime de restricţie şi legate
împreună cu ajutorul ligazei. SMC conţine secvenţele de recunoaştere
pentru mai multe enzime de restricţie care nu se conţin în altă regiune a
vectorului [2].
O altă componentă foarte importantă a plasmidelor sunt markerii
de selecţie care sunt de obicei nişte gene, a căror produs (enzimă) fac
posibilă selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt
mai numeroase. Cei mai frecvenţi markeri utilizaţi sunt genele ce
conferă rezistenţă la antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă
rezistenţă. Spre exemplu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină.
Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă vor proteja celulele
bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dacă un amestec de celule
transformate cu plasmide care vor conţine atât celule cu, cât şi fără
plasmid, se însămânţează pe un mediu cu ampicilină, vor supravieţui
doar celulele care conţin plasmidul.
Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu
plasmid recombinat adică cu insert de cele cu plasmid fără insert. Insert
se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul
multiplu de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în
SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intactă,
produsul ei este o proteină activă. Dacă în SMC a fost introdus un
19
fragment ADN atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv.
Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZ′ care codifică subunitatea
α a enzimei β-galactozidază, atunci produsul acestei gene împreună cu
subunităţile codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o
enzimă activă capabilă să metabolizeze un derivat al galactozei numit
X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în
mediu şi este incolor. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va
metaboliza acest substrat, iar produsul format în urma reacţiei va avea o
culoare albastră. În acest fel coloniile rezultate după transformare care
conţin vectorul fără insert vor fi albastre, iar cele ce conţin vector
recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă activă capabilă
de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie utilizează o
enzimă toxică pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid
fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor.
Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena
nefuncţională şi vor supraveţui [2].
Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva
mii de pb şi în care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb până
la 2000-5000 pb (Figura 1.5). O caracteristică importantă pentru
plasmide este numărul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici
au de obicei un număr mai mare de copii per celulă. Acest fapt permite
obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de
bacterii (din 3-5 ml de cultură se pot obţine câteva μg de ADN
plasmidic). Pentru vectorii mai mari numărul copiilor per celulă este
20
mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN
este necesară o cantitate mai mare de cultură.
Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar
care oferă în plus posibilitatea exprimării genei clonate. Plasmidele de
exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus faţă de vectorii
de clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc în genom şi fac
parte dintr-o genă: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii
START şi STOP care delimitează cadrul deschis de citire (termenul
englez este Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se
află în amonte de genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care
se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază transcrierea. Numai în
prezenţa promotorului exprimarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul
de legare al ribozomilor (termenul englez este Ribosome Binding Site)
este o secvenţă care se transcrie dar care nu se traduce şi care este
recunoscută de ribosomi. Ribosomii se leagă la acest situs şi se
deplasează de-a lungul ARNm până întâlnesc primul codon START de
unde începe traducerea. Codonul START la procariote este în cele mai
dese cazuri AUG, urmat de codonul +2, care este necesar sa nu fie cu
frecvența de decodare rara, pentru a nu ȋncetini miscarea in vivo a
ribosomilor pe mARN [17]. Aceşti doi codoni sunt de obicei incluşi în
situsul multiplu de clonare, sau se pot introduce în fragmentul ţintă cu
ajutorul amorselor. In contrast, codonul STOP (UAA, UGA) este inclus
de obicei în situsul de clonare. Unerori UGA poate fi recodat in
selenocisteina [75]. În unele cazuri UAA este prezent după regiuni care
codifică anumite aşa-zisele etichete. Acestea din urmă facilitează
21
purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele
mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-
transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei (Maltose Binding
Protein, MBP este termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte
integrantă a proteinelor la capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă
secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau înainte de situsul de
clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate
afinitate faţă de anumite răşini cromatografice [2].
Figura.1.5 Reprezentarea a plasmidei pTN48 [9].
22
1.5. Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se
numeşte transformare dacă sunt utilizate celule bacteriene sau
transfecţie dacă sunt utilizate celule eucariote. În continuare se va
detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea având cea mai
mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi
proteinelor recombinate. Există două tipuri de transformare a celulelor
bacteriene pe larg utilizate în laboratoarele de biologie moleculară:
• transformarea chimică
• transformare sub influenţa câmpului electric.
Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei
competenţe de transformare, deoarece E. coli nu are proprietăţi de
transformare naturală. Această competenţă în cazul transformării
chimice este indusă cu CaCl2. În acest scop se realizează o cultură de E.
coli şi prin tratarea celulelor cu clorură de calciu la rece se poate induce
transformarea celulelor bacteriene (Figura 1.6A). Apoi celulele sunt
şocate termic foarte scurt, timp de maxim două minute, la 42°C. Acest
timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele
bacteriene.
Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât
transformarea chimică. Prepararea celulelor competente presupune doar
creşterea lor până în faza logaritmică (D600nm = 0,6 - 0,8) şi înlăturarea
prin spălări repetate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor
asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip
de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va
23
crea câmpul electric între doi electrozi. Amestecul de celule competente
şi plasmide recombinate vor fi depuse într-o cuvă specială de
electroporare, ai cărei pereţi laterali sunt electrozii. Transformarea are
loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura
1.6B). După transformare celulele şocate sunt preluate în mediu de
cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice [2].
Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare
parte dintre ele fiind netransformate, adică fără plasmid. Eficienţa de
transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o
cantitate de 1 ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile
rezultate. Numărul de colonii va corespunde numărului de celulele
transformate deoarece fiecare colonie ia naştere dintr-o singură celulă.
Numărul obţinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se
raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoarea la 1000). O eficienţă
bună de transformare este 106, ceea ce înseamnă ca la transformarea
unui μg de plasmid s-ar obţine 1 milion de colonii, o valoare foarte
mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie sau de
câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în
amestecul de ligare numărul de molecule recombinate este mic şi din
aceas-tă cauză este recomandată o eficienţă cât mai mare a celulelor
competente.
Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă
avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa de transformare şi de costuri.
Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar
mai ieftină deoarece nu necesită aparataj şi cuve costisitoare.
24
Figura 1.6. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic [2].
A – transformarea chimică cu CaCl2;
B – electroporarea celulelor bacteriene.
1.6. Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină
într-un câmp electric. Migrarea moleculelor se realizează printr-o
matrice specifică. Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a
acizilor nucleici. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza
proteinelor în condiţii denaturante în gel de poliacrilamidă (termenul
englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice şi
pentru electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a
separării fragmentelor de ADN, mai ales în cazul fragmentelor mici.
Această matrice este folosită mai rar în laboratoarele de analize
genetice, deoarece este mai laborioasă. Primul loc în utilizarea
vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de agaroză.
25
Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă, ea este
utilizată cu succes deoarece este mai simplă.
Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită
grupărilor fosfat. Această sarcină face posibilă migrarea moleculelor de
ADN şi ARN într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de
molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză.
Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele
mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi în
dependenţă de masa lor moleculară. Pentru estimarea aproximativă a
mărimii fragmentelor în acelaşi gel, dar în godeu separat se va migra un
amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest
amestec de molecule se numeşte marker molecular ADN.
Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile
de agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon
specific. Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1% şi 3% în
dependenţă de scopul urmărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai
mare, cu atât mărimea porilor va fi mai mică. La concentraţii mai mici
de agaroză, porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. În
concluzie concentraţii mai mici se folosesc pentru fragmente mari
(câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru fragmente mici. Gelurile
de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea
moleculelor între 0,1 şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt plasate între
cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de migrare. Acest
tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folosite
tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA).
26
Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este
necesară utilizarea unui colorant. Cel mai des folosită în acest scop este
bromura de etidiu, care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine
fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 1.7). Bromura de etidiu
se intercalează între bazele azotate din molecula dublu catenară de
ADN. Lungimea de undă a luminii ultraviolete la care este expus gelul
trebuie să fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.
Figura 1.7. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei
în gel de agaroză.
Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea
şi purificarea ADN. Vizualizarea ne oferă informaţii despre integritatea
ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor
enzimatice, estimarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de
extracţie. ADN poate fi purificat din gel de agaroză după migrare prin
27
excizarea fragmentului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special
predestinate acestui tip de purificări [2].
Verificarea moleculelor recombinate
Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-
18 ore de la transformare când apar coloniile de E. coli pe mediu
selectiv. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a
clonării, deoarece acestea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi
colonii cu plasmid fără insert. Chiar dacă se foloseşte un sistem alb-
albastru de selecţie a coloniilor pozitive, acestea necesită totuşi o
dovadă în plus a prezenţei plasmidului recombinat. În acest scop se va
efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va
însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu
agitare la 37°C. Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica
ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor
kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie
enzimatică şi apoi prin secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se va
realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus în vector
sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această
digestie va confirma prezenţa insertului în plasmid şi aproximativ
mărimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa
fragmentului clonat.
Secvenţierea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a
clonării. Această verificare este necesară deoarece ADN polimeraza
utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori
28
de sinteză. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN
polimerază care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de
ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza
ş. a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigură
de obicei randamente de sinteză mai mari. În unele cazuri se utilizează
un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu
polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate
crescută [2].
Analizatoarele genetice din seria ABI Prism, produse de Applied
Biosystems (SUA), au laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi, şi ȋn
actiunea sa utilizează principiul Sanger de secvenţiere. Acest principiu
presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secvenţiere. Matriţa
ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată, apoi la unul din
capetele sale are loc ataşarea unei amorse de la care ADN polimeraza
va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conţine
dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar şi di-dezoxiribonucleozide
trifosfat (ddNTP) care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a
dezoxiribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă continuarea
sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul
nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare
(deoarece se foloseşte o singură amorsă) de diferite mărimi. Numărul de
cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se
opresc în toate punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor,
fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente
rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care
29
presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul
micrometrilor. O cantitate de câţiva microlitri vor fi separaţi în gelul din
capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de mărimea
lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. În ultima
parte a capilarului există o fereastră transparentă prin care un fascicol
laser va excita fluorocromii, iar fluorescenţa emisă va fi captată şi
prezentată sub forma unei electroforegrame (Figura 1.8).
Electroforegramele sunt apoi analizate şi comparate cu secvenţa
existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot fi
secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari
sau pentru matriţe dificile (cu secvenţe repetitive) este necesară
utilzarea unor kituri speciale [2].
Figura 1.8. Electroforegrama unei secvenţe obţinută cu ajutorul
analizorului ABI Prism 310.
30
1.7. Exprimarea genelor în sistem procariot Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile:
multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate.
Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când
ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi
separate cu ajutorul electroforezei şi la care se urmăreşte cunoaşterea
secvenţei. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un
vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate.
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine
recombinate. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă,
care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi de ce
cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul
exprimării genei şi obţinerii de proteină recombinată include câteva
aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate
fi clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare
conţin neapărat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei
gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START (AUG) şi
unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important în
acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire, adică împărţirea
exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul.
Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai
des utilizat inductor este IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid),
care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de
la Novagen asigură de obicei o supraexprimare a genelor clonate.
Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7, situsul de
31
recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul multiplu de
clonare şi codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Dacă se optează
pentru prezenţa unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei
pentru facilitarea purificării, atunci din genă se va înlătura codonul
STOP. Dacă această etichetă nu este necesară, atunci în genă se va
păstra codonul STOP şi traducerea se va opri înainte de etichetă.
Promotorul T7 nu este recunoscut de către ARN polimeraza de la E.
coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bacteriene nu va sigura
o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin
gena pentru ARN polimerază de la fagul T7. Această genă se află sub
controlul promotorului lac UV5 şi a operatorului lac.
Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină
numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau
analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi
împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este
gena pentru T7 ARN polimerază. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va
exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este
codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi
în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un
analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul
lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel
promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care
va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va
recunoaşte promotorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest
sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o
32
producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale
bacteriene.
Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină
numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau
analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi
împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este
gena pentru T7 ARN polimerază. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va
exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este
codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi
în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un
analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul
lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel
promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care
va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va
recunoaşte promotorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest
sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o
producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale
bacteriene [2].
1.8. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode
cromatografice. Pentru o purificare cât mai bună din amestecul total de
proteine este necesară purificarea în cel puţin două etape prin metode
cromatografice diferite.
Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură
purificarea proteinelor într-o singură etapă, ceea ce reduce timpul
33
necesar şi asigură randamente de purificare mai mari (Figura 1.9). Dacă
eticheta deranjează în analiza ulterioară a proteinei, atunci se poate
recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. În acest scop
pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţine situsul
pentru peptidază, cum este spre exemplu situsul pentru trombină în
cazul plasmidului pET28 [2].
Figura 1.9. Reprezentarea schematică a purificării de proteine
recombinate prin cromatografie de afinitate.
34
1.9. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare
Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică
indispensabilă în laboratoarele de biologie moleculară. Una dintre
aplicaţiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar şi
pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de
proteine recombinate. Clonarea genelor şi exprimarea lor în celule
gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. În cele mai multe
cazuri purificarea unei proteine din celulele în care aceasta se exprimă
în mod firesc natural prezintă mai multe dificultăţi:
• cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre
exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesară o
cantitate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul purificărilor
în câteva etape pot fi sub 100 mg de proteină;
• obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este
aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu
putem să le cultivăm în condiţii de laborator;
• obţinerea materialului pentru purificare implică probleme
etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obţinerea de
proteine din celule umane ar fi imposibilă;
• purificarea se face în mai multe etape care necesită timp,
consumabile şi are randamente mai mici.
Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic
sunt eliminate în cazul exprimării genelor în celule gazdă. Un mare
avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care
pot dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea
35
proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutageneză pot fi introduse
mai multe tipuri de mutaţii:
• mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;
• deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi
înlăturate;
• inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena
codificatoare şi respectiv în proteina recombinată;
• fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei
proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea
N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu capătul
C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;
• proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate
cu anumite molecule care sunt introduse în proteine în procesul lor de
sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este marcarea
proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod specific sau
randomizat. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor
cu proteine fluorescente, care apoi facilitează detecţia lor.
Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este
tehnica la care se apelează cel mai des, deoarece este mai rapidă şi mai
puţin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de
organizare, astfel o proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi
cuaternară. Exprimarea genelor şi sinteza proteinelor în celulele
procariote asigură doar structura primară exactă a polipeptidului
sintetizat. În unele cazuri proteinele adoptă structura secundară
independent după sinteză, în alte cazuri este nevoie de condiţii speciale
36
şi alte proteine care contribuie la adoptarea conformaţiei proteinei
active. Unele proteine atât de la eucariote cât şi de la procariote
sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o structură
secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplasmă
formează corpi de incluziune. Există cazuri când acumularea proteinei
sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune
oferă posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii
denaturante.
Proteinele denaturate purificate în acest mod pot fi utilizate
pentru imunizarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai
important aspect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a
proteinei şi nu structura ei secundară sau terţiară. Exprimarea
proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza
apartenenţei genei sau pe baza analizei structurii primare. O altă
problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Cauzele
neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Un alt
dezavantaj (deşi în unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificărilor
post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacteriene.
Majoritatea proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări
conformaţionale dar şi modificări post-traducere cum ar fi fosforilări,
glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară,
atunci se va recurge la clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea
ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-traducere este un
avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte
să se cunoască rolul grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest
37
fel proteina recombinată nu va fi modificată şi se va putea deduce rolul
acestor grupări în activitatea proteinei [2].
CAPITOLUL 2.
Tehnici moleculare utilizate in selecţia asistată de markeri genetici
2.1. TEHNICA PCR Tehnica PCR sau reacţia în lanţ a polimerazei, dezvoltată la
mijlocul anilor ’80, a revoluţionat genetica moleculară, făcând
posibilă studierea şi analizarea genelor prin metode mult mai
accesibile şi foarte simple. Această tehnică a fost descoperită de Kary
Mullis în anul 1983, plecând de la caracteristicile replicării ADN şi
anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizează o catenă a
ADN ca matriţă pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin
această tehnică se produc un număr enorm de copii a unor
secvenţe de ADN (gene) fără a se apela la clonare [44].
Tehnica PCR exploatează unele caracteristici ale replicării
ADN, unde pentru amplificarea secvenţei de ADN dorite se utilizează
o secvenţă de oligonucleotide numită primer sau amorsă. Primerii sunt
secvenţe scurte de 15 – 35 nucleotide, complementare capetelor 3’
ale secvenţei de ADN ce se doreşte a fi amplificată; ei sunt specifici
fiecărei gene şi sunt sintetizaţi cu ajutorul unor sintetizatoare
automate de ADN. Pentru amplificarea secvenţelor specifice de
ADN, prin tehnica PCR, se foloseşte o soluţie tampon (PCR
buffer) în care se introduce ADN ce conţine gena de interes, primerii
38
sintetizaţi, Taq polimeraza şi cele patru tipuri de deoxinucleotid-
trifosfaţi (dATP, dGTP, dCTP şi dTTP).
Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, într-un
aparat în care realizarea ciclurilor termice este controlată automat de
Termocycler:
- Denaturarea ADN, presupune încălzirea soluţiei în care se
află ADN la 940 C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea
legăturilor de hidrogen şi separarea celor două catene.
- Ataşarea primerilor se realizează prin răcirea pȋnă la 40°C –
60°C a soluţiei în care se află secvenţa de amplificat.
Primerii se leagă la capetele 3’a celor două catene de
ADN ale genei pe care dorim să o amplificăm. De
obicei, este nevoie de doi primeri numiţi sens şi antisens,
dar amplificarea se poate realiza şi cu un singur primer, în
cazul tehnicii PCR ancorat.
- Elongaţia se produce la temperatura de circa 72°C,
temperatură la care Taq-polimeraza funcţionează optim, în
faza de extensie, iar ciclul se repetă de 25 – 40 ori.
Amplificarea este aproximativ exponenţială, realizându-
se după 3 cicluri 2 copii, după 10 cicluri 256 copii, iar
după 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenţei supuse
amplificării [2]. După amplificare, gena de interes se
vizualizează în lumină ultravioletă, la nivelul gelului de
agaroză în care fragmentele au fost colorate cu bromură de
39
etidiu. Dacă amplificarea s-a produs, în gel se vor
observa una sau mai multe benzi, corespunzătoare
secvenţei specifice de ADN.
În tehnica PCR, alegerea primerilor este primordială şi putând fi
utilizaţi două tipuri de primeri:
- primeri specifici - sunt dirijaţi spre un situs foarte precis al
ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene
cunoscute. Prin primer specific se înţelege o secvenţă
cunoscută de ADN utilizată pentru începerea sintezei unei
anumite gene, cu structură cel puţin parţial cunoscută. Primeri
specifici pot fi dirijaţi şi spre regiunile situate în amonte sau
aval de secvenţele unice, la nivelul secvenţelor minisatelit sau
microsatelit. Secvenţele de tip satelit, specifice fiecărui
individ sunt astfel amplificate. Evidenţierea acestor
polimorfisme se utilizează în momentul de faţă în
medicina criminalistică pentru identificarea suspecţilor,
pornind de la diferite mostre de ţesut (sânge, spermă, bulbi de
păr etc.), pentru marcarea cărnii, sau altfel spus, urmărirea ei
pe parcursul filierei de distribuţie şi consum.
- primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (în medie 10
– 20 nucleotide ). Alegerea secvenţelor care constituie aceşti
primeri este complet arbitrară. În cursul reacţiei PCR aceşti
primeri se vor hibrida de fiecare dată când în ADN se vor găsi
secvenţe care le sunt complementare şi de orientare opusă.
40
Tehnica PCR şi-a găsit aplicare în cele mai diverse domenii:
- în selecţia animalelor: prin stabilirea genotipurilor la locii care
codifică sinteza cazeinei, β-lactoglobulinei, leptinei, factorului
de transcripţie pituitar (Pit1) care este responsabil pentru
expresia hormonului de creştere la mamifere, este posibilă
aplicarea selecţiei timpurii, reţinând la reproducţie numai
animalele a căror genotip se asociază cu producţii cantitative şi
calitative mai ridicate.
- în alimentaţie: se poate folosi pentru alegerea tulpinilor de levuri sau
mucegaiuri ce vor putea fi utilizate ca probiotice (aditivi
furajeri) în hrana animalelor.
- în reproducţie: se foloseşte pentru identificarea sexului încă din
faza de embrion. Utilizând primeri specifici pentru
amplificarea unor secvenţe de ADN de pe heterozomul Y, se
poate stabili sexul. Dacă embrionul este de sex mascul (XY) se
va produce amplificarea secvenţei specifice de pe
cromozomul Y şi va putea fi vizualizată în gelul de
agaroză. Dacă embrionul este de sex femel (XX) nu se va
produce amplificarea secvenţei respective, în gelul de
agaroză lipsind banda caracteristică.
- în medicină: se foloseşte pentru identificarea unor gene mutante
(oncogene), care conduc la apariţia unor tumori maligne, în
monitorizarea evoluţiei şi terapiei cancerului, în detectarea
infecţiilor bacteriene şi virale.
41
- în institutele medico - legale: se foloseşte pentru determinarea
paternităţii, sau pentru identificarea persoanelor care s-au făcut
vinovate de delicte penale: crimă, viol etc [38].
2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR
2.2.1. Tehnica RFLP Această tehnică se bazează pe proprietăţile de hibridare
care există între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de
omologie (RFLP- bazat pe hibridare) şi tehnica PCR – denumită PCR-
RFLP, în care se evidenţiază polimorfismele existente la nivelul
situsurilor enzimelor de restricţie.
a) Tehnica RFLP bazată pe hibridare cu o sondă, implică
parcurgerea următoarelor etape:
- extracţia ADN din organismele ce urmează să fie analizate;
- digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie;
- separarea fragmentelor obţinute în urma digestiei, în
funcţie de mărimea lor, prin electroforeză în gel de agaroză;
- transferul ADN sub formă denaturată pe o membrană de
nylon (Southern blotting) în care poziţia relativă a diferitelor
fragmente de ADN din gel se păstrează pe parcursul
transferului;
- hibridarea ADN cu sonda marcată prealabil, în regiunile în
care prezintă omologie;
42
- vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film
sensibil la radiaţii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacţii
enzimatice, care dă o coloraţie specifică.
În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit
evidenţierea unor tipuri diferite de polimorfism. Sondele mono- sau
oligogenice pun în evidenţă unul sau mai mulţi loci; ele dau un profil
simplu care include câteva benzi. Utilizarea acestui tip de sonde
permite vizualizarea polimorfismelor de secvenţă, localizate la
nivelul situsurilor de restricţie, precum şi a polimorfismelor de
inserţie/deleţie, situate între situsurile de restricţie. Acest tip de sondă a
fost utilizat pentru a alcătui hărţi genetice la om, pentru a identifica
unele varietăţi de măr şi pentru a pune la punct un test de
depistare a anemiei falciforme. Sondele poligenice sau multilocus
pot fi dirijate spre zonele care prezintă ariabilitate foarte mare, cum
sunt secvenţele de tip micro şi minisatelit, alcătuite de 2 până la 16
perechi de baze, repetate în tandem. Cu ajutorul sondelor
multilocus, se observă, în general un grad ridicat de polimorfism între
genotipurile înrudite. Acest tip de sondă a fost utilizat pentru prima dată
de Jeffreys şi colaboratorii in 1985 [33] la hibridarea cu ADN genomic
uman digerat şi amprentizarea genetică a fiecărui individ. Ulterior, au
fost descoperite alte secvenţe satelit şi la alte mamifere, la insecte
şi plante. Sondele multilocus permit evidenţierea polimorfismului
de secvenţă la nivelul situsurilor de restricţie, polimorfismului de
inserţie/deleţie precum şi polimorfismului determinat de numărul
unităţilor repetitive, pentru fiecare individ în parte [33].
43
b) Tehnica RFLP, bazată pe PCR, utilizează o enzimă de
restricţie pentru digerarea unui produs de amplificare, obţinut cu
primeri specifici, iar în gelul de agaroză se vor obţine benzi de
dimensiuni diferite, corespunzătoare celor trei genotipuri
(homozigoţi pe una din cele două alele şi heterozigoţi).
Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce
identifică variaţiile secvenţei de ADN la nivelul unui situs de
restricţie, prin analiza RFLP. O sursă abundentă de markeri genetici,
utilizaţi în tehnicile de cartare a genomului animal au la bază
modificările unor secvenţe de ADN care se produc la nivelul situsurilor
de restricţie
De regulă aceste variaţii sunt cauzate de mutaţii punctiforme
(substituţia unei nucleotidecu o alta), inserţii sau deleţii, în
interiorul situsului de restricţie şi astfel, enzima de restricţie, nu
mai recunoaşte situsul respectiv şi nu mai taie. Aceasta va
determina obţinerea unor fragmente de restricţie de lungimi diferite
(polimorfice) care pot fi uşor vizualizate şi identificate în gelul de
agaroză datorită lungimii lor diferite. Din această cauză ele se vor
separa în gelul de electroforeză sub forma unor benzi situate în diferite
regiuni. Greutatea moleculară se apreciază cu ajutorul unui ADN
standard de etalonare - ladder. În practică, mărimea unui fragment ce se
detectează prin Southern blotting este de 300 pb – 15 kb cu
diferenţe detectabile mai mici de 50 pb.
44
Prin tehnica PCR se detectează produşi între 60 pb-2kb, cu
diferenţe chiar de câteva baze. Indivizii diferiţi genetic pentru un anumit
locus, vor prezenta fragmente de restricţie de lungimi diferite, într-un
număr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda moleculară –
enzimă de restricţie. În acest context, fiecare sistem format din ADN
genomic – enzimă de restricţie, poate defini un locus polimorf care are
cel mult două alele diferite [38].
Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaţiile genetice dintre indivizi
doar la nivelul situsurilor de recunoaştere a enzimelor de restricţie,
respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri
existente în locusul de interes (AA, Aa, aa) şi nu se pot detecta
variaţiile la nivelul întregului genom, care la mamifere este de ordinul
3x 109 pb.
2.2.2. Tehnica AFLP Tehnicile moleculare care permit obţinerea amprentelor
genetice şi vizualizarea polimorfismelor, a diferenţelor dintre
eşantioane la nivel de ADN, se bazează pe două principii: hibridare cu
sonde sau amplificare prin reacţia PCR. Polimorfismul bazat pe
numărul de repetiţii în tandem, a motivelor de tip satelit, este azi
cel mai utilizat în studiul diversităţii genetice a raselor de animale şi a
soiurilor de plante.
AFLP este o tehnică bazată pe punerea în evidenţă a polimorfismelor
tot la nivelul situsurilor de restricţie. Această tehnică a fost descrisă de
Vos şi colaboratorii în anul 1995 şi se bazează pe amplificarea
selectivă, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obţinute
45
printr-o restricţie particulară, care utilizează 2 enzime de restricţie şi
adaptori, marele avantaj al metodei este acela că nu necesită
informaţii preliminare despre genom.
Tehnica AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a fragmentelor
de restricţie, obţinute din ADN genomic total digerat şi ea parcurge trei
etape:
- restricţia ADN genomic şi legarea adaptorilor
oligonucleotidici;
- amplificarea selectivă a seturilor de fragmente de restricţie;
- analiza fragmentelor amplificate, în gel de poliacrilamidă.
Pentru prepararea unei matriţe AFLP, ADN genomic este izolat şi
digerat simultan cu 2 enzime de restricţie, de exemplu: EcoRI şi MseI.
EcoRI are un situs de recunoaştere de 6 pb (taie rar) iar, MseI are un
situs de recunoaştere de 4 pb (taie frecvent).
Fragmentele obţinute prin restricţie pot fi grupate în 3 clase:
- marea majoritate (90%) prezintă două situsuri MseI la
extremităţile lor;
- aproximativ 10% prezintă un situs EcoRI şi un situs MseI;
- câteva fragmente prezintă 2 situsuri EcoRI.
Procedeul AFLP se bazează pe detecţia predominantă a
fragmentelor EcoRI - MseI care au o extremitate tăiată cu o enzimă care
taie rar şi o extremitate tăiată de o enzimă care taie des. Succesul
tehnicii AFLP depinde de digestia completă a ADN genomic.
Pentru aceasta trebuie acordată o importanţă sporită izolării ADN de
înaltă calitate, intact şi fără contaminări cu nucleaze sau inhibitori [39].
46
Legarea adaptorilor, după inactivarea prin căldură a endonucleazelor de
restricţie, de tip Eco RI şi MseI, dublu catenari, se face la extremităţile
fragmentelor de ADN.
Structura adaptorilor este următoarea:
- secvenţă nouă, care va servi ca situs ţintă pentru ataşarea
primerilor PCR în etapa următoare a AFLP;
- o secvenţă care permite restaurarea situsului de restricţie;
Sunt utilizate două tipuri de adaptori: cei care restaurează situsul
EcoRI şi cei care restaurează situsul MseI. Primerii care sunt utilizaţi în
reacţia PCR nu se fixează pe ADN genomic, dar se vor fixa pe adaptori.
După digestia ADN genomic şi legarea adaptorilor, fragmentele de
restricţie vor fi amplificate prin PCR. În structura primerilor PCR vom
regăsi de o parte secvenţa adaptorilor şi un situs de restricţie (este acela
la nivelul căruia se vor fixa primerii PCR în următoarea reacţie PCR),
iar de cealaltă parte o nucleotidă selectivă, adăugată la extremitatea 3’ a
primerilor PCR.
Numărul nucleotidelor selective poate varia de la 0 la 3 pe primer.
Fixarea nucleotidelor specifice determină ca un singur subansamblu de
fragmente de restricţie să fie recunoscut şi amplificat. Condiţiile de
reacţie sunt alese de aşa natură ca singurele fragmente de ADN care
corespund perfect cu primerul să fie amplificate. Dacă se lucrează cu
genoame complexe, cum sunt cele de la plante sau animale, PCR-ul este
realizat în două etape consecutive. În prima reacţie, numită
preamplificare, ADN genomic este amplificat cu doi primeri AFLP,
având câte o singură nucleotidă selectivă şi produsul PCR al
47
preamplificării este diluat şi utilizat ca matriţă pentru a 2-a
amplificare selectivă, iar în al doilea PCR se vor utiliza primeri AFLP,
ce conţin câte trei nucleotide selective.
Această strategie, de amplificare în două etape, permite obţinerea
unei amprente genetice foarte clare, care poate fi analizată pentru
detectarea polimorfismelor şi între indivizii strâns înrudiţi. Unul din
marile avantaje ale tehnicii AFLP este permisivitatea modulării
numărului de profiluri genetice. Este posibilă creşterea sau
reducerea complexităţii profilului, adaptând diferiţi parametrii, iar
factorul cel mai important pentru determinarea numărului de
fragmente, amplificate într-o reacţie simplă AFLP, este numărul de
nucleotide selective din primerii selectivi. Numărul de fragmente
detectate în gel, pentru o amprentă genetică, scade când numărul
nucleotidelor selective creşte.
Alegerea numărului de nucleotide selective este strâns legată de
mărimea genomului, cu cât mărimea genomului este mai redusă cu
atât numărul fragmentelor amplificate este mai restrâns şi amprenta
genetică mai simplă. Pentru organismele cu genoame mari (5x108-
5x109pb) se utilizează primeri selectivi cu câte trei nucleotide, astfel
încât să se amplifice în medie 50 fragmente pe probă şi pe perechea de
primeri selectivi, acest număr poate varia însă între 10 şi 100, în funcţie
de secvenţa nucleotidică şi complexitatea genomului. Al doilea factor,
ce determină numărul de fragmente amplificate, este compoziţia în baze
G şi C a nucleotidelor selective din primeri. În general, se amplifică mai
puţine fragmente când nucleotidele selective sunt G şi C.
48
Tehnicile amprentelor genetice sunt multiple, fiecare are
caracteristici particulare de specificitate de locus, nivel de polimorfism,
tehnicitate. Alegerea unei metode trebuie întotdeauna să fie luată în
considerare în funcţie de obiectivul cercetării:
- pentru studii de diversitate ca şi pentru măsurarea
variaţiilor inter sau intrapopulaţionale, distanţei genetice,
pentru clasificarea în sistematică a populaţiilor distincte genetic.
- pentru clonarea poziţională ca şi pentru obţinerea unei
densităţi mari de markeri moleculari, într-o regiune
precisă din genom (hipervariabilă), din vecinătatea unei gene
care urmează să fie clonată;
- pentru stabilirea hărţilor genetice la speciile puţin studiate
sau acolo unde sondele şi primerii PCR nu au fost încă
dezvoltaţi.
Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea în detectarea
polimorfismului la nivelul genomului total. Cu toate acestea, tehnica
AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea în sistematică
a populaţiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate în ADN sunt
transmise mendelian şi utilizate apoi pentru genotipizare,
identificarea markerilor moleculari şi cartografierea genelor [2].
2.2.3. Tehnicile MAAP Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon
Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic
49
DNA), alături de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) şi AP-
PCR (Arbitrary Primed PCR).
2.2.3.1. Tehnica RAPD Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la
nivel alelic în ceea ce priveşte producerea unor produşi de amplificare
sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar,
într-o poziţie care să-i permită realizarea amplificării.
Această variantă a tehnicii PCR nu necesită clonarea sau
secvenţierea ADN şi poate detecta mai mulţi loci simultan.
Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este
supus unei reacţii PCR utilizând primeri oligonucleotidici, de
secvenţă arbitrară, care vor hibrida la secvenţele sale
complementare, în cazul în care acestea există. Dacă din întâmplare, doi
primeri consecutivi, aflaţi în vecinătate, se ataşează la matriţă în sensuri
opuse, fiecare pe una din cele două catene, la o distanţă nu prea mare
unul de celălalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dacă
unul din cele două situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta
amplificarea nu va avea loc, evidenţiindu-se un polimorfism de
prezenţă/absenţă. Secvenţele de primeri scurţi, împerecheaţi aleator (8 –
12 perechi de baze) sunt folosiţi la amplificarea ADN de tip RAPD, de
obicei rezultând un polimorfism de prezenţă/absenţă, în gel. O astfel de
situaţie, care permite amplificarea randomizat, în mai multe puncte,
poate fi realizată la nivelul întregului genom.
50
Deoarece RAPD este o tehnică bazată pe PCR, vom prezenta
câteva din particularităţile definitorii ale acesteia. Modificarea unei
singure baze în genom este suficientă pentru a împiedica ataşarea
primerului în acel loc şi a împiedica amplificarea fragmentului delimitat
de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure
baze în ADN genomic, în anumite condiţii [39].
Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din câteva tipuri de
modificări:
- inserţia unei secvenţe mari de ADN, între secvenţele de
ataşare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste
secvenţe prea mare pentru a fi amplificat;
- deleţia unui fragment de ADN ce conţine unul din situsurile de
ataşare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificării
segmentului;
- substituţia unui nucleotid poate afecta hibridarea
primerului la un anumit situs de ataşare, putând evidenţia
sau nu un polimorfism (dispariţia unei benzi);
- inserţia sau deleţia unui mic fragment de ADN poate duce la
modificarea mărimii unui fragment amplificat şi a poziţiei
benzii în gel.
Modificările de mărime se observă rar, dar cel mai adesea
polimorfismul se manifestă prin aceea că un fragment amplificat poate
fi prezent sau absent. Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca
şi marker molecular. Markerii RAPD se comportă ca markeri dominanţi
51
când sunt urmăriţi în descendenţă. Acest comportament rezultă din
faptul că un fragment amplificat este prezent în gel (ca o alelă
dominantă A) sau absent (ca alelă recesivă a). În analiza
descendenţilor, un fragment este observat în stare homozigotă
(analog cu AA), fiind amplificat atât ADN de la un părinte, cât şi de la
celălalt, sau în stare heterozigotă (analog cu Aa), când este amplificat
numai ADN provenit de la unul din părinţi, celălalt prezentând un
polimorfism reperezentat prin absenţa fragmentului.
În stare heterozigotă, absenţa fragmentului de la unul din
părinţi este mascată de prezenţa benzii datorată fragmentului
amplificat de la celălalt părinte. Prin urmare, analiza RAPD nu
poate discerne între starea homozigotă (AA) şi cea heterozigotă (Aa).
În cazul markerilor codominanţi însă (în care fiecare părinte
posedă o bandă distinctă, pe care celălalt nu o posedă), starea
heterozigotă (AB) în descendenţă (prezenţa ambelor benzi în hibridul
din F1) poate fi deosebită de stările homozigote (AA) şi (BB). In anii
`90 s-a arătat că 95% din fragmentele RAPD se comportă ca markeri
dominanţi (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii
părinţi şi descendenţi) şi sub 5% se comportă ca markeri codominanţi.
Calculul numărului de fragmente care poate fi aşteptat teoretic la
folosirea unui primer care hibridează 100% cu matriţa, poate fi
calculat din lungimea primerului şi din complexitatea genomului
ţintă, presupunând că nucleotidele sunt prezente în proporţii egale.
Produşii de amplificare se separă prin electroforeză în gel de agaroză
şi se evidenţiază după colorare în bromură de etidiu .
52
2.2.3.2. Tehnica DAF In 1991, Caetano-Anolles şi colaboratorii [13], au introdus o
metodă numită DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au
folosit primeri scurţi, cel mai adesea de lungime între 5 – 8
nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiţi parametrii PCR,
folosind paşi atât de joasă cât şi de înaltă stringenţă, precum şi un
program al ciclurilor cu numai două temperaturi în loc de standardul
cu trei. Produşii de amplificare au fost separaţi prin electroforeză în
gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin colorare cu argint. Nivelul
complexităţii profilului benzilor poate fi predeterminat prin
manipularea condiţiilor de reacţie. Ca urmare a apariţiei mai
multor variante de amprentare a întregului genom, bazate pe PCR
cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles şi colab., au propus în
(1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de
Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) [13].
Totuşi, datorită simplităţii şi utilităţii, numele şi metoda
originală RAPD, cunoaşte cea mai largă răspândire. Această tehnică
permite amplificarea unui număr mai mare de fragmente de dimensiuni
foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de poliacrilamidă.
2.2.3.3. Tehnica AP – PCR Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de
distincţie între cele trei tehnici descrise anterior; astfel că pentru
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii
decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint)
53
primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR)
primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR şi DAF pot releva
numeroase benzi (până la 100) în timp ce RAPD-ul produce un număr
mic de benzi, până la zece [56] .
Avantajele tehnicilor Multiple Arbitrary Amplicon Profiling
(MAAP) rezidă din: simplitate, rapiditate, costuri scăzute, şi faptul că
nu necesită cunoştinţe anterioare despre genom, nu necesită digestie
sau transfer pe o membrană, marcare radioactivă sau fluorescentă,
cu ajutorul lor fiind generaţi markeri moleculari utilizând markerii
deja disponibili [52] . Tehnica RAPD fiind rapidă, poate fi utilizată în
hibridări interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor,
descoperirea markerilor sex-linkaţi, măsurarea distanţelor genetice la
plante, animale şi om.
Dezavantajele tehnicii constau în reproductibilitatea scăzută,
iar schimbările de scurtă durată a condiţiilor de reacţie pot cauza
benzi nereproductibile. O singură procedură cuprinde trei etape
importante. Tehnica AP-PCR utilizează primeri de 18 pb şi a fost
dezvoltată şi utilizată ca metodă reprezentativă [32].
2.2.4. Tehnica RT – PCR Această tehnică este tot o variantă a tehnicii PCR, în care
amplificarea porneşte de la ARN mesager (ARNm). În prezenţa
enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matriţă pentru sinteza
ADN complementar (ADNc), după care procesul de amplificare
decurge în mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazează pe
54
presupunerea că se păstrează o anumită proporţionalitate între cantitatea
de ADN de la începutul reacţiei şi cantitatea produsului de amplificare
[56].
Trebuie subliniat faptul că aplicarea reacţiei PCR la moleculele de
ARN necesită o modificarea a reacţiei PCR în prima etapă. Pentru
că molecula de ARN nu poate fi copiată în prezenţa Taq
polimerazei, această etapă este catalizată de revers transcriptază, enzimă
în prezenţa căreia este sintetizată molecula de ADN de pe matriţa de
ARN. Copia de ADN este apoi amplificată în prezenţa Taq
polimerazei.
Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza -
obţinută din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul cărora pot fi
obţinute copii termostabile de ADN atât de pe matriţe de ADN cât şi de
pe matriţe de ARN face posibilă aplicarea RT – PCR în
condiţiile în care va fi necesară o singură reacţie în prezenţa unei
singure enzime [11]. Această tehnică oferă o informaţie mai detaliată
referitoare la detectarea cu sensibilitate ridicată a unor gene exprimate
în cantităţi reduse, într-o anumită celulă.
2.2.5. Tehnica microsateliţilor - SSR La organismele procariote şi eucariote o parte din ADN genomic
este reprezentat de secvenţe de ADN înalt repetitive, de
complexitate mică şi considerate noninformaţionale. Microsateliţii
sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvenţe înalt repetate,
care conţin motive de 2 – 5 perechi de baze, repetate în tandem şi care
55
flanchează o secvenţă unică de ADN. Se pare că aceştia sunt
rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va
fi utilizată pentru relevarea profilurilor individuale, furnizând
markeri specifici de locus ce se transmit codominant.
Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar
regiunile flancatoare sunt specifice [19]. Aceşti markeri bazaţi pe PCR
necesită investiţii considerabile pentru a putea fi generaţi, dar sunt
înalt polimorfici pentru folosirea lor în aplicaţiile MAS (selecţia
asistată de markeri moleculari). Polimorfismul este determinat de
diferenţele existente în lungimea produşilor de amplificare. Acest
polimorfism va duce la evidenţierea mai multor alele la acest locus.
Fiind o regiune înalt polimorfică se pot distinge foarte multe
alele, dar care pot determina diferenţele chiar şi între indivizi înrudiţi.
Motivele repetate în tandem pot fi utilizate şi ca sonde, dirijate către
ADN genomic, unde să-şi găsească regiunile complementare.
2.2.6. Tehnica EST Această reacţie bazată pe PCR necesită atât clonare cât şi
informaţii despre secvenţă, utilizând informaţiile proiectului de
secvenţiere a genelor, când sunt generate clone de ADNc. Această
secvenţă este folosită pentru designul unor primeri de 18 – 20 pb cu
care se vor amplifica secvenţe învecinate.
Markerul EST este de obicei detectat după mărime în produsul
de amplificare şi este un marker codominant. Crearea acestor primeri se
realizează cu costuri foarte mari, dar aceştia sunt foarte utili prin
56
diversele aplicaţii în cartare, descoperirea genelor asociate cu locii
caracterelor cantitative - QTL (Quantitative Traits Loci) şi ar trebui
să contribuie considerabil la înţelegerea mecanismelor la aceşti loci
[11].
2.2.7. Tehnica SCAR În cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate
prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate şi pe baza lor se construiesc
primeri specifici care vor avea lungime mai mare decât primerii RAPD.
Prin utilizarea primerilor SCAR în PCR, nu se rezolvă problema
reproductibilităţii reduse, deseori întâmpinată de markerii RAPD.
Obţinerea unui marker codominant poate deveni un avantaj în plus,
în convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR [11].
Totuşi, markerii SCAR pot manifesta dominanţă completă când
unul sau ambii primeri coincid parţial cu variaţia din secvenţa unui
anumit locus. Markerii SCAR dominanţi pot fi făcuţi deseori
codominanţi, prin digestia produsului PCR cu diferite enzime de
restricţie.
2.2.8. Tehnica SNP Această tehnică se caracterizează prin detectarea mutaţiilor
punctiforme la un locus particular, mutaţii determinate de substituţia
unei singure nucleotide cu alta. Prin această tehnică pot fi evidenţiate
diferenţele de secvenţă existente între alele, cum ar fi substituţia A în T
57
de exemplu AAGGCTAA în ATGGCTAA [23]. Pentru ca o variaţie de
secvenţă să fie considerată SNP ea trebuie să apară cu o frecvenţă de
până în 1% în populaţie, ceea ce în populaţia umană va detemina mai
mult de 90% din întreaga variaţie genetică [23].
Aceasta înseamnă apariţia mutaţiei la fiecare 100 până la 300
perechi de baze din totalul de 3 miliarde. Două din trei polimorfisme
SNP sunt determinate de înlocuirea citozinei cu timina, ce apar
atât în regiunile codificatoare cât şi necodificatoare, polimorfisme de
tip citozină – timină au fost descrise şi de Schenkel F.S. şi colaboratorii
în anul 2005 [63].
2.2.9. Tehnica STS Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvenţă unică într-
un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiţi
markerii genetici RAPD în markeri STS, pentru acelaşi locus. Tehnica
nu necesită clonare dacă există informaţii anterioare despre secvenţă,
pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi
conceput după secvenţa fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a
amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi
secvenţa unui produs PCR - RAPD sau a sondelor RFLP).
Polimorfismul este în general detectat ca o diferenţă de mărime
în produsul de amplificare STS faţă de produsul RAPD, de la
acelaşi locus. Dacă nu există nici o diferenţă de mărime, se
apelează la restricţia enzimatică pentru a tăia produşii de
amplificare şi pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi
58
astfel detectat un polimorfism de câteva nucleotide. Din moment
ce primerii STS sunt mai lungi decât primerii RAPD şi bazaţi pe
o secvenţă specifică, această metodă detectează polimorfismul de la
acelaşi locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică.
Dezavantajul metodei este că proiectarea şi crearea primerilor poate
implica o investiţie importantă [11].
2.2.10. Tehnica ARMS –PCR O modificare a metodei PCR, care permite detecţia
mutaţiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri
specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metodă
care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este
posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin
elecroforeză în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea
mutaţiilor prin amplificare refractară, descrisă pentru prima dată de
Newton C.R. şi colab., 1989. Metoda constă în utilizarea a doi
primeri care prezintă aceeaşi secvenţă de nucleotide cu excepţia
nucleotidei terminale 3’ – unul complementar cu alela normală, iar
celălat cu alela mutantă.
Pentru amplificarea enzimatică se foloseşte Taq-polimeraza,
enzimă care nu are activitate exonucleazică 3’-5’, ceea ce implică
necesitatea unei perfecte complementarităţi a primerului cu capatul
3’ al matriţei ADN. Rezultatul se obţine în urma electroforezei în gel
de agaroză prin prezenţa sau absenţa produsului de amplificare
respectiv.
59
Specificitatea este obţinută dacă primerul oligonucleotidic este
complementar cu secvenţa alelei dorite, dar nu este complementar cu
cealaltă alelă la capătul 3’, sau în imediata vecinătate a capătului 3'
al primerului specific de alelă. Neamplificarea este rezultatul
nepotrivirii dintre ADN matriţă şi oligonucleotidul din primer. Pentru
că Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazică în direcţia 3'-5',
această nepotrivire împiedică eficient elongarea la capatul 3' cu
ajutorul Taq polimerazei. Metoda este aplicabilă, în general, în
detecţia mutaţiilor punctiforme cunoscute, mici deleţii şi inserţii,
polimorfisme şi alte variaţii în secvenţa ADN.
De aceea, o mutaţie (sau un polimorfism) poate fi detectată prin
utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o
elongare eficientă, în cazul unui cromozom mutant şi o elongare
ineficientă, în cazul unui cromozom normal [11].
2.3. TEHNICA SSCP Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului
determinat de cel puţin o nucleotidă. Evidenţierea polimorfismului se
face în timpul electroforezei în gel de poliacrilamidă. Acest
polimorfism se bazează pe diferenţele de conformaţie ale unei
singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct,
datorită unei substituţii, deleţii sau inserţii [6]. În anumite condiţii,
acizii nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluţie o
structură secundară. Structura secundară depinde de compoziţia în
baze, structură care poate fi alterată şi de substituţia unei singure
60
nucleotide. Această diferenţă va determina o mobilitate
electroforetică diferită în condiţiile unui gel nedenaturat (gel de
poliacrilamidă nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi
detectate se face după o prealabilă colorare cu argint sau după marcarea
radioactivă [1].
2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENŢIERE Prima secvenţă descifrată a fost ARNt-ul purtator de alanina
publicată de către Robert Holley şi colegii săi de la Universitatea
Cornell in 1964 [26]. Aceştia au utilizat enzime specifice care au rupt
molecula de ARNt în segmente mici până când s-a reuşit secvenţierea
directă prin metode de degradare enzimatică. Abia în 1976 a fost
descifrată secvenţa completă a ARN monocatenar de la fagul MS2,
de către Walter Fiers în laboratorul său din Ghent. S-a stabilit atunci
structura completă a genomului viral şi organizarea acestuia,
corespondenţa dintre codoni şi cele trei proteine codificate de genele
fagului MS2 şi că un codon stop cauzează terminarea transcripţiei
[58].
Secvenţierea ADN poate fi făcută prin procedee chimice
- metoda Maxam şi Gilbert sau cu ajutorul terminatorilor de lanţ
- metoda dideoxi sau Sanger, aceasta din urma fiind astăzi utilizată mai
mult. Prima metodă a fost pusă la punct de către Maxam si Gilbert ȋn
1977 şi este de fapt o clivare chimică [40]. Cea de-a doua, metoda
dideoxi sau Sanger, a fost pusă la punct în acelaşi an de către Sanger şi
61
se bazează pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN,
amplificat prin PCR [62].
În ambele cazuri, fragmentele obţinute sunt supuse marcării
radioactive (cu 32P, de exemplu) înaintea separării pe baza greutăţii
moleculare într-un gel de poliacrilamidă. Vizualizarea şi analizarea
produşilor rezultaţi se face prin autoradiografie.
O metodă mult mai convenabilă şi mai precisă este marcarea
fluorescentă a fragmentelor şi secvenţierea automată. Fragmentele de
ADN sunt migrate într-un gel de poliacrilamidă iar aparatul
(secvenţiatorul), prevăzut cu un fascicul laser, excită fiecare
moleculă marcată fluorescent şi transformă valorile fluorescente în
secvenţa în nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel de aparat
(ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe oră. Fiecărei secvenţe
de acizi nucleici îi corespunde o diagramă a succesiunii de baze
numită electroforegramă. În această diagramă fiecărei baze îi
corespunde un vârf şi o coloraţie caracteristică.
O altă tehnică este secvenţierea automată, în cazul căreia, catena
de ADN care va intra în reacţia de secvenţiere depinde de primerul
utilizat, putând fi supusă secvenţierii atât catena sens cât şi cea
antisens. În studiile de secvenţiere a genelor, pentru precizia
rezultatelor obţinute sau atunci când sunt căutate mutaţii
punctiforme, se recomandă secvenţierea ambelor catene şi
compararea rezultatelor obţinute. În acest caz, este necesară
cunoaşterea ambilor primeri, care să iniţieze sinteza genei ce urmează
să fie descifrată.
62
În cazul în care se doreşte descifrarea structurii unui fragment
de ADN, sau a unei gene, de la specii a căror genom nu este saturat în
hărţi genetice, pentru amplificare se utilizează primeri universali, cum
este cel de la fagul M13 [72]. Pentru fragmente de dimensiuni diferite
se aleg vectori corespunzători pentru clonare, de exemplu: plasmide
(0,1-10 kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom
artificial bacterian 75-300 kb) şi YAC (cromozom artificial de drojdie
100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat şi sunt întocmite
hărţile de restricţie.
Etapele secvenţierii:
1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce
urmează să fi clonat sau secvenţiat;
2. Purificarea ADN izolat;
3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu ajutorul
primerilor specifici sau a primerilor universali, în prezenţa celor
patru dNTP marcaţi florescent, fiecare cu altă culoare - (adenina în
verde, timina în roşu, guanina în negru şi citozina în albastru) şi a
polimerazei ;
4. Vizualizarea produşilor de amplificare prin migrarea în gel de
agaroză (procedeu care face posibilă atât identificarea produşilor
de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate şi a
calităţii produsului de amplificare;
5. Purificarea produşilor de amplificare; pentru ca produşii de
amplificare să poată fi utilizaţi în reacţii de secvenţiere trebuie să
63
aibă un grad înalt de puritate (evitându-se contaminarea cu inhibitori
şi prezenţa rezultatelor eronate) ;
6. Secvenţierea automată;
7. Citirea secvenţelor pe catena analizată;
8. Alinierea secvenţelor de pe cele două catene sens şi antisens;
Reacţia de secvenţiere începe întotdeauna după ce ADN supus
secvenţierii a fost iniţial amplificat prin PCR, purificat şi cuantificat
[2].
64
CAPITOLUL 3.
Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare
3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codifică leucin dehidrogenaza de la Bacillus
sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz
dehidrogenaza de la Bacillus subtilis şi aspartaza de la Escherichia coli
au fost amplificate prin metoda PCR utilizând amorse specifice. În
secvenţa amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricţie
necesare inserării genei în vectorul de exprimare. Pentru clonarea
genelor ce codifică leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza şi
aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest
vector oferă posibilitatea exprimării genelor la inducere cu IPTG.
Produşii PCR au fost purificaţi din gel şi digeraţi cu enzimele de
restricţie corespunzătoare (Tabel 3.1). Vectorii de exprimare au fost
digeraţi cu aceleaşi enzime de restricţie. Produşii de digestie (produşii
PCR şi vectorii) au fost separaţi cu ajutorul electroforezei în gel de
agaroză.
65
Tabelul 3.1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a
genelor.
Enzima Amorsele utilizate Organism sursă Enzime
de
restricţie
Vector
utilizat
AlaDH
Q08352
5΄-GAGGGATCCGATGAT
CATAGGGGTTCCTAAAG-3΄
5΄-GGTCTCGAGTATAGCA
CCCGCCACAGATGATT-3΄
Bacillus subtilis BamHI
XhoI
pET21b
LeuDH
P13154
5΄-GGTGGATCCGATGGAA
TTGTTCAAATATATGG-3’
5΄-TATTCTCGAGTATTGC
CGAAGCACCTGC-3΄
Bacillus
stearothermo -
philus
BamHI
XhoI
pET21b
ALL
P0AC38
5' –GGTAGGATCCGATGTCA
AACAACATTCGTATCG– 3'
5' –GCTACTCGAGTTACTGT
TCGCTTTCATCAGTA– 3'
Escherichia coli NdeI
BamHI
pET21b
GalM
GalM
P0A9C3
5'-GGAATTCCATATGCTGA
ACGAAACTCCCGCAC-3'
5'-CGCGGATCCTCACTCAG
CAATAAACTGATATTCCG-3'
Escherichia coli NdeI
BamHI
pET24a
GlucDH
P12310
5΄-GGAATTCCATATGTATC
CGGATTTAAAAGGAAAAG-3΄
5΄-CGCGGATCCTCAAC
CGCGGCCTGCCTGG-3
Bacillus subtilis NdeI
BamHI
pET24a
Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroză. Pentru inserea
genelor în vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a
66
reface legăturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate după
ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare în tulpina de
Escherchia coli DH5α. Secvenţele genelor clonate au fost verificate
prin secvenţializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer
utilizând kitul de secvenţializare BigDye Terminator v3.1 (Applied
Biosystems).
3.2. Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au
fost introduse prin transformare în tulpina de Escherichia coli
BL21(DE3). Pentru obţinerea de proteine recombinate s-au realizat
culturi mai mari (0,5-1L). După ce densitatea optică (DO) la 600 nm a
atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil-β D-
tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM [2]. După câteva ore de la inducere
(3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate şi păstrate la -80°C până la
utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare
bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri şi
timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu atât mai valoros
cu cât implică mai puţine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate în
tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereţii celulelor bacteriene au fost
distruse prin sonicare. După sonicare extractul bacterian a fost
centrifugat (20 min la 21 000×g la 4°C), iar supernatantul cu proteinele
solubile a fost utilizat pentru măsurarea activităţii enzimatice. Analiza
exprimării genelor şi sintezei de proteine recombinate în celulele de E.
coli a fost urmărită cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă în
condiţii denaturante în prezenţă de SDS (Figura 3.1).
67
΄
Figura 3.1. Sinteza de proteine recombinate în celulele gazdă de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum şi masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportată la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene [2].
3.3. Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor Măsurătorile de activitate enzimatică a dehidrogenazelor s-au
efectuat la 30ºC cu un spectrofotometru urmărindu-se scăderea
absorbanţei NADH (reacţia de aminare a cetoacizilor) sau formarea
acestuia (reacţia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La această
lungime de undă NADH prezintă maximul de absorbanţă şi are un
coeficient molar de extincţie de 6,22 ·103 ·M-1 ·cm-1. Activitatea
enzimatică s-a calculat după formula:
A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min – variaţia densităţii optice pe minut la 340 nm
Vr – volumul reacţiei
Vp – volumul probei
FD – factorul de diluţie
O unitate enzimatică (1U) corespunde formării unui µmol de
produs într-un minut. Mediile de reacţie pentru enzime au fost
următoarele:
Ala DH LeuDH AAL
68
a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH
0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare;
L-leucină 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de
dezaminare
b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15
mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare; L-
alanină 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de
dezaminare
c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0
d) GalM (galacto mutarotaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U
e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0
f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris
HCl 50 mM pH8,5, MgCl2 6 mM Pentru măsurarea activităţii
enzimatice a aspartzei s-a urmărit formarea acidului fumaric la 240 nm,
care are un coeficient molar de extincţie la aceasă lungime de undă egal
cu 2,54 ·103 ·M-1 ·cm-1.
Pentru măsurarea activităţii enzimatice s-au folosit câţiva µl de
enzimă purificată sau extract brut bacterian, astfel încât valorile
DO/min să fie cuprinse între 0,05 şi 0,3. S-a ales porţiunea dreptei cu
activitatea cea mai mare.
69
3.4. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N Mediul de reacţie pentru sintezele de aminoacizi marcaţi cu 15N
a conţinut:
• cetoacid 100 mM
• 15NH4Cl 100 mM
• NADH 1 mM
• glucoză 670 mM
Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacţia
s-a declanşat prin adăugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcaţi
au fost efectuate la 30ºC cu urmărirea pH-lui şi agitare. Pe parcursul
sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Această
metodă constă în formarea unui compus de culoare, la interacţiunea
ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului şi a cloraminei. Probele s-au
preparat după următoarea procedură: 10 µl de probă diluată de 20 ori,
200 µl de fenolnitroprusiat, 200 µl de hipoclorit de sodiu şi 590 µl apă.
Developarea culorii s-a făcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la
100ºC. S-a măsurat absorbanţa la 623 nm. Înainte de declanşarea
sintezelor s-a preluat o probă care a servit la alcătuirea unei curbe
etalon. Ca martor a servit amestecul de sinteză fără clorură de amoniu
(din care cauză se adăuga la sfârşit). În Figura 3.2 este prezentată curba
etalon de la sinteza de [15N]-L-metionină. Pe baza curbelor etalon s-a
calculat cantitatea de ion de amoniu rămas în mediul de sinteză.
Sintezele au fost oprite prin denaturarea termică a enzimelor, timp de 15
min la 85ºC.
70
Figura 3.2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionină [2].
3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizaţi Aminoacizii sintetizaţi au fost purificaţi pe o coloană cu răşină
schimbătoare de ioni Dowex 50W x 8, în forma H+. Activarea
umpluturii s-a făcut prin tratare cu HCl2N, după care s-a spălat până la
un pH neutru. Amestecul de sinteză filtrat s-a încărcat pe coloană şi
apoi s-a spălat cu apă (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH
1M. Controlul eluării s-a făcut cu ninhidrină pentru aminoacizi.
Fracţiunea cu aminoacid s-a concentrat pe baia de apă, după care s-a
precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lăsat peste noapte, iar
precipitatul obţinut s-a filtrat şi uscat. În continuare, aminoacizii astfel
obţinuţi au fost supuşi determinării structurii, purităţii şi concentraţiei
izotopice.
71
3.6. Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă Pentru analiza calitativă prin metoda spectrometriei de masă a
aminoacizilor este necesară o derivatizare a produsului de reacţie.
Derivatizarea, care trebuie facută la ambele funcţiuni polare ale
moleculei de aminoacid, la carboxil şi amină, s-a facut prin sililare,
utilizând metoda Das Neves şi Vasconcelos, care introduce la fiecare
funcţiune polară din moleculă câte o grupare terţ-butil-dimetilsilil
(TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul că, datorită
substituentului terţ-butil voluminos, la amină se introduce o singură
grupare silil, şi nu una sau două în mod statistic, cum se întâmplă în
cazul derivatizării cu grupări trimetilsilil. Derivatizarea s-a făcut
utilizând ca reactiv N-metil-N-(terţ-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida
(MTBSTFA) în calitate de donor al grupării silil, reactivul având şi un
conţinut de 1% terţ-butil-dimetil-clorsilan, în calitate de catalizator.
Derivatizarea s-a făcut pe cantitaţi de probă de ordinul 0.5-1 mg de
probă, cu 150 µl de acetonitril ca solvent şi 50 µl reactiv MTBSTFA, la
120ºC timp de 20 minute.
Separarea gaz-cromatografică a produşilor de sinteză sub formă
de TBDMS-derivaţi s-a făcut pe o coloană capilară cu fază staţionară
DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca şi gaz purtător şi cu temperatură
programată între 55 şi 250ºC. La ionizarea cu impact de electroni,
aminoacizii sub formă de TBDMS-derivaţi se produc în cea mai mare
parte sub formă de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor
fragment fiind caracteristice fiecărui aminoacid. Prin ruperea în diferite
poziţii din gruparea tert-butil-dimetilsilil se formează ioni cu masele M-
72
43, M-57 şi M-85, iar prin ruperea legăturii dintre carboxil şi atomul de
carbon alfa, adiacent, ia naştere un fragment cu masa M-159. Pentru
analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar
spectrele s-au înregistrat cu un spectrometru de masă cuadrupolar HP
5985.
3.7. Sinteza de aminoacizi marcaţi Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin
sinteze chimice şi enzimatice. În primele etape de marcare a acizilor
aminaţi cu izotopi stabili s-au folosit metode de sinteză chimică. Aceste
metode prezintă un şir întreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei
cantităţi mari de amoniac, randamente scăzute datorită mai multor etape
de sinteză, obţinerea racemicului.
Folosirea enzimelor în sinteze de aminoacizi marcaţi cu izotopi
stabili prezintă mai multe avantaje faţă de metodele chimice, datorită
faptului că decurg stereoselectiv şi au randamente superioare. O metodă
relativ simplă şi mai utilizată pentru obţinerea de aminoacizi marcaţi cu 15N este sinteza enzimatică pornind de la cetoacizi şi săruri de amoniu
(15N). Reacţiile de sinteză sunt cuplate cu reacţii de regenerare a
cofactorilor costisitori.
Majoritatea enzimelor utilizate în sinteza diverşilor compuşi
necesită coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preţului mare a
acestora utilizarea lor în cantităţi stoichiometrice nu este eficientă.
Pentru a evita acest fenomen există câteva căi de regenerare continuă a
coenzimelor pe parcursul sintezelor:
73
• regenerarea în vivo, cu utilizare de celule în creştere. Această
metodă prezintă dezavantajul manipulării laborioase a celulelor şi
caracterul enantioselectiv scăzut al reacţiei;
• regenerarea enzimatică în vitro, cele mai utilizate enzime
pentru regenerarea coenzimelor în sinteze fiind alcool dehidrogenaza şi
formiat dehidrogenaza [27];
• regenerarea electrochimică, care constă în oxidarea unui
mediator şi transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al
metodei îl prezintă specificitatea şi viteza de regenerare reduse.
Modalitatea cea mai eficientă pentru regenerarea coenzimelor
rămâne metoda enzimatică. Sursele enzimelor utilizate în regenerarea
coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la
bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas
fluorescens a fost utilizată în regenerarea atât a NAD cât şi a NADP
pentru producerea de hidromorfonă [10]. Schema de sinteză a
aminocizilor marcaţi cu 15N utilizată în prezenta lucrare este
reprezentată în Figura 3.3.
74
Figura 3.3. Schema de sinteză a acizilor aminaţi cu 15N. AADH –
aminoacid dehidrogenză
Aminoacid dehidrogenazele catalizează reacţia de formare a
aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl şi cetoacizii corespunzători.
Sinteza de aminoacizi a fost cuplată cu reacţia catalizată de glucozo-
dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la
regenerarea NADH, utilizând ca sub-strat glucoza cu formare de acid
gluconic. În unele sinteze s-a folosit galac-tozo-mutarotaza pentru
transformarea α-glucozei în β-glucoză. Enzimele utilizate în sintezele
de aminoacizi marcaţi nu au fost purificate. Enzimele recombinate,
exprimate în celule de E. coli, reprezintă aproximativ 50% din
proteinele totale existente în lizatul bacterian. Purificarea acestora este
o etapă suplimentară care, în general, nu conduce la mărirea
randamentului reacţiei. Honorat şi colaboratorii [24] au testat sinteza de
15NH4Cl
Cetoacid
L-(15
N)- Aminoacid
AADH
NAD+
NADH
GDH
GalM
β- glucoză
Acid gluconic
α- glucoză
75
L-alanină şi L-valină cu enzime (alanin dehidrogenază şi valin
dehidrogenază) purificate şi în lizat bacterian. Acest fapt nu a influenţat
randamentul sintezelor.
3.8. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor Bionanotehnologiile moderne se inspiră din organizarea celulară
a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca şi structurile vii, sunt
alcătuite din componente de natură organică şi anorganică. Aceste
structuri sunt speranţa pentru tratarea a numeroase cancere, existând în
prezent deja aplicaţii ale nanoparticulelor în tratamentul unor cancere.
Nanoparticulele sunt o speranţă nu numai pentru tratamentul
numeroaselor boli, dar şi pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea
nanoparticulelor în medicină este axa prioritară în aplicarea
bionanotehnologiilor.
Limitările bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza
particule de aceleaşi dimensiuni cu aceeaşi suprafaţă, controlul
organizării lor. Ţesuturile tari, cum ar fi ţesutul osos, cochiliile la
moluşte, conţin una sau mai multe componente organice de natură
proteică care controlează organizarea structurală .
3.9. Aplicaţii ale bionanotehnologiilor Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevărată speranţă în
diagnosticul şi tratamentul cancerelor.
76
Au a fost utilzat timp de câteva decenii în diverse aplicaţii în
medicină (implanturi dentare) datorită caractersticilor sale neutre.
Nanoparticulele de Au au început să fie din ce în ce mai des utilizate în
depistarea şi chiar tratamentul unor celule canceroase datorită faptului
că acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici şi
capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a acţiona asupra unor
anumite tipuri de celule chiar în absenţa oricăror grupe funcţionalizate.
NP-Au induc moartea celulară liniei de celule de carcinom pulmonar
A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule
HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) şi BHK21 (celule
juvenile din rinichi de hamster) [57].
3.10. Diagnostic Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura
depistarea celulelor canceroase în faze incipiente ale bolii.
Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate
pentru depistarea celulelor canceroase [15]. NP-Au la care s-au ataşat
oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al
leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate în acest
scop reprezentau un fragment din joncţiunea care rezultă în urma
translocaţiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este
translocat la un alt cromozom, în acest caz fragmentul de la
cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find
cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Această
77
translocaţie este cauza leucemiilor mieloide cronice şi care sunt cauzate
de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 3.14).
Figura 3.14. Formarea cromozomului Philadelphia – translocaţia
reciprocă între cromozomul 9 şi 22.
Produsul acestei gene este o proteină himeră cu activitate
tirozin-kinazică. Metoda de detecţie cu ajutorul nanoparticulelor se
bazează pe formarea de porţiuni hibride ADN:ARN (ADN sonda:
ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor împiedica
agregarea nanoparticulelor de Au odată cu creşterea concentraţiei de
săruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular
de cancer oferă avantaje faţă de metodele utilizate actual în diagnostic
BCR
Translocație reciprocă
Abi
Comozomul 9 Comozomul 22 Comozomul 9
Comozomul Philadelphia
Abi BCR
78
(FISH, transcrierea inversă a ARNm şi amplificarea prin PCR) prin
faptul că este mai ieftină şi mai rapidă (~30 min) şi necesită cantităţi
mici de ARNm (10 ng/μl). Diagnosticul timpuriu în asemenea cazuri
este foarte important, în fazele ulterioare celulele canceroase devenind
rezistente la chemoterapice.
Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive în
domeniul bionanotehnologic după descoperirea efectului lor
antibactericid [66]. Acest efect este unul de importanţă majoră datorită
faptului că bacteriile capătă din ce în ce mai multă rezistenţă la
antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influenţă nu numai
asupra bacteriilor, dar şi asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la
concentraţii non-toxice pentru celule inhibă replicarea virală (sinteza
materialului genetic ai virusului) atunci când nanoparticulele sunt
administrate înainte de infectare sau ime-diat după (2-4 ore) aceasta
[67].
Unele substanţe chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor
asupra proliferării celulare, angiogenezei şi rol antiinflamator. Un astfel
de exem-plu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care
induce apoptoza (moartea celulară) în celule umane de melanom A375
şi G361 [12]. DCPIP s-a dovedit a avea acţiune antiangiogeneză şi
antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116.
Efectul acestuia este mai intens dacă este încapsulat în particule de
polia-cizi (lactic şi glicolic). Concentraţiile de ≥6 μg/ml de colorant
(DCPIP) induc moartea celulară prin apoptoză [41].
79
Nanobiotehnologiile urmăresc nu numai crearea de nano-
vehicule pen-tru transportarea diferitor substanţe, dar şi crearea şi
manipularea unor adevărate nano-motoare, utile în nanomanipulare
celulară. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a cărei
mişcări pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici şi chimici [60].
Sisteme particulare capabile de transport ţintit şi eficient a
diferitor substanţe, cu puţine efecte adverse, se datorează probabil
endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide
cationice şi polielectroliţi s-au dovedit a fi cărăuşi excelenţi pentru
transportul amfotericinei B – un antifungicid pentru Candida albicans
[71].
Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat
bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul că
HDL este numit “colesterolul bun” deoarece este implicat în transportul
molecu-lelor hidrofobe (colesterol) în fluxul sangvin care este un
mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una
simplă, fiind alcătu-it din fosfolipide şi apolipoproteină (apo). Cea mai
abundentă formă de lipoproteină din plasma sanguină umană este apoA-
I, care este alcătuită din 243 de aminoacizi, este bine caracterizată şi la
incubarea cu vezicule de fosfolipide în vitro formează HDL revers,
capabil de transportul molecule-lor hidrofobe [61]. Fosfolipidele cele
mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC
(dimirisstoil-fosfatidil colina) şi DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol).
Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasamblează ND-HDL.
Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dacă nu este utilizată
80
enzima integrală, ci numai fragmente de apolipoproteine [73]. ND-HDL
reprezintă astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor
transmembranare, transportul unor substanţe hidrofobe.
Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele
transmembranare care îşi păstrează proprietăţile sale conformaţionale şi
activitatea. Suprafaţa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300
nm2, o suprafaţă suficientă pentru integrarea câtorva molecule proteice.
Avantajul utilizării acestor structuri comparativ cu miceliile de
detergenţi, este că asigură un mediu natural apropiat, fără prezenţa
detergenţilor care pot schimba conformaţiile proteinelor. ND-HDL au
fost utilizate în studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar
fi bacteriorodopsina [7,8], citoromul p450 3A4 [3], toxina antraxului
[35], hidrogenaze enzime de membrană produse de Pyrococcus furiosus
care pot sintetiza H2 [5]. ND-HDL au fost testate în utilizarea lor pentru
transportul diferitor substanţe hidrofobe, care sunt insolubile în mediu
sangvin hidrofil. Un exemplu în acest sens este transportul de către ND-
HDL a amfotericinei B un potenţial antifungicid care inhibă creşterea
Saccharomyces cerevisiae şi a altor fungi patogene, care administrat
sub această formă nu mai este toxic la anumite concentraţii [51]. ND-
HDL ce conţineau cucurmină (un polifenol hidrofob natural obţinut din
Curcuma longa) au inhibat creşterea liniei celulare hepatice HepG2
comparativ cu administrarea curcuminei libere [22]. O altă aplicaţie a
nanodiscurilor de HDL a fost încorporarea de lipide cu ioni bivalenţi de
Ni2+, care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichetă de 6-His
(histidine). Proteina din învelişul virusului West Nile [28].
81
CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE
4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat în diferite
ştiinţe au revoluţionat felul în care acea ştiinţă a fost percepută ulterior.
Culturile celulare sunt un asemenea exemplu în biologie. Introducerea
acestei tehnici în urmă cu aproximativ 100 de ani a permis practic
importul naturii în laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor
şi generalizarea strategiilor de studiu între cercetătorii din diverse
instituţii, urmată de o explozie informaţională în lumea biologică.
Avansarea cunoaşterii biomedicale din ultimele decenii nu ar fi fost
posibilă fără dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele.
Cercetarea biomedicală actuală foloseşte tehnicile de lucru cu celulele
pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie,
biologie celulară şi moleculară, genetica, biologia dezvoltării
organismelor, evolutionism, medici-na moleculară, farmacologia,
bionano-tehnologia, inteligent drug design etc. Este practic de
neimaginat desfăşurarea activităţii într-un centru de cercetare
biomedical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaţii curente
sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea
vaccinurilor, producţia glicoproteinelor recombinante (cytokine,
hormoni, anticorpi monoclonali folosiţi în cercetare şi clinica medicală,
interferoni, eritropoietina), testarea agenţilor anticanceroşi, studii de
genomică, metabolism, apoptoză. Într-un sens mai larg, cultura celulară
poate cuprinde cultura ţesuturilor şi organelor. Pe de altă parte, celulele
pot fi folosite ca şi model pentru studiul răspunsurilor fiziologice la
82
diferiţi factori de stres din mediu. Avansarea cercetării din domeniul
celulelor stem şi lucrul cu celulele embrionare face posibilă,
deocamdată teoretic, cultivarea organelor şi ţesuturilor cu aplicaţii în
bolile cronice degenerative, cancere şi altele. Din punct de vedere al
tipului de cultură se poate vorbi despre:
- cultura de organe - presupune prelevarea şi cultivarea unui organ în
totalitate. Aceasta include şi cultivarea unor embrioni întregi;
- cultura de ţesuturi - presupune prelevarea unor fragmente de ţesuturi şi
cultivarea lor;
- cultura de celule - presupune prelevarea unor ţesuturi şi digestia lor
pentru obţinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivată mai
departe.
Dacă ne referim la cultura de celule, există trei tipuri de celule
animale care sunt cultivate în laborator: primare, secundare şi
imortalizate (tabel 4.1).
Proprietăți primare secundare imortale/canceroase Inhibiţia de contact1 Da Da Unele/nu
Fenotipul faţă de situaţia in vivo
Identic Asemănător Asemănător/ rotunde
Genotipul faţă de situaţia in vivo
Identic Identic Asemănător/ diferit
Necesarul factorilor de creştere
Crescut Crescut Crescut/limitat
Diferenţiate Da Da Da/nediferențiate
Număr de diviziuni 2-3 <100 Nelimitat
Timp necesar cultivării Crescut Scăzut Scăzut
Reproductibilitatea rezultatelor
Scăzută crescută crescută
83
Tabel 4.1. Caracteristicile celulelor primare, secundare şi
imortale/canceroase [2]. 1 în mod normal, celulele cresc în vasul de cultură până când stabilesc contact cu vecinele lor, moment în care îşi opresc creşterea. Celulele canceroase pierd această caracteristică fenotipică şi după ce ajung să fie confluente încep să crească una peste cealaltă formând ghemuri de celule uşor de distins la microscopul optic.
4.2. Culturi primare Majoritatea celulelor din culturile primare necesită ancoraj.
Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se
face prin biopsierea ţesutului şi formarea unei suspensii unicelulare.
Aceste celule vor creşte aderente de suprafaţa vasului de cultură. Pentru
a le separa de acesta şi pentru separarea celulelor unele de altele se
folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de altă parte,
cultivarea celulelor prelevate din sângele periferic se face într-o manieră
care nu necesită ancorarea acestora de pereţii vasului de cultură. Este
posibil ca celulele să formeze aderenţe între ele dar de obicei acestea
sunt de o mică intensitate. Diferite substanţe (factori de creştere ai
diferitelor populaţii leucocitare şi/sau mitogeni – substanţe care
stimulează mitoza) pot fi utilizate pentru diferenţierea şi înmulţirea
celulelor în cultură [2].
4.3. Culturi secundare Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultură primară se pot obţine
aşa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultură secundară pot
parcurge până la 100 de diviziuni înainte de a-şi pierde potenţialul
84
proliferativ. Deşi nu prezintă alterări ale setului de cromozomi
(karyotipului), aceste celule acumulează anumite caracteristici
fenotipice care le fac să devină o linie celulară distinctă. Pe lângă
derivarea culturilor secundare, subcultura are ca scop menţinerea
celulelor în faza logaritmică de creştere, evitarea confluenţei care poate
avea ca rezultat inhibarea creşterii, îndepărtarea celulelor moarte şi a
produşilor de metabolism celular şi adăugarea substanţelor nutritive [2].
4.4. Culturi de celule imortalizate Este posibil ca unele celule din culturile secundare să sufere
anumite transformări care le conferă caracterul de imortalitate adică
posibilitatea de a se divide la nesfârşit. Aceste celule pot apărea ca
urmare a unor modificări (transformări) la nivelul cromozomului prin
factori chimici, fizici (radiaţii) sau biologici (virusurile oncogene).
Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter
oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator
este urmată de apariţia tumorilor la acestea. După cum se poate observa
din tabelul 4.1, celulele canceroase au unele proprietăţi care le
diferenţiază de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezintă
inhibiţia de contact; pot creşte cu mai puţini nutrienţi etc [2].
4.5. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu
Aplicaţiile culturilor celulare îşi găsesc utilitatea în producerea:
vaccinurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemică, antivaricela,
85
antirabic); hormonilor şi factorilor de creştere (insulina,
eritropoietina), factorilor de coagulare, enzimelor, anticorpilor
monoclonali şi altor substanţe imunomodulatoare (interferoni,
interleukine), agenţilor anticanceroşi etc. Mai mult, dezvoltarea în
ultimii ani a cunoştinţelor şi tehnologiei de lucru cu celulele stem
constituie una dintre temele cele mai actuale în domeniul biomedical.
Este de aşteptat ca acest domeniu să revoluţioneze tratamentul
diferitelor afecţiuni. În plus, celulele animale sunt deosebit de utile în
testarea citotoxicităţii diferitelor substanţe incluzând noile terapii
anticanceroase. Nu în ultimul rând, prin folosirea tehnologiei AND-ului
recombinat este posibilă crearea celulelor transgene care constituie per
se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic,
traficului de membrană, ciclului celular, diferenţierii, îmbătrânirii şi
apoptozei [2].
4.6. Anticorpii monoclonali Una dintre aplicaţtiile culturilor celulare cu cel mai mare impact
pentru societate la ora actuală este reprezentată de tehnologia de
obţinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor.
Această tehnologie a fost inventată de către Milstein şi Koehler în urma
cu aproape patru decenii. În 1975 cei doi cercetători au publicat
rezultatele prin care pot fi obtinuţi anticorpii monoclonali. Pe scurt
tehnica presupune imunizarea unui animal de experienţă cu un antigen
şi recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit
interval de timp după imunizare (figura 4.3). Aceste celule sunt
86
fuzionate apoi în prezenţa polietilenglicolului (PEG) cu o linie celulară
canceroasă de mielom (cancer al plasmocitelor). În urma acestei
fuziuni, se formează celule hibrid (de unde şi numele de hibridoame)
dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorită (caracter
dobândit de la celula B a animalului imunizat) într-o manieră continuă
(dobândind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite
metode de screening se pot găsi aceste celule care sunt ulterior
subclonate dând naştere astfel unor linii celulare pure şi stabile are
produc anticorpii monoclonali.
Datorită specificităţii deosebit de mari (se consideră că un
anticorp poate distinge antigenul pereche între 108 molecule), anticorpii
monoclonali şi-au găsit foarte rapid aplicaţii în domenii variate cum ar
fi: diagnosticul şi trata mentul clinic, cercetare fundamentală [59] şi cea
aplicată prin metode de izolare a diferitelor substanţe recunoscute,
anticorpi catalizatori ai reacţiilor chimice (abzymes).
Folosirea terapeutică a anticorpilor monoclonali în diferite
afecţiuni umane urmează două direcţii: markeri diagnostici care pot
identifica diferite tipuri de antigene din populaţii celulare in vivo şi
terapia ţintită a diferite-lor afecţiuni în care anticorpului monoclonal îi
sunt ataşate substanţe chimice toxice sau radioactive [2].
87
Figura 4.3. Producerea anticorpilor monoclonali [2].
Splina este izolată la câteva saptămâni (timp necesar pentru
îmbogăţi-rea repertoriului de celule B specifice) după imunizarea
animalului cu anti-genul faţă de care se doreşte producerea anticorpilor
monoclonali. Celulele B sunt izolate şi combinate cu mieloamele
(partea stângă) în prezenţa PEG care mediază fuziunea celulelor.
Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieţui în mediul
suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT).
Screeningul face posibilă identificarea coloniilor care produc anticorpi
faţă de antigenul dorit. Urmează apoi subclonarea realizată prin diluarea
Screening
Subclonare
Linie celulară producătoare de anticorpi monoclonali
PEG
HAT
Antigen
88
celulelor din coloniile producătoare în aşa fel încât fiecare recipient să
conţină teoretic o singură celulă. Se obţin în acest fel colonii în care
toate celule provin dintr-o singură celulă mamă şi deci vor produce
acelaşi anticorp ca şi aceasta.
Această abordare a permis medicilor oncologi să obţină rezultate
spectaculoase în diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actuală
de cancere tratate cu anticorpi monoclonali în care pacienţii
supravieţuiesc fără recidivă la 30 de ani de la administrarea terapiei.
Deşi nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produşi în şoarece
prezintă neajunsul de a fi străini organismului uman. Ajunşi în
organism aceşti anticorpi ca orice altă substanţă străină iniţiază un
răspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreţia de
anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de şoarece. Cu timpul
anticorpii umani pot neutraliza şi distruge anticorpii monoclonali
injectaţi anulându-le efectele terapeutice. Din acest motiv, în ultimii ani,
anticorpii de şoarece au fost umanizaţi. Tehnologia ADN-ului
recombinat a făcut posibilă ataşarea părţii specifice (cea care recunoaşte
antigenul) derivată de la şoarece cu un braţ constant (care constituie
cea mai mare parte) de la om. Există la ora actuală şi peste 30 de
anticorpi monoclonali folosiţi ca şi agenți terapeutici în diferite
afecţiuni umane; numărul celor aflaţi în diferite stadii de testare
depăşeşte 100.
4.7. Celule stem Următorul pas în revoluţia din domeniul biomedical a fost
reprezentat de posibilitatea cultivării celulelor stem în laborator. Prin
89
definiţie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau naştere
unei celule fiică identică şi unei alte celule care poate fi diferită. După
sursa de provenienţă există două tipuri de celule stem: celule stem
embrionare şi celule stem adulte. După numărul de precursori ai liniilor
diferenţiate pe care le poate produce, celule stem pot fi clasificate în:
totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente. După cum implică
numele, celulele totipotente sunt capabile să formeze un organism în
totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de către ovulul fertilizat şi
celulele obţinute din primele diviziuni ale acestuia. O schiţă a
diferenţierii celulare se găseşte în figura 4.4. Cele mai bine studiate
celule stem sunt cele derivate din măduva osoasă şi care constituie
precursorii tuturor celulelor din sânge. Interesul major pentru biologia
celulelor stem este explicat de potenţialul de diferenţiere al acestora în
orice tip de ţesuturi şi organele dintr-un organism. Deşi cercetarea în
acest domeniu este relativ la început, cercetătorii au reuşit să izoleze şi
cultive cu succes anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele
fiind apoi diferenţiate în numeroase celule finale. Pe lângă potenţialul
terapeutic enorm, celulele stem prezintă şi aplicaţii diagnostice. Este
posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat în urma
fertilizării in vitro a unui ovul să fie îndepărtată şi analizată din punct de
vedere genetic (celula este dispensabilă deoarece restul celulelor rămase
refac embrionul). În urma analizelor care pot să depisteze diferite
defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului în uterul
viitoarei mame.
90
Folosirea acestor celule face posibilă şi obţinerea animalelor
modificate genetic prin introducerea unor gene în embrionul tânăr. Se
pot produce astfel animale „chimera” care exprimă genele implantate în
diferite organe. Dacă aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaşii
unei împerecheri dintre doi astfel de şoareci chimera pot produce un
knock-out/knock-in pentru acea genă. Deşi deosebit de atractivă,
tehnologia cultivării celulelor stem embrionare este puternic îngrădită
de normele actuale ale eticii cercetării.
Figura 4.4 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final [2].
Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem
embrionare au încurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem
91
adulte. Rămâne de văzut dacă potenţialul unor astfel de celule stem
adulte este la fel de nelimitat ca şi al celor embrionare. Recent au fost
descrise şi celule stem canceroase. Această nouă descoperire pune sub
semnul întrebării principiile actuale care stau la baza tratamentului
cancerului. Existenţa acestor celule canceroase stem poate explica
apariţia recidivelor prin participarea unui număr redus de celule care nu
pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Experimental s-a dovedit
că un număr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem
canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la
un altul în timp ce un număr de câteva sute de ori mai mare de celule
canceroase care nu prezintă caracteristicile celulelor stem sunt
incapabile să transfere boala.
Succesul în lucrul cu celule depinde de factori variaţi cum ar fi:
utilarea laboratorului, calitatea celulelor şi a reactivilor, tehnica
asepteică (prezentate în cele ce urmează) şi experienţa personală a
operatorului care contribuie decisiv la primele trei [2].
92
CAPITOLUL 5.
Aparatajul disponibil şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente
5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare Organizarea generală a laboratorului de culturi celulare include
următoarele echipamente de bază:
a. Hota cu flux laminar
• Serveşte lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaţiului de lucru este
descrisă în figura 4;
• este prevazută în mod obligatoriu cu o lampă de UV care va fi pornită
5-10 minute înainte de începerea lucrului şi repornită pentru
5-10 minute după încheierea lucrului;
• tipul de hotă folosită pe scară largă în cultura celulelor animale este
hota cu flux de aer vertical care oferă o protecţie bună atât pentru
celule cât şi pentru operator.
b. Incubator cu sursa de CO2
• creşterea celulelor; în funcţie de tipul de celulp, concentraţia de CO2
este în general ajustată între 5% şi 7% pentru a obţine un sistem
tampon optimal în combinaţie cu substanţele din mediul de cultură;
• responsabil pentru menţinerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA -
high efficiency particulate air), umede şi cu temperatura constantă.
c. Microscop optic inversat cu contrast de fază (opţional aparat
foto)
• serveşte la observarea celulelor;
93
• deoarece în cultura de celule animale, celulele sunt în general situate
pe suprafaţa bazei recipientului se foloseşte microscopul inversat;
• contrastul de fază îmbunătăţeşte vizualizarea specimenelor transpa-
rente (celulelor).
d. Centrifuga de masă cu răcire
• centrifugarea suspensiilor de celule în diverse scopuri.
e. Recipient cu azot lichid
• stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se găseşte într-o incintă
anexată;
• o precauţie deosebită trebuie acordată faptului că recipientul este
extrem de rece (-196 grade Celsisus) şi azotul poate produce arsuri
în urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesară
utilizarea echipamentului de protecţie (ochelari/mască facială,
manuşi, halat).
f. Frigider/congelator
• stocarea reactivilor (medii cultură, stocuri de antibiotice, L-glutamina
etc.)
g. Alte componente
• Baie de apă
păstrarea mediilor şi altor reactivi la temperatura de 37°C;
o alternativă este înlocuirea apei cu perle metalice care
prezintă următoarele avantaje: reducerea contaminării
reactivilor cu care vin în contact, igienizare uşoară,
economisirea consumului de energie, stabilitate în timp.
• Autoclav şi sterilzor cu aer uscat
94
Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluţii şi recipiente
folosite.
• Pompa de vid şi sisteme de sterilfiltrare
pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se
poate folosi şi ca sistem de aspirare a mediilor folosite.
h. Consumabile
• pipete serologice, pot fi din plastic (de unică folosinţă) sau din sticlă
(refolosibile după sterilizare);
• vase de cultură - codate în funcţie de aria utilă de cultivare şi de vo-
lumul maxim de mediu care poate fi conţinut;
• medii de cultură (multe celule pot fi cultivate în
DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaugă diferite concentraţii de L-
glutamina şi antibiotice).
Cronologic se poate vorbi de existenţa a două categorii de medii;
cele na-turale care includ serul sanguin şi alte secreţii de origine
animală şi medii sintetice în care componentele de bază sunt produse
separat şi apoi amestecate de obicei de către firme specializate. Chiar
dacă este vorba de un mediu sintetic, cu unele excepţii serul este
considerat un component de bază. La ora actuală, serul provine de la
animale mari, în gene-ral de la vacă - de unde şi numele de fetal bovine
serum (FBS). Mediile de cultură sunt soluţii saline tamponate.
Compoziţia mediilor de cultură este complexă incluzând: aminoacizi,
acizi graşi, carbohidraţi, săruri, microelemente, vitamine, hormoni,
factori de creştere şi alte componente. Cele mai multe medii conţin şi
phenol red, un indicator al pH-ului care trebuie să rămână între 7 şi 7,4.
95
Dacă acesta virează spre galben indicând un mediu acid este cazul ca
mediul să fie schimbat.
• suplimente pentru mediile de cultură: antibiotice – uzual se foloseşte
un amestec de penicilină/streptomicină, L-glutamină, Na-piruvat,
bicarbonat, glucoză şi altele în funcţie de particularităţile
experimentului [2].
5.2. Strategii de lucru Din punct de vedere tehnic, există câteva principii de bază ale
lucrului cu celulele:
• culturile celulare vor fi făcute într-o cameră dedicată acestui scop.
Este de dorit ca această încăpere să fie oarecum izolată faţă de restul
laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest
motiv, accesul personalului în această cameră va fi restricţionat pe
cât posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct
implicaţi în procesul de lucru cu celulele;
• personalul care urmează să lucreze cu celulele va fi instruit
corespunzător (vezi mai jos);
• acele încăperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezintă risc
infecţios pentru cei implicaţi; de aceea încăperile vor fi semnalizate
corespunzător;
• toate mediile şi suplimentele care urmează a fi folosite în cultura
celulară trebuie să fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule
(indicaţia cell culture certified/approved trebuie să apară pe
96
ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor
celulare cu care urmează a se lucra în laborator;
• spre deosebire de celulele vegetale şi bacterii, celulele animale sunt
pretenţioase în ceea ce priveşte condiţiile în care pot sa crească; există
riscul contaminării cu diferite microorganisme care datorită ratei de
creştere mult superioară celulelor animale vor deveni majoritare în scurt
timp; în plus factori ca spre exemplu temperatura (37oC pentru celule
mamifere), pH-ul, osmolaritatea (290-310mOsm), şi o concentraţie a
CO2 între 5 şi 7% condiţionează cultura celulelor animale (sistemul de
tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau
potasiu din mediul de cultură + CO2 din incubatorul folosit);
• celulele animale sunt limitate în ceea ce priveşte numărul de generaţii
pe care le produc. Chiar şi în condiţii optime, celulele animale se vor
opri din creştere după un număr de generaţii care depinde de sursa
primară a celulelor;
• creşterea celulelor animale urmează o curbă cu trei faze:
o faza de echilibrare (primele 24h) în care celulele se acomodează
cu noul mediu în care sunt introduse;
o faza de creştere exponenţială care durează în jur de 7-10 zile;
o faza de inhibare a creşterii datorită inhibiţiei de contact, creşterii
densităţii peste un nivel critic, scăderii potenţialului de metabolizare a
mediului;
• substanţele pot fi preîncălzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20
min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita „uitarea”
97
mediilor pentru un timp îndelungat şi degradarea lor (L-glutamina,
tripsina).;
• lucrul bine organizat şi desfăşurat fără grabă este esenţial pentru o
eficienţă maximă:
o mişcările vor fi măsurate şi sigure;
o imediat după adăugarea suplimentelor în mediile de cultură se
notează acest fapt pe recipientul respectiv;
o nimic din ceea ce vine în contact direct cu celulele nu se deschide în
afara hotei sterile; înainte de scoaterea din hotă se verifică etanşeitatea
închiderii [2].
5.3. Instruirea personalului Cultivarea celulelor este un lucru care se poate învăța repede. Cu
alte cuvinte, oricine poate învăța să menţină culturile de celule după
doar câteva zile petrecute în laborator dacă respectă protocoalele şi are
la dispoziţie echipamentul necesar. Singurul lucru care este şi mai uşor
şi nici măcar nu necesită învățare este să contaminezi celulele. De aceea
desfăşurarea activităţii în linişte este esenţială în laboratorul de culturi
celulare. Odată apărută, contaminarea se poate propaga din aproape în
aproape şi duce în final la compromiterea nu doar a celulelor la care
contaminarea a fost iniţial semnalată ci a întregului stoc de celule. Pe
lângă considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu conţinut
original (celule produse în laborator şi care nu pot fi achiziţionate de la
companiile specializate sau transferate de
98
la alţi investigatori) reprezintă cel mai neplăcut aspect care poate afecta
un laborator de culturi celulare. Toţi cei care urmează să lucreze cu
celule vor fi în prealabil instruiţi teoretic înainte de a pătrunde pentru
prima dată în laborator. Practic, ei vor începe prin a observa manoperele
de lucru şi a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar
după această perioadă este permis lucrul direct, mai întâi sub
supravegherea directă a celor familiarizaţi şi mai apoi în mod
independent. Chiar şi după câştigarea in-dependenţei în lucru, cel
proaspăt iniţiat va fi supravegheat din umbră de către un coleg cu
experienţă care ar putea observa anumite manopere executate
neconform cu normele curente [2].
5.4. Asigurarea asepsiei şi antisepsiei Există anumite măsuri care asigură igiena în lucrul cu celulele:
• Utilizarea echipamentului de protecţie - pentru evitarea contaminării
celulelor şi operatorului:
halat cu mâneci lungi
pantofi închişi
mănuşi de unică folosinţă
• Spălatul pe mâini înainte şi după lucrul cu celulele;
• O soluţie antimicrobiană de etanol 70% trebuie să fie în permanență
la îndemână;
• Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice
obiect (pipeta, recipient etc.) care urmează să fie introdus în hota pentru
lucrul steril trebuie dezinfectat înainte sau imediat după introducere;
99
• Orice pipetă trebuie folosită o singură dată; nu este permisă păstrarea
pipetei în mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera
mediu de la un recipient la altul;
• Orice mediu sau obiect contaminat din greşeală va fi aruncat;
• Orice lichid care ajunge în contact cu suprafaţa de lucru sterilă va fi
îndepărtat imediat cu ajutorul unui prosop de hârtie îmbibat în
etanol 70%;
• Este necesară investigarea stării de sănătate a celulelor în fiecare zi.
Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea.
Se pot de asemenea observa contaminări cu alte celule sau
microorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea
prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare [2].
5.5. Cultivarea celulelor • după felul în care cresc în flacoanele de cultură, celulele eucariote pot
fi împărțite în două mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de
cultură şi cele care cresc în suspensie. Modul de lucru este asemănător
pentru toate celulele dar există anumite particularităţi de care trebuie
ţinut cont în cazul fiecărei grupe;
• evaluarea celulelor se face în mod normal în fiecare zi prin
vizualizarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent
trebuie să apară distribuite pe suprafaţa de contact cu vasul în care cresc
şi de cele mai multe ori capătă o formă poligonală, iar celulele care
cresc în suspensie rămân rotunde şi uneori (în funcţie de linia cultivată)
100
pot forma aglomerări de celule (asemănător cu o ciorchină de struguri);
starea de sănătate a celulelor este confirmată şi de creşterea numărului
de la o zi la alta; o evaluare de primă instanţă a celulelor se realizează
prin vizualizarea macroscopică a culorii mediului din sticlele de cultură;
• culoarea standard a mediilor este roşu-orange; o culoare care virea ză
spre galben indică necesitatea schimbării mediului;
• subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celulară poate influenţa
negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomandă ca
celulele să fie subcultivate; această procedură care se aplică în faza
logaritmică de creştere a celulelor permite obţinerea unor cantităţi
crescute de celule prin împărţirea/transferul acestora dintr-un recipient
de cultură în mai multe recipiente fiecare reprezentând o nouă sursă de
celule; există anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie
a combinaţiilor optime; de asemenea se pot planifica în acest fel
anumite experimente pentru anumite date; în anumite situaţii este
nevoie de utilizarea unor soluţii de tripsina/EDTA pentru crearea
suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea) [2].
5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora
Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele într-un anumit
protocol este nevoie de stabilirea numărului de celule pe unitatea de
volum. Mediul de cultură conţinând celulele este transferat unor tuburi
în care se centrifughează (centrifuga trebuie echilibrată în prealabil -
dacă avem un singur tub cu celule va trebui să folosim un al doilea tub
101
cu aceeaşi greutate care poate să conţină apă distilată sau orice alt lichid
cu densitate asemănătoare). Pentru o separare bună este nevoie de 10
minute la 200-250g/min (într-o centrifugă de masă cu rotor standard
1000rpm). După centrifugare celulele se resuspendă în mediu proaspăt
şi apoi 10 microlitri sunt combinaţi cu 10 microlitri de soluţie Trypan
blue 0,5% şi pipetate în camera de numărat. Sub microscopul optic,
leucocitele apar ca şi celule gălbui/transparente cu o membrană brună.
Soluţia de trypan blue va pătrunde în celulele moarte care apar albastre.
În funcţie de tipul camerei de numărat, există formule de calcul după
care putem să aflăm numărul total de celule. O viabilitate de peste 90-
95% este în general acceptată pentru toate manipulările ulterioare [2].
5.7. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor Doi paşi critici ai lucrului cu celulele sunt constituiţi de către
îngheţarea şi dezgheţarea celulelor. Îngheţarea este indispensabilă din
următoarele considerente:
• Celulele sunt supuse în permanenţă variaţiilor în compoziţia
cromozomilor. De aceea cea mai sigură metodă de prezervare a liniilor
celulare este cryoprezervarea care opreşte procesele metabolice
nelăsând astfel loc modificărilor genotipului.
• În plus, cryoconservarea este o metodă practică din punct de
vedere economic: este mult mai simplu să păstrezi un tub cu celule
îngheţate care nu au nevoie decât de o completare periodică a rezervei
de azot decât să cultivi în mod repetat celulele în laborator; de
102
asemenea transportul între laboratoare este mai uşor dacă celulele sunt
îngheţate.
• Nu în ultimul rând, metoda face posibilă revenirea la celule cu
un număr mai mic de pasaje.
Este esenţial ca înainte de începerea procedurii respective să
notăm următoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celulă, numărul de
celule, numărul de pasaj şi data la care a fost creat stocul.
Îngheţarea va fi lentă şi constantă pentru a minimaliza efectele
adverse asupra viabilităţii celulelor. Mediul de îngheţare cel mai
frecvent folosit conţine mediul de cultură recomandat pentru linia
celulară + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid
(DMSO) sau 10-15% glicerol care are rolul de a scădea temperatura de
îngheţ permiţând apei să iasă din celulă şi împiedicând astfel formarea
cristalelor de gheaţă care ar putea distruge membrana. După
centrifugarea şi verificarea vitalităţii (se recomandă folosirea celulelor
vitale în proporţie de >90-95% la colorarea cu trypan blue), celulele vor
fi resuspendate direct în mediul de îngheţare răcit în prealabil la 4 grade
la o concentraţie de 1x106-1x107/ml6 şi transferate imediat la -20 oC
pentru 1-2 ore. Urmează apoi transferul peste noapte la -80 oC şi apoi
stocarea de lungă durată în azot lichid.
Dezgheţarea celulelor trebuie făcută extrem de rapid (ideal în
mai puţin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot,
pe gheaţa uscată, direct în baia de apă la 37 de grade Celsius. Odată ce
103
dezgheţarea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheţată) aceasta se
transferă într-un tub de 15ml peste care se adaugă picătură cu picătură8
o cantitate de mediu preîncălzit echivalentă cu de două-trei ori
cantitatea suspensiei, după care se poate adăuga mai rapid mediu până
la 10ml. Se centrifughează în general la 200rpm timp de 2-5 min pentru
a elimina urmele mediului de îngheţare. Se resuspendă în 10 ml de
mediu şi se transfera în sticlele de cultură etichetate. Prin mişcări fine
se distribuie celulele. După câteva ore (cel târziu a doua zi dimineaţa) se
verifică starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi
schimbat pentru a înlătura celulele moarte şi resturile de cryoprotector
(DMSO – sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).
5.8. Subclonarea şi tripsinizarea Celulele formează aderenţe între ele şi suprafaţa vasului de
cultură (celule aderente) şi/sau între ele (celulele aderente, unele celule
care cresc în suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere
este necesară obţinerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecventă
combinaţie folosită în acest scop este tripsina/EDTA.
Dacă este vorba de celule aderente protocolul de lucru
presupune îndepărtarea mediului, spălarea cu o soluţie salină tampon
fără calciu şi magneziu şi adăugarea unei cantităţi de trispină/EDTA
care să acopere stratul de celule. Celulele nu trebuie lăsate neacoperite
timp îndelungat. Pentru a ajuta separarea este posibilă uşoara bătaie a
sticlei de podul palmei. Urmărind sub microscop separarea celulelor
(durează câteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubări
104
prea îndelungate. Celulele devin rotunde odată ce pierd aderenţele.
Imediat, acţiunea trispinei este antagonizată prin adăugarea de ser
urmată de transferul într-un tub adecvat şi centrifugarea. După
centrifugare celulele sunt resuspendate în mediu pentru a obţine o
suspensie unicelulară şi apoi numărate/investigate la microscop prin
colorarea cu trypan blue (proporţia celulelor moarte). Dacă tripsinizarea
s-a făcut în cadrul protocolului de subcultivare, celulele sunt apoi
transferate vaselor noi de cultură şi incubate până a doua zi. A doua zi
se recomandă schimbarea mediului care permite înlăturarea celulelor
moarte şi a resturilor de tripsină/EDTA. Dacă manopera s-a făcut în alt
scop, se urmează paşii din protocolul respectiv.
La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi
direct numărate iar densitatea lor este ajustată prin adăugarea mediului
proaspăt. La fiecare 2-4 săptămâni se centrifughează şi resuspendă
celulele neaderente în mediu proaspăt [2].
CAPITOLUL 6. Producerea şi izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere
Tehnica de bază pentru producerea acestor proteine implică mai
multe etape care sunt menţionate în tabelul 3. După întocmirea
strategiei de lucru, fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica
PCR. Pe scurt, ţesutul care conţine antigenul ţintă este prelevat de la
sursa de interes după care ARN-ul mesager obţinut în urma extracţiei
este folosit ca şi matriţă pentru sinteza ADN-ului complementar [2]. Cu
105
ajutorul amorselor specifice, folosind acest ADN complementar pot fi
amplificate secvenţele de interes prin reacţia de PCR. După clonarea
acestor fragmente în celule, urmează exprimarea proteinelor codate şi
purificarea acestora [2]. Apoi în funcţie de aplicaţia dorită, acestea vor
fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boală fie pentru cel
pasiv.
6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi Terapia biologică cu ajutorul anticorpilor este considerată la ora
actuală ca fiind cea mai activă branşă a industriei biotehnologice [57].
Din punct de vedere istoric, prevenţia/terapia cu ajutorul anticorpilor
este o procedură folosită de câteva mii de ani. Chinezii şi indienii sunt
cei cărora li se atribuie folosirea terapeutică a serurilor (fracţiunea
sângelui în care se găsesc anticorpii alături de alte proteine) încă
înaintea erei noastre. În urmă cu câteva secole, este semnalată folosirea
serurilor pentru protejarea persoanelor în Turcia şi apoi odată cu
experimentele doctorului Edward Jenner de la sfârşitul secolului al
XVIII şi în Anglia. Totusi folosirea pe scară mai largă a anticorpilor în
scop terapeutic a început să fie practicată începând cu secolul XX. În
ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea anticorpilor a fost
însă limitată de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au
fost:
• lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni;
• anumite aspecte adverse (apriţia unui răspuns imun faţă de
însuşi anticorpii) datorită utilizării anticorpilor de la alte specii;
106
• dificultăţilor tehnice în izolarea/producerea lor şi
• necunoaşterea posibilelor ţinte terapeutice esenţiale pentru
diferite afecţiuni.
Descoperirea antibioticelor în anii 30-40 ai secolului trecut
alături de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor
într-un con de umbră. Începând cu 1975 situaţia avea însă să se
schimbe. Într-o lucrare de referinţă pentru literatura biomedicală, doi
cercetători anunţă în revista Nature o metodă prin care se pot obţine
cantităţi teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorită.
Diferenţa între anticorpii policlonali (cei care erau la acea oră în uz
medical) şi noii anticorpi (numiţi monoclonali) poate fi comparată,
chiar şi numai pentru a face lucrurile mai uşor de înţeles, cu diferenţa
dintre două persoane, prima purtând haine de diferite mărimi, forme şi
culori şi a doua purtând haine personalizate de către un croi-tor
profesionist, începând de la lenjerie şi până la ultimul nasture al
paltonului. Chiar dacă uşor exagerată şi poate nu cea mai potrivită din
punct de vedere biomedical, folosirea acesteia are un substrat uşor de
înţeles şi anume în literatura de specialitate de limba engleză termenii
„tailor made antibodies” sunt folosiţi pentru a descrie producerea de
anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaţii [57]. Dezvoltarea
acestei noi tehnici, a dus la înlăturarea primului din cele două mari
dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali, şi anume lipsa unei
surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu
timpul, noua tehnologie a permis obţinerea lor prin tehnici relativ
107
simple şi cu costuri substanţial diminuate înlăturând astfel cel de-al
treilea dintre dezavantajele amintite anterior. Anticorpii monoclonali
produşi iniţial au păstrat neajunsul de a fi produşi în alte specii ducând
la declanşarea unui răspuns imun masiv din partea primitorului (cel de-
al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv, lumea biomedicală
şi industria farmaceutică a fost în prima instanţă rezervată la posibila
utilizare a acestora pe scară largă. Această temere a fost dublată şi de
avansarea tehnicilor industriale de producere a molecule-lor cu masă
moleculară mică care păreau să fi rezolvat în sfârşit problema
inexistenţei unor medicamente perfecte. În ciuda acestor piedici,
entuziaştii au continuat însă lucrul la producerea anticorpilor
monoclonali ducând la aprobarea utilizării primului anticorp produs în
acest fel nu însă mai repede de un deceniu de la publicarea
metodologiei de către Koehler şi Milstein [37]. Totuşi în anii care au
urmat, potenţialul imens al noii tehnologii a incitat atât curiozitatea
comunităţii ştiinţifice (interesată în definirea noilor aplicaţii pentru care
anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-căutată, cel de-al
patrulea neajuns amintit mai sus) cât şi de către pragmatismul
industriei farmaceutice (care găsea o nouă mină de aur în
comercializarea noilor „gloanţe magice” aşa cum le numea Paul
Ehrlich, părintele hematologiei şi chemoterapiei, acesta din urmă fiind
un termen pe care l-a introdus chiar el, cu mai bine de un secol în urmă
[69]. După unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor
monoclonali reprezintă inovaţia secolului trecut în ceea ce priveste
importanţa terapeutică, diagnostică şi preventivă a îmbolnăvirilor
108
umane. Dacă în anul 2000, în topul primelor zece produse folosite în
tratamentul diverselor afecţiuni existau, cu o singură excepţie, doar
substanţe cu greutate moleculară mică, se estimează că cinci din cele
zece substanţe vor fi reprezentate de anticorpi în viitor [57, 66]. Desigur
această turnură a fost posibilă prin îmbunătăţirea permanentă a
protocoalelor de lucru şi obţinerea unor anticorpi modificaţi prin
tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare
extraordinară în ultimele două – trei decenii. La ora actuală, anticorpii
sunt în aproape toate situaţiile luaţi în calcul la stabilirea strategiei
terapeutice alternative sau câteodată constituie chiar terapia de primă
alegere. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflaţi la ora
actuală pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afecţiunilor
umane, majoritatea sunt destinaţi tratării cancerelor. De asemenea dintr-
un total de 1500 de studii clinice în care sunt testaţi noi anticorpi
monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora în tratarea
cancerelor. Majoritatea sunt folosiţi ca atare (neconjugati), urmaţi de cei
conjugaţi cu material radioactiv şi o mică proporţie sunt reprezentaţi de
cei conjugaţi cu toxine. Aceste date au menirea de a sublinia interesul
major al comunităţii biomedicale şi al guvernelor statelor
industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanţate din
bani publici) pentru găsirea unor strategii terapeutice specifice pentru
tratarea acestei maladii.
După cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrării
lui Koehler şi Milstein [37], în 1986 este aprobată utilizarea primului
anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea
109
pe scară largă a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost însă
limitată de faptul că acest anticorp de origine murină (produs în celule
de şoarece care diferă suficient de celulele umane) induce un răspuns
imun amplu în organismul uman [68]. Mai mult, administrarea acestui
anticorp a dus la apariţia sindromului eliberării sistemice de cytokine
datorită interacţiunii OKT3 cu receptorii pentru porţiunea Fc a IgG.
Datorită eşecului relativ al utilizării acestui medicament şi datorită
timpului îndelungat necesar dezvoltării unui nou medicament, timpul
scurs până la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de
încă opt ani de la aprobarea OKT3. În 1997, rituxan (rituximab), un
anticorp monoclonal împotriva CD20 de pe celulele B devine cel de-al
treilea medicament admis pe piaţa din SUA pentru tumori ale celulelor
B. Între timp acest medicament este folosit şi în tratamentul unor boli
autoimune cum ar fi artrita reumatoidă, bolile buloase (pemfigusul,
pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitică autoimună,
vasculita autoimună etc. Acest anticorp chimer (combinaţie între uman
şi murin) are multiple mecanisme de acţiune dintre care merită amintite:
inducerea toxicităţii celulare indusă de anticorpi (ADCC) şi
citotoxicitatea mediată de complement (CDC), alături de un mecanism
de inducere a apoptozei celulelor care exprimă CD20 pe suprafaţă. În
general, anticorpii sunt substanţe care interacţionează cu structuri
extracelulare sau de pe suprafaţa celulelor. Mare parte dintre eforturile
actuale au menirea de a creşte penetranţa acestor glicoproteine pentru
ţinte din interiorul celulelor. În plus dacă anticorpii iniţiali aparţineau
clasei IgG1, investigaţii actuale sunt concentrate asupra diversificării
110
activităţii prin schimbarea clasei şi deci a paletei de efecte posibile. Mai
mult, există câteva direcţii prin care se urmăreşte creşterea posibilelor
interacţiuni terapeutice. Dintre acestea amintim:
- o modificarea porţiunii Fc a anticorpilor pentru:
- îmbunătăţirea interacţiunii cu receptorii Fc sau Fc de tip
neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare;
- îmbunătăţirea proprietăţilor efectoare prin optimizarea in-
teracţiunii cu sistemul complement;
o prelungirea duratei de injumătăţire cu efecte favorabile
datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv,
Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig;
o multispecificitatea, adică adăugarea unei alte specificităţi în
zona de recunoaştere a Fab.
Pe scurt, anticorpul păstrează specificitatea pentru care a fost
creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de ţinta dorită
urmând ca pe celalalt fragment Fab să lege un receptor de pe o celulă
efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a
distruge celula recunoscută specific.
111
6.2. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii a culturilor celulare.
Una dintre direcţiile de cercetare care vor fi abordate în viitor se
va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor
protei-ne autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenţia
va fi concentrată pe producerea acelor autoantigene a căror patogenitate
este încă incomplet elucidată, contribuind astfel într-un mod inovativ la
definirea naturii autoimune a diferitelor entităţi clinice. Un exemplu în
acest sens îl constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele
sunt o clasă heterogenă de proteine implicate în diverse procese de la
asigurarea contac-telor dintre celule şi mediul înconjurător, la funcţii de
recrutare şi transducerea semnalului. Un interes primar pentru
preocupările noastre îl constituie producerea fragmentelor recombinate
ale proteinelor care asigu-ră adeziunea keratinocitelor de stratul dermal.
Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate în
patogeneza bolilor autoimune. Nu este deocamdată clar în ce fel şi în ce
măsură autoanticorpii faţă de aceste mole-cule sunt implicaţi în
patogeneza autoimună. De aceea, odată produse aceste fragmente ar
putea fi folosite în diferite combinaţii pentru a reproduce caracteristicile
bolii umane în animalele de experienţă. Ca şi metodologie de lucru,
producerea unui model de boală şi modularea acestuia în scop
preventiv/terapeutic implică mai multe etape (Tabelul 6.1).
112
Tabelul 6.1. Etape recomandate pentru modelare în scop
preventiv/terapeutic a unei boli autoimune în animalele de
experienţă
Denumire etapă activități
Obţinerea
fragmentelor
recombinate ale
autoantigenului
Stabilirea planului de clonare
Designul şi producerea de amorse specifice Izolarea
ARN-ului mesager
RT-PCR Clonarea produşilor obținuți prin PCR
Exprimarea proteinelor recombinate
Producerea
modelului activ de
boală
Imunizarea animalelor de experienţă cu diferite
combinaţii de proteine recombinate Evaluarea clinică
şi paraclinică a inducerii bolii Dezvoltarea unor
strategii de prevenţie, diagnostic şi tratament a bolii
induse:
- folosirea diverselor căi de administrare, adjuvanţi,
cantităţi variabile de autoanitgen, folosirea
autoantigilor modificaţi
- folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau
funcţionalizaţi cu nanosfere
- folosirea nanosferelor direcţionate specific
împotriva celulelor imune autoreactive
Producerea
modelului
pasiv de boală
Imunizarea unor animale intermediare cu diferite
combinaţii de proteine recombinate şi izolarea
anticorpilor specifici produşi
Transferul pasiv al acestor anticorpi în şoarecii de
113
laborator
Dezvoltarea strategiilor de prevenţie, diagnostic şi
tratament:
- folosirea anticorpilor din diferite surse şi
evaluarea mecanismelor patogenetice
specifice fiecăruia (sistem complement,
granulocite prin FcR etc.)
- izolarea claselor şi subclaselor din sursa de
anticorpi policlonali şi investigarea meca-
nismelor efectoare prin care aceştia produc
boala
- modificarea anticorpilor prin tehnica
ADN-ului recombinat (se urmăreşte în acest
fel modularea interacţiunii cu diferite
mecanisme efectoare prin modificarea spre
exemplu a porţiunii Fc a anticorpului)
În ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea
interacţiunilor dintre porţiunea Fc a anticorpilor şi alte proteine
efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor
imunităţi înnăscute, sistemul complement). Cercetări recente au arătat
că există diferenţe esenţiale între acţiunea diverşilor anticorpi care la
prima vedere sunt identici. Explicaţia propusă a fost că diferenţa este
datorată unor modificări postranslaţionale apărute în porţiunea Fc a
anticorpilor. Este vorba despre adăugarea diferitelor lanţuri glucidice
care fac anticorpii entităţi glicoproteice. Deşi acest lucru era cunoscut
114
de mai multă vreme, semnifica-ţia funcţională a acestui detaliu
structural a rămas un mister până de cu-rând. S-a dovedit recent că o
scădere a syalilarii lanţului glucidic din aceas-tă porţiune duce la
creşterea activării celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. De
asemenea structura primară a lanţului polipeptidic care formează
porţiunea Fc a anticorpilor este implicată în reactivităţile diferite
observate la folosirea diverselor preparaţii de anticorpi. De altfel
interesul tot mai mare în explicarea la nivel molecular a susceptibilităţii
la anumite afecţiuni a dus din ce în ce mai frecvent la obţinerea
secvenţelor de nucleotide care codează pentru anticorpi. S-a dovedit
astfel existenţa unei concordanţe între aceste secvenţe şi capacitatea
lanţurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare. Tendinţa
actuală este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN în
funcţie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumită clasă de
celule efectoare cu implicare în terapia afecţiunilor autoimune şi
cancerelor. Astfel, interesul extraordinar în găsirea combinaţiilor optime
de anticorpi care să identifice celulele tumorale ţintă şi în acelaşi timp
să angajeze un răspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab
a început să fie balansată de interesul pentru modifica-rea porţiunii Fc
în vederea creşterii efectivităţii. Ideea de bază este că un sistem imun
„acordat” perfect reuşeşte să distrugă celulele nedorite prin implicarea
la timpul şi momentul potrivit a potenţialului uriaş pe care celu-lele
imunităţii il posedă. Se vorbeşte în acest sens despre anticorpi
trispecifici/multispecifici în care pe lângă specificitatea porţiunii Fab
pen-tru ţinta dorită, cea de-a doua porţiune Fab poartă specificitatea
115
agentului terapeutic (nanosfera radioactivă sau toxina; specificitate
pentru un alt re-ceptor de pe o celulă citotoxică spre exemplu), iar o a
treia, patra etc. speci-ficitate este adusă de
cătremodificarea/modificările din porţiunea Fc astfel încât acestea să
poată activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 6.1).
Figura 6.1. Mecanisme de acţiune ale anticorpilor multispecifici.
Pe lângă specificitatea pentru celula tumorală ţintă şi cea
pentru nanoparticule, anticorpii multispecifici posedă şi alte specificităţi
care să le crească capacitatea funcţională benefică. Spre exemplu, prin
modificarea porţiunii Fc pe partea stângă a figurii, anticorpul capătă
116
proprietăţi sporite de activare a sistemului complement care fie direct
(2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune. În
plus, folosirea unei duble specificităţi a porţiunii variabile a
fragmentului Fab face posibilă recrutarea în vecinătatea tumorii a
celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin „personalizarea”
interacţiunii fragmentului Fc cu celulele care poartă receptori pentru
acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot
avea ca rezultat o activare crescută a acestor celule cu producerea
speciilor reactive de oxigen şi eliberarea proteazelor efectoare (5,6).
În prezent se urmăreşte lărgirea paletei de experimente şi
metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroşi
membri ai acestuia se află în prezent în diverse laboratoare partenere
unde deprind metode şi tehnici noi pe care dorim să le implementăm
odată cu reintegrarea acestora în laboratorul de origine.
Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca şi agenţi biologici în
tratamentul cancerului amintim:
- timpul de înjumătăţire crescut faţă de moleculele cu greutate moleculară mică ceea ce face posibilă scăderea dozei utilizate
- specificitatea şi afinitatea mare
- multiple mecanisme de acţiune care pot fi combinate (vezi anticorpi
multispecifici pentru ADCC şi CDC)
- posibilitatea folosirii acestora ca şi terapie complementară/alternativă oricărei forme de terapie anti-canceroasă tradiţională
117
- utilizarea lor ca şi vehicul specific pentru transportul diverselor
substanţe anticanceroase spre diverse destinaţii (vezi anticorpi
bispecifici)
- utilizarea lor ca şi markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite afecţiuni.
- în anumite cazuri anticorpii pot per se să controleze creşterea tumorii prin interferarea cu căile de semnalizare celulară, fie prin inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de creştere [49].
Tabelul 6.2. Diferite mecanisme de acţiune ale anticorpilor
monoclonali
Mecanism de acţiune propus Reprezentant
ADCC Anti-CD20
CDC Anti-CD20
Inducerea apoptozei Anti-CD20
Blocarea interacţiunii factorilor de creştere
cu receptorii specifici
Anti-EGFR
Blocarea fizică a dimerizării receptorilor
pentru factorii de creştere
Anti-EGFR Anti-Her2/neu
Inhibarea neoformării vaselor sangvine Anti-VEGF-A
Anti-EGFR
Blocarea factorilor de creştere în forma solubilă Anti-EGFR
Funcţionalizarea/conjugarea cu radioizo-topi, toxine,
enzime sau cytokine
Diverşi
118
Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizaţi acţionează asupra
ţintelor specifice prin acest mecanism; legarea concomitentă a Fv
(partea a Fab) de antigenul ţintă şi a Fc de o celulă cum ar fi
macrofagul sau celula NK care posedă receptori pentru această porţiune
duce la activarea celulei imune urmată de distrugerea celulei ţintită
specific. Cercetări recente au arătat că ADCC este mai eficientă la acei
indivizi care prezintă anumite polimorfisme în porţiunea Fc
(respondenţi cu grad înalt)
119
CAPITOLUL 7.
Cromatografia şi cromatofocalizarea. Principii și metode Biomoleculele sunt purificate folosind tehnici cromatografice
care le separă potrivit diferențelor în proprietățile lor specifice, astfel
cum se arată în figura 7.1.
7.1. Cromatografia de schimb ionic (Ion exchange
chromatography - IEX) separă biomolecule in funcție de variația
suprafeței moleculare (figura 7.1.).
Gel filtrare Interacțiune
hidrofobă
Schimb de
ioni
Afinitate Faza reversă
Figura 7.1. Principii de separare în purificarea cromatografică
IEX pentru separarea biomoleculelor a fost introdusă în 1960 și
continuă să joace un rol important în separarea și purificare. Astăzi, IEX
este una dint tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru purificarea de
proteine, peptide, acizi nucleici și alte biomolecule, oferind o înaltă
rezoluție de separare de grup și cu încărcări de mare capacitate. Tehnica
120
este capabilă de a separa specii moleculare, care au cele mai minore
diferențe de sarcină, de exemplu două proteine care diferă prin un
aminoacid. Aceste caracteristici fac IEX bine potrivită pentru captarea,
purificare intermediară într-un protocol de purificare tehnică și este
utilizată la purificarea microcantităților și purificarea pentru analize a
cantităților de ordinul kilogramelor de produs.
IEX separa moleculele pe baza diferențelor de sarcină pe
suprafață. Molecule variază considerabil în proprietățile lor de încărcare
și expun diferite grade de interacțiune cu faza fixă a cromatografiei în
funcție de diferențele în sarcina lor, densitatea și distribuția sarcinii pe
suprafață. Grupurile intramoleculare care posedă diferite valori pKa, în
funcție de structura acestora și micromediul chimic.
Deoarece toate moleculele cu grupări ionizabile poate fi titrate,
sarcina lor externă depinde de pH. În cazul proteinelor, care sunt
construite din mai mulți aminoacizi conținând grupări acide și bazice
slabe. Fiecare proteină are propria sa încărcare unică față de relația pH
care poate fi vizualizată ca o curbă de titrare. Această curbă reflectă
modul de încărcare general al modificărilor de proteine în funcție de
pH-ul mediului. Figura 7.2 ilustrează mai multe curbe teoretice titrare
proteice (aceste curbe pot fi generate folosind o combinație de
focalizarea izoelectrică și electroforeza). Cromatografia IEX are un
avantaj deoarece relația dintre pH și sarcina moleculară externă este
specifică fiecărei substanțe [48].
121
Figura 7.2. Curba ipotetică de titrare a proteinelor, care arată modul în
care sarcina superficială a moleculei variază în funcție de pH.
7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. Filtrarea pe gel, mentionat ca cromatografia de excluziune
sterică – SEC, separă moleculele conform diferențe în dimensiune ca acestea trec printr-un mediu de filtrare în gel ambalat în o coloană. Spre deosebire de schimbători de ioni sau cromatografie de afinitate, moleculele nu se leagă de mediul pentru cromatografie. Prin urmare, un avantaj semnificativ de filtrare pe gel este că condițiile pot fi variate pentru a se potrivi tipului de probă sau cerințele pentru purificare ulterioară, analiză sau de depozitare fără a modifica separarea.
Filtrarea pe gel este un procedeu foarte potrivit pentru biomolecule care pot fi sensibile la modificarea pH-ului, concentrația ionilor metalici sau co-factori și condițiile dure de mediu. Separarea
Sarcina superfi
cială
122
poate fi realizată în prezența ionilor esențiali sau cofactori, detergenți, uree, guanidina clorhidrat, la tăria ionică ridicată sau scăzută, la 37°C sau în camera frigorifică conform cerințelor experimentului. Proteine purificate pot fi colectate în orice soluție tampon.
Acest capitol oferă sfaturi generale aplicabile pentru orice separare filtrare gel. Un pas cheie față de separarea de succes este selectarea mediului corect.
Pentru a realiza o separare, filtrare pe gel, mediul este ambalat într-o coloană, pentru a forma un strat tasat. Mediul este o matrice poroasă de particule sferice cu stabilitatea chimică și fizică și Inert (lipsit de reactivitate și proprietăți de adsorbție). Stratul tasat este echilibrat cu tampon care umple porii matricei și spațiul dintre particule. Lichide în interiorul porilor, sau faza staționară, este în echilibru cu lichidul din afara particulei, sau fază mobilă. Eșantioanele sunt eluați izocratic deci nu este nevoie de a utiliza diferite tampoane în timpul separare. Cu toate acestea, un pas de spălare folosind tampon de rulare este, de obicei, la sfârșitul unei separare a elimina molecule care poate au fost păstrate la coloană și a pregăti coloană pentru o nouă centrare.
Filtrare pe gel poate fi folosită direct după schimbul de ioni, cromatofocalizare, interacțiune hidrofobă, sau afinitate, deoarece compoziția tampon nu va afecta în general, separarea finală. Figura 7.3 ilustrează procedeul de separare de filtrare pe gel [47].
123
Figura 7.3. Procesul de gel filtrare. (A) Schema unui șirag de mărgele, cu o extindere de microscopie electronică. (B) Schema desen de molecule de probă difuzarea în porii șirag de mărgele. (C) descrierea grafică a separării I. Proba este aplicat pe coloană, II. Cea mai mică moleculă (galben) este mai întârziată decât cea mai mare molecula (roșu). III. Cea mai mare molecula este eluată prima din coloană. Banda lărgită produce diluarea semnificativă a
124
zonelor de proteine în timpul cromatografie. (D) cromatogramă schematică.
7.3. Interacțiunea hidrofobă Apa este un bun solvent pentru substanțele polare, și un solvent
slab pentru substanțele nepolare. În apă lichidă o majoritate a moleculelor de apă apar in grupuri datorită legături de hidrogen între ele însele (Figura 7.4). Deși timpul de semidezintegrare al clusterilor aquatici este foarte scurt, efectul net este o coeziune foarte puternică între moleculele de apă, reflectată, de exemplu, printr-un punct de fierbere ridicat.
Figura 7.4. Proprietățile de solubilizare ale apei apărute în capacitatea sa de a interacționa cu dipoli și pentru a forma legături de hidrogen.
La o interfață aer-apa, moleculele de apa se vor aranja într-o structură foarte ordonat. Aici, posibilitatea de a forma legături de hidrogen nu mai este în echilibru, dar este dominată de partea lichidă a interfeței. Acest lucru dă naștere la o structură ordonată, care se manifestă ca o tensiune de suprafață puternică. Orice lucru care influențează stabilitatea apei afectează și tensiunea superficială.
Atunci când o substanță hidrofobă, cum ar fi o proteină sau un ligand hidrofob este scufundat în apă se întâmplă ceva analog
125
fenomenului de tensiune superficială. Moleculele de apă nu pot ”umezi” suprafața substanței hidrofobe. În schimb, se formeaza un înveliș foarte ordonat în jurul substanței, din cauza incapacității lor de a forma legături de hidrogen în toate direcțiile (figura 7.5).
Figura 7.5. Apă structurată înconjoară suprafețele hidrofobe de liganzi și proteine. Substanțe hidrofobe sunt forțate să fuzioneze pentru a minimiza suprafața totală a acestor structuri (maximizarea entropiei). Sărurile sporesc interacțiunea hidrofobă. B) echilibru de interacțiune hidrofobă este controlat în special de concentrația de sare.
Per ansamblu, toate tehnicile cromatografice prezentate mai sus
sunt o modalitate foarte eficientă de a separa molecule anorganice, cȋt si macromoleculele organice de interes cercetatorilor preocupaţi de genetica moleculară, ȋn studii biomedicale, aplicaţii biotehnologice si nanotehnologiile viitorului. Aceasta editie are ca auditoriu-ţinta tineri specialişti ȋn biologia moleculară si genetica aplicată cu aspiraţii inalte spre realizări de performanta ȋn domeniul ales.
126
BIBLIOGRAFIA 1. Abba M.C., Gómez M.A., Golijow C.D., (2001). HLA-DQA1 allele
typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP. Braz. J. Med. Biol. Res. Jul;34(7):867-9.
2. Aluaş M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Cărţii de Ştiinţă, ISBN 978-606-17-0115-5.
3. Baas B. J., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 în a nanoscale native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28.
4. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase în water-soluble nanolipoprotein particles. Journal of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509.
5. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561-67.
6. Barroso A, Dunner S, Cañón J., (1998). Technical note: Detection of bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). J. Anim. Sci. Jun;76(6):1535-8.
7. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single bacteriorhodopsin trimers în bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22.
8. Blanchette C. D., Cappuccio J. A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(3), 724-31.
9. Billard-Pomares T, Tenaillon O, Le Nagard H, Rouy Z, Cruveiller S, Médigue C, Arlet G, Denamur E, Branger C., (2011). Complete
127
nucleotide sequence of plasmid pTN48, encoding the CTX-M-14 extended-spectrum β-lactamase from an Escherichia coli O102-ST405 strain. Antimicrob. Agents Chemother.;55:1270-1273.
10. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66.
11. Brown T.A., (2002). Genomes. 2nd edition. Oxford: Wiley-Liss. 12. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T.,
(2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54.
13. Caetano-Anollés G, Bassam BJ, Gresshoff PM., (1991). DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology (NY). 1991 Jun; 9(6):553-7.
14. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells entrapped în polyacrylamide gels. Methods în Enzymology, 44, 739-746.
15. Conde J., de la Fuente J. M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold nanoprobes - application to cancer diagnostics. Journal of Nanobiotechnology, 8:5.
16. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hägg P., Abdulkarim F., Isaksson L.A., (2004). Generation and characterization of functional mutants in the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. Feb;271(3):534-44.
17. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Isaksson L.A., (2005). In vivo involvement of mutated initiation factor IF1 in gene expression control at the translational level. FEBS Lett. Feb 14;579(5):995-1000.
18. Croitoru V., Semrad K., Prenninger S., Rajkowitsch L., Vejen M., Laursen B.S., Sperling-Petersen H.U., Isaksson L.A., (2006). RNA chaperone activity of translation initiation factor IF1. Biochimie. Dec;88(12):1875-82
19. Dakin E.E., Avise J.C., (2004). Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity (Edinb). Nov;93(5):504-9.
20. Deconttignies-Le Maréchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J.,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized
128
Escherichia coli cells. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44.
21. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J., Remacle J., (1997). Identification of lysine 74 în pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry, 272, 2276-84.
22. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.
23. Heaton MP, Harhay GP, Bennett GL, Stone RT, Grosse WM, Casas E, Keele JW, Smith TP, Chitko-McKown CG, Laegreid WW. (2002) Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in U.S. beef cattle. Mamm. Genome. May;13(5):272-81.
24. Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20.
25. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41.
26. Holley R.W., Everett G.A., Madison J.T, Zamir A., (1965). Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic Acid. J. Biol. Chem. 240 (5): 2122–8.
27. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. European Journal of Biochemistry, 184, 1-13.
28. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22.
29. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and immobilized β-tyrosinase. European Journal of Applied Microbiology, 1, 25-39.
129
30. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76.
31. Fusee M., Weber J., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat β-decarboxylase activity and application to L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98.
32. Iacobazzi V, Castegna A, Infantino V, Andria G.(2013). Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool. Mol. Genet. Metab. Sep-Oct;110(1-2):25-34.
33. Jeffreys A.J., Royle N.J., Patel I., Armour J.A., MacLeod A., Collick A., Gray I.C., Neumann R., Gibbs M., Crosier M., (1991). Principles and recent advances in human DNA fingerprinting. EXS.;58:1-19
34. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67.
35. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8), 3453-57
36. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38.
37. Köhler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. Aug 7;256(5517):495-7.
38. Landegren U., (1996). The challengers to PCR: a proliferation of chain reactions. Curr Opin Biotechnol. 1996 Feb;7(1):95-7.
39. Liu Q., Liu A., Gao F., Weng S., Zhong G., Liu J., Lin X., Lin J.H., Chen X., (2011) Coupling technique of random amplified polymorphic DNA and nanoelectrochemical sensor for mapping pancreatic cancer genetic fingerprint. Int. J. Nanomedicine.;6:2933-9.
130
40. Maxam A.M, Gilbert W., (1992). A new method for sequencing DNA. 1977. Biotechnology.; 24:99-103.
41. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors în human colon cancer cells in vitro and in ovo by free and nanoparticle-encapsulated redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9.
42. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74.
43. Mueller U.G, Wolfenbarger L.L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends Ecol. Evol. Oct;14(10):389-394.
44. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. (Paris).;48(8):579-82.
45. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63.
46. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62.
47. Nagore L.I., Nadeau R.J., Guo Q., Jadhav Y.L., Jarrett H.W., Haskins W.E. (2013). Purification and characterization of transcription factors. Mass Spectrom. Rev. Sep;32(5):386-98
48. Nakatani N., Kozaki D., Mori M., Tanaka K. (2012). Recent progress and applications of ion-exclusion/ion-exchange chromatography for simultaneous determination of inorganic anions and cations. Anal. Sci.;28(9):845-52
49. Nakamura T., Mizuno S. (2010). The discovery of hepatocyte growth factor (HGF) and its significance for cell biology, life sciences and clinical medicine. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci.;86(6):588-610
131
50. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67.
51. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67.
52. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12.
53. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97.
54. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine production în a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18.
55. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry, 11, 307-11.
56. Park D.J., (2004). 3' RACE LaNe: a simple and rapid fully nested PCR method to determine 3'-terminal cDNA sequence. Biotechniques. Apr;36(4):586-8, 590.
57. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 111–19
58. Pierrel J. (2012). An RNA Phage Lab: MS2 in Walter Fiers' laboratory of molecular biology in Ghent, from genetic code to gene and genome, 1963-1976. J. Hist. Biol.;45(1):109-38
59. Rasmussen L.C., Jensen J.M., Croitoru V., Sperling-Petersen H.U., Mortensen K.K., (2007). Production and epitope characterization of mAbs specific for translation factor IF1. Biochem. Biophys. Res. Commun. Dec 7;364(1):72-8.
132
60. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of Nanobiotechnology, 7:3.
61. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28.
62. Sanger F., Nicklen S., Coulson AR., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Dec;74(12):5463-7.
63. Schenkel F.S., Miller S.P., Ye X., Moore S.S., Nkrumah J.D., Li C., Yu J., Mandell I.B., Wilton J.W., Williams J.L., (2005). Association of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J. Anim. Sci. Sep;83(9):2009-20.
64. Schütte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii. European Journal of Biochemistry, 62, 151.
65. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175, 6789-96.
66. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and Interface Science, 275, 177–82.
67. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of Nanobiotechnology, 8:19.
68. Starzl T.E., Fung J.J., (1986). ORTHOCLONE OKT3 in Treatment of Allografts Rejected Under Cyclosporine-Steroid Therapy. Transplant Proc. Aug;18(4):937-941.
69. Strebhardt K, Ullrich A. (2008) Paul Ehrlich's magic bullet concept: 100 years of progress. Nat. Rev. Cancer. Jun;8(6):473-80.
70. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89.
133
71. Vieira D. B., Carmona-Ribeiro A. M., (2008). Cationic nanoparticles for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and activity in vitro, Journal of Nanobiotechnology, 6:6.
72. Vieira J, Messing J. (1982). The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. Oct;19(3):259-68.
73. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.
74. Welsh J., McClelland M., (1991). Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Res. Oct 11;19(19):5275-9
75. Xu J., Croitoru V., Rutishauser D., Cheng Q., Arnér E.S., (2013). Wobble decoding by the Escherichia coli selenocysteine insertion machinery. Nucleic Acids Res. 2013 Aug 27. [Epub ahead of print].