Suport de Curs Biotehnologii 2009-10-11 TPPA

7/31/2019 Suport de Curs Biotehnologii 2009-10-11 TPPA

1/38

1

BIOTEHNOLOGII NOTE DE CURS

Ce sunt biotehnologiile?Biotehnologie provine din doi termeni

bio deriva din grec. bios = viata

tehnologia studiul al masinilor si uneltelor (termen utilizat inca de Plutarh siCicero)

Notiunea a aparut pentru prima data in Danemarca in 1908

DefinitieBiotehnologia este o stiinta inginereasca, pluridisciplinara ce utilizeaza materia vie pentru

degradarea, sinteza si producerea de materiale noi utilizate in activitatile umane.Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare, biocatalizatori, tehnici de ingineriegenetica etc.

1 BIOTEHNOLOGIILE CLASICE

nc din antichitate erau utilizate, n mod empiric, unele metode biotehnologice cum ar fifermentaiile cu ajutorul microorganismelor, cunoscute cu cteva milenii nainte de era noastr.

Babilonienii cunoateau, nc din mileniul VI .H., modul de preparare a berii precum ibioconversia alcoolului etilic n acid acetic (oet). Mai trziu, n mileniul III .H., sumerienii cunoteautehnologia fabricrii a peste 20 de tipuri de bere. Descoperirile au demonstrat c majoritateapopoarelor antice utilizau drojdiile pentru fabricarea unor produse alimentare (pine, vin, bere etc)precum i bacteriile pentru obinerea derivatelor lactate.

Progrese nsemnate sunt realizate ncepnd din secolul XVII cnd olandezul ANTONVAN LEEUWENHOEK (1632- 1723) a descoperit, n anul 1680, la microscopul ce l-a inventat,existena unei lumi microbiene, necunoscut pn atunci. La microscopul su cu putere de mrire decirca 300 de ori, a observat micile vieti pe care le-a numit animalcule, cu forme sferice, drepte sauspiralate, care triesc n apa de ru, decoctul de fn, saliv i mustul de bere. Cercetrile sale au fcutobiectul a 112 comunicri tiinifice, prezentate la Royal Society of London.

n secolul XIX, savantul francez LOUIS PASTEUR (1822 - 1895) a demonstrat c nprocesul de fermentaie alcoolic are loc transformarea glucidelor n alcool etilic, cu degajare de CO2,proces care furnizeaz energia necesar celulelor de drojdii ce se dezvolt chiar n absena O2.Concomitent extinde studiile asupra fermentaiilor butiric i lactic.

n timpul primului rzboi mondial, WEIZMANN a descoperit fermentaia acetono-

butanolic iar produii derivai i-a folosit la sinteza cauciucului sintetic (butadien) i a unui explozivdenumit cordi. Cercetrile biologului scoian ALEXANDER FLEMING, iniiate n anul 1929, audeschis era microbiologiei industriale moderne, prin elaborarea bazelor de obinere a penicilinei. Aurmat descoperirea streptomicinei de ctre colectivul condus de WAKSMAN (1943) i alchloramphenicolului creat de SMITH i WORREL (1953). Pn n anul 1959 s-au elaborat peste 4000de antibiotice, perfecionndu-se tehnicile i instrumentarul necesar n industria ffarmaceutic(bioreactoare automatizate).

Ca rezultat al acestor descoperiri, la jumtatea anilor 60 a aprut, cu o mare for dedezvoltare, biologia industrial, capabil s produc o schimbare fundamental a tehnicilor defabricare a unui numr mare de produse alimentare, farmaceutice i chimice. Folosind microorganismespecifice, implicate n diferite fermentaii anaerobe, s-au produs proteine alimentare i furajere,

aminoacizi, aromatizani, acizi organici, ndulcitori alimentari, solveni organici, enzime, medicamenteprecum i noi surse energetice.


2/38

2

2 BIOTEHNOLOGIILE MODERNE

n centrul ateniei specialitilor n biotehnologii st asigurarea necesarului de alimentepentru populaia globului, mai ales proteine i aminoacizi, producerea de medicamente pentrusntatea public, pentru profilaxia i tratamentul celor 300 de boli ereditare i a celor dou maladiigrave ale sfritului de secol (cancerul i SIDA), precum i combaterea efectelor nocive ale poluriimediului de via.

Evolutia populatiei planetei240.000 ani 10.000 locuitori4000 iHr. - 30 milioane1 dHr. - 210 milioane1900 1.650 milioane2008 6.7 md.n fruntea rilor care au iniiat dezvoltarea biotehnologiilor moderne a fost Japonia care,

ca i alte ri asiatice, avea o foarte veche tradiie n domeniul producerii buturilor i a alimentelorfermentate, folosind ca materii prime orezul i soia.

Pe baza unui imens volum de date experimentale de biochimie microbian, dup cel de-aldoilea rzboi mondial, microbiologia industrial japonez a devenit rapid unul din principaleledomenii ale cercetrilor tiinifice i tehnologice, mai ales dup anul 1953 cnd s-a creat Institutul de

Microbilogie aplicat din Tokyo.Creterea preului petrolului, dup anul 1973, a stimulat industriile nipone s gseasc alte

materii prime, n afara celor de natur petrochimic, pentru a pstra avansul tehnologic n unelesectoare prioritare. n aceste condiii, Japonia a trecut la industrializarea modern a fermentaiiormicrobiene, satisfcnd rapid necesarul intern i devenind exportatorul principal cu produse defermentaie spre rile asiatice. Pn n anul 1980, Japonia a ajuns la o producie anual de 50 mil hlbere, 27 mil.hl sake, 12 mil.hl sos de soia i 3 mil hl oet.

Dezvoltnd rapid ingineria genetic, orientat spre recombinare ADN din unele sue de

microorganisme, cercettorii japonezi i ulterior americanii, au devenit, nc din anul 1957, posesoriiprimelor licene de fabricare a aminoacizilor eseniali ca: acid glutamic (1957), lizin (1957), treonin(1960), fenilalanin (1961), producnd, nc din anul 1980, peste 85.000 tone anual de aminoaciziproteici, precum i a licenelor de fabricare a vitaminei B12 (1959), a unor antibiotice, a interferonului,a primelor medicamente de lupt mpotriva cancerului i a multor produse alimentare, farmaceutice,cosmetice i chimice.

Miracolul japonez n lansarea biotehnologiilor se datorete i investiiilor de zeci demiliarde de yeni anual, prin cele 70 de mari companii implicate, sub coordonarea firmei Kyowa HakkoKogyo, responsabil i cu pstrarea secretului tiinific i tehnologic.

n prezent, microbiologia face parte din cultura cotidian i obligatorie a tuturoruniversitilor i ntreprinderilor japoneze. Aici exist peste 1.500 de specialiti cu doctorat n

microbiologie.Biotehnologiile de producere a diferitelor substane utile s-au extins rapid i n alte ridezvoltate sub spect industrial, respectiv S.U.A., rile vest-europene, China, fosta U.R.S.S.

n S.U.A., activitatea uzinelor biotehnologice s-a concentrat, iniial, pe producereasiropului de fructoz prin fermentarea porumbului, realizndu-se anual peste 500.000 tone HighFructose Corn Syrup, cu mari utilizri n industria alimentar i farmaceutic. De remarcat c fructozaare o putere de ndulcire superioar zaharozei i glucozei, fiind unicul glucid acceptat n alimentaiadiabeticilor. Alte programe naionale americane au urmrit obinerea, prin biotehnologii, a necesaruluide medicamente, vaccinuri, acizi organici (citric, acetic, fumaric, lactic), a unor aminoacizi, aproteinelor macromoleculare i a drojdiilor de panificaie. Randamentele ridicate ale biotehnologiiloramericane s-au datorat aplicrii n producie a rezultatelor celor 45 companii de inginerie genetic,

orientate n direcia recombinrii acizilor nucleici din diferite specii vegetale i a celor circa 700 desocieti specializate n biotehnologii (firmele Cetus- 1970, Genentech- 1976, Eli Lilly, Genex,Genencor, Biogen, Centocor, Immunex, Genzyme, Hybritech, Syntex etc).


3/38

3

n fosta U.R.S.S. existau n anii 80 peste 100 de uzine biotehnologice dintre care 86produceau proteine monocelulare pentru consum zootehnic iar celelalte produceau aminoacizi,hormoni, vitamine, antibiotice, enzime i lipide. Ca substrat nutritiv pentru microorganisme sefoloseau, cu precdere, deeuri cu origine forestier, agricol i industrial.

n Europa de Vest programele naionale de investiii au stimulat apariia unor mari uzinebiotehnologice la Braunschweig (Germania), Cambridge, Mill Hill, Porton Down, Slough (Anglia),

Delft (Olanda), Strasbourg, Compigne, Toulouse, Rhne- Poulenc (Frana), Pavia (Italia) etc.n uzinele biotehnologice, bazate pe tehnici moderne de microbiologie industrial, se

folosesc bioreactoare speciale cu factori dirijai, cu capaciti ntre 10.000- 250.000 litri (cele maifrecvente de 20.000 litri). Prin perfecionarea tehnicii de cultivare s-a ajuns la un flux continuu n carese menin constante condiiile de via microbian (temperatur, pH, oxigenare, nutriie mineral iorganic), folosind un sistem modern de programare pe computere.

Coordonarea activitii uzinelor biotehnologice i elaborarea programelor naionale deinvestiii intr n atribuiile societilor specializate care devin, treptat, prioriti locale i naionale,asigurnd legturi indispensabile ntre biotiine i bioindustrii precum i transferul de tehnologiiultramoderne. Dac n anul 1983 existau, pe plan mondial, 450 societi de biotehnologie, n urmtorii10 ani s-a ajuns la 1.700 societi n S.U.A., Europa i Asia. O activitate intens desfoar cele peste60 societi biotehnologice din Frana: Immunotech, Genset, Transgne- Mrieux, Calliope,

Zymogenetics, Germe, Coletica, Gist- Brocades, Bio- Europe etc .

Bilanul activitii acestor societi i uzine specializate a fost prezentat la cel de al VII- leaCongres European de Biotehnologie, inut la Nisa n februarie 1995, la care au participat 70 desocieti naionale, inclusiv din Romnia.

Evaluarea produselor tehnologice obinute pe plan mondial la nivelul anului 1990 totalizacifra de 250 miliarde de dolari din care: 50 miliarde din producerea de etanol, 42,8 miliarde dolari dinproduse agroalimentare provenite din porumb, 40,7 miliarde de dolari din antibiotice, 21,3 miliardedolari din vaccinuri, 7,5 miliarde dolari din aminoacizi, 6,1 miliarde dolari din hormoni, 4,6 miliardede dolari din acizi organici etc .

Extinderea biotehnologiilor n toate rile dezvoltate i slab dezvoltate, ar putea conduce nunumai la rezolvarea unor probleme economice locale ci i la modificri radicale n structuraindustriilor alimentare, chimice i farmaceutice, cu efecte benefice imediate, pe plan naional i

mondial. Alegerea profilului de activitate pentru fiecare uzin biotehnologic, din diferite saumacrozone populate, merit o atenie deosebit, urmrindu-se ca grefarea sistemelor tehnologice scorespund cu situaiile economice i sociale ale populaiilor respective. Astfel, crearea de cicluriscurte de producere a proteinelor monocelulare prin biotehnologii poate prezenta avantaje foarte marin rezolvarea problemei alimentaiei umane, n dezvoltarea sectorului zootehnic, protecia solului,reducerea ritmului de despdurire i valorificarea eficient a forei de munc rmas disponibil.

Ca o imagine retrospectiv a evoluiei biotehnologiilor clasice i moderne se poate subliniac prima revoluie biotehnologic lansat prin lucrrile savantului LOUIS PASTEUR, a asiguratdifuzarea vaccinurilor i a primelor antibiotice, avnd ca efect imediat salvarea multor viei omeneti.Cea de a doua revoluie biotehnologic, declanat de colile microbiologice japoneze i americane,n ultimele 3 decenii, a nceput s-i fac simit contribuia benefic n asigurarea alimentiei i adreptului la via a sute de milioane de oameni, mai ales a copiilor din lumea a III- a, care piereauanual din cauza subnutriiei cronice.

Progresele imense nregistrate n microbiologia mondial, dup cel de al doilea rzboimondial, l-au determinat pe ilustrul genetician FRANOIS JACOB, laureat al Premiului Nobel, sscrie: n civa ani, omul a avut surpriza s constate c, fr microorganisme, aceast lume n-ar fi

fost ceea ce este n prezent.


4/38

4

BIOTEHNOLOGIILE PENTRU ASIGURAREA SNTIIPentru sectorul de sntate uman i animalier, cercetrile de biotehnologie aplicativ

vizeaz trei cmpuri de activitate: producerea de molecule cu efecte terapeutice, producerea devaccinuri i elaborarea unor metode mai eficiente de diagnosticare a bolilor. Asociaia fabricanilor de

produse farmaceutice din Frana nregistra noi creaii pe cale biotehnologic (exceptnd antibioticile):- hormoni de cretere 12- interferoni 13- interleucine 14

- anticorpi monoclonali 41- vaccinuri 15

3. PRODUCEREA DE ANTIBIOTICEAntibioticele sunt substane produse de diferite microorganisme care au capacitatea

de a inhiba sau distruge alte microorganisme, unele implicate n declanarea anumitor maladiiinfecioase.

Istoricul producerii de antibiotice coboar nc n antichitate. Pe un papirus rmas dintimpul celei de a 11- a dinastie egiptean (n urm cu 4.000 de ani), se descrie utilizarea unor ciupercii mucegaiuri care creteau pe suprafaa iazurilor i erau utilizate n tratamentul rnilor deschise iinfectate. Tot pentru vindecarea rnilor i a furunculelor, grecii i chinezii din antichitate foloseau

sucul de soia i lutul fierbinte. Venind din vremuri mai apropiate, gsim n ziarul medical Lancet cdoctorul MOSSE (1852) propunea tratamentul furunculozelor epidemice cu drojdie de bere(Saccharomyces cerevisiae) (o linguri de 3 ori pe zi), care asigur o vindecare fr recidive.

Baza teoretic a producerii antibioticelor a fost prezentat de savantul romn VICTORBABE, n anul 1885, care scria c unele microorganisme pot produce substane chimice capabile sinhibe dezvoltarea altora iar o boal cauzat de unele bacterii va putea fi tratat cu ajutorul altorbacterii. La scurt timp dup formularea teoretic a lui BABE apare descoperirea, din anul 1888,cnd CHARDIN i GUIGNARD au demonstrat c bacteria Pseudomonas pyocyanea produce unpigment solubil care este toxic pentru bacteria Bacillus anthracis, fr a cauza hemoliza globulelorroii din sngele organismului gazd. Tot n acel timp, VUILLEMIN propune termenul de antibioz(contrar simbiozei) care st la baza aciunii antibioticelor ce vor fi descoperite ulterior.

Dup unele experimentri cu rezultate contradictorii (SCHAPIRO- 1908, PORTER- 1924la actinomicete, PRAT i BOYLE la mucegaiuri), apare marea descoperire a scoianuluiALEXANDER FLEMING (1929) care demonstra c o cultur de stafilococ auriu a fost distrus prinsuprainfectarea cu mucegaiul Penicillium rubrum (notatum).

Era antibioticelor a fost inaugurat prin comunicarea despre penicilin prezentat deFLEMING la Medical Research Club, n ziua de 13 februarie 1929. Comunicarea a fost primit debacteriologi cu mult rceal i zmbete de bunvoin. Ulterior, o serie de cercettori s-au ocupat deperfecionarea peniciline (LOVELL, RAISTRICK, CLUTERBRUCK). Obiectivul acestei munci a fostfinalizat abia n anul 1939 cnd australianul FLOREZ i germanul CHAIN au reuit purificareapenicilinei, n stare cristalizat, folosind procedeul liofilizrii. Prin infectarea animalelor de experiencu stafilococi, streptococi i Clostridium, ei au reuit distrugerea acestora prin tratamente cupenicilin pur. Pentru aceast extraordinar realizare, FLEMING, FLOREY i CHAIN au fostncununai cu premiul Nobel pentru medicin, n anul 1945.

Din aproape 5.500 de antibiotice cunoscute n prezent, circa 1.000 de tipuri sunt produsede 6 genuri de ciuperci filamentoase, dintre care cele mai importante sunt Penicillium, Streptomycesi Cephalosporium. Peste 500 de forme sunt sintetizate de dou tipuri de bacterii nefilamentoase, iar3.000 de forme sunt produse de 3 genuri de actinomicete. Aceste specii de microorganisme sunt maieficiente n cazul suelor ameliorate prin mutaii, recombinri de ADN i, eventual, prin ingineriegenetic.

Antibioticile au cptat o foarte larg utilizare medical, cu extindere rapid n ultimajumtate de secol, cele mai mult comercializate fiind penicilinele (produse de mucegaiul Penicillium

chrysogenum), cefalosporinele (produse de mucegaiul Cephalosporium acremonium),streptomicinele i tetraciclinele (produse de bacteriile din genul Streptomyces) la care se adaug , ncantiti mai reduse, anthracidinele, aureomicinele, canamicinele i neomicinele.


5/38

5

4. PRODUCEREA DE HORMONIa. Insulina. Este hormonul a crui absen din organismul uman provoac diabetul, boal

rspndit pe glob la peste 60 milioane de locuitori. Pentru corectarea acestei insuficiene hormonale,insulina a fost extras, iniial, din pancreasul de cine (n 1921) i experimentat, 1922, la un biat de 9ani, cu rezultate spectaculoase. Din anul 1923 firma american Eli Lilly a produs insulina pe caleindustrial, prin extragerea din pancreasul de bovine i porc, cu un randament de 100g insulincristalizat la 100 kg pancreas (0,01 %)

Perfecionri aduse tehnicilor de preparare au permis obinerea unor produse cristalizate cu

aciune lent i ultralent, fiind absorbite n 48 de ore. Aceast insulin, extras din bovine i porcine,provoac unele efecte secundare iar unii diabetici fac intoleran la hormonul animal: pentru aceasta afost necesar purificarea insulinei animale pn la calitatea celei umane, procedeu realizat de firmadanez Novo Industrie (1981) prin substituirea aminoacidului alanina cu treonin, pe cale enzimatic iseparare cromatografic.

Ca structur chimic s-a constatat c insulina are dou catene polipeptidice (A i B), lungide 21 i 30 de aminoacizi. Sinteza celor dou gene implicate n producerea catenelor polipeptidice afost realizat la universitatea din California (n 1979), prin includerea genei mutante ntr-o plasmid,cu rol de vector i transferul n bacteria Escherichia coli care produce circa 100.000 molecule deinsulin la o celul bacterian. Pe aceast cale microbiologic, firma Eli Lilly a dezvoltat, n anul 1977,sistemul industrial de producere a proinsulinei i insulinei identice cu cea uman, fr a provoca

eventuale efecte secundare (tulburri renale i oculare). La Centrul de microbiologie aplicat dinPorton Down (Anglia), folosind un bioreactor de 1.000 litri mediu de cultur, s-au obinut 200 ginsulin, echivalentul al cantitii extrase din 1.600 kg pancreas de bovine sau porcine: Insulinaprodus prin aceast tehnic de inginerie genetic poart denumirea de humulin, nlocuind pe ceaextras din organismele animale.

b. Somatostatina. Este un hormon produs n organismul uman de gland hipotalamus,situat la baza creierului, avnd rol n eliberarea insulinei i a unor hormoni de cretere.

Pentru suplinirea carenei organismului n somatostatin, ncepnd din anul 1977, a fostsintetizat hormonul respectiv cu ajutorul bacteriilor recombinate genetic. Gena somatostatinei,sintetizat artificial de ITAKURA (California), este alctuit din 52 de nucleotide, avnd la baz 14aminoacizi. Aceast gen a fost introdus ntr-o plasmid i transferat n bacteria Escherichia coli

care poate sintetiza circa 10.000 molecule de somatostatin la o celul bacterian. Este posibil sintezaa 1 mg hormon la 1 litru de cultur bacterian, cantitate ce s-ar extrage din 5 milioane creiere de oaie.Firma Genentech din San Francisco (S.U.A.) a obinut un randament care poate ajunge la 3%somatostatin.

c. Somatotropina. Este hormonul uman de cretere (HCU), secretat de celulele lobuluianterior al hipofazei, ntr-o cantitate foarte redus (4-6 mg/ hipofiz). n absena sa se provoacnanismul hipofizar (piticirea), frecvent n lume la 7-10 persoane dintr-un milion de indivizi.Administrarea de somatotropin prin injecii intramusculare n doze de 10 mg/ kg corp/ an, fracionaten cte 3 infecii pe sptmn, ar asigura un ritm normal de cretere a copiilor suferinzi de piticire.Condiia reuitei tratamentului este nceperea la vrsta de 4-5 ani, cu continuare pn la sfritulpubertii i chiar dup aceasta.

Extragerea i purufucarea somatotropinei umane (HCU) a fost realizat de ROSS i colab.(1963) din hipofiza cadavrelor, cu un randament foarte redus (4-5 mg hormon dintr-o hipofiz uman).

Societatea de inginerie genetic Genentech (S.U.A.) a reuit sinteza chimic a genei caredetermin formarea acestui hormon, respectiv o protein complex alctuit dintr-o secven de 191aminoacizi. Dup clonare n celula bacterian de Escherichia coli, a rezultat o su selecionat (K-12) care poate produce circa 100.000 de molecule de somatotropin la o celul bacterian. Acesthormon de cretere, obinut prin inginerie genetic, este pur din punct de vedere chimic, foarteomogen, liber de viroze i cu o metionin n plus fa de hormonul uman.

Firma Kabi Vitrum din Suedia a preluat sua american K-12 i a produs hormonul pe caleindustrial astfel c 1 litru de cultur bacterian s realizeze, n 7 ore, o cantitate de hormon egal cu

cea extras din 60 hipofize umane i la un pre de cost mai redus de 3 ori. Hormonul obinut prinbiotehnologie poate fi folosit la stimularea creterii, att la oameni ct i la animale domestice.d. Interferonul. A fost descoperit de ISAACS i LINDENMANN (1957), n Anglia, sub

forma unei proteine globular, produs de leucocitele din celula animal sau uman, avnd rol de


6/38

6

aprare antiviral i antitumoral, atunci cnd un virus ptrunde n organism. Interferonul endogen, cti cel administrat prin injecii, stimuleaz sistemul imunitar, nhib nmulirea celulelor anormale icombate bolile de origine viral (grip, hepatit, zona Zoster).

ntruct producerea interferonului prin extracii din celule sanguine i fibroblaste estefoarte scump i laborioas, W. GILBERT (1980) din Boston (S.U.A.) a ncercat procedeul de sinteza secvenelor de ADN corespunztoare unor gene modificate, pe care le-a inclus ntr-o plasmid i le-atransferat n celulele bacteriene de Escherichia coli. Ulterior, n anul 1981, cercettori de launiversitatea Seattle-Washington, n colaborare cu firma Genentech din California, au reuit s

transfere genele interferonului leucocitar n celulele drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae) cugenom modificat. Randamentul a devenit destul de mare n sensul c la 1 litru de mediu nutritiv decelule de levuri s-au produs 25.000 de uniti de interferon.

n prezent, interferonul leucocitar i fibroblastic se produce la un pre de cost foarte redus,n urma reuitei de transfer a genelor n celulele bacteriene de Escherichia coli i Methylophilusmethylotrophus. Purificarea i testele chimice i farmacologice s-au fcut n uniti de profil dinS.U.A., Japonia, Anglia, Frana, Suedia i Israel, urmrindu-se efectele n combaterea cancerului, prinaprarea limfocitelor capabile s distrug celulele canceroase. De asemenea s-a testat, cu bunerezultate, eficacitatea n tratarea altor boli cum ar fi keratita herpetic, papilomul laringian, scleroza nplci, guturaiul, gripa, hepatita i zona Zoster.

Mai recent, firma internaional de biotehnologie Biogen din S.U.A. a reuit s

perfecioneze o tehnologie prin care se produce o cantitate de interferon de 1.000 de ori mai mare dectcantitatea obinut prin prelucrarea aceluiai volum de snge uman, produsul fiind utilizat, cu maresucces, i n combaterea hepatitei (B, C)

e. Cortizonul- Este un hormon steroidic cu o eficacitate foarte ridicat n tratamentulreumatismului articular. Sinteza chimic a cortizonului se realizeaz n 37 de etape. Folosind caleabiotehnologiilor, prin nmuliea ciupercii Rhizopus arhizus care hidrolizeaz progesteronul, sintezacortizonului s-a redus la numai 11 etape, cu un pre de cost mai redus de 400 de ori.

f. Hormonii sexuali. Numeroase microorganisme eucariote conin molecule de tiphormonal care joac un mare rol n manifestrile sexualitii, unele dintre ele fiind de natur steroid.O mare parte dintre hormonii sexuali sunt sintetizai prin metabolismul bacterian dar, n majoritateacazurilor, aciunea microbian const dintr-o simpl bioconversie a unui compus natural sau obinut

printr-o sintez chimic.Sterozii sexuali, cu aplicaii n chimia farmaceutic, sunt transformai (bioconvertii) prin

procese de oxidare, reducere, hidroliz, condensare i izomerizare.Reaciile de oxidare sunt de 4 tipuri: hidroxilarea, dehidroxilarea, n oxidarea gruprilor

hidroxil i degradarea oxidativ a catenelor laterale, n urma crora se obin corticosteron,hidroxiprogesteron, homoprogesteron, hidrocortizon etc. La aceste reacii particip, dup caz,microorganisme din genurile Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Flavobacterium, Glomerella,Mycobacterium, Pellicularia i Rhizopus.

Reaciile de reducere se realizeaz prin hidrogenarea la nivelul gruprilor cetonice subaciunea microorganismelor din speciile Rhodotorula glutinis i Kloeckera jensenii, implicate nsinteza unor prostaglandine (sulprostone).

Reaciile hidrolitice au aciune asupra esterilor, cu eliberarea gruprii OH din steroid sauasupra eterilor, cu transformarea saponinelor, n prezena mucegaiului Penicillium chrysogenum,activnd compuii cu proprieti terapeutice.

5. BIOSINTEZA VITAMINELORnc din anul 1906, HOPKINS a stabilit c n alimentaia animalelor sunt absolut necesari

factori accesorii care se gsesc n drojdia de bere. Ulterior, CAZIMIR FUNK (1912) a izolat dindrojdie acidul nicotinic i a dat denumirea de vitamine pentru acest grup de substane.

Majoritatea microorganismelor prototrofe sunt capabile s sintetizeze toate vitaminele sauprovitaminele de care au nevoie, uneori n cantiti mult superioare fa de necesarul propriu, pentru

procesele de cretere. Astfel bacteria Ashbya gossypii, cultivat pe un mediu agitat i mbogit nlipide, sintetizeaz de 20.000 de ori mai mult riboflavin (vitamina B2) fa de necesarul propriu, iarbacteria Pseudomonas denitrificans produce de 50.000 de ori mai mult cianocobalamin (vitaminaB12) dect i este necesar. De altfel, vitamina B12 are ca surs unic biosinteza microbian. De


7/38


8/38

8

electrolitic, n D- sorbitol care se oxideaz, pe cale microbian, n L- sorboz. Urmeaz tratarea cuacton i formarea complexului diaceton- L- sorboz care este oxidat n acid 2- cetogluconic i apoitransformat, prin enolizare, n acid ascorbic.

Un alt procedeu de sintez a vitaminei C are la baz oxidarea, pe cale bacterian, a D-glucozei n acid 5- ceto- D- gluconic, urmat de o alt oxidare a acidului L- idonic n acid 1,2- ceto-gulonic. n aceste reacii intervin mai multe specii din genurile Acetobacter, Aerobacter iPseudomonas.

Rolul fiziologic al vitaminei C este multilateral, cuprinznd majoritatea proceselor

metabolice eseniale care au loc la nivelul organismelor. Este implicat n procesele de biosintez aADN- ului, respectiv n biosinteza substanelor proteice din esuturile de cretere. Acidul ascorbicacioneaz ca transportor de hidrogen la nivel intracelular. Vitamina C stimuleaz sistemul imunitar imrete rezistena organismului la bolile infecto-contagioase i fa de substanele cancerigene.Accelereaz vindecarea rnilor, regenerarea esuturilor, a cartilagiilor i a oaselor. Faciliteaz absorbiafierului i stimuleaz maturarea hematiilor.

Sucul de lmie, proaspt recoltat, servete la oprirea hemoragiilor scorbutice (scorbutul),deoarece coninutul n acid ascorbic i bioflavonoide micoreaz permiabilitatea i mresc rezistenacapilarelor sanguine.

Vitamina D (calciferol- vitamina antirahitic). Este constituit din substane care provinprin iradierea microsterolilor (ergosterol, zimosterol, escosterol etc). Cel mai cunoscut este

ergosterolul care a fost izolat, prima dat, din Claviceps purpurea i ulterior din miceliile unormucegaiuri ca Penicillium, Fusarium i Aspergillus. La o cultur de Aspergillus fischerii, pe unmediu nutritiv cu 10% glucoz, se obine 1,1% ergosterol, n condiiile unui raport optim C/N de 20/ 4.

Pe cale biotehnologic, ergosterolul se obine prin culturi de drojdii sau micelii deAspergillus niger i Penicillium notatum. Urmeaz operaia de transformare a ergosterolului nvitamina D prin iradiere cu lmpi de mercur sau cu srm incadescent de magneziu. Are rol esenialn fixarea calciului i fosforului cu implicaii directe n formarea sistemului osos i a dentiiei,prevenind rahitismul la copii, osteoporoza i cariile severe. Ajut la tratarea rcelilor i aconjuctivitelor.

Vitamina H (biotina) este sintetizat, pe cale microbiologic, n prezena unormicroorganisme ca: Phycomyces blakesleana, Torulopsis utilis, Hansenula anomala i Aspergillus

niger. Se prezint sub trei forme: bios I (mezoinozitol), bios II- A (acid pantotenic) i bios II- B(biotina). Din mediu de cultur, separarea se face prin filtrare i absorbie pe norit. Biotina estecomponent a unor enzime implicate n metabolismul proteic, lipidic i glucidic. Amelioreaz durerilemusculare dup oboseal excesiv i contribuie la meninerea integritii pielii. mpiedic ncrunireaprului i previne alopecia (chelia).

Vitamina K(acidul para- aminobenzoic). Deriv din menadion, prin cultura algei Chlorellasau a anumitor specii din genul Bacillus. n organismul uman contribuie la metabolismul fierului i laformarea hematiilor, prevenind sngerrile i emoragiile interne prin coagularea rapid a sngelui.

Vitamina PP (nicotinamida). Nu este realizat prin culturi de microorganisme ci estesintetizat numai n plantele superioare. n schimb, niacina, o form dezaminat a vitaminei PP, poatefi obinut prin culturi de bacterii din genul Corynebacterium. Are rol n prevenirea pelagrei i adermatitelor severe, intensific circulaia sangvin, reduce tensiunea arterial i atenueaz tulburrilegastro-intestinale, meninnd starea de sntate a aparatului digestiv, a creierului i a sistemuluinervos. Este o vitamin esenial n sinteza hormonilor sexuali (estrogeni, progesteron, testosteron, acortizonului i insulinei).

Provitamina A (carotenul). Este un pigment carotenoidic de natur terpenic, sintetizat dinizo- pentil- pirofosfat. Se gsete n anumite alge, n Mucoraceae i n mucegaiul Choanephora.Beta- carotenul protejeaz mucoasa nazal, bucal, faringian, laringian, traheal i pulmonar,constituind un bun remediu n tratamentul infeciilor respiratorii i emfizemului pulmonar. Are rolprofilactic n bolile maligne (cancer gastric i esofagian, cancer de prostat), transformnd metaboliiicancerigeni n substane mai solubile i mai puin nocive. Vitamina A contribuie la profilaxia

tulburrilor de vedere, este un factor n meninerea sntii pielii, prului, danturii i gingiilor.Totodat stimuleaz activitatea sistemului imunitar i previne pigmentrile cauzate de bolile ficatuluisau de btrnee.


9/38


10/38

10

Tendinta de crestere a populatiei modiale

Cresterea populaiei pe continente pn n 2020

South America 8%

Africa 35%

Asia 51%

Former Soviet Union 0%

Europe 0%

North

America 5%

Benefits of biotechnology More food

.

ra nk c oun tr y ar ea sq. km. p op ul atio n ( all es timat es )

2009-07-01 yearly growth yesterday daily increase today

World 510,072,000 6,790,062,216 1.17% 6,807,646,989 217,096 6,807,864,085

1. China 9,596,960 1,338,612,968 0.66% 1,340,573,578 24,205 1,340,597,783

2. India 3,287,590 1,166,079,217 1.55% 1,170,090,210 49,518 1,170,139,728

3. United States 9,826,630 307,212,123 0.98% 307,880,246 8,248 307,888,495

4. Indonesia 1,919,440 240,271,522 1.14% 240,879,376 7,504 240,886,880

5. Brazil 8,511,965 198,739,269 1.20% 199,268,514 6,534 199,275,048

6. Pakistan 803,940 176,242,949 1.95% 177,005,622 9,416 177,015,038

7. Bangladesh 144,000 156,050,883 1.29% 156,497,616 5,515 156,503,131

8. Nigeria 923,768 149,229,090 2 .00% 149,891,422 8,177 149,899,599

9. Russia 17,075,200 140,041,247 -0.47% 139,895,182 -1,803 139,893,379

10. Japan 377,835 127,078,679 -0.19% 127,025,097 -662 127,024,436

11. Mexico 1,972,550 111,211,789 1.13% 111,490,672 3,443 111,494,115

12. Philippines 300,000 97,976,603 1.96% 98,402,761 5,261 98,408,022

13. Vietnam 329,560 86,967,524 0.98% 87,156,660 2,335 87,158,996

14. Ethiopia 1,127,127 85,237,338 3.21% 85,844,531 7,496 85,852,028

15. Egypt 1,001,450 83,082,869 1.64% 83,385,245 3,733 83,388,978

16. Germany 357,021 82,329,758 -0.05% 82,320,623 -113 82,320,510

51. Romania 237,500 22,215,421 -0.15% 22,208,026 -91 22,207,935


11/38

11

8. Biotehnologiile n agricultura modernPrima revolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial de Norman Borlaug

pentru a incerca sa rezolve o parte din probleme grave ale nutri iei omenirii pentru care a primitPremiul Nobel pentru Pace. Cercetrile au fost dezvoltate in Mexic si Filipine la grau, orez, porumb,sorg, mei etc.

A doua revoluie verde este considerata a fi reprezentata de Biotehnologiile moderne

8.1.Tendinte actuale in agricultura

Msuri diversificarea cultivarelor i a speciilor cultivateIntroducerea biotehnologiilor (10% din necesarul de fora de munc din agricultura pentruproducerea aceleiai cantiti de proteine)

Fixarea azotului atmosferic Valorificarea solurilor srturoase Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor

(anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, se nregistreaz 1 milintoxicatii acute soldate cu 20 mii mori )

Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelor Schimbarea treptat a tuturor modelelor de producie

Promovarea conceptului de dezvoltare durabil Modificarea legislaiei privitoare la OMG (ORGANISME MODIFICATE GENETIC)

Peste 90 si, respectiv 120 de milioane de hectare cu plante modificate genetic au fostcultivate n anul 2005 si 2008, n ntreaga lume. Potrivit raportului dat publicitii de InternaionalService of the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), suprafeele nsmnate cu plantemodificate genetic au crescut cu 11%, fa de anul 2004. Creterea din 2005 nu este att de nsemnatprecum cea nregistrat pe parcursul anului 2004 (20%), dar se previzioneaz c se va menine de-alungul ntregului deceniu.

n 2005 ase ri au cultivat 98% din suprafaa mondial de plante modificat genetic. Peprimul loc se situeaz SUA, cu 48 milioane hectare, urmate de Argentina 17 milioane hectare,

Canada 6 milioane ha, Brazilia 6 milioane ha, China 4 milioane ha, Paraguay 1,4 milioane ha.Restul de 2% din suprafaa estimat cultivat de 15 ri, printre care Mexic, Spania, Germania,Romnia, Africa de Sud. Estimrile ISAAA sunt puternic contestate de organizaiile ecologiste,contestaii cu marea caren de a nu avea nici o prob practic. Aflate de civa ani n centrul unordezbateri contradictorii aprinse, organismele modificate genetic i continu expansiunea fulminantpreconizat de oamenii de tiin. n mai puin de 10 ani ele au nregistrat un ritm mediu de dezvoltarerealizat n agricultura tuturor timpurilor. Cantitativ acest ritm nregistreaz o cretere anual de peste10 milioane hectare, iar analitii anticipeaz o extindere a suprafeelor cultivate la orizontul anului2020 la dimensiunea total de 350 milioane hectare, adic de aproape trei ori mai mult ct reprezintsuprafaa cultivat a rilor UE 15. Reticena europenilor fa de aceste plante pare a fi una fals dinpunct de vedere tiinific, singura explicaie plauzibil innd de imposibilitatea acestora de a valorifica

eficient actuala abunden alimentar. Din acest punct de vedere, Romnia este o ar europeanatipic, dac avem n vedere c ea este incapabil s-i asigure securitatea alimentar din resurseproprii.

n 1996, anul introducerii acestor plante, doar ase ri le utilizau, iar suprafeele erau dedoar 1,7 milioane de hectare.

Cea mai mare parte a suprafeelor cultivate cu varieti modificate genetic este acoperit desoia (60%). Valoarea pe pia a culturilor transgenice a atins, n 2005, 5,25 miliarde de dolari. RaportulISAAA remarc faptul c agricultorii francezi i portughezi au reintrodus, n 2005, cultura de porumbBt, la care renunaser de 2 i respectiv 5 ani. Cehia a introdus pentru prima dat cultura de porumb Bt.Pn n momentul de fa, culturile de porumb Bt au ptruns n cinci ri din Uniunea European(Cehia, Frana, Germania, Portugalia, Spania). Spania ar membr a UE cultiv, nc din anul

1998, porumb modificat genetic pe suprafee care n timp ar permite transformarea acestei ri nprincipalul furnizor de semine de porumb modificat genetic al Europei.

In Romnia, in 2006 s-au cultivat in jur de 100 de mii de hectare cu organismemodificate genetic Din cele 21 de ri care cultiv varieti modificate genetic, 13 o fac pe suprafee


12/38

12

care depesc 50.000 de hectare. Potrivit ISAAA, rile n cauz sunt: Africa de Sud, Argentina,Australia, Brazilia, Canada, China, Filipine, India, Mexic, Paraguay, Spania, Statele Unite, Uruguay.n anul 2005, Brazilia este ara care a recunoscut cea mai important cretere de suprafeelor cultivatecu organisme modificate genetic: culturile de soia transgenic au progresat cu 88%, ajungnd sacopere 9,4 milioane de hectare. n India, suprafeele cultivate cu bumbac Bt (modificat genetic) aucrescut de la 500.000 de hectare, n 2004, la 1,3 milioane de hectare, n 2005.

Potrivit Institutului Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA),Iranul i China sunt rile cu potenialul cel mai mare n comercializarea de orez modificat genetic. 250

de milioane de agricultori din ntreaga lume, cultiv orezul transgenic, care se constituie n aliment debaz pentru 1,3 miliarde de persoane. International Service of the Acquisition of Agri-biotechApplications (ISAAA), asociaie sponsorizat, ntr-o anumit msur, de industria biotehnologiilor, seautocaracterizeaz ca fiind un organism caritabil, fr a avea ca scop obinerea de profit, care lucreazpentru nlturarea srciei din rile n curs de dezvoltare. Acest scop ar putea fi atins prin facilitareatransferului de cunotine i prin transferarea aplicaiilor din domeniul geneticii vegetale.

Ministerului Agriculturii a interzis a cultivarii de soia modificata genetic (Roundup Ready)n Romnia ncepnd cu anul 2007, pe motivul c UE nu ar permite acest lucru

Suprafete cultivate cu plante modificate genetic in 2004

0

20

40

60

80

100

120

140

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

0

20

40

60

80

100

120

140

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

Global Area of Biotech Crops, 1996 to 2007:Industrial and Developing Countries (Million Hectares)

Total

Industrial

Developing

Total

Industrial

Developing


13/38

13

9. BAZELE MOLECULARE ALE INGINERIEI GENETICEEreditatea: transmiterea caracterelor codificate de materialul genetic ADNCelula la celulele fiiceIndivid la descendentiGenotip: totalitatea materialului genetic al unui organismFenotip: totalitatea trasaturilor observabile ale unui organism, determinate de materialul genetic si demediul inconjurator

Dogma central a geneticii

ADN-ARN-proteine

9.1. Structura acizilor nucleici Compozitia chimica a ARN Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), uracilul (U) Riboza (monozaharid) Radicali fosfat Compozitia chimica a ADN Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), timina (T) Dezoxiriboza (derivat mai stabil al ribozei) Radicali fosfat

Bazele purinice: A, G (dublu nucleu aromatic) Bazele pirimidinice: C, T, U (un singur nucleu hexagonal)

Structura nucleozidelor si a nucleotidelorNucleozide = baze azotate + monozaharid (pentoza)Baze azotate + riboza (ribo-nucleozide)Baze azotate + dezoxiriboza (dezoxiribo-nucleozide)Nucleotide = nucleozide + fosfatHibridizarea bazelor azotate Nucleotidele formeaza intre ele legaturi de hidrogen Aceste legaturi se realizeaza intre bazele azotate, care se asociaza 2 cate 2 (hibridizare) astfel:

A = T (ADN) sau A = U (ARN), C G Legaturile se stabilesc intotdeauna intre o baza purinica si o baza pirimidinica Hibridizarea A = T este mai putin stabila (mai usor de disociat) decat hibridizarea C G

Citoplasma

Nucleu

ADN

Citoplasma

Nucleu

ADN

CitoplasmaCitoplasma

NucleuNucleu

ADNADN

ARNARN

ProteinaProteina

ReplicatieReplicatieReplicatie

TranscriereTranscriereTranscriere

TranslatieTranslatieTranslatieTranslatie


14/38

14

Structura acidului dezoxiribonucleic

ADN este format din nucleotide (A, G, C, T), ale caror pentoze sunt dezoxiriboze. Legaturile dintrenucleotide sunt de tip fosfodiester.

Molecula ADN este formata din 2 lanturi polinucleotidice ale caror nucleotide sunt unite intre ele, 2cate 2, prin legaturi de hidrogen, pe toata lungimea Bazele azotate sunt orientate spre interior Ribozele si resturile fosfat formeaza un schelet exterior

Cele 2 lanturi sunt antiparalele: extremitatea 5 a unui lant se hibridizeaza cu extremitatea 3 aceluilalt lant

Secventele lor sunt complementare: pentru ca toate nucleotidele sa poata fi hibridizate, trebuie caordinea legarii lor pe un lant (secventa) sa fie complementara cu cea a lantului opus

Lanturile polinucleotidice sunt spiralate unul in jurul celuilat dubla spirala (modelul J.D. Watsonsi F.H.C. Crick, 1953)

Cele 2 lanturi unite prin legaturi de hidrogen pot fi disociate la cald: denaturarea ADN; refacerealegaturilor: renaturarea

Replicarea: sinteza ADN identic cu materialul genetic al celulei, inainte de diviziunea mitoticadublarea cantitatii de ADN

Replicarea este semiconservativa: fiecare lant este matrita pentru sinteza lantului complementar: 1molecula ADN 2 molecule, fiecare avand un lant vechi si unul nou sintetizat

Comparaie dintre ADN i ARN

9.2. Codul genetic


15/38

15

Codul genetic este universal degenerat ambiguu far virgule

9.3. Expresia genicaTranscriptia si translatia genereaza expresia genicaInformatia genetica codificata in ADN unui embrion include toate genele necesare pentru a mentine si

dezvolta organismul.

Diferite tipuri de celule exprima diferite tipuri de gene

Expresia genica diferita in timpul dezvoltarii stabileste rolul celulei in corpInitierea transcriptieiTranscriptiaPrin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARN m complementaraProcesul citirii ARM mesager si transformarea informatiei in prioteine se numeste translatie

99..44..SSttrruuccttuurraa ggeenneelloorr llaa eeuuccaarriioottee

Gena: secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine sau a uneimolecule de ARNAlcatuirea unei gene1. promotorul (Elemente reglatoare) secventa situata inaintea genei, leaga ARN polimeraza sidetermina locul de unde incepe transcrierea2. Secventa codificatoare (informationala) formata dintr-o succesiune de exoni (secvente transcrise,pastrate in ARNm si traduse sau exprimate in proteine) si introni (secvente eliminate, absente dinARNm)3. Secventa terminala (terminator)- O secventa semnal (AAUAAA) pentru terminarea transcrierii la

sfarsitul ultimului exon

10. INGINERIA GENETIC, ETAPELE TRANSGENEZEI


16/38

16

Ingineria genetica poate fi definita ca un ansamblu de metode si tehnici care permit fie introducerea inpatrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, de interes, fie modificareaexpresiei unei/unor gene prezente, deja, in celula. Genele transferate sunt denumite transgene.Ingineria genetica mai este numita, uneori, si modificare genetica, transformare genetica sautransgeneza, iar produsele obtinute poarta numele de organisme modificate genetic (OMG) sauorganisme transgenice (Badea, 2000).

In Germania, definitia data organismelor modificate genetic este urmatoarea: OMG sunt organismeal caror material genetic a fost modificat intr-un mod care nu exista in natura in conditii naturale saude recombinare naturala. Organismul modificat genetic trebuie sa fie o unitate capabila deautoreplicare sau transmitere a materialului genetic.

In Statele Unite, termenul de organism modificat genetic se refera la plante si la animale carecontin gene transferate de la alte specii, pentru a obtine anumite caractere, precum rezistenta laanumite pesticide si erbicide.

In Romania (conform OG nr. 49/2000), organismul modificat generic este un organism carecontine o combinatie noua de material genetic, obtinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care iiconfera noi caracteristici.

ROMANIA este singura tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificate genetic.Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationale pentru Securitate Biologica(CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiile legislatiei nationale si internationalereferitoare la regimul activitatilor care implica utilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicilebiotehnologiei moderne, numai dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National.

Pentru modificarea genetica a plantelor este nevoie de:- gene de interes;- metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleul celulei care va

fi la originea unei noi plante;

- - selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvat scopului urmarit(toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunator etc.).

10.1 Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape:- identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes;- - transferul genelor de interes la plantele de cultura ;- - selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat si testarea

acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresiei transgenei in timp, in conditiinaturale.

Comparativ cu metodele clasice de ameliorare, transformarea prin ingineria genetica prezinta,cel putin,doua avantaje:

- ofera posibilitatea introducerii unui singur caracter la o varietate, deja evaluata caperformanta;

- gena transferata poate proveni din orice sursa, ceea ce extinde, practic, in modnelimitat, posibilitatile de ameliorare.

11. IDENTIFICAREA, IZOLAREA SI CLONAREA GENELOR DE INTERES


17/38

17

Exemple de enzime de restricie i secvenele recunoscute de acestea

Identificarea i izolarea genelor se face cu ajutorul enzimelor de restricie


18/38

18

Clonarea genelor de interes

1. Vectorul de clonare (de obicei un plasmid) este secionat cu ajutorul enzimelor derestricie

2. Fragmentul de ADN de interes este detaat de din cromozom cu ajutorul aceleiaienzime de restricie

3. Fragmentele rezultate sunt ataate vectorului de clonare cu ajutorul ligazelor rezultndun vector recombinant

4. Vectorul recombinant este introdus (de exemplu prin metoda biolistic) n celula gazd(de regul o bacterie)

5. Bacteria mpreun cu vectorul recombinant se nmulete (cloneaz) producnd multecopii de ADN recombinant


19/38

19

6. ADN recombinant se extrage si se purific

12. PRINCIPALELE METODE UTILIZATE PENTRU TRANSFERUL GENELOR DEINTERES METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA

1. Transformarea mediat de bacterii: Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium rhizogenes

2. Transformarea mediat de virusuriMETODE DIRECTE1. Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule2.Transformarea protoplastelor

a.Microinjectareab.Electroporareac.Sonicarea3. Electroforeza4. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu

12.1 TRANSFORMAREA MEDIAT DE AGROBACTERIUMBacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes realizez ceea ce

adeseori s-a numit inginerie genetic natural. Aceaste bacterii sunt capabile s transfere n esutul

vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (tumor inducing) n cazulspeciei A. tumefaciens sau Ri (root inducing) n cazul speciei A. rhizogenes, care se integreaz ngenomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului(crown gall disease) iar A. rhizogenes formarea de rdcini firoase (hairy roots). In decursul

Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR

Constructia unei transgene

Gena de interes

Gene bacterieneantibiotic markerreplication origin

Gene bacterieneantibiotic markerreplication origin

Gena marker pentruselectia plantei

Plasmid ADNConstruct

Gena marker pentruselectia plantei

Plasmid ADNConstruct

intrerupator Sinteza proteinei Semnal stop


20/38

20

coevoluiei plant microorganism aceste bacterii au devenit capabile s transforme plantele pentru ale exploata mai bine ca i surse de energie. ADN T se transmite dup legile Mendeliene, ca gendominant. Exist date care confirm faptul c o astfel de transformare genetic are loc n natur frintervenia omului.

Astfel, s-a demonstrat c plasmida Ri poate purta una sau dou copii de ADN-T, iar o partedin una dintre aceste secvene a fost regsit n genomul unor plante nemodificate genetic. Celulelevegetale care poart ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conine gene cuefect oncogen. Deleia acestor gene din ADN-T nu interfer, din fericire, cu transferul i integrarea

ADN-T n genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aa numitele latur dreapt istng constnd din o secven alctuit din 24 de nucleotide care se repet, reprezint situri derecunoatere pentru sistemul de transfer. Prin nlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de intereseste posibil transferul acestora n celule vegetale int, celule care nu mai dobndesc caracter tumorali deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes fie ele gene marker sau raportoaresau gene cu importan economic pot fi introduse n plante fie prin linkage cu regiunea ADN-Tdezarmat prin recombinare, obinndu-se un aa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor ntresecvenele repetate laterale ntr-un replicon independent, ceea ce se numete vector binar. Existenamai multor regiuni T n celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora n celula vegetalint cu eficien crescut. Pe de alt parte pentru integrarea ADN-T n celula vegetal se pot utilizasecvene omoloage ADN vegetal int care induc, cu frecven relativ sczut, recombinarea omolog

ntre ADN-T i ADN vegetal.

Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacunele dintre acestea nu formeaz tumori. Dei spectrul de gazde pentru aceast bacteriei este limitat laplantele dicotiledonate s-au obinut tulpini supervirulente, capabile s infecteze eficient i celuleleplantelor monocotiledonate. S-a deschis, astfel, calea transformrii cerealelor i prin intermediulacestui vector bacterian. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens, variaz destulde mult n funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este foarte important, totodat, caesutul supus transformrii s fie totipotent i deci s regenereze plante transformate genetic. De celemai multe ori, ns, dintr-un esut doar un numr limitat de celule sunt totipotente i nu ntodeaunaacestea sunt i cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat

metode potrivite pentru transformarea eficient mediat de A. tumefaciens. Ca esuturi int pot fiutilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sausemine ntregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate n1983, succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la sistemul model tutunul (Nicotianatabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia, bumbacul, orezul, ovzul, sorgul, trestia de zahr,grul i multe altele. Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de:identificarea metodei optime de cultur a esutului int, condiiile de cultur a materialului surs, sausua bacterian utilizat. Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz ngenomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea uneisingure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizat descifrarea mecanismelor implicate ncolonizarea esuturilor vegetale de ctre bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic alvirulenei bacteriene .

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea plantelor detutun n anul 1977. Aceast bacterie transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formareardcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta gene de interes, dac acesteaau fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etap intermediar,n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes, este cultura rdcinilor firoase care aucapacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel, prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metaboliisecundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acestsistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile prezentnd cibiochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile firoase pot fi cultivate uor, folosind

un echipament simplu i ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabiledin punct de vedere genetic. Asemntor sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic. Aceasta dinurm poate purta n ADN-T o gen marker, de exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic,


21/38

21

o gen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipic i o gen cu importan economic.Avantajul acestui sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care determin dezvoltareardcinilor firoase, i ADN-T de pe vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi diferii nplantele transformate i deci, vor segrega independent n descenden. Un avantaj aparte al sistemuluide transformare Ri este faptul c toate celulele vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri potfi uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de rdcin firoas. Sistemul de transformaremediat de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n1989), dar asemntor sistemului A. tumefaciens rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip

sau sua bacterian. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmentede tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau

cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii decartof. Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoase numai la una dinextremele explantului, rdcini capabile s ignore fora gravitaional. Mai mult, exist dateexperimentale care sugereaz efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen,rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole

12.3 TRANSFORMAREA MEDIAT DE VIRUSURIUtilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda numeroaselor eforturi

experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n 1984 a fost posibil transferul unei gene derezistena la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul

viral nu poate accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin. Descoperirea faptului cvirusurile ARN pot genera ADN prin transcripie invers a generat sperana c, mult mai numeroaselevirusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-auntmpinat alte dificulti. ADN viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala


22/38

22

surs de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizain experimentele de transformare genetic a plantelor.

METODE DIRECTE

12.4 METODA BIOLISTICS mpucarea direct a ADN n celuleMetoda biolistic (biolistics) sau particle gun, de mpucare direct a ADN n esuturi

int este o metod de transformare genetic a plantelor foarte rapida. In dezvoltarea acestei tehnici s-au investit foarte mult efort i bani iar rezultatele obinute au fost pe msura ateptrilor.Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici (1m diametru) din tungsten, wolfram

sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, n esuturi vegetale int. Aceast tehnic arenumeroase avantaje care o recomand pentru aplicabilitate general: este o metod uor de aplicat,printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule, celulele supravieuiesc dup mpucare, genelepurtate de particule i pstreaz activitatea biologic, particulele pot fi mpucate n straturilesuperficiale sau n profunzimea unui organ vegetal. Celulele int pot fi foarte diferite: polen, celule nsuspensie, embrioni imaturi, celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme. Datorit avantajelorsale biolistica a devenit metoda favorit n numeroase laboratoare, permind transformarea cu succesa unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovzul, orezul,

sorgul, trestia de zahr, grul, plante forestiere etc. O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii demicroproiectile pentru rnirea apexurilor la floarea soarelui, eficientiznd astfel transformarea mediatde Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuit mpucarea direct n esuturi vegetale a celulelorbacteriene ntregi

12.5. UTILIZAREA PROTOPLASTELOR PENTRU TRANSFERUL DIRECT DEADNProtoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de expresie atotipotenialitii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate pn astzi numrulplantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibil a crescut permanent, ajungndactualmente la aproximativ 400 de specii de plante.

Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i seleciatransformanilor. Indeprtarea peretelui celular elimin principala barier n calea ptrunderii ADN

strin n celula vegetal. Izolarea enzimatic a protoplastelor acioneaz ca un factor de stress careinduce reacii de rspuns la rnire reacii presupuse a declana starea de competen att deimportant pentru transformarea eficient. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamn cu osuspensie bacterian avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaii mari de celule


23/38

23

individuale n medii de cultur bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au n general origineclonal provenind din celule individuale. Eficiena seleciei transformanilor este deci maxim n cazulprotoplastelor deoarece se evit formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelormulticelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utilizadiferite metode, i anume: a. Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete aADN direct n protoplaste, acestea fiind fixate cu o alt micropipet. Microinjectarea celulei vegetalentregi sau a esuturilor este, de asemenea posibil, dar se realizeaz mai greu din punct de vederetehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent i const n imobilizarea protoplastelor recipiente

de tutun ntr-un strat foarte subire de mediu solidificat cu agaroz sau alginat. Protoplastele au fostimobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea i monitorizarea prin fotografiere aprotoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.b. Electroporarea implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice n prezena unorpulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte scurt, porii formai nmembran permind intrarea ADN strin n citoplasm . Electroporarea a devenit o metod de rutinpentru transformarea protoplastelor vegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene. Laplante electroporarea protoplastelor se folosete eficient pentru transformarea permanent lanumeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se eliminnecesitatea utilizrii unor gene marker, ceea ce reprezint un avantaj deosebit n condiiile oponeneiacerbe a opiniei publice fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker. Avantajele

electroporrii constau n eficiena crescut a incorporrii ADN strin, reproductibilitatea i simplitateaacestei metode. Singura limitare a aplicrii electroporrii o reprezint capacitatea de regenerare aprotoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost depit prin extinderea aplicrii electroporrii celulelor sauchiar esuturilor ntregic. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezena ultrasunetelor s-a dovedit, deasemenea o metod eficient pentru transferul ADN n protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fostaplicat i celulelor sau esuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus comparativ cuelectroporarea

12.6 ALTE METODE DE TRANSFER DIRECT AL ADN N CELULELE VEGETALEElectroforeza Migrarea ADN printr-un esut vegetal int a fost o alt idee interesant pentru transferul

de gene i a fost aplicat pentru prima oar embrionilor intaci de orz.

Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology)Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea genetic prin aceast

tehnologie este relativ simpl, constnd n vortexarea (agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibrede carbur de siliciu. Astfel, fibrele penetreaz pereii celulari permind ADN s ptrund ncitoplasm. Metoda a fost aplicat iniial transformrii embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovediteficient i n transformarea celulelor vegetale. Cercetrile de microscopie electronic au relevatpenetrarea peretelui celular de ctre astfel de fibre, sugernd c ADN ader de suprafaa fibrelor i esteintrodus odat cu acestea n celul. Avnd proprieti fizice asemntoare azbestului fibrele de carburde siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetic a fost raportat folosind aceasttehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovz, tutun i Agrostis alba. Transformarea stabil afost, de asemenea posibil folosind suspensii celulare de porumb i tutun. Datele obinute au indicattransformarea preponderent a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun


24/38

24

cercetri ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fi foarte simpli ieftin, dar datorit riscurilor poteniale pentru sntatea uman se caut materiale alternative,eventual biodegradabile .

Alte metode cu aplicabilitate restrns de transformare a celulei vegetale sunt: mbibarea ADN nesuturi utiliznd semine uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic,macroinjectarea ADN n esuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular iplasmalema. Astfel de metode se afl, actualmente, n diferite faze de experimentare. De un interes

deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesit faze de cultur in vitro. O astfel demetod, cu potenial deosebit este transformarea gruncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele nacest domeniu sunt relativ modeste

12.7 SELECIA TRANSFORMANILOR

Selecia este o parte importan a proceselor de transformare. n general, genele de interes suntco-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uurin a celulelor recipiente transformate.Markerii de selecie cei mai utilizai confer rezisten la ageni chimici, cum ar fi antibiotice ierbicide. Manozo-6 fosfat izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai receni markeri de selecie. Enzima

este codificat de gena manA de la E.coli, care convertete monoza-6P n frucozo-6P. Astfel,transformanii ce conin manA pot crete pe manoz ca surs de carbon. Aceast selecie este un modpozitiv al aciunii de cretere a esuturilor transformante cu o rat care s-i permit acest lucru.Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecia transformanilor de sfecl (0,94%), porumb (50%)i gru (25%) .

Genele de selecie pot fi utilizae ntr-o prim generaie i eliminate mai trziu prin ncruciareconvenional. O posibilitate este de a obine dou ADN-T separate; una cu gene de interes i alta cumarkeri de selecie, n aceeai sau dou celule diferite de Agrobacterium. Cele dou ADN-T suntinserate n situsuri ne-link-ate n genomul plantei gazd, permind mai trziu segregarea genetic .

Transformarea optim se caracterizeaz printr-o singur copie a transgenei care va segregamendelian cu o expresie uniform de la o generaie la alta. Transformanii ideali pot fi identificai cu

dificultate, depinznd de materialul vegetal care va fi transformat i de cantitatea i complexitateatransgenelor. O gen inserat este esenial randomizat n genom, se observ o variabilitate de la oplant transgenic la alta, fenomen cunoscut sub numele de variaie cu efect de poziie.

Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII, sau neo, gen izolat din transpozonulTn5 de la Escherichia coli K12. Aceast gen codific neomicinfosfotransferaza enzima implicat ndetoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina, paramomicina saugeneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful,

Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul ca s le amintim pe cele mai importante. Pentruaceast gen ca ageni de selecie se utilizeaz cel mai mult kanamicina (50 100 mg/l) sau geneticina.Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicin, n acest cazgeneticina dnd rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat c la unele specii kanamicina poateinterfera cu procesele de organogenez, afectnd eficiena regenerrii plantelor transformate.O alt gen marker mult utilizat este gena hpt sau hph, gen izolat tot de la bacteria E. colicodificnd enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Aceast enzim detoxific antibioticulhigromicin B, antibiotic fa de care majoritatea esuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea,aceast gen marker a fost utilizat pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul,

Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este ndeosebi foarte potrivit caagent de selecie pentru cereale, folosindu-se n concentraii de 25-200 mg/l. Secvena codant a geneia fost, de asemenea, modificat pentru o expresie mai bun n celula vegtal.Dintre genele care conferrezisten la erbicide cel mai mult a fost utilizat gena bar, izolat de la bacteria Streptomyces

hygroscopicus i gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificnd enzimafosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid deselecie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca:tutunul, rapia, porumbul, orezul, grul i altele. O alt gen marker este gena dhfr pentru enzima


25/38

25

dihidrofolatreductaz (DHFR), izolat tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR conferrezistena la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile laconcentraii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfra fost transferat la specii cum ar fi:tutunul, petunia i grul.

Genele raportoare, spre deosebire de markerii de selecie nu confer celulelor rezisten fa de unanumit compus. Ele codific proteine care pot fi detectate direct sau catalizeaz reacii specifice aicror produi pot fi detectai prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de

transcripie cis sau trans, n condiiile transformrii tranziente sau permanente, precum imonitorizarea i optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoaresunt: gena gus (uidA) codific -glucuronidaza (GUS) i a fost izolat de la E. coli K12(Jefferson i colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizat la plante. Exist pentru aceasthidrolaz compui substat pentru evidenierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sauhistochimice la nivelul esuturilor rezultnd un compus de culoare albastr uor de evideniat. La pH-ul utilizat pentru determinarea GUS nu exist activitate -glucuronidazic detectabil n nici un esutvegetal. Toate metodele de determinare se aplic ns, numai celulelor fixate, nonviabile. genaraportoare luc pentru enzima luciferaz folosete un sistem substrat-enzim care producebioluminescen. Gena luc a fost izolat de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus

pyralis, fiind exprimat n plante (Ow i colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extras din

esuturi iar activitatea ei poate fi determinat n prezena luciferinei. Dar, exist i o metod dedeterminare non-letal i neinvaziv direct n esuturile i organele plantelor transformate, pentrumsurarea bioluminescenei fiind necesar un luminometru.

gena gfp pentru proteina cu fluorescen verde (GFP) reprezint cea mei nou gen raportoarei totodat cea mai spectaculoas i avantajoas. Gena a fost izolat de la o meduz, Aequarea victoria,fiind transferat la cteva specii de plante (Chalfie i colab., 1994). GFP prezint o serie de avantaje ianume: nu necesit un substrat, proteina se evideniaz n esuturi intacte in vitro i in vivo, prinexcitarea n UV, proteina poate fi fuzionat cu alte proteine permind monitorizarea traficului proteici a metabolismului (vezi Rakosy-Tican i colab., 1999; 2000). gena cat izolat de la E. coli,codific enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizat ca genraportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenioas bazndu-se pe monitorizarea acetilrii

cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produii fiindseparai prin cromatografie n strat subire (TLC) i msurai prin densitometrie sau prin scintilaie.Uneori poate exista activitate CAT i n unele esuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ceafecteaz eficiena acestui sistem. antocianii sunt pigmeni roii sau purpurii care se acumuleazn vacuole n unele esuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlat de gene structurale ireglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate i clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca generaportoare n esuturile i organele unor genotipuri care conin gene structurale dar nu sintetizeazantociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezint o serie de avantaje: nu necesit un substrat, seexprim doar n celulele viabile i metabolic active, sunt uor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizatgenele pentru factorii de transcripie R i C1 de la porumb (Schrott, 1995).genele care confer

rezisten la streptomicin i/sau spectinomicin au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoareprin efectul de etiolare pe care l au, prin inactivarea cloroplastelor13. PRIMA GENERAIE DE PLANTE TRANSGENICE


26/38

26

Prima generaie de plante transgenice este constituita din cultivare care au fost modificate prinintroducerea unuia sau cel mult dou caractere noi, cum sunt tolerana la unul sau mai multe erbicide,toleran la insecte sau la duntori sau tolerana combinat (caractere input).Ponderea pierderilorproduse de diferii factori din producia potenial

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate cu OMG

13.1 PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE

Erbicidele molecule chimice care actioneaza selectiv, afectand buruienile-Specifice-TotaleAvantajele erbicidelor totale:-toxicitate redusa-efecte minore asupra mediului-costuri reduseStrategii :-modificarea tintei erbicidului (cantitativ si calitativ)-introducerea in plantele cultivate a unui sistem de degradare a erbicidului

Erbicidele sikimice (glifosat) sunt sistemice totale si actioneaza avand ca tinta o enzima dincalea metabolica ce duce la sinteza aminoacizilor aromatici (prezenta la plante si microorganisme nu sila om sau animale). O gena mutanta care sa determine sinteza unei enzime insensibile la actiuneaerbicidului poate fi izolata de la bacterii sau chiar de la plante.

Soia Roundup Ready (RR) poseda o gena transferata de la E. coliPorumbul RR poseda o gena transferata de la porumbRoundup aprobat in Romania de 20 de ani

6315

1413 Productia realizata

Boli

Insecte

Buruieni

75

178

Toleranta laerbicide(TE)Rezistenta la insecte(RI)

TE/RI


27/38


28/38

28

A doua generatie de plante transgenice se refera la noi cultivare care au modificate caractere legate decalitatea produselor obtinute (caractere output).

Exemple: -modificarea continutului de amidon, proteine, zaharuri-modificarea insusirilor de panificatie-cresterea duratei de pastrare a fructelor-sporirea continutului de beta-caroten-imbunatatirea digestibilitatii furajelor

Tomatele la care a fost modificat procesul de coacere a fructelorTomatele comercializate in stare proasp\t\ sub numele FLAVRSAVRR sunt primul produs alimentarrecoltat de pe plante transgenice care a fost aprobat pentru consum.~n general, tomatele sunt culesecnd sunt `nc\ necoapte [i tari - stadiu pe care cultivatorii `l numesc matur-verde. Coacerea esteindus\ dup\ ajungerea la destina]ie, printr-un tratament cu etilen\ (hormon natural implicat `n coacerea

fructelor). Din p\cate, din cauza recolt\rii timpurii, aceste tomate nu au arome [i gustul maturate peplant\. Evident, o recoltare ceva mai trzie ar ameliora considerabil calitatea tomatelor proaspete. ~nconsecin]\, s-a procedat la modificarea genetic\ `n sensul p\str\rii consisten]ei dup\ cules, fapt ce faceposibil\ nu numai recoltarea `ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat, cnd s-au acumulat [i aromelespecifice, ci [i reducera pierderilor determinate de zdrobirea `n timpul transportului.Pentru modificareaprocesului de coacere al tomatelor, au fost aplicate dou\ strategii.

Prima a fost conceput\ pornind de la faptul c\ `nmuierea fructelor, `n general, se produce atunci cndpere]ii celulelor sunt degrada]i de enzime specifice; dou\ dintre aceste enzime au fost identificate [i latomate. Cercet\torii de la Calgene, din Davis (California), au blocat sinteza uneia dintre ele -poligalacturonaza (PG)- [i ca urmare, procesul de degradare a pere]ilor celulari a fost `ntrziat, iarfructele [i-au conservat fermitatea mai mult timp.

A doua strategie se bazeaz\ pe faptul c\, `ntr-o anumit\ faz\ a dezvolt\rii lor, fructele produc etilen\ -hormonul men]ionat mai sus, care declan[eaz\ [i accelereaz\ procesul de coacere. Evident, dac\ sesuprim\ sinteza acestui hormon- sinteza `n care sunt implicate tot dou\ enzime - `ntregul proces decoacere este `ntrziat. Mai precis, se folosesc genele care codific\ una sau alta dintre cele dou\ enzimeimplicate `n sinteza etilenei, dar orientate `n sens invers. Transferate la tomate, aceste transgeneantisens determin\ reducerea cu 95% (!) a cantit\]ii de etilen\ sintetizate [i prelungirea duratei coaceriide la una la patru s\pt\mni. ~n Fran]a, a fost ob]inut\ o linie de pepene galben care exprim\ o gen\antisens ACC oxidaz\. Fructele acestei linii se `nmoaie mult mai trziu dect fructele variet\]ilorconven]ionale. Prin urmare, ele pot r\mne mai mult timp pe plant\, acumulnd zaharuri solubile [icomponente ale aromei `n cantit\]i superioare.Tomatele constituie, de asemenea, materia prim\ pentruo industrie de multe miliarde de dolari, care produce ketchup, supe, paste, sosuri, conserve etc. Toate

acestea se ob]in din variet\]i special create pentru industrializare. Totu[i, 95% din fruct este ap\, caretrebuie par]ial eliminat\ `n procesul prelucr\rii. Ca urmare a acestui fapt, o parte din pre]ul produselorpe baz\ de tomate este reprezentat\ de costul elimin\rii apei. Cre[terea ponderii substan]elor solidesolubile (`n principal, zaharuri, acizi organici [i compu[i aromatici) `n fruct cu numai un procent- de la


29/38

29

5% la 6%- ar permite economisirea `n industria tomatelor din SUA a nu mai pu]in de 75 de milioanede dolari anual. Evident, [i acest obiectiv poate fi atins tot prin modificare genetic\, adoptndu-sediferite strategii.Tipuri noi de amidonDe[i amidonul este prezent `n `ntreaga lume vegetal\, sunt exploatate industrial doar cteva surse:porumbul, cartoful, grul, maniocul [i orezul. Produc]ia european\ se ridic\ la 10 milioane de tone, iarcea mondial\ - la 35 milioane de tone. 60% din amidonul produs provine din porumb, 25% - din gru[i 15% - din cartof. O treime dintre produse sunt naturale, iar dou\ treimi sunt derivate, dintre care20% - amidonuri modificate [i 55% - zaharuri. Exist\ deja numeroase brevete referitoare la aplica]iiale amidonului modificat prin transgenez\.~n SUA, cartofii se consum\ sub form\ de chips saucartofi pr\ji]i. Pentru a putea fi folosi]i `n acest scop, ei trebuie s\ con]in\ amidon `n propor]ie de 25%.Un con]inut mai mic - de exemplu, 21- 22% - impune evaporarea unei cantit\]i mari de ap\, fapt ceduce la absorb]ia gr\similor `n timpul prepar\rii. Recurgnd la o gen\ bacterian\, cercet\torii de laMonsanto au reu[it s\ sporeasc\ con]inutul de amidon al tuberculilor de cartof de la 22 la25%.Amidonul - glucid puternic polimerizat- are doi constituien]i esen]iali: amiloza [i amilopectina.Diferen]ele de structur\ molecular\ le confer\ acestora [i propriet\]i reologice foarte diferite, care suntexploatate `n industria agroalimentar\: amiloza formeaz\ u[or geluri, `n timp ce amilopectina este unagent de `ngro[are foarte eficace. ~n amidonurile cerealelor predomin\ amilopectina, raportulamiloz\/amilopectin\ variind `ntre 20/ 80 [i 30/70. Avnd `n vedere faptul c\ amiloza prezint\avantaje, `n prezent se `ncearc\ r\sturnarea acestui raport prin inginerie genetic\.Sinteza unorglucide de interes industrial

Metabolismul plantelor poate fi deturnat `n sensul sintetiz\rii unor molecule de interes pentru industrieprin introducerea unor noi echipamente enzimatice. O strategie de acest tip a fost aplicat\ pentrusinteza unor oligozaharide - ciclodextrinele. Acestea au o structur\ ce le confer\ capacit\]i de adsorb]ieutilizate `n industriile cosmetic\ [i farmaceutic\, `n agrochimie sau `n industria agroalimentar\, pentrustabilizarea parfumurilor [i aromelor, pentru complexarea produ[ilor cu eliberare treptat\, ca [i pentruextragerea unor substan]e speciale (cofein\, colesterol) din amestecuri. De exemplu, o gen\ izolat\ dela o bacterie a fost introdus\ `n genomul cartofului [i a determinat sinteza enzimei ce condi]ioneaz\formarea ciclodextrinelor `n tuberculi. Evident, aceast\ tentativ\ reu[it\ atest\ viabilitatea conceptului[i deschide calea spre alte `ncerc\ri de a produce, cu ajutorul plantelor, moleculare cu mare valoaread\ugat\, derivate din amidon.Una dintre cele mai remarcabile realiz\ri apar]ine Institutului Federal deTehnologie din Zurich. Este vorba de un soi de orez cu bobul galben care, ca urmare a modific\riigenetice, con]ine, `n semin]e, vitamina A [i fier. Desigur, aceast\ realizare este extrem de interesant\mai ales pentru popula]ia s\rac\, malnutrit\.Se [tie c\ beta-carotenul este un pigment necesar pentrufotosintez\, sintetizat `n ]esuturile verzi ale tuturor plantelor, deci [i ale orezului, dar nu [i `n ]esuturilenefotosintetizatoare, cum sunt cele ale semin]elor. Pe de alt\ parte, se estimeaz\ c\, `n `ntreaga lume,peste 124 de milioane de copii sunt deficien]i `n vitamina A. Ce s-ar realiza printr-un aport de vitaminaA `n diet\? S-ar preveni, anual, moartea a 1,3 - 2,5 milioane de copii mici [i de vrst\ prescolar\.Orezul galben auriu sintetizeaz\ betacaroten [i `n semin]e, deoarece `n genomul s\u sunt incluse patrugene care codific\ enzimele cheie ale biosintezei acestui pigment, izolate de la Narcissus [i Erwinia.O alt\ problem\ acut\ de nutri]ie este deficitul de fier `n organism, care afecteaz\ 30% din popula]iaglobului. Solu]ia: `n acela[i orez, a fost introdus\ [i o gen\, izolat\ de la soia, care codific\ feritina - oprotein\ ce stocheaz\ fierul. Func]ionarea acestei gene, pus\ sub controlul unui promotor cu expresie

s\mn]\ specific\, a f\cut s\ creasc\ de trei ori nivelul fierului `n bobul de orez.~n cadrul unui altproiect, a fost ob]inut\ sfecla de zah\r transgenic\ ce produce fructan, un `ndulcitor necaloric: O alt\cale de a spori dulcea]a fructelor const\ `n a face plantele s\ sintetizeze proteine naturale dulci, cumsunt monelina [i taumatina-proteine prezente `n fructele unor specii de plante tropicale. Gena pentrumonelin\ a fost transferat\ la tomate [i salat\, iar gena care codific\ precursorul taumatinei - la cartof[i castravete. Evident, pe aceast\ cale devine posibil\ [i reducerea cantit\]ilor de zaharuri ad\ugate `nunele preparate alimentare. Un alt `ndulcitor proteic este brazeina. Unul deosebit de performant. De500 pn\ la 2000 de ori mai dulce dect zah\rul. Societ\]ile ProdiGene [i NeKtar Worldwidepreconizeaz\ s\ transfere gena care `l codific\ la porumb.~n anul 2001, `n SUA se afl\ `n cmpuri detestare o nou\ genera]ie de produse cu `nsu[iri de ordin calitativ [i tehnologic modificate.Alte proiecteinteresante pentru industrie:- plante transgenice de plop, eucalipt [.a. produc\toare de biomas\ pentru

ob]inerea etanolului;- plante transgenice cu lignina modificat\ pentru fabricarea hrtiei;- plante derapi]\ modificate pentru a produce un material plastic biodegradabil (polimerul respectiv a fostexprimat [i `n lumenul fibrelor de bumbac).


30/38

30

Dintre plantele care nu se cultiv\ pentru hran\, bumbacul r\mne cazul cel mai interesant `n privin]aaplica]iilor ingineriei genetice. ~n afara soiurilor rezistente la insecte [i erbicide (obiectiv impus defaptul c\ aproximativ 40% din cantitatea total\ de pesticide consumate se aplic\ la aceast\ specie),cultivate deja pe suprafe]e mari `n Statele Unite ale Americi, dar [i `n China, Africa de Sud [i India,sunt `n curs de ob]inere:- linii care sintetizeaz\ melanin\, pentru culoarea neagr\, `n lumenul fibrei,prin expresia unor transgene sub controlul unor promotori fibr\ specifici - linii care sintetizeaz\, tot `nlumenul fibrei, un miez de material plastic.Scopurile finale ale acestor transform\ri sunt evidente:renun]area la opera]iunea de colorare a fibrelor, costisitoare [i poluant\, [i ameliorarea propriet\]ilortermice.Tot pentru ameliorarea calit\]ii `mbr\c\min]ii, `n plantele furajere se introduc gene carecodific\ proteine cu sulf. Proteine menite s\ amelioreze calitatea lnii oilor.Plantele ornamentalemodificate genetic pe pia]\ `nc\ din 1996: o garoaf\ mov- MoondustTM- ob]inut\ prin introducereagenelor ce codific\ pigmen]ii corespunz\tori `ntr-un soi cu flori albe, precum [i o garoaf\ care poate fip\strat\ t\iat\, `n vaz\, timp relativ `ndelungat. De altfel pia]a este inundat\ de plante ornamentale cuculoarea florilor modificat\.Un interes aparte prezint\ plantele modificate genetic pentru a fi folositeca instrumente de bioremediere, adic\ de decontaminare a terenurilor poluate natural saucontaminate ca urmare a unor activit\]i ale omului. Iat\ numai cteva exemple de asemenea plante:plopul galben, care posed\ dou\ gene bacteriene ce-i permit s\ converteasc\ mercurul ionic [imetilmercurul `n mercur volatil; mu[tarul cu toleran]\ sporit\ la cadmiu; tutunul care posed\ enzimece degradeaz\ hidrocarburile poluante; arborii care supraexprim\ nitratreductoza, eliminnd oxizii deazot ce se acumuleaz\ `n marile aglomer\ri urbane.

15. A TREIA GENERATIE DE PLANTE TRANSGENICE

Cea de a treia generatie include plante modificate genetic in vederea producerii unor molecule utilepentru industrie, medicin sau stiinProduse primare Anticorpi (imunoglobuline)

- Enzime (cosmetic, terapeutic, industrie,diagnostic)- Proteine structurale (peptide, hormoni)- Vaccinuri- Medicamente

Produse secundare Bioplastic-Vitamine- Metaboliti secundari (fenoli, taninuri, amidonuri, arome, alcaloizi)- Fibre

RealizariSalata care vaccineaz contra hepatitei B.Cartoful care imunizeaz impotriva holerei.Rapita care produce de doua ori mai multa vitamina E.

16. RISCURILE PENTRU MEDIU

Ingineria genetica si produsele sale au aparut numai in ultimii 20 de ani. De aceea, este aproapeimposibil de evaluat impactul potential al speciilor trangenice asupra mediului. Totusi, pornind de laobservatiile efectuate in situatii similare cu specii naturale, oamenii de stiinta au sugerat urmatoareleefecte:1. Crearea de noi daunatori: a planta de cultura care a fost modificata prin inginerie genetica pentru a fitoleranta fata de saruri ar putea scapa (evada) din lanul de cultura, ar putea invada estuarele, sufocandvegetatia naturala a acestui habitat.2. Amplificarea problemelor cu daunatorii deja existenti: plantele de cultura sunt capabile de a

transfera gene la distante de kilometrii la specii inrudite, prin polenizarea mediata de vant sau insecte,unele dintre aceste specii putand fi buruieni cunoscute. Astfel, genele straine de la plantele de cultura

cu caractere inginerizate, cum ar fi toleranta la erbicide sau uscaciune, ar putea fi transferate laburuieni, facandu-le si mai greu de controlat.3. Afectarea speciilor nevizate, non-tinta: virusurile, microorganismele sau plantele modificate geneticpentru a omora insectele daunatoare ar putea afecta si insectele utile. In experimentele de laborator,


31/38

31

bacteriile modificate pentru a converti reziduurile vegetale cum ar fi frunzele in alcool, cu scopulutilizarii acestuia ca si combustibil, au determinat reducerea populatiilor de ciuperci (fungi) benefice.In unele cazuri, au fost omorate si ierburile din zone invecinate prin otravire cu alcool.4. Reducerea biodiversitatii prin inlocuirea speciilor native: plantele de cultura GE care au un avantajde supravietuire ar putea evada din campurile de cultura, ar putea invada alte ecosisteme si ar puteainlocui alte specii. Aceasta pierdere a biodiversitatii ar putea diminua sever abilitatea ecosistemelor sauspeciilor de a raspunde cu succes la stessuri neasteptate, cum ar fi uscaciunea sau bolile.

17. RISCURILE ASUPRA SANATATIIPrincipalele griji referitoare la siguranta alimentelor care contin derivate OMG se concentreaza asupraurmatoarelor aspecte:1. Testele analitice existente si bazele de date continand substantele toxice naturale sau nutrientiiprezenti in alimentele conventionale nu sunt adecvate pentru a testa modificarile neintentionate alederivatelor OMG;2. Ingineria genetica poate afecta in mare masura toxinele, alergenii sau nutrientii din alimente;3. Alergiile asociate alimentelor pot fi exacerbate prin inginerie genetica;4. Folosirea genelor marker care confera rezistenta la antibiotice in unele alimente OMG ridicaprobleme de sanatate.

18. MARKERI MOLECULARI18.1. GeneralitiMarkerii moleculari (DNA markers) pun n eviden diferenele dintre secvenele de

nucleotide din ADN (acid dezoxiribonucleic) extras din indivizi diferii. Spre deosebire de markeriimorfologici, aceste diferene nu sunt neaprat vizibile n fenotip. O singur nucleotid diferit, dintr-o

gen sau chiar din ADN repetitiv, poate determina formarea sau dispariia unui marker molecular (N.Jones i colab., 1997). Prezint marele avantaj c sunt mult mai numeroi dect cei morfologici i nuperturbeaz fiziologia organismului.

Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genomurilor, a determinat cretereaspectaculoas a eficienei activitilor de ameliorare att la plante ct i la animale, precum ideschiderea unor multiple aplicaii practice ca: identificarea indivizilor, realizarea hrilor genetice(care faciliteaz, n mod indirect, activitatea de selecie), clonarea unor gene importante, realizareaunor studii de filogenie, stabilirea similaritii genetice dintre indivizi etc. (Vos P. i colab., 1995).Pentru procesul de conservare a germoplasmei, determinarea gradului de nrudire dintre indivizipermite reducerea accentuat a cheltuielilor cu pstrarea, evitndu-se dublurile.

Noiunea de amprent genetic (DNA fingerprinting) a fost introdus de cercettorulbritanic Alec Jeffreys n anul 1984, acesta fcnd aluzie la utilizarea tradiional a amprentelor cametod de identificare a indivizilor. Astfel, pe cnd amprentele clasice analizeaz aspecte fenotipice,amprentele genetice analizeaz informaia genetic.

Utilizate corect, testele bazate pe analiza ADN pot evidenia cu mare precizie identitateaunui individ. Tot ceea ce se cere pentru realizarea unei amprente genetice este o proba de esut dincare s se poat extrage o cantitate infim de ADN: fragmente din frunze tinere, cotiledoane, embrion,semine, me

Suport de Curs Biotehnologii 2009-10-11 TPPA

Documents

Transcript of Suport de Curs Biotehnologii 2009-10-11 TPPA