UNIVERSITATEA “Al. I. CUZA” IAŞIFACULTATEA DE CHIMIE

CATEDRA DE BIOCHIMIESPECIALIZAREA CHIMIA MEDIULUI SI

SIGURANTA ALIMENTARA

LUCRARE DE DISERTAŢIE

IULIE 2011

UNIVERSITATEA “Al. I. CUZA” IAŞIFACULTATEA DE CHIMIE

CATEDRA DE BIOCHIMIESPECIALIZAREA CHIMIA MEDIULUI ŞI

SIGURANŢA ALIMENTARĂ

Conducător Ştiiţific: Masterand:

Lect. Dr. Robert Vasile Grădinaru Gabriela Bucataru

Univ. “Al. I. Cuza”, Faculatatea de Chimie, Iaşi

Cuprins:

Capitolul I. Studiu de literatura privind activitatea ureazei din plante

I.1.Introducere

Capitolul II. Contributii proprii privind determinarea activitatii ureazei din plante

1.Materiale si metode:

1.1.Obtinerea extractelor enzimatice

1.2. Metode de masurare a activitatii ureazei

I.2.1. Metoda cu reactiv Nessler

I.2.2. Metoda micro-fluorimetrica

I.2.3.Metoda fluorimetrica

1. Stingerea fluorescentei ureazei in prezenta DNP

2. Dependenta pH-ului ureazei in prezenta DNP

2. Rezultate si discutii.

3. Concluzii.

Bibliografie

Capitolul I. Studiu de literatura privind activitatea ureazei din plante

I.1. Introducere.

Enzimele sunt catalizatori biochimici, aşadar sunt compusi care măresc viteza reacţiilor

chimice ce se desfaşoară in sistemele biologice, fără să se consume in cursul lor.

Denumirea de enzimă s-a folosit în 1877, iar prima teorie generală a catalizei chimice

conținea și un exemplu de enzimă (diastaza din malț ), subliniindu-se că hidroliza amidonului

este mai eficient catalizată de diastază decât de acid sulfuric. Deși Louis Pasteur recunoștea că

fermentația este catalizată de enzime, el presupunea, în 1860, că acestea sunt indisolubil

legate de structura și viața celulei de drojdie. În 1897, Eduard Buchner a extras din celulele de

drojdie enzimele care catalizează fermentația alcoolică. Apoi s-a demonstrat că aceste enzime

importante, care catalizează o cale metabolică majoră, furnizoare de energie, pot funcționa

independent de structura celulară. Mulți ani mai târziu s-a izolat o enzimă în stare pură,

cristalină. Acest lucru a fost realizat de J.B. Sumner, care, in 1926, a izolat ureaza din extract

de fasole (Canavalia ensiformis). J.B. Sumner a dovedit că, cristalele obţinute conțin o

proteină, datorita acestui fapt a tras concluzia că enzimele sunt proteine. Părerea sa nu a fost

imediat acceptată și abia în 1930-1936 când J. Northrop a cristalizat enzimele pepsină,

tripsină și chimotripsină, s-a acceptat definitiv natura proteică a enzimelor.

În 1950 apare tehnica difracției în raze X ce demonstrează ”structura enzimelor”, care a ramas

valabilă până astăzi. În 1974 enzimele s-au împărțit în sase mari clase: oxidoreductaze,

transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze si ligaze (sintetaze).

Astăzi se cunosc aproape 2000 de enzime diferite. Multe au fost izolate în stare pură,

omogenă și cel puțin 200 au fost cristalizate.

Ureaza este o metaloenzimă care contine ioni de nichel, catalizează reactia de conversie a

ureei la ionul de amoniu și dioxid de carbon. Este produsă de plante, fungi și bacterii.

Schema 1. Reactii de scindare a ureei in absenta/prezenta ureazei.

Caracteristici structurale ale ureazei

Structura cristalină a centrului activ al ureazei conţine două molecule de apă şi o punte

hidroxil, specificitatea enzimei este strâns legată de forma centrului său activ.

In timp ce ureaza din plante sau fungi este cunoscuta ca si homohexamerul α6, ureaza

bacteriană este sub formă de heterotrimeri (αβγ)3, ale carei unităţi demonstrează o omologie

ridicată a secvenţelor de aminoacizi cu subunităţile α din ureaza prezentă in boabele de fasole.

Ureaza produsă de Helicobacter pylori este compusă doar din 2 subunităţi care formează un

complex dodecameric. Important, in toate formele de urează cunoscute, spatiile active sunt

intotdeauna localizate in subunităţile α. Prezenţa ureazei din spatiile active a fost dată de

structurile cristalelor. Spatile active demonstreaza existenta unui centru de nichel binuclear.

S-a emis teoria că în plante ureaza este implicată în obținerea azotului și în protecția

impotriva factorilor patogeni.

Creşterea nivelului de amoniac şi cresterea  pH-ului asociate cu această reacţie au implicaţii

majore medicale şi agricole. Studii recente relevă faptul că unele erbicide pot inhiba

activitatea ureazei. În  concentratii ridicate  2,4-dinitrofenolul (DNF), precum şi alţi

nitrofenoli sunt toxici pentru mamifere.

Studii recente relevă faptul că unele erbicide pot inhiba activitatea ureazei. La concentraţie

mare, 2,4-dinitrofenolul (DNF), precum şi alţi nitrofenoli sunt toxici pentru mamifere. 

DNF-ul este cunoscut ca un uncoupler de fosforilarea oxidativa in mitocondrii.

Pentru a înţelege mai bine toxicitatea  DNF şi pentru a o exploata in diferite aplicatii,

parametrii unui astfel de interacţii, constante de asociere şi de influenţa a pH-ului sunt

importante. În acest raport, va punem la dispozitie rezultatele anchetei privind

interacţiunea DNF cu ureaza prin tehnici spectroscopice de fluorescenţă la valori ale  pH-

ului diferite. Acest studiu este de asteptat sa fie de interes special in ecotoxicologia

nitrofenolilor.

I.2. Scopul lucrarii

Lucrarea de faţă a avut în prim plan două obiective principale:

1. Determinarea activităţii enzimatice a ureazei din două surse diferite utilizand:

Metode spectrofotometrice - monitorizarea activitatii enzimatice cu ajutorul

reactivului Nessler

Metode spectrofluorimetrice – stingerea fluorescenţei eozinei

2. Interactiunea ureazei cu 2,4 dinitrofenolul.

Masuratori de activitate a ureazei in absenţa/prezenţa 2, 4 dinitrofenolului.

Capitolul II. Contributii proprii privind determinarea activitatii ureazei

din plante

II.1. Materiale si metode

II.1.1. Materiale:

Urează (Canavalia ensiformis, M = 483 kDa) a fost achiziţionată de la firma Roth

(Germania)

Uree

Solutie tampon Tris a fost achiziţionat de la firma Roth (Germania)

Reactiv Nessler

2,4 Dinitrofenol a fost achiziţionat de la firma Sigma, o soluţie stoc DNF a fost

pregătită prin dizolvarea DNF-ului în metanol.

Fosfat a fost achiziţionat de la firma Roth (Germania)

Borat a fost achiziţionat de la firma Roth (Germania)

HEPES fost achiziţionat de la firma Roth (Germania)

II.1.2. Aparatură

Spectrofotometru UV-VIS, Libra S 35 PC (UK) – utilizat pentru determinarea

absorbanţei în măsuratorile de activitate, în care ionul de amoniu rezultat în urma reacţiilor

enzimatice a fost determinată cantitativ cu reactivul Nessler.

Spectrofluorimetru - Modulus TM Microplate Multimode Reader (Turner Biosystem Inc,

USA) – utilizat pentru determinarea activităţii enzimatice in prezenţa eozinei, la scară redusă.

Spectrofluorimetru SFM 25 – utilizat in determinarea fluorescenţei ureazei în absenţa

sau in prezenţa dinitrofenolului.

Microprocesor cu ultrasunete – utilizat pentru extragerea ureazei din diverse surse

Centrifugă- separarea amestecului ce conţine proteine solubile de componentele

insolubile ( membrane celulare ).

Unitate de filtrare la vid – pentru pregătirea soluţiei tampon utilizat in fluorimetrie.

pH-metru – determinarea pH-ului solutiei tampon.

Baie de apă cu termostat – reglarea temperaturii măsurătorilor de fluorescenţă

II. 1. 3. Metode

II. 1. 3.1. Metode spectrofotometrice de determinare a activităţii enzimelor.

Aceste metode se bazează pe proporţionalitatea care există între extincţia E (sau densitatea

optică D.O.) a unei soluţii şi produsul dintre concentraţia soluţiei respective (c) şi drumul

optic (d)adică grosimea stratului de soluţie pe care lumina o străbate:

E (sau D.O.) =ε∙l∙c

ε-coeficientul de extincţie molară, adică extincţia substanţei respective aflată în soluţie într-o

concentraţie de 1M atunci când drumul optic este de 1 cm. Pe de altă parte,

valoareaextincţiei este dată de relaţia:69

  E=1

I0- intensitatea luminii incidente;

I - intensitatea luminii transmise;

T - transmisia.

Ţinînd cont de aceste relaţii, unitatea de măsură a coeficientului de extincţie molară este:

Cea mai mare sensibilitate în determinarea unui compus prin metode

spectrofotometrice se situează la lungimea de undă corespunzătoare absorbţiei maxime. De

aceea, determinările se fac la lungimi de undă bine stabilite în funcţie de spectrul de

absorbţie, aceste metode fiind pe deplin realizabile deoarece este practic imposibil

ca atât substratul cât şi produsul de reacţie să posede ace laş i spec t ru de

absorb ţ ie . În mul te s i tua ţ i i se de te rmină d i rec t ex t inc ţ ia subs t ra tu lu i sau

a  produsului de reacţie la o lungime de undă bine determinată, situată în ultraviolet, domeniul

vizibilsau chiar domeniul infraroşu. De foarte multe ori, se folosesc metode în care substratul

sau produsul de reacţie formează complecşi coloraţi cu reactivi specifici, iar

intensitatea culorii este direct  proporţională cu concentraţia substanţei respective.

În asemenea situaţii se determină densitatea optică a acestui compus colorat la o

lungime de undă din domeniul vizibil. Calculul rezultatelor în toate metodele

spectrofotometrice, se face, fie prin utilizarea unei soluţii etalon (standard), fie prin trasarea

unei curbe de etalonare.

II. 1. 3.2.Metode fluorimetrice de determinare a activităţii enzimelor

Aceste metode de analiză sunt extrem de sensibile deoarece pot fi înregistrate modificări ale

emisiei spectrale chiar la concentraţii foarte mici ale substanţelor analizate. Metodele

fluorimetricede dozare se pot utiliza atunci cînd fie substratul, fie produsul de reacţie, fie

cofactorul enzimatic prezintă proprietăţi fluorescente. De exemplu, activitatea

dehidrogenazelor FAD-dependente poatefi determinată cu mare exactitate prin metode

fluorimetrice deoarece coenzimele flavinice sunt fluorescente în stare oxidată.

Proprietăţile fluorescente dispar prin reducerea lor în procesele redox pe care le catalizează

flavoenzimele.

II. 2. Rezultate si discutii

II.2.1. Obtinerea extractelor enzimatice:

Extractele enzimatice au fost pregătite prin suspensia a 1 g seminţe de pepene rosu sau

seminţe de fasole verde în 10 ml tampon Tris 50 mM, pH 7,4 (solutie racită in prealabil),

sonicat de trei ori timp de 1 min (50% impulsuri / 5 min pauză) şi a fost centrifugat 10 min la

10000 rpm. Supernatantul a fost recentrifugat 10 min la 10000 rpm şi filtrat cu ajutorul unui

filtru 0.22 m (Millipore). Soluţia astfel obţinută a fost depozitată la 4 C.

Toate testele de activitate au fost realizate folosind reactiv Nessler la 25 ° C.

II.2.2. Metode de măsurare a activitaţii enzimatice:

II.2.2.1. Monitorizarea activitatii enzimatice cu ajutorul reactivului Nessler.

Un amestec conţinând 300µl uree 0.1 M, 300µl extract si 300 µl reactiv Nessler a fost

omogenizat si valoarea absorbantei a fost inregistrata la 425 nm cu ajutorul unui spectro-

fotometru Libra S 35 PC (UK).

Schema 2. Determinarea activitatii enzimatice cu reactiv Nessler. 1,3- control; 2-extract din

fasole verde; 4-extract din seminte de pepene rosu;

Ureaza din extractul de pepene prezinta o activitate enzimatica mai pronuntata comparativ

cu aceea din extractul de fasole ( Fig. 1).

S-a constatat faptul ca activitatea enzimatica se mentine in urma procesului de inghetare.

II.2.2.2.Metoda micro-fluorimetrica

Determinarea activităţii enzimatice cu ajutorul fluorescenţei reprezintă o metodă de analiză

sensibilă pentru cuantificarea ureei.

Fluorescenţa a fost citită cu un fluorimetru Modulus TM Microplate Multimode Reader (Turner

Biosystem Inc, USA) folosind filtrul albastru (λex=490 nm, λem= 510-570 nm). Soluţiile

folosite la fluorescenţă au fost sterilizate in prealabil folosind o unitate de filtrare la vid

Steriflip (Milipore)

Schema 3. Microplacă folosită în experimentele de măsurare a fluorescenţei (volumul

aplicat/godeu = 300 l ). Determinarile au fost efectuate in triplicat.

Figura 3. Variaţia fluorescenţei eozinei (soluţie apoasă) in sistemul uree-urează

In soluţie apoasă descresterea fluorescenţei eozinei raportată la concentraţia ureei prezintă

un maxim la 2,5 M (Fig. 3).

II.2.2.3. Studiu privind interacţiunea dintre 2,4-dinitrofenol şi urează, în soluţie apoasă.

Activitate şi testul total de proteine.

Extractele enzimatice au fost pregătite prin suspensia a 1 g seminţe de pepene rosu sau

seminţe de fasole verde în 10 ml tampon Tris 50 mM, pH 7,4 (solutie racită in prealabil),

sonicat de trei ori timp de 1 min (50% impulsuri / 5 min pauză) şi a fost centrifugat 10 min la

10000 rpm. Supernatantul a fost recentrifugat 10 min la 10000 rpm şi filtrat cu ajutorul unui

filtru 0.22 m (Millipore). Soluţia astefel obţinută a fost depozitată la 4 C.

Toate testele de activitate au fost realizate folosind reactiv Nessler la 25 ° C.

La 300 l tampon Tris pH 7.4 am adaugat 300 l extract si 300 l urea 0.1 M si am incubat la

37 C. Produsul de culoare galbenă a fost măsurat la 425 nm. Masurătorile s-au realizat faţă de

un martor (fără enzime) pentru corecţia corespunzătoare. O unitate enzimă este definită ca

fiind cantitatea de enzimă necesară pentru a elibera 1  mol NH4+ / min în condiţii de analiză.

Pentru estimarea concentraţiei de proteine totale am folosit testul Bradford.

Activitatea specifică a ureazei a fost masurata din extracte proaspăt preparate. Am constatat

că activitatea specifică a ureazei din seminţe de fasole a fost aproape jumătate faţă de

activitatea specifică a ureazei din seminţe de pepene roşu. În plus, cantitatea totală de proteine

a fost de 5 ori mai mare în al doilea extract. Astfel, concentraţia ureazei a fost mai mare în

seminţele de pepene rosu. Studiul testului de activitatea enzimei, aşa cum este descris în

partea experimentala, a fost efectuat pentru acest extract, după 5 minute de incubare la 37 ° C.

In urma incubarii s-a obtinut un produs portocaliu şi a fost inregistrata absorbanţa de

aproximativ 0.9 u. A. la 425 nm. Având în vedere că activitatea enzimei este relativ mai mare

vom folosi primul extract pentru a efectua experimente similare de activitate în prezenţa 2,4

dinitrofenolului. Deoarece acest derivat de fenol este de culoare galbenă acesta poate interfera

cu reactivul Nessler. Din acest motiv am redus concentraţia de 2,4 dinitrofenol la 5,5 M

pentru a evita aceste interpretări greşite.

În figura 1, activitatea ureazei din extractul din fasole verde a fost măsurată în absenţa /

prezenţa DNF (5,5 M concentraţie finală), in urma careia s-a observat o uşoară creştere de

activitate în prezenţa DNF.

Figure 1. Măsurători de activitate a ureazei (extract din seminţe de pepene şi fasole verde) în absenţa (stânga) sau in prezenţa DNF (5.5M; dreapta) în tamponTris 20 mM, pH 7, la 37 C.

Măsurători de fluorescenţă.

Toate Spectrele de fluorescenta au fost înregistrate la un Spectrofluorimetru SFM-25

(Kontron Instruments SPA, Milano, Italia), echipat cu celule de cuarţ de 1.0 cm şi o baie

termostatată.

Probele martor corespunzatoare tamponului sau DNF-ului au fost folosite in scopul de a

corecta fondul fluorescentei. Un volum de 3.0 ml de solutie, ce contine o conc

corespunzatoare de ureaza (10 μmol/L), a fost adaugata, intr-o cuva de cuart, prin aditie de

solutie de DNF . Volumul total acumulat, de soluţie de DNF, a fost mai putin de 50 μL, in

scopul de a evita schimbarile semnificative in urma dilutiei. Spectrele de fluorescenta au fost

apoi masurate (lungimi de undă de excitare la 275 nm şi lungimi de undă de emisie intre 290 -

400 nm), la 298 K. Spectrele de fluorescenta tridimensionale au fost efectuate în următoarele

condiţii: lungimile de undă de emisie au fost stabilite de la 270 la 400 nm, lungimea de undă

de excitare a fost la 200 nm, lungimea de undă crescând cu 5 nm.

Ureaza din fasole este o enzimă pe baza de Ni care are in structura 24 unitati fenilalanină, 21

unitati tirozina si 4 resturi de triptofan. Prin urmare, această enzimă este potrivită pentru

studiul fluorescenţei . Spectrele fluorescenţei de emisie ale ureazei, măsurată în absenţa/

prezenţa DNF sunt prezentate în Fig. 2. Ureaza are maxima fluorescenţei de emisie la 324

nm ( la pH 7 şi 25 C), indicând contribuţia tirozinei şi a resturilor de triptofan. Modificările

spectrului de fluorescenţă în special a triptofanului, , poate fi din cauza proprietăţilor

dielectrice sau din cauza unor modificări conformationale. Se poate deduce că modificările

conformaţionale ale ureazei induse de interacţiunea DNF duce la scăderea polarităţii în jurul

resturilor de triptofan şi/sau contribuţia resturilor de tirozină la spectrele de emisie ceea ce

este mai important.

Figura 2. Fluorescenta ureazei (10,0 M), în absenţa / prezenţa DNF (50 M) în tampon

fosfat 20 mM, pH= 7 şi 25 C.

Reiese din Fig. 2, o deplasare spre domeniul albastru datorata resturilor de tirozină la

adăugarea DNF. Depăşirea maximelor de emisie indică faptul că unele modificări

conformaţionale apar şi datorita scăderii caracterului hidrofob al resturilor de tirozina.

Spectrele sugerează că triptofanul este un stingător de fluorescenta mai bun decât tirozina.

Mai mult decât atât, spectrele de doua derivate sunt mai relevante în ceea ce priveşte

interacţiunea. Două vârfuri importante la 338 şi 357 nm sunt caracteristice pentru

interacţiunea dintre Trp-DNP.

Spectrul de fluorescenţă tridimentional este necesar pentru a studia schimbările

conformaţionale în proteine. Spectrele de fluorescenţă tridimentionale ale ureazei (A) şi

urează-DNP (B) sunt prezentate în Fig. 3. În Fig 3.a, harta contur afişată se disting spectre de

fluorescenţă şi două vârfuri tipice fluorescenţei (a şi b). După interacţiunea cu DNF, poziţia

pick-urilor de fluorescenţa ale ureazei s-au schimbat (o deplasare spre domeniul albastru a

fost observată atât pentru pick-ul „a” cat şi pentru „b” şi scăderea intensităţii pick-urilor

(scăderea intensităţii pick-ului "a" este mult mai evidentă ). Analiza spectrelor a arătat că

interacţiunea ureazei cu DNF induce unele schimbări de mediu şi micro-conformationale ale

ureazei.

Figura 3. Spectre de fluorescenţă 3D şi spectrele conturul corespunzătoare de urează (10

m), în absenţa/prezenţa DNF (Panel A1 şi A2 / Panel B1 şi B2) de DNP (50 M) în 50 mM

Tris / NaCl 100 mM pH 8 şi 25 C.

O scădere de stingere urează de DNP cu creşterea pH-ul a fost observată (Fig. 4.). Un

stingerea mai mare extindere a fost observată în mediu putin acid deoarece (pH 5-6). Cu toate

acestea, la un pH mai mare de 7 diferenţele de stingere sunt similare. Acest aspect ar trebui să

fie subliniat, deoarece activitatea optimă a enzimei este la pH 6-7.

Concluzii

În această lucrare, oferim rezultate din ancheta privind interacţiunea DNF cu ureaza, bazat pe

tehnici de activitate şi de fluorescenţă in condiţii de pH diferite. Activitatea ureazei este

afectată prin adăugarea de DNF în extractele brute. Stingerea fluorescenţei ureazei este

dependentă de pH. Mediul triptofan şi tirozină au fost modificate la pH 8 şi activitatea ureazei

este parţial afectata de DNF. Studiul obligatoriu a DNFcu ureaza are o importanţă

toxicologică. Aceste studii pot furniza date importante despre efectul nitrofenolilor asupra

ureazei din plante şi are, prin urmare unele aplicaţii potenţiale.