Separarea doxiciclinei şi a produşilor săi de degradare prin metoda de analiză HPLC

Masterand: Simona Ştefanovici

Specializarea: Chimia produselor cosmetice şi farmaceutice

1. Introducere

În ultimii ani s-a remarcat o creştere a utilizării doxiciclinei în practica medicală, fapt

care nu se datorează în principal proprietăţilor sale antibacteriene, ci efectului său inhibitor

asupra unui grup de enzime;astfel, ea e mentionată ca matrice a metaloproteinazelor. Aceste

metaloproteinaze sunt enzime care intervin în cazurile inflamatorii, precum: gingivite şi

ulceraţii aftoase. Doxiciclina, ca medicament din clasa tetraciclinelor, se distribuie uşor în

marea majoritate a ţesuturilor, cum ar fi: dentina, smalţul dinţilor neerupţi şi gingii, motiv

pentru care s-a dovedit a fi eficient în tratamentul afecţiunilor inflamatorii ale gurii.

Determinarea prin HPLC a doxiciclinei şi a produşilor săi de degradare s-a dovedit a fi

relativ dificilă. Mulţi dintre aceşti produşi de degradare sunt epimeri , deci se aseamănă

structural foarte mult cu doxiciclina, dar şi între ei (fig.1a şi b), apărând constant probleme în

ceea ce priveşte separarea lor. O altă problemă de separare prin HPLC apare atunci când sunt

folosite coloane ODS, deoarece timpul de retenţie e mare din cauza hidrofobicităţii crescute.

Totuşi această problemă poate fi ocolită dacă faza mobilă e suficient de acidă astfel încât să

permită ionizarea tetraciclinei, lucru posibil prin creşterea hidrofilicităţii şi reducerea timpului

de retenţie.

Pentru determinarea tetraciclinelor în formulele farmaceutice, s-au utilizat multe

metode HPLC, folosind silica gel, grafit poros, faze staţionare pe bază de silice sau polimeri.

Majoritatea acestor metode sunt complexe, necesită un timp de analiză îndelungat , unele sunt

foarte scumpe, iar altele nu pot reda separarea tetraciclinelor de produşii lor de degradare.

În acest articol a fost descrisă o metodă HPLC simplă şi selectivă pentru separarea

doxiciclinei şi a unor produşi ai săi de degradare: 6-epidoxiciclina şi metaciclina. Această

metodă îndeplineşte cerinţele Farmacopeei Europene în privinţa selectivităţii pentru aceste

substanţe. Încercări anterioare de separare a celor doi produşi de degradare au întâmpinat mari

dificultăţi. Astfel, metoda propusă este adecvată pentru evaluarea calitativă a acestor compuşi

în produsele farmaceutice.

Figura 1. a – doxiciclina şi epimerii săi

b – produşi de degradare ai doxiciclinei

2. Experimente

2.1. Reactivi

Ca reactivi s-au utilizat doxiciclina, metaciclina şi 6-epidoxiciclina. De asemenea, s-au

mai folosit acetonitril, metanol şi acid percloric. Toţi reactivii utilizaţi sunt de puritate

analitică.

2.2. Cromatografie. Aparatură

S-au folosit: un sistem HPLC cu separare termică a produşilor, detector UV, un

Integrator Chromjet şi un autosampler Merck. Coloanele folosite în vederea separării sunt:

Hypersil ODS C18, C8 de diferite diametre. Lungimea de undă a detectorului a fost setată la

350 nm, iar debitul stabilit pentru separarea doxiciclinei şi a produşilor de degradare este de

1.0 ml/min. Compoziţia fazei mobile este: acetonitril : apă : acid percloric = 26:74:0.25,

echilibrată la pH 2.5 cu NaOH 5M. Probele şi standardele au fost dizolvate în faza mobilă, iar

20 µl de probă au fost injectaţi la temperatura camerei în sistemul HPLC.

2.3. Prepararea soluţiilor

Soluţiile test de doxiciclină (40µg-ml), metaciclină (7ug/ml) şi 6-epidoxiciclină

(7ug/ml) au fost preparate prin dizolvarea lor in faza mobilă. Standardele de calibrare (3-40

µg/ml pentru doxiciclină şi oxitetraciclină şi 0.5-7 µg/ml pentru metaciclină şi 6-

epidoxiciclină) au fost preparate din soluţiile stoc, după cum urmează: s-au cântărit cu

precizie 0.020 g doxiciclină HCl şi 0.003 g 6-epidoxiciclină şi metaciclină, fiecare într-un

pahar de 200 ml. Se dizolvă în aproximativ 100 ml faza mobilă, după care se completează cu

faza mobilă până la un volum prestabilit. Aceasta este solutia S, care e apoi diluată

corespunzător. Soluţia SI: 10 ml de soluţie S diluată la 25 ml, soluţia SII: 15 ml de SI diluată

la 25 ml, SIII: 15 ml de soluţie SII diluată la 25 ml, SIV: 10 ml SIII diluată la 25 ml, SV: 5 ml

SIV diluată la 10 ml. Probele au fost filtrate printr-o seringă cu filtru de nylon cu diamentru

foarte mic, înainte de a fi injectate în sistemul HPLC.

3. Rezultate şi discuţii

3.1. Cromatografie

A fost posibilă o separare eficientă a metaciclinei şi 6-epidoxiciclinei, atât una faţă de

alta,cât şi faţă de doxiciclină, utilizând doar o coloană Luna de 5 µm C8 250x4.6 mm. Prin

această metodă, pentru compuşii investigaţi s-au obţinut valori ai timpilor de retenţie , care

sunt aproximativ la fel cu cei obţinuţi prin metoda oficială a Farmacopeei Europene ( 30

minute). De asemenea şi cerinţele de rezoluţie şi simetria picurilor sunt îndeplinite de această

metodă (fig.2 si tab.1).

Figura 2. Exemplu de cromatogramă: pic1 – metaciclina, pic2 – epoxiciclina, pic3 –

doxiciclina.

Tabel 1. Timpi de retenţie si rezoluţie

a – între metaciclină şi 6-epidoxiciclină

b – între 6-epidoxiciclină şi doxiciclină

Principalele avantaje ale acestei metode faţă de cea oficială sunt timpul considerabil

redus necesar efectuării analizei şi faptul că probele sunt mai uşor de preparat.

Studii preliminare asupra capacităţii de separare prin această metodă descrisă, dar

pentru alte tetracicline, arată o separare bună pentru toţi compuşii investigaţi (fig.3), ceea ce

indică faptul că metoda poate fi aplicată în analiza diferitelor tetracicline.

Figura 3. Exemplu de cromatogramă: pic 1 – tetraciclina, pic 2 – demeclociclina, pic 3 –

clortetraciclina, pic 4 – minociclina, pic 5 – metaciclina, pic 6 – 6-epidoxiciclina, pic 7 –

doxiciclina

Substanţă Timp de retenţie (min) Rezoluţie

Metaciclină 22.22

6-epidoxiciclină 23.30 1.2a

Doxiciclină 25.16 1.9b

3.2. Faza mobilă

3.2.1. Compoziţia fazei mobile

Au fost testate compoziţiile pentru faza mobilă ce conţine o soluţie tampon de acid

percloric, apă si acetonitril in rapoarte diferite (30-50%), ajungându-se la concluziile: cu cât

faza mobilă conţine mai multă soluţie tampon, cu atât timpul de retenţie al tetraciclinelor

creşte, se obţine o rezoluţie mai bună, dar se observă şi o lărgire a picurilor. În urma testării

mai multor compoziţii pentru faza mobilă, a fost selectat raportul de 26% pentru acetonitril,

ca fiind ceea ce permite separarea doxiciclinei şi a produşilor săi de degradare.

3.2.2. Faza mobilă. pH

În alegerea valorii pH-ului fazei mobile, un rol important au avut trei factori: în primul

rând, doxiciclina trebuie să se prezinte sub forma sa ionizată pentru a putea creşte timpii de

retenţie, prin urmare, pH-ul fazei mobile trebuie să fie mai mic decât pKa-ul doxiciclinei, care

este 3.4. În al doilea rând, la un pH foarte mic, timpul de viaţă al fazei staţionare din coloană e

redus cu mult, mai ales la pH mai mic de 2; iar în al treilea rând, cu cât valorile pH-ului scad,

creşte numărul de izomeri analogi obţinuţi. În urma acestor considerente, s-a ales o valoare a

pH-ului de 2.5.

3.3 Validarea metodei analitice

Pentru a valida metoda HPLC s-au realizat o serie de teste . Parametrii incluşi in

metodologia de validare a metodei cromatografice sunt:

3.3.1. Liniaritatea

Scopul procedurii:se doreşte să se demonstreze că există o relaţie liniară între

concentraţiile soluţiilor analitului de interes care se injectează în coloana cromatografică

şi ariile picurilor generate în cromatogramele corespunzătoare.

Pentru cei trei compuşi s-a făcut câte o curbă de calibrare. Concentraţiile investigate au fost

între 3 si 60 µg/ml pentru doxiciclină şi 0.5-7 µg/ml pentru 6-epidoxiciclină şi metaciclină.

Coeficientul de corelaţie nu indică liniaritatea dacă nu are o valoare ce depăşeşte r = 0,999.

Coeficienţii de corelare (R2) au fost: 0.9990 pentru doxiciclină, 1.0000 pentru 6-

epidoxiciclină şi 0.9994 pentru metaciclină.

3.3.2. Selectivitatea

Scopul procedurii:se doreste să se demonstreze că metoda cromatografică propusă are

capacitatea de a separa substanţa activă în raport cu impurităţile înrudite chimic rezultate prin

degradarea acesteia.

Selectivitatea metodei pentru separarea doxiciclinei de compuşii săi de degradare a

fost studiată trecând cantităţi exacte de tetraciclină prin faza mobilă. Aşa cum s-a arătat în

fig.2 şi tab.1, compuşii au fost separaţi cu o rezoluţie corespunzatoare. Aşadar, o analiză bună

înseamnă că toate perechile de picuri care eluează succesiv sunt separate cu o rezoluţie de cel

puţin 1,5.

3.3.3 Precizia şi acurateţea

Scopul procedurii: se doreşte să se demonstreze că aplicarea metodei, în mod repetat,

asupra aceleiaşi probe, generează rezultate similare.

Prin repetarea analizelor (n=7) au fost determinate deviaţia standard relativă (R.S.D.)

pentru aria de sub curbă (AUC) şi timpii de retenţie pentru cele trei substanţe. Media valorilor

R.S.D. obţinute pentru timpii de retenţie a fost de 1.16%, iar pentru ariile de sub curbă: 1.44%

(tab.2). Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii standard relative (RSD) în studiul preciziei

metodei este RSD ≤ 2% (n ≥ 6).

Tabel 2. Precizia

Compus R.S.D. (%) AUC R.S.D. (%)

Doxiciclină 1.16 1.12

6 - epidoxiciclină 1.15 1.63

Metaciclină 1.16 1.58

4. Concluzii

S-a dezvoltat o nouă metodă pentru separarea doxiciclinei şi a produşilor săi de

separare, 6-epidoxiciclină şi metaciclină, metodă care s-a dovedit că este fiabilă, relativ ieftină

şi simplă în ceea ce priveşte procedurile ce trebuiesc aplicate, comparativ cu metoda

Farmacopeei Europene.

Rezultatele arată că metoda descrisă poate fi folosită în analizele calitative ale celor

trei compuşi, iar cercetări suplimentare vor putea determina aceste limite calitative ale

metodei. Simplitatea metodei prezentate o face să fie o alternativă potrivită la metodele

oficiale folosite în controlul calitativ al doxiciclinei.

Acest studiu indică, de asemenea, faptul că metoda poate fi folosită atât pentru

analiza calitativă cât şi în analiza cantitativă a multor tetracicline, însă pentru confirmarea

acestui fapt sunt necesare cercetări suplimentare.