REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - umfcd.ro · coronariana, boala vasculara periferica si boala...

Universitatea de Medicină și Farmacie

„Carol Davila” București

Facultatea de Farmacie

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONTRIBUȚII EXPERIMENTALE LA EVALUAREA

IN-VITRO ŞI IN-VIVO A PROPRIETĂȚILOR

BIOFARMACEUTICE ALE CLOPIDOGRELULUI ŞI

METABOLIȚILOR SĂI

Coordonator ştiinţific:

PROF. DR. CONSTANTIN MIRCIOIU

Doctorand:

SIMONA NICOLETA SAVU (căs. DUNĂ)

BUCUREŞTI

2016

CUPRINS I. INTRODUCERE………………...………………………………………….

1

II. STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII

II.1 Notiuni generale privind istoricul si rolul actual al clopidogrelului in farmacoterapie………………………………………………………… 4

II.2 Stadiul actual al cunoasterii privind farmacocinetica clopidogrelului si a metabolitilor sai…………………………………………………... 9

II.3 Stadiul actual al cunoasterii privind cinetica de cedare a clopidogrelului si premisele dezvoltarii unui model IVIVC…………..

16

III. CONTRIBUTII EXPERIMENTALE LA EVALUAREA IN-VITRO SI IN-VIVO A PROPRIETATILOR BIOFARMACEUTICE ALE CLOPIDOGRELULUI SI METABOLITILOR SAI

III.1 Teste de stabilitate ex-vivo; teste privind influenta anticoagulantului utilizat la recoltari asupra rezultatelor farmacocinetice; aplicarea intr-un studiu de biodisponibilitate realizat pe voluntari sanatosi a unor metode analitice de ultima generatie pentru determinarea in probe de farmacocinetica a clopidogrelului si metabolitilor sai………………... 26

III.2 Dezvoltarea unui model IVIVC biorelevant ce poate fi aplicat pentru predictia biodisponibilitatii formularilor generice de clopidogrel…… 53

III.3 Evaluarea cailor de metabolizare prin mecanisme de conjugare a clopidogrelului: studii farmacocinetice pe soareci si subiecti umani sanatosi ce descriu absorbtia, disponibilitatea si eliminarea clopidogrelului acil glucuronid……………………………………….. 73

III.4 Evaluarea interactiunilor medicamentoase intre clopidogrel si substraturi competitoare sau inhibitori CYP2C19 sau CYP3A4 si determinarea impactului lor asupra ratei de formare a metabolitului activ H4: studii in vitro realizate pe microzomi hepatici……………... 90

IV. CONCLUZII

IV.1 Concluzii partiale……………………………………………………... 110

IV.2 Concluzii finale...……………………………………………………... 120

V. REFERINTE BIBLIOGRAFICE……………………………….………….. 123

VI. ANEXE…………………………………………………………………….. 136

VII. ARTICOLE PUBLICATE CA PRIM AUTOR IN REVISTE COTATE ISI……………………………………………………………………………… 149

NOTA: Cuprinsul respecta numerotarea paginilor si capitolelor din teza

Pagina|1

INTRODUCERE

Clopidogrelul este un medicament din clasa tienopiridinelor, utilizat ca

antiagregant plachetar cu scopul de a inhiba formarea cheagurilor de sange in boala

coronariana, boala vasculara periferica si boala cerebrovasculara [RCP, 2013]. In

ciuda faptului ca acest medicament este utilizat in practica farmacoterapeutica de mai

bine de 18 ani (a primit aprobarea de punere pe piata in Uniunea Europeana in anul

1998) si ca, inainte de expirarea brevetului sau, acesta a fost al doilea cel mai utilizat

medicament din lume [Topol et. al., 2011], este surprinzator faptul ca informatiile

disponibile pana in prezent cu privire la soarta sa metabolica si variabilitatea inter-

individuala crescuta farmacocinetica si farmacologica sunt inca incomplete.

Clopidogrelul in sine este un promedicament; pentru a rezulta metabolitul

activ care inhiba agregarea plachetara, acesta trebuie sa fie metabolizat pe calea

izoenzimelor citocromului P450. Metabolitul activ al clopidgrelului inhiba selectiv

legarea adenozin-difosfatului (ADP) de receptorul sau plachetar P2Y12 si, prin

aceasta, activarea complexului glicoproteinei GP IIb/IIIa mediata de ADP;

consecutiv, agregarea plachetara este inhibata. Datorita legarii ireversibile,

trombocitele expuse la clopidogrel sunt afectate pentru tot restul duratei lor de viata

(aproximativ 7-10 zile), iar refacerea functiei trombocitare normale corespunde

duratei turn-over-ului trombocitar [RCP, 2013].

In vitro si in vivo, clopidogrelul este metabolizat pe doua cai metabolice

principale: una mediata de esteraze care determina hidroliza la derivatul sau

carboxilic inactiv (85% dintre metabolitii circulanti) si una mediata de izoenzimele

citocromului P450. Pe calea izoenzimelor hepatice, clopidogrelul este convertit mai

intai la metabolitul intermediar 2-oxo-clopidogrel. Metabolizarea consecutiva a

intermediarului 2-oxo-clopidogrel determina formarea metabolitului activ, un derivat

tiolic al clopidogrelului. In vitro, aceasta cale metabolica este mediata de CYP3A4,

CYP2C19, CYP1A2 si CYP2B6 [Kazui et. al., 2010].

Conform RCP “deoarece metabolitul activ se formeaza pe calea izoenzimelor

citocromului P450, dintre care o parte sunt polimorfe sau sunt inhibate de alte

medicamente, inhibarea plachetara nu este adecvata la toti pacientii”. Desi este

adevarat ca s-a demonstrat existenta unei legaturi intre polimorfismul genetic al

izoenzimei CYP2C19, formarea metabolitului activ si evenimentele adverse clinice,

corelarea dintre genotipul individual si raspunsul la tratament reuseste sa explice

Pagina|2

numai 12% din variabilitatea totala cu privire la eficacitatea tratamentului cu

clopidogrel [Krishna et. al., 2012; Nissen et. al., 2011; Shuldiner et. al., 2009].

Pana in prezent au fost in realitate formulate mai multe ipoteze cu privire la

motivele pentru care unii pacienti nu raspund sau au un raspuns diminuat la

tratamentul cu clopidogrel, insa impactul individual sau chiar si cumulat al factorilor

citati nu explica pe deplin faptul ca aproximativ 20% pana la 40% din populatia

tratata prezinta un raspuns suboptimal la regimul standard de terapie [Zhang et. al.,

2014]. Factorii cel mai adesea incriminati sunt variabilitatea intra- si inter-individuala

cu privire la formarea metabolitului activ, rezistenta generala la xenobiotice si

reactivitatea trombocitara individuala pre-tratament [Gurbel et. al., 2003; Müller et.

al., 2003].

In aceasta lucrare va fi descrisa pe larg farmacocinetica clopidogrelului

parinte, determinata prin metode HPLC-MS/MS de ultima generatie si se vor corela

informatiile obtinute cu date in vitro privind cedarea sa din forma farmaceutica,

printr-un model IVIVC biorelevant. De asemenea, pornind de la observatii privind

capacitatea unuia dintre principalii metaboliti circulanti ai clopidogrelului sa

reformeze medicamentul parinte in vitro prin trans-esterificare [Silvestro et. al.,

2010], se va studia posibila relevanta in vivo a unei reactii similare. Pentru elucidarea

acestui aspect au fost realizate teste in vivo cu administrare directa a metabolitului

clopidogrel acil glucuronid (metabolit capabil sa genereze in vitro cantitati

semnificative de clopidogrel parinte) pe cale orala si intravenoasa intr-un model

animal relevant. Scopul a fost acela de a vedea daca in vivo este posibila o reactie de

trans-esterificare sau de hidroliza a metabolitului (prin actiunea beta-glucuronidazei

sau a esterazelor plasmatice) din care sa rezulte clopidogrel parinte. Cu acelasi scop

au fost realizate si teste pe voluntari umani sanatosi, in care s-a realizat administrarea

de clopidogrel in doza unica orala fie in conditii standard, fie urmata de un regim de

dozare cu carbune medicinal activat ce avea ca scop intreruperea circuitului entero-

hepatic. In acest studiu pe subiecti umani au fost recoltate atat probe de

farmacocinetica cat si de eliminare (clopidogrelul si principalii sai metaboliti

circulanti au fost cuantificati in probe de urina si materie fecala), pentru a elucida

daca acesti metaboliti sunt implicati sau nu intr-un circuit entero-hepatic si a

determina in cazul observarii unei asemenea reactii daca fractia reabsorbita este

clopidogrelul parinte sau o alta entitate derivata. O intelegere amanuntita a tuturor

proceselor metabolice ce pot contribui la expunerea totala la clopidogrel observata in

Pagina|3

om este fundamentala pentru identificarea tuturor surselor de variabilitate ce

influenteaza farmacocinetica sa. Datele de excretie determinate in acest studiu, cu

specificitate fata de entitatea derivata eliminata, au fost si ele analizate in contextul

informatiilor non-specifice existente in literatura cu privire la recircularea si

eliminarea derivatilor de clopidogrel (obtinute in studii de bilant de masa realizate cu

clopidogrel marcat cu C14 [Lins R., 1999]).

Dupa determinarea profilului farmacocinetic si de eliminare al clopidogrelului,

urmatorul scop important a fost acela de a caracteriza expunerea la metabolitii

importanti ai acestuia (atat cei importanti cantitativ (precum clopidogrel acid

carboxilic si clopidogrel acil glucuronid) cat si cei relevanti din punct de vedere al

bioactivarii (2-oxo-clopidogrel si metabolitul tiolic activ)). Aceasta lucrare descrie o

metodologie analitica complexa pentru determinarea in plasma a metabolitilor mai sus

mentionati si trateaza pe larg posibile surse de interferenta ce pot afecta cuantificarea

lor in plasma (coversii ex-vivo cauzate de paroxonazele sau esterezale plasmatice si

reactii de trans-esterificare ce pot avea loc in momentul procesarii probelor). Un

aspect important studiat a fost cel privind posibila influenta a anticoagulantului folosit

pentru recoltarea sangelui asupra cantitatilor de metaboliti determinati in probele de

PK. Fiind cunoscut faptul ca pentru anumite prodroguri cu grupari ester, pot avea loc

reactii de metabolizare ex vivo sub influenta esterazelor plasmatice [Billecke et. al.,

2000; Lindegardh et. al., 2006; Li et. al. 2005] si tinand cont de faptul ca in momentul

realizarii studiului era in mare voga teoria conform careia paroxonaza-1 (si nu

izoenzimele citocromului P450) ar fi fost principalul determinant al formarii

metabolitului activ [teorie enuntata de Bouman et. al. in 2011], s-au realizat teste

pentru determinarea consumului de substrat si identificarea eventualilor metaboliti

rezultati in urma incubarii ex-vivo a 2-oxo-clopidogrelului in fluide biologice

relevante (sange intreg, plasma si lizat eritrocitar).

De asemenea a fost dezvoltat si un model predictiv pentru testarea in vivo,

utilizand microzomi hepatici, a potentialelor interactiuni la nivel metabolic intre

clopidogrel / oxo-clopidogrel si alte medicamente administrate in mod uzual in

practica medicala concomitent cu clopidogrelul.

Pagina|4

PARTEA DE TEORIE GENERALA

Notiuni privind stadiul actual al cunoasterii cu privire la

medicamentul studiat

Partea generala a tezei de doctorat cuprinde trei capitole care trateaza aspecte

referitoare la progresele stiintifice deja rezultate din studii clinice si experimente cu

clopidogrel (sau metaboliti derivati) si identifica domeniile unde o cercetare mai

amanuntita este inca necesara.

In subcapitolul I au fost prezentate notiuni generale privind istoricul si rolul

actual al clopidogrelului in farmacoterapie, incepand cu aprobarea acestuia si

urmarind rezultatele studiilor clinice/ghiduri care au modelat indicatiile actuale,

posologia medicamentului si stabilirea terapiei duale clopidogrel-aspirina ca standard

in preventia evenimentelor aterotrombotice:

- CAPRIE [Clopidogrel versus Aspirin in Patients at Risk of Ischaemic

Events]

- CREDO [Clopidogrel for the Reduction of Events During Observation]

- “Ghidul privind Interventiile Coronariene Percutanate”, versiunea 2005,

publicat de comitetul reunit al ACC/AHA/SCAI [American College of

Cardiology/ American Heart Association/ Society for Cardiovascular

Angiography and Interventions].

Odata cu oficializarea rolului clopidogrelului in farmacoterapia de preventie

cardiovasculara a avut loc si o crestere semnificativa a expunerii populatiei la

tratament, lucru care a facut vizibila variabilitatea inter-individuala mare cu privire la

raspunsul terapeutic. S-au discutat, printre altele, si rezultatele urmatoarelor studii

clinice randomizate care au influentat modul in care intelegem variabilitatea

farmacodinamica a clopidogrelului:

- sub- studiului GIFT (Genotype Information and Functional Testing study)

subordonat GRAVITAS (Gauging Responsiveness with A VerifyNow

assay–Impact on Thrombosis And Safety), in care s-a studiat influenta

polimorfismului uninucleotidic al CYP2C19 asupra efectului

farmacodinamic.

Pagina|5

- studiul TRITON-TIMI 38 in care s-a studiat corelarea intre polimorfismul

ABCB1 (gena responsabila pentru activitatea transportorului de eflux P-

glicoproteina (Pgp), esentiala pentru absorbtia intestinala a

clopidogrelului), polimorfismul CYP2C19 si evenimentele cardiovasculare

intampinate de pacientii tratati cu clopidogrel.

In subcapitolul II s-au prezentat notiuni privind metabolismul clopidogrelului si

progresele facute de-a lungul timpului in vederea elucidarii farmacocineticii

compusului parinte si al metabolitilor sai, accentuand si aspectele ramase inca

neelucidate ce urmeaza sa fie tratate in capitolul experimental. In linii mari, discutia

se bazeaza pe considerentele prezentate in continuare:

- Desi Plavix (clopidogrel) a inceput sa fie utilizat inca din anul 1998,

detaliile cu privire la farmacocinetica compusului parinte si a metabolitului

sau cu activitate farmacologica au ramas necunoscute pentru o lunga

perioada de timp. La momentul respectiv, erau disponibile metode

analitice numai pentru cuantificarea metabolitului inactiv principal

circulant, clopidogrel acid carboxilic, care reprezinta aproximativ 85% din

bilantul compusilor derivati din clopidogrel circulanti in plasma. Desi util

ca marker de absorbtie, a fost recunoscut faptul ca relevanta studiilor

farmacocinetice conventionale bazate pe cuantificarea metabolitului

inactiv este limitata.

- Urmatoarea etapa importanta in intelegerea farmacocineticii si

metabolismului clopidogrelului a fost dezvoltarea de metode analitice cu

sensibilitate suficient de mare pentru detectia compusului parinte. Spre

deosebire de clopidogrel acid carboxilic pentru rezultate similare au fost

obtinute prin metode analitice diferite si de catre autori diferiti, in cazul

clopidogrelului parinte intre parametrii de farmacocinetica raportati de

cercetatori diferiti pentru aceeasi doza de 75 mg administrata exista o

diferenta substantial (de 6-7 ori ca ordin de marime). Studii mai

amanuntite efectuate de Silvestro et. al. au aratat ca metabolitul

clopidogrelul acil-glucuronid este responsabil pentru aceste diferente, prin

re-conversia la clopidogrel-parinte in conditii standard de recoltare si

manipulare a probelor biologice [Silvestro et. al., 2011]. Datorita tendintei

clopidogrelului acil glucuronid de reconversie la clopidogrel in vitro, unul

Pagina|6

dintre obiectivele cercetarii in cadrul acestei teze a fost acela de a evalua

daca un proces similar este posibil si in vivo prin trans-esterificare sau sub

actiunea glucuronidazei [subiect tratat in Capitolul III.3, unde sunt

prezentate si date complete de farmacocinetica si eliminare pentru

metabolitul conjugat].

- In anul 2004, grupul Taubert et al. a publicat prima lucrare privind

determinarea de clopidogrel metabolit tiolic in plasma, fara selectivitate

insa pentru izomerul activ al acestuia (forma H4). Cercetari mai

amanuntite realizate in vivo de care Lada et. al. si Furlong et. al. au

demonstrat ca in matrice biologice numai formele izomere H3 si H4 sunt

cuatificabile [Karazniewicz-Lada et. al., 2012; Furlog et. al., 2013].

- Impreuna cu progresele analitice realizate in ultimii ani, un mare efort a

fost de asemenea depus pentru a intelege mai bine calea de metabolizare a

clopidogrelului, cu accent pe identificarea de markeri care ar putea fi

asociati cu variabilitatea farmacodinamica individuala, prin

genotipare.Studiile au demonstrat ca CYP2C19 a contribuit substantial la

ambele etape de oxidare necesare pentru formarea de clopidogrel metabolit

activ si ca CYP3A4 a contribuit semnificativ la al doilea pas oxidativ,

astfel explicand impactul pe care polimorfismul genetic al CYP2C19 si co-

administrarea de inhibitori puternici ai CYP3A4 il au asupra

comportamentului farmacocinetic si farmacodinamic al clopidogrelului

[subiect trata mai pe larg in capitolul III.4].

- In timp ce pentru majoritatea metabolitilor clopidogrelului exista date

disponibile in literatura, foarte putine sunt cunoscute despre profilul

farmacocinetic al 2-oxo-clopidogrelului, intermediar indispensabil in

procesul de formare al metabolitului activ. Abia in anul 2015 a fost

publicat primul articol privind cuantificarea metabolitului in plasma

stabilizata cu antioxidant, recoltata de la 8 voluntari sanatosi, dupa

administarea de Plavix 75 mg in conditii post-prandiale [Li et. al., 2015].

Pana in prezent nu a fost insa publicat nici un studiu in care sa se

determine simultan 2-oxo-clopidogrelul si metabolitul activ forma H4

astfel incat sa se observe in mod comparativ cinetica acestora [lucru

realizat in cadrul acestui proiect de cercetare, rezultatele fiind prezentate in

capitolul III.1].

Pagina|7

In subcapitolul III se analizeaza:

- importanta si avantajele utilizarii unor medii de cedare continand agenti

tensioactivi fiziologici care sa simuleze cat mai fidel conditiile de la

nivelul gastric si respectiv intestinal in conditii pre- si postprandiale (asa

numitele medii “biorelevante”) fata de mediile de cedare compendiale.

- o serie de situatii de non‐corelare in vitro ‐ in vivo cauzate deindepartarea conditiilor experimentale de realitatea fiziologica aprocesului de dizolvare sau de tentativa de a corela un proces fizicireversibil precum dizolvarea cu parametrii farmacocineticicaracterizati prin ciclicitate (in cazul medicamentelor implicate incircuitenterohepatic).

- principiile de baza ale obtinerii de corelatii cantitative intre cinetica de

cedare in vitro si farmacocinetica in vivo.

PARTEA ORIGINALA EXPERIMENTALA

III.1 Teste de stabilitate ex-vivo

Fiind deja cunoscut faptul ca pentru anumite entitati chimice cu grupari ester, pot

avea loc reactii de metabolizare ex vivo sub influenta esterazelor plasmatice [Billecke

S., 2000; Lindegardh N., 2006; Li B. 2005] si in urma examinarii rezultatelor

publicate de Bouman et. al. in 2011 in care se descria faptul ca cea de a doua etapa

metabolica necesara formarii derivatului tiolic activ al clopidogrelului (conversia 2-

oxo-clopidogrelului la metabolitul farmacologic activ), nu necesita implicarea

izoenzimelor citocromului CYP450 ci se produce prin scindarea hidrolitica catalizata

de esterazele PON1 si PON3 a inelului γ-tiobutirolactonic al 2-oxo-clopidogrelului, s-

a cercetat posibilitatea ca sub actiunea parxonazelor prezente in sange, 2-oxo-

clopidogrelul aflat in probele proaspat recoltate sa fie convertit la metabolitul activ

sau un izomer al acestuia in conditii de prelucrare standard. Deoarece aceasta reactie

ar avea loc inainte de separarea si congelarea probelor de plasma, rezultatele obtinute

la determinarea cantitativa a metabolitului activ ar fi supraestimate, prejudiciul fiind

unul nedetectabil prin analiza repetata (ISR – incurred sample reanalysis) impusa prin

normele actuale de validare bioanalitica. Prin urmare, pentru a evalua impactul unei

asemenea reactii, am conceput un experiment pentru determinarea cineticii de

conversie a 2-oxo-clopidogrelului in fluide biologice relevante (singe proaspat

recoltat/plasma/lizat eritrocitar, fara adaos suplimentar de PON1 sau PON3).

Pagina|8

Probe de sange intreg proaspat au fost recoltate, in tuburi continand heparina ca

anticoagulant, de la un voluntar sanatos care nu a urmat vreodata tratament cu

clopidogrel si nu a primit in ultimele trei saptamani anterioare recoltarii alte

medicamente. Sangele proaspat obtinut de la voluntar a fost utilizat ca atare sau

pentru obtinerea unor probe de plasma heparinizata sau lizatul eritrocitar. Dupa

recoltare/procesare aceste fluide biologice blank au fost incubate la 37° Celsius pentru

a reveni la o temperatura fiziologic relevant, tratate cu solutii de 2-oxo-clopidogrel in

DMSO, si lasate in continuare la incubat la 37° Celsius.

In figura de mai sunt prezentate cromatograme reprezentative obtinute prin

determinarea simultana a analitilor clopidogrel, 2-oxo-clopidogrel, clopidogrel acid

carboxilic si clopidogrel metabolit tiolic activ intr-o proba de incubare cu substrat 2-

oxo-clopidogrel (Figura III.3):

Figura III.3 Cromatograma obtinuta dupa incubarea 2-oxo-clopidogrelului (Sample 17.3)

In timp ce metabolitul activ tiolic (formula stanga) nu a fost identificat in probe, s-a

cuantificat un peak foarte apropiat, despre care credem ca reprezinta forma endo- a

metabolitului activ (formula dreapta).

Clopidogrel metabolit activ (H4) Clopidogrel „endo”-metabolit

Pagina|9

Rezultatele sugereaza ca sub actiunea paroxonezei-1, in mediu ex-vivo are loc o

conversie a 2-oxo-clopidogrelului la un metabolit cu o structura si un timp de retentie

foarte similare cu cele ale metabolitului activ. Acest lucru poate sa explice de ce unii

autori au raportat ca aceasta estereaza poate fi responsabila de formarea metabolitului

activ atat in mediu hepatic cat si in ser [Bouman H.J., 2011], rezultate care nu au fost

reproduse pana in prezent. Este posibil ca metodele analitice folosite sa nu fi fost

suficient de selective pentru a departaja cei doi analiti.

Concentratiile obtinute pentru acest endo-metabolit par sa scada pe masura ce creste

durata de incubare, sugerand ca metabolitul nu este unul foarte stabil (Figura III.4).

Figura III.4 Concentratiile de endo-metabolit cuantificate in plasma dupa incubarea a 5 concentratii

diferite de 2-oxo-clopidogrel in probe de sange intreg (proaspat recoltat) timp de 60 de minute

Acelasi lucru este valabil si pentru 2-oxo-clopidogrel, metabolit al carui concentratii

in probele de plasma obtinute dupa centrifugarea sangelui intreg incubat scad

considerabil dupa 15 minute, sugerand ca pe langa conversia la endo-metabolit mai au

loc si reactii de degradare dependente de timp (Figura III.5).

Figura III.5 Curbele de epuizare a substratului obtinute pentru 5 concentratii diferite de 2-oxo-

clopidogrel, dupa incubarea metabolitului in probe de sange intreg proaspat recoltat timp de 60 de

minute

0

100

200

300

400

500

600

700

15 30 45 60 Con

cen

trat

ie 2

-oxo

-clo

pid

ogre

l (n

g/m

L)

Timp de incubare (minute)

Recuperarea 2-oxo-clopidogrelului in plasma dupa centrifugarea probelor de sange intreg in care a fost incubat

10 000 ng/ml

5 000 ng/ml

2 000 ng/ml

1 000 ng/ml

500 ng/ml

0

100

200

300

400

500

15 30 45 60

Con

cent

rati

e en

d0-

met

abol

it (

ng/

mL

)

Timp de incubare (minute)

Concentratiile de "endo-metabolit"in plasma dupa centrifugarea probelor de sange intreg in care a fost incubat

2-oxo-clopidogrel

10 000 ng/ml

5 000 ng/ml

2 000 ng/ml

1 000 ng/ml

500 ng/ml

Pagina|10

Comparand concentratiile de 2-oxo-clopidogrel obtinute in urma analizei

concentratului eritrocitar si a plasmei provenind din aceleasi probe de sange intreg, a

fost dedus si faptul ca 2-oxo-clopidogrelul nu patrunde in eritrocite.

Degradare substantiala si dependenta de timp a 2-oxo-clopidogrelului in sange sub

actiunea PON-1 sugereaza faptul ca rezultatele obtinute in urma determinarii acestui

metabolit in probe de farmacocinetica pot sa difere in functie de anticoagulantul

utilizat la recoltarea lor (avand in vedere ca EDTA, de exemplu, este inhibitor PON1

in timp ce heparina nu este).

Avand in vedere faptul ca 2-oxo-clopidogrelul este un intermediar cheie in formarea

metabolitului tiolic activ, cuantificarea sa corecta in plasma poate ajuta la elucidarea

anumitor aspecte mecanistice cu privire la cele doua etape oxidative.

Teste privind influenta anticoagulantului utilizat la recoltari asupra rezultatelor

farmacocinetice

Avand in vedere reactiile de metabolizare/degradare suferite de 2-oxo-clopidogrel sub

actiunea paroxonazelor, a fost realizat un experiment prin care sa se determine daca

recoltarea probelor de farmacocinetica in tuburi ce contin EDTA (inhibitor PON) sau

EDTA + DTT (1,4-ditio-DL-treitol; utilizat pentru a opri oxidarea sulfului din inelul

tiolactonic al 2-oxo-clopidogrelului la sulfoxid sau sulfona), aduce beneficii in plus

din punct de vedere al stabilitatii metabolitului comparativ cu heparina. Patru

voluntari sanatosi fara istoric de tratament cu clopidogrel, au primit o doza unica de

Plavix 75 mg in conditii de repaus alimentar. Le-au fost recoltate cu ajutorul unor

seringi probe de sange la 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa administrare. Imediat dupa

recoltare, fiecare proba a fost divizata in 3 parti alicote care au fost puse in monovete

continand heparina, EDTA si respective EDTA+DTT si mentinute la temperatura

camerei timp de 15 minute (conditii standard de lucru) inainte de centrifugare. Apoi

probele au fost prelucrate la rece si analizate pentru cuantificarea 2-oxo-

clopidogrelului.

Curbele individuale de concentratie plasmatica a 2-oxo-clopidogrelului versus timp,

obtinute de la cei patru voluntari dupa divizarea acelorasi probe in trei tuburi cu

anticoagulanti diferiti, sunt prezentate in Figura III.6 de mai jos; curbele medii

obtinute pentru EDTA versus Heparina si EDTA + DTT versus Heparina sunt

prezentate in figurile III.7 si respectiv III.8.

Pagina|11

Figura III.6 Curbe farmacocinetice de 2-oxo-clopidogrel individuale, prezentate in functie de

anticoagulantul utilizat

p <0.05

p < 0.05

p < 0.05

0.00

3.00

6.00

9.00

12.00

15.00

18.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxo

-clo

pid

ogre

l (ng

/mL

)

Timp (ore)

Concentratii de oxo-clopidogrel determinate in probele plasate in tuburi cu EDTA sau heparina

EDTA

Heparina

Figura III.7 Curbe farmacocinetice medii de 2-oxo-clopidogrel prezentate in mod comparativ pentru

EDTA versus Heparina (prezentare lineara insotita de deviatii standard si marcarea punctelor in care

testul T a demonstrat diferente semnificative statistic)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxo

-clo

pid

ogre

l (n

g/m

L)

Timp (ore)

Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu Heparina

Sub 1

Sub 2

Sub 3

Sub 4

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxo

-clo

pid

ogre

l (n

g/m

L)

Timp (ore)

Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu EDTA

Sub 1

Sub 2

Sub 3

Sub 4

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxo

-clo

pid

ogre

l (n

g/m

L)

Timp (ore)

Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu EDTA + DTT

Sub 1

Sub 2

Sub 3

Sub 4

Pagina|12

p < 0.05

p <0.05

p < 0.05

p < 0.05

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxo

-clo

pid

ogre

l (ng

/mL

)

Timp ore)

Concentratii de oxo-clopidogrel determinate in probele plasate in tuburi cu EDTA+DTT sau heparina

EDTA + DTT

Heparina

Figura III.8 Curbe farmacocinetice medii de 2-oxo-clopidogrel prezentate in mod comparativ pentru

EDTA+DTT versus Heparina (prezentare lineara insotita de deviatii standart si marcarea punctelor in

care testul T a demonstrat diferente semnificative statistic)

Verificarea semnificatiei statistice a diferentelor obtinute s-a realizat prin aplicarea

testului T bilateral pentru esantioane dependente. In cazul EDTA versus Heparina,

testul a demonstrat diferente semnificative (valori p < 0.05) la trei timpi de recoltare

iar pentru EDTA + DTT versus heparina la patru timpi de recoltare. Este de remarcat

faptul ca in ambele cazuri a fost observata o diferenta importanta in proba

corespunzatoare concentratiei plasmatice maxime, astfel incat se poate spune ca

parametrii farmacocinetici principali (atat Cmax cat si ASC0-t) difera semnificativ in

functie de anticoagulantul ales pentru recoltarea probelor.

Intre EDTA simplu si EDTA+DTT nu s-au obtinut rezultate semnificativ diferite.

A fost demonstrat faptul ca anticoagulantul utilizat poate avea impact asupra

stabilitatii oxo-clopidogrelului (si foarte posibil si asupra altor entitati chimice care

contin inel lactonic) prin inhibarea sau inlesnirea activitatii paroxonazelor.

Efectul observat a atins nivelul de semnificatie statistica chiar si in contextul unor

conditii rapide de procesare (timpul scurs intre recoltarea probelor de sange intreg si

inghetarea plasmei dupa centrifugare a fost mentinut sub 30 minute).

Deoarece sunt cunoscute doua tipuri polimorfe ale PON1 (Q192R si L55M) iar datele

de literatura sugereaza ca polimorfismul acesta are efect asupra eficientei hidrolitice a

enzimei [Adkins, 1993; Billecke, 2000], este de asteptat ca degradarea in probe a 2-

Pagina|13

oxo-clopidogrelului sa fie una specifica subiectului si astfel o potentiala sursa de

eroare in ipotezele formulate cu privire la variabilitatea inter-subiecti a parametrilor

farmacocinetici.

Aplicarea intr-un studiu de biodisponibilitate realizat pe voluntari sanatosi a

unor metode analitice de ultima generatie pentru determinarea in probe de

farmacocinetica a clopidogrelului si metabolitilor sai

In pofida utilizarii pe scara larga a clopidogrelului si a faptului ca s-au realizat

proiecte extensive de cercetare in vederea elucidarii anumitor aspecte particulare ce

tin de biodisponibilitatea lui si rata de formare a metabolitului sau activ, sursele

variabilitatii intra-individuale substantiale observate atat farmacocinetic cat si

farmacodinamic raman inca incomplet descrise. Lipsa unor raspunsuri care sa

convinga intreaga comunitate stiintifica se datoreaza partial faptului ca pasii critici

implicati in bioactivarea pro-medicamentului nu au putut fi descrisi integral din cauza

multiplelor provocari intampinate la cuantificarea sa si a metabolitilor sai (atat din

punct de vedere al conditiilor de procesare ale probelor cat si al metodelor analitice

folosite). Metoda analitica dezvoltata pentru determinarea clopidogrelului si a

metabolitilor inactivi este una optimizata pentru a evita procesul de reconversie

clopidogrel acil glucuronid – clopidogrel (temperatura autosamplerului pe durata de

achizitie a probelor este setata la -5ºC si se utilizeaza acetonitril ca agent de

precipitare al probelor in loc de solutii ce contin metanol) iar determinarea

metabolitului activ are loc separat (metoda 2, unde procedura optima de extractie

implica utilizarea metanolului ca agent de precipitare iar faza mobila contine la randul

ei metanol). De asemenea, conditiile de recoltare si prelucrare a probelor la centrul

clinic au fost optimizate pentru stabilizarea 2-oxo-clopidogrelului atat termic cat si

prin inhibarea paroxonazelor. Prin faptul ca se cuantifica toti metabolitii principali

(fie ca sunt sau nu legati de activitatea farmacologica a medicamentului) in probe

proveniti de la aceiasi subiecti, se faciliteaza o evaluare mai complexa a

metabolismului clopidogrelului si a stabilitatii metabolitilor sai in probele de plasma,

fiind posibila identificarea eventualelor surse de degradare si a produsilor rezultati in

urma unor asemenea reactii prin reanaliza de probe reale (ISR, incurred samples

reanalysis). Probele analizate provin dintr-un studiu pilot de bioechivalenta in care au

fost inrolati 12 voluntari sanatosi si s-au administrat comprimate de 75 mg

clopidogrel in doza unica. Cu 11 ore inainte de administrarea medicatiei, subiectii au

Pagina|14

luat o cina standardizata si apoi au postit pana la 5 ore dupa dozare. De asemenea,

consumul de lichide a fost restrictionat timp de o ora inainte si o ora dupa dozare, iar

volumul de apa plata la temperatura camerei utilizat pentru administrarea medicatiei a

fost unul standardizat (240 mL).

Probe de sange a cate 5 mL fiecare au fost recoltate in tuburi racite continand

K2EDTA ca anticoagulant + DTT (1,4-ditio-DL-treitol; utilizat pentru a opri oxidarea

sulfului din inelul tiolactonic al 2-oxo-clopidogrelului): inainte de administrare si la

0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 16.0, 24.0 si 36.0 ore

post doza. Tuburile de recoltare au fost imediat plasate pe baie de apa cu gheata si

mentinute acolo maxim 15 minute pana in momentul centrifugarii.

Centrifugarea s-a efectuat la o temperatura nominala de 4 °C si o forta de 1500-g,

timp de 10 minute. Dupa scoaterea din centrifuga, plasma rezultata a fost divizata in

doua parti alicote de aproximativ 1 mL fiecare, in tuburi de polietilena pre-racite.

Tuburile continand cele doua parti alicote au fost puse in doua congelatoare de -70 °C

pana cand au fost expediate catre laboratorul analytic. Pe durata transportului,

temperatura probelor a fost monitorizata si inregistrata cu ajutorul unui dispozitiv

electronic iar la printarea raportului de temperaturi s-a confirmat faptul ca probele nu

au fost expuse la temperaturi mai ridicate de -70 °C.

- Inainte de inceperea procesarii in laborator, probele au fost dezghetate pe baie

de apa si gheata.

- Dupa dezghetare acestea au fost vortexate timp de 3 minute pentru

omogenizare.

Extractie clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil

glucuronid:

- Esantioane de cate 0.2 mL plasma mentinuta pe baie de apa cu gheata au fost

transferate in tuburi de propilena pre-racite si tratate cu solutie-mix de

standard intern racit (0.02 mL continand d3-clopidogrel hidrogensulfat

100ng/mL, 13C6-clopidogrel acid carboxilic 800ng/mL, acil-β-D-glucuronid si

oxoclopidogrel-d3 100 ng/mL in acetonitril) - aceste probe au fost utilizate

doar pentru cuantificarea clopidogrelului si a celor trei metaboliti inactivi:

clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil glucuronid;

- S-au adaugat 0.4 mL acetonitril rece (ca agent de precipitare) in fiecare tub;

Pagina|15

- Probele au fost mixate timp de 2 minute apoi centrifugate timp de 5 minute la

o viteza de 10 000 rpm si o temperatura nominala de 4°C;

- Volume de cate 0.4 mL supernatant limpede din fiecare proba au fost

transferate in tuburi de autosampler din polipropilena pre-racite si apoi

introduse in autosamplerul prevazut cu criotermostat ce a mentinut o

temperatura de - 5 °C (+/- 1 °C) pe intreaga durata de achizitie a probelor.

Extractie metabolit activ:

- Deoarece pentru metabolitul activ procedura optima de extractie implica

utilizarea de metanol, in vederea cuantificarii sale s-au luat in lucru alte

esantione de plasma provenind din aceleasi probe farmacocinetice dezghetate,

vortexate si apoi mentinute pe baie de apa cu gheata. Volume de cate 0.2 mL

plasma au fost transferate in tuburi de propilena pre-racite si tratate cu solutie-

mix de standard intern racit (0.02 mL d3-metabolit activ 40 ng/mL in acid

formic 0.1% si apa cu metanol (40/60 v/v);

- S-au adaugat 0.35 mL solutie racita de metanol + 0.1% acid formic in fiecare

tub, ca agent de precipitare;

- Probele au fost mixate timp de 2 minute apoi centrifugate timp de 5 minute la

o viteza de 10 000 rpm si o temperatura nominala de 4°C;

- Volume de cate 0.2 mL supernatant limpede din fiecare proba au fost

transferate in tuburi de autosampler din polipropilena pre-racite si apoi

introduse in autosamplerul prevazut cu criotermostat ce a mentinut o

temperatura de - 5 °C (+/- 1 °C) pe intreaga durata de achizitie a probelor.

Metode analitice:

1. Clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil

glucuronid:

Sistemul LC au fost compus din pompe binare seria 1200SL produse de Agilent

(Santa Clara, CA, USA) si autosampler de tip CTC PAL HTS (Zwingen, Elvetia),

configurate cu ajutorul unui sistem Aria LX-2 (Cohesive Technologies, Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) pentru a opera doua coloane analitice in

paralel.

Separarea s-a realizat pe coloane cromatografice in mecanism de faza inversa de tip

Ascentis RP-Amide 10 cm x 2.1mm, 2.7 µm (Supelco, Bellefonte, PA, USA).

Volumul de elutie a fost de 0.2 mL/min cu o faza mobila compusa din apa cu 0.1%

Pagina|16

acid formic (A) si acetonitril (B) in gradient. Volumul de injectie a fost de 10 µL si

probele au fost termostatate in autosampler la o temperaura de - 5 °C (+/- 1 °C)

utilizand un criotermostat extern model Lauda RM 6 (Lauda-Königshofen,

Germania). Spectrele de masa si cromatogramele au fost achizitionate cu

spectrometrul de masa de tip trapa ionica liniara model API 4000 QTRAP produs de

Applied Biosystems-Sciex (Toronto, ON, Canada). Acesta a fost operat in modul de

ionizare pozitiv, cu o interfata de tip electrospray (Applied Biosystems

Turboionspray). Ca si gaz de coliziune pentru fragmentarea ionilor moleculari si

pentru gaz-cortina a fost folosit azotul de inaltă puritate, iar pentru nebulizare si

vaporizarea eluentului in sursa a fost utilizat aer comprimat. Datele au fost obtinute si

procesate cu soft-ul producatorului, Analyst 1.4.2.

Pentru determinarea cantitativa s-a folosit modul de scanare MRM (multiple reaction

monitoring), urmarind tranzitiile:

- 322.0/184.0, clopidogrel // 327.0/189.0, d3-clopidogrel

- 308.0/95.0, clopidogrel acid carboxilic // 314.1/158.1, clopidogrel a. carboxilic 13C6

- 338.1/155.1, oxoclopidogrel // 341.1/158.0, d3-oxoclopidogrel

- 484.3/198.1, clopidogrel acil glucuronid

Particularitati: ionul molecular corespunzator la 35Cl (322.2) a fost ales ca si ion

precursor pentru clopidogrel in metoda MRM folosita pentru cuantificare, in timp ce

in cazul standardului intern d3-clopidogrel au fost preferati ionii ce contin izotopii 37Cl in pofida faptului ca sunt mai putin intensi, in sesul obtinerii unei mai bune

selectivitati; in cazul metabolitului acid a fost preferat fragmentul cu m/z 95 mai putin

intens deoarece concentratiile plasmatice mari (comparativ cu clopidogrelul) puteau

conduce la o saturare a detectorului in cazul masurarii fragmentelor principale

[cromatograme reprezentative in Figurile A I.2 – A I.4] .

Metoda analitica a fost validata in ceea ce priveste eficienta de extractie, efectul de

matrice, linearitatea, limita inferioara de cuantificare, specificitate, selectivitate,

acuratete, precizie si stabilitatea probelor. Reanalizarea sistemica a 5% din probele de

studiu a demonstrat ca peste 2/3 din probele reanalizate se incadreze in + 20 % fata de

rezultatele initiale, demonstrand astfel reproductibilitatea metodei si stabilitatea

compusilor in conditiile optimizate de procesare.

Curbe de calibrare cu 8 puncte au fost preparate in intervalele de concentratii 0.01 -

100 ng/mL pentru clopidogrel si oxoclopidogrel si 1 - 10000 ng/mL pentru

clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic. In fiecare secventa analitica

Pagina|17

a fost analizata o curba de calibrare si trei randuri de probe pentru controlul calitatii

(QC-uri preparate la patru concentratii diferite din intervalul acoperit de calibrare).

2. Metabolit activ:

Sistemul LC au fost compus din pompe binare serila 1200SL produse de Agilent

(Santa Clara, CA, USA) si autosampler de tip CTC PAL HTS (Zwingen, Elvetia),

configurate cu ajutorul unui sistem Aria LX-2 (Cohesive Technologies, Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) pentru a opera doua coloane analitice in

paralel. Separarea s-a realizat pe coloane cromatografice in mecanism de faza inversa

de tip Ascentis RP-Amide 10 cm x 2.1mm, 2.7 µm (Supelco, Bellefonte, PA, USA).

Volumul de elutie a fost de 0.25 mL/min cu o faza mobila compusa din apa cu

metanol si 0.1% acid formic (65/35 v/v) - A si apa cu metanol si 0.1% acid formic

(90/10 v/v) – B si un program de gradient intercalat (100:0, 0:100, 0:100, 100:0,

100:0). Volumul de injectie a fost de 40 µL si probele au fost termostatate in

autosampler la o temperaura de - 5 °C (+/- 1 °C) utilizand un criotermostat extern

model Lauda RM 6 (Lauda-Königshofen, Germania). Spectrele de masa si

cromatogramele au fost achizitionate cu spectrometrul de masa de tip triplu cuadrupol

model API 4000 produs de Applied Biosystems-Sciex (Toronto, ON, Canada). Acesta

a fost operat in modul de ionizare pozitiv, cu o interfata de tip electrospray (Applied

Biosystems Turboionspray). Ca si gaz de coliziune pentru fragmentarea ionilor

moleculari si pentru gaz-cortina a fost folosit azotul de inaltă puritate, iar pentru

nebulizare si vaporizarea eluentului in sursa a fost utilizat aer comprimat. Datele au

fost obtinute si procesate cu soft-ul producatorului, Analyst 1.4.2.

Pentru determinarea cantitativa s-a folosit modul de scanare MRM (multiple reaction

monitoring), urmarind tranzitiile:

- 356.1/212.2, metabolitul activ de clopidogrel // 361.1/217.1, standard intern deuterat

Metoda analitica a fost validata in ceea ce priveste eficienta de extractie, efectul de

matrice, linearitatea, limita inferioara de cuantificare, specificitate, selectivitate,

acuratete, precizie si stabilitatea probelor. Reanalizarea sistemica a 5% din probele de

studiu a demonstrat ca peste 2/3 din probele reanalizate se incadreze in + 20 % fata de

rezultatele initiale, demonstrand astfel reproductibilitatea metodei si stabilitatea

compusului. Curbe de calibrare cu 8 puncte au fost preparate in intervalele de

concentratii 0.1 - 1000 ng/mL. In fiecare secventa analitica a fost analizata o curba de

calibrare si trei randuri de probe pentru controlul calitatii (QC-uri preparate la patru

concentratii diferite din intervalul acoperit de calibrare).

Pagina|18

A I.1 Cromatograma reprezentativa a unui punct din curba de calibrare in care sunt prezentati suprapus cei 7 analiti si timpii de retentie asociati

Pagina|19

A I.2 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de clopidogrel

Pagina|20

A I.3 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de d3-clopidogrel

Pagina|21

A I.4 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de clopidogrel acid carboxilic

Pagina|22

A I.5 Metabolitactiv(coloanastanga)sistandardintern(coloanadreapta)inCalibrare0(blank–randsuperior)siCalibrare1(LLOQ–randinferior)

Pagina|23

A I.6 Metabolitactiv(coloanastanga)sistandardintern(coloanadreapta)inCalibrare8(ULOQ–randsuperior)sioprobadinstudiu(randinferior)

Pagina|24

Metoda statistica:

Estimarea parametrior de farmacocinetica a fost realizata prin analiza non-compartimentala,

utilizand programul SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA), astfel:

- concentratia plasmatica maxima (Cmax) si timpul la care aceasta s-a produs, raportat la

momentul administrarii (Tmax) sunt parametrii obtinuti direct din profilele plasmatice

individuale, fara interpolare

- constanta de eliminare (ke) a fost calculata in baza regresiei lineare obtinuta din

concentratiile terminale ale profilului concentratie versus timp, utilizand metoda celor

mai mici patrate

- timpul de injumatatire a fost calculate dupa formula 0.693/ke

- aria de sub curba pana la ultima concentratie cuantificabila (ASC0−t) a fost calculata

utilizand metoda trapezoidala, conform formulei Σ[(Cn-1 + Cn) × (tn – tn-1)/2], unde Cn-1

si Cn reprezinta concentratiile plasmatice obtinute la timpii de recoltare consecutivi tn-1

si tn (astfel obtinand aria unui trapez); astfel, ASC0-t reprezinta suma ariilor tuturor

trapezelor ce pot fi calculate pe valori de concentratie mai mari decat 0;

In figurile de mai jos [III.9, III.10] sunt prezentate curbele medii obtinute pentru clopidogrel si

metabolitii sai (acid carboxilic, acil glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ) dupa

cuantificarea lor in aceleasi probe de plasma, provenite de la 12 voluntari sanatosi:

Figura III.9 Profilele farmacocinetice medii de clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, clopidogrel acil

glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ obtinute dupa administrarea de clopidogrel (n=12 voluntari,

doza=75 mg, conditii pre-prandiale) - prezentare lineara

Pagina|25

Figura III.10 Profilele farmacocinetice medii de clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, clopidogrel acil

glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ obtinute dupa administrarea de clopidogrel (n=12 voluntari,

doza=75 mg, conditii pre-prandiale) - prezentare ln-lineara

Pentra a facilita interpretarea rezultatelor obtinute, parametrii farmacocinetici estimati pentru

clopidogrel si metabolitii sai sunt tabelati mai jos [Figura cu tabele III.11] in functie de

procesul metabolic prin care se formeaza.

Clopidogrel

Medie Cmax

(ng/ml) Medie ASC0-t

(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)

Mediana t1/2 (h)

1.236 1.956 0.75 4

Esteraze CYP450

Clopidogrel acid carboxilic Oxoclopidgrel

Medie Cmax



Mediana t1/2 (h)

Medie Cmax



Mediana t1/2 (h)

3075 9892 0.5 7 18.936 34.818 0.5 9.6

UDP-glucuroniltransferaza Clopidogrel acil glucuronid Metabolit activ (H4) Medie Cmax



Mediana t1/2 (h)

Medie Cmax



Mediana t1/2 (h)

459 1573 1 5 13.215 16.832 0.75 0.5

Figura cu tabele III.11 Reprezentare a parametrilor farmacocinetici medii estimati pentru clopidogrel si

metabolitii sai (N=12) in cadrul schemei de metabolizare a compusului parinte [datele din cele doua tabele unde

se prezinta contributiile individuale ale izoenzimelor CYP la cele doua etape oxidative necesare pentru formarea

metabolitului activ sunt preluate din Kazui et. al., 2010]

CYP 1A2 2B6 2C19

% contributie 35.8 19.4 44.9

CYP 2B6 2C9 2C19 3A4 CYP450

% contributie 32.9 6.76 20.6 39.8

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000

0 2 4 6 8 10 12

Con

cen

trat

ie n

g/m

L t

ran

sfor

mat

a in

sca

ra ln

Timp (h)

Clopidogrel si metabolitii sai determinati in probe de plasma provenite de la 12 voluntari sanatosi, dupa administrarea de Plavix 75 mg (scara ln-lineara)

Acil glucuronid (ng/mL) Acid carboxilic (ng/mL) Clopidogrel (ng/mL)

Oxoclopidogrel (ng/mL) Metabolit activ H4 (ng/mL)

Pagina|26

Dupa cum era de asteptat deja, cele mai mici concentratii plasmatice determinate in acest

studiu au fost pentru pro-medicamentul clopidogrel parinte, puternic hidrolizat (deoarece

acesta devine disponibil pentru hidroliza mediata de carboxilesteraze de indata ce este eliberat

din forma farmaceutica la nivel gastric - CES2 iar cantitatea ce nu se pierde pre-sistemic si ar

putea fi, dupa absorbtie, metabolizata oxidativ de izoenzimele CYP450 din mediul hepatic

este din nou supusa partial hidrolizei sub actiunea carboxilesterazei hepatice - CES1) si in mai

mica masura metabolizat. Din punct de vedere al autoritatilor de reglementare a produselor

medicamentoase, in pofida lipsei unei activitati intrinseci a clopidogrelului parinte si a faptului

ca nu exisa o corelatie intre concentratiile plasmatice ale acestuia si cele ale metabolitului

activ, demonstrarea bioechivalentei intre formularile farmaceutice orale ce contin clopidogrel

trebuie sa fie bazata pe profilele farmacocinetice de medicament parinte [Ghid FDA cu prvire

la Clopidogrel bisulfat, revizuit August 2008; Ghid EMA cu privire la bioechivalenta

produselor orale cu eliberare imediata, 2010] si nu pe cele de metabolit activ. Aceasta cerinta

se bazeaza, dupa cum este explicat in ghidul EMA, pe intelegerea notiunii ca Cmax-ul

medicamentului parinte este un parametru farmacocinetic cu o sensibilitate mai mare pentru

detectia diferentelor in rata de absorbtie cauzate de formulare decat Cmax-ul unui metabolit. In

cazul clopidogrelului, aceasta observatie este intr-adevar foarte pertinenta avand in vedere

complexitatea proceselor metabolice implicate in activarea medicamentului parinte,

concentratiile de metabolit activ rezultate fiind dependente in mod principal de factori ce tin

de subiectul tratat si nu de profilul de cedare al formularii administrate. Din moment ce

suntem interesati doar de soarta moleculei cedate de ce nu am gasi deci o solutie biorelevanta

pentru testarea in vitro macar a prezumtiei de bioechivalenta? Conform cadrului legislativ

actual studiile pivotale pe oameni nu pot fi inlocuite deoarece clopidogrelul face parte din

clasa BCS (Biopharmaceutical Classification System) II, pentru care in prezent nu se admite

demonstrarea echivalentei prin conceptul de “biowaiver” (bioderogare, prin care se admite

lipsa datelor de bioechivalenta obtinute prin administrarea la subiecti umani daca se pot

demonstra caracteristici similare de cedare in vitro pentru doua formulari farmaceutice cu

eliberare nemodificata destinate pentru administrare orala). Insa ceea ce putem avea in vedere

pentru reducerea costurilor de dezvoltare a unui generic este sa inlocuim studiile pilot multi-

comparative (o cerinta a pietei, avand in vedere faptul ca majoritatea departamentelor de

dezvoltare farmaceutica pleaca la drum cu mai multe propuneri de formulari) cu teste

relevante in vitro. In capitolul III.2 al acestei lucrari se va discuta pe larg acest subiect si se va

propune o metoda noua de triere a formularilor de clopidogrel, adaptata profilului

biofarmaceutic si farmacocinetic al medicamentului parinte (studiu IVIVC).

Pagina|27

Urmand calea metabolica inactiva a clopidogrelului, primul si cel mai semnificativ metabolit

din punct de vedere cantitativ este clopidogrelul acid carboxilic, format prin hidroliza

enzimatica mediata de carboxilesteraze [Zhu H. et. al., 2013], reprezentand aproximativ 85%

dintr-o doza de medicament parinte administrata [SmPC Plavix, 2013]. Pentru acest metabolit

expunerea totala inregistrata este de 5000 de ori mai mare decat cea a medicamentului parinte,

demonstrand ca aceasta cale metabolica este una cu potential mare de conversie.

La randul sau, clopidogrelul acid carboxilic este in proportii semnificative (aproximativ 16%

pe baza datelor privind ASC obtinute in studiu) convertit la clopidogrel acil glucuronid, sub

actiunea UDP-glucuroniltransferazei. Data fiind instabilitatea demonstrata de acest metabolit

ex-vivo si faptul ca prin trans-esterificare acesta duce la reformarea clopidogrelui parinte

[Silvestro et. al., 2011], prezinta un deosebit interes investigarea potentialelor cai metabolice

prin care acest proces ar putea sa aiba loc si in vivo. Acest subiect va fi aprofundat in capitolul

III.3 al acestei lucrari unde sunt descrise doua studii pe care le-am realizat pe animale de

laborator si respectiv oameni, pentru a deslusi soarta metabolica a acestui compus conjugat.

Prin metabolism hepatic oxidativ, pasul intermediar in procesul de activare al clopidogrelului

implica formarea tiolactonei 2-oxo-clopidogrel, mediata de izoenzimele CYP2C19, 1A2 si

2B6. Acest metabolit se regaseste in plasma umana in concentratii de 18 ori mai mari decat

clopidogrelul si de doua ori mai mari decat metabolitul activ H4 (pe baza datelor privind ASC

obtinute in studiu). Intrucat se cunoaste deja faptul ca rata de formare a metabolitului activ

este limitata si variabila, o intrebare foarte importanta este care dintre cele doua etape

oxidative mediate de izoenzimele CYP este saturabila, incetinind astfel global formarea de

metabolit activ? Judecand dupa rezultatele obtinute: Cmax similar dar ASC de doua ori mai

mare pentru oxoclopidogrel comparativ cu H4 si timp de injumatatire de 19 ori mai

indelungat, se pare ca cea de a doua etapa oxidativa este cea critica. In timp ce intr-adevar

CYP2C19 contribuie substantial la ambele etape oxidative, este important de observat faptul

ca totusi principala izoenzima responsabila pentru conversia oxoclopidogrelului la H4 activ

este CYP3A4. Prin urmare ar trebui reflectat asupra tendintei generale de a incrimina

poliformismul CYP2C19 ca principala sursa a variabilitatii farmacologice a clopidogrelului

fara a lua in calcul si faptul ca vasta majoritate a pacientilor primeste concomitent si alte

tratamente de fond iar aproximativ 50% din xenobioticele existente pot fi considerate

substraturi competitoare pentru CYP 3A4. In capitolul III.4 al acestei lucrari se va discuta pe

larg acest subiect si se vor prezenta comparativ rezultatele unor studii de interactiune in vitro

intre clopidogrel sau 2-oxo-clopidogrel si diferite medicamente ce sunt substraturi

competitoare sau inhibitori CYP 2C19 sau 3A4.

Pagina|28

III.2 Dezvoltarea unui model IVIVC biorelevant ce poate fi aplicat pentru predictia

biodisponibilitatii formularilor generice de clopidogrel

Din punct de vedere al sistemului biofarmaceutic de clasificare a medicamentelor,

clopidogrelul bisulfat se incadreaza in Clasa II, demonstrand solubilitate scazuta si

permeabilitate ridicata [Lassoued et. al., 2011]. Tinand cont de acest aspect, ne putem astepta

ca una din cauzele importante de variabilitate a biodisponibilitatii sale sa fie chiar cinetica de

cedare partiala si oscilanta in functie de conditiile de pH intalnite pe parcursul tractului gastro-

intestinal. Pana in prezent acest aspect nu a fost inca studiat cu rigurozitate. Obiectivele

principale ale acestui proiect experimental sunt evaluarea cineticii de dizolvare a

clopidogrelului in medii gastrice si intestinale ce simuleaza conditii pre- si post-prandiale,

determinarea farmacocineticii clopidogrelului dupa administrarea lui la voluntari sanatosi in

conditii pre- si post-prandiale utilizand metode analitice HPLC-MS/MS de ultima ora si

incercarea de a dezvolta un model predictiv de corelare intre datele in vitro si in vivo. De

asemenea, pe baza corelarilor realizate, s-a dorit identificarea testului de dizolvare biorelevant

care s-ar preta cel mai bine ca surogat la testarea biodisponibilitatii in vivo.

Componenta in vivo

Tabel III-5. Caracteristici demografice ale subiectilor din studiul de biodisponibilitate pre-

prandiala

Numar de subiecti Inrolati: 28

Dozati: 27

Sexul subiectilor dozati

(si procentul raportat la populatia studiului)

Femei: 15 (55.56%)

Barbati: 12 (44.44%)

Rasa subiectilor dozati


Caucaziana: 27

(100.00%)

Varsta subiectilor dozati

(medie, (± deviatie standard)) 34.92 (± 14.80)

Indicele de masa corporala al subiectilor dozati


Datele demografice medii ale subiectilor inrolati in studiul cu administrare in conditii post-

prandiale standardizate sunt prezentate in tabelul urmator:

Pagina|29

Tabel III-6. Caracteristici demografice ale subiectilor din studiul de biodisponibilitate post-

prandiala

Numar de subiecti Inrolati: 12

Dozati: 12

Sexul subiectilor dozati


Femei: 7 (58.33%)

Barbati: 5 (41.67%)

Rasa subiectilor dozati

si procentul raportat la populatia studiului)

Caucaziana: 12

(100.00%)

Varsta subiectilor dozati

(medie, (± deviatie standard)) 37.25 (±15.04)

Indicele de masa corporala al subiectilor dozati


Conform ghidului FDA cu privire la studiile de biodisponibilitate pentru identificarea

efectului mancarii [FDA-CDER, 2002], administrarea unei forme farmaceutice pentru uz oral

in conditii post-prandiale poate duce la modificari ale biodisponibilitatii unei substante active

prin diferite mecanisme incluzand: intarzieri in golirea gastrica, stimularea secretiei de acizi

biliari, modificari de pH pe parcursul tractului gastro-intestinal, intensificarea circulatiei

sangvine in compartimentul abdominal sau interactiuni de natura fizica/chimica cu o forma

farmaceutica sau substanta activa.

Pentru a garanta faptul ca administrarea se realizeaza in conditii post-prandiale standardizate,

voluntarii au petrecut 15 ore sub supraveghere la Centrul Clinic inainte de dozare.

Confirmarea faptului ca acestia nu au adus asupra lor alimente sau bauturi interzise s-a realizat

printr-un control amanuntit al bagajelor inainte de internare. Incepand cu momentul internarii

si pana la recoltarea ultimei probe de sange pentru determinari farmacocinetice voluntarii au

avut o dieta standardizata din punct de vedere al continutului meselor si al orarului acestora.

Cu 11 ore inainte de administrarea medicatiei, subiectii au luat o cina standardizata;

urmatoarea masa a fost micul dejun lipidic servit inainte de administrarea medicatiei, urmand

ca mai apoi sa li se impuna post pana la 5 ore dupa dozare.

In conformitate cu “Ghidul cu privire la Investigarea Biochivalentei” aplicabil local

[CPMP/EWP/ QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **], cu exact 30 minute inainte de administrarea

Pagina|30

medicatiei de studiu, voluntarilor le-a fost oferit un mic dejun cu continut ridicat de calorii si

lipide, avand urmatoarea compozitie standard:

Tabel III.7 Mic dejun standardizat oferit cu 30 minute inainte de dozare in studiul de

biodisponibilitate post-prandiala

Aliment Kilocalorii Proteine

(g)

Lipide

(g)

Carbohidrati

(g)

1 felie de paine (aprox. 25 g) 58.75 2.125 0.25 12

2 oua fierte 150 15 10 0

unt, 10 g 74.7 0 8.3 0

1 felie bacon (25 g) 90.5 5.62 7.5 0.13

cartofi prajiti, 125 g 401.23 6.25 23.75 40.62

lapte integral, 250 ml 156.25 8.125 8.75 11.25

TOTAL 931.43 37.12

(= 148.48 Kcal)

58.55

(=526.95 Kcal)

64

(=256 kcal)

Continut caloric relativ

(% din numarul total de Kcal adus de clasa

de nutrienti)

15.94 56.57 27.48

Subiectii au consumat intregul continut al mesei standardizate in decurs de 20 – 25 minute de

la servirea acesteia iar medicatia de studiu a fost administrata la 5 – 10 minute dupa

consumarea meniului.

Componenta in vitro

Testele de cedare in vitro au fost realizate pe un sistem de dizolvare DT 800 (produs de

Erweka GmbH, Germania) folosind aparatul 2 (agitator cu palete) la 50 rotatii pe minut.

Pentru studierea cineticii de cedare a clopidogrelului, a fost utilizat un set de patru medii

biorelevante reprezentative: mediul gastric simulat pre-prandial (FaSSGF - Fasted State

Simulated Gastric Fluid), mediul gastric simulat post-prandial (FeSSGF - Fed State Simulated

Gastric Fluid), mediul intestinal simulat pre-prandial (FaSSIF - Fasted State Simulated

Intestinal Fluid) si mediul intestinal simulat post-prandial (FeSSIF - Fed State Simulated

Intestinal Fluid). Au fost de asemenea realizate teste de dizolvare si in mediile compendiale ce

simuleaza fluidul gastric (SGF – Simulated Gastric Fluid) si intestinal (SIF– Simulated

Intestinal Fluid) [USP 32, 2009].

Pagina|31

Tabel III-8. Compozitia mediilor de dizolvare gastrice compendiale si biorelevante

Compus SGF FaSSGF FeSSGF

Cloruradesodiu 2.0g 34,2mM 237,02mM

Pepsina 3,2g 0,1g ‐

Acidacetic ‐ ‐ 17,12mM

Acetatdesodiu ‐ ‐ 29,75mM

Lapte/Tampon ‐ ‐ 1:1

Taurocolatdesodiu ‐ 80µM ‐

Lecitina ‐ 20µM ‐

Acidclorhidric 7ml q.s.adpH1,6 q.s.adpH5

Apa(q.s.ad) 1L 1L 1L

pH 1.2 1.6 5.0

Tensiunedesuprafata(mN/m) 70 42.6 52.3±0.3

Osmolaritate(mOsm/kg) 120.7±2.5 400±10

Capacitateadetamponare

(mmol/L/ΔpH)

25

Volumdedizolvare(mL) 1000 500 500

Tabel III-9. Compozitia mediilor de dizolvare gastrice compendiale si biorelevante

Compus SIF FaSSIF FeSSIF

Fosfatdesodiumonobazic 6.8g 3.438g ‐

Cloruradesodiu ‐ 6.186g 11.874g

Acidacetic ‐ ‐ 8.65g

Hidroxiddesodiu(pelete) ‐ ‐ 4.04g

Pancreatina 10g ‐ ‐

Taurocolatdesodiu ‐ 3mM 15mM

Lecitina ‐ 0.75mM 3.75mM

Hidroxiddesodiu q.s.adpH6.8 q.s.adpH6.5 q.s.adpH5.0

Apa(q.s.ad) 1L 1L 1L

pH 6.8 6.5 5.0

Tensiunedesuprafata(mN/m) 54 48

Pagina|32

Compus SIF FaSSIF FeSSIF

Osmolaritate(mOsm/kg) 270±10 670

Capacitateadetamponare

(mmol/L/ΔpH)

12 72

Volumdedizolvare(mL) 1000 500 1000

Toate mediile de dizolvare au fost preparate conform literaturii de specialitate [Dressman et.

al., 1998; Jantratid et. al., 2008; Vertzoni et. al., 2010]. Experimentele au fost realizate in

triplicat.

Pentru compararea curbelor de dizolvare pentru clopidogrel in diferitele medii testate a fost

utilizat factorul de similaritate (f2), conform formulei:

descrisa in Appendixul I al Ghidul cu privire la Investigarea Biochivalentei publicat de

Agentia Europeana a Medicametului [CPMP/EWP/ QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **]. Usoara

modificare adusa este aceea ca in loc de a compara doua formulari diferite (R=referinta si

T=test) se compra aceeasi formulare referinta in doua medii de dizolvare diferite (R=mediul

de dizolvare de referinta, T=mediul de dizolvare comparat), termenii utilizati in aceasta

formula devenind astfel: n - numarul de timpi de evaluare; R(t) - procentul mediu de substanta

dizolvata in mediul referinta la “t” timp dupa inceperea studiului si T(t) - procentul mediu de

substanta dizolvata in mediul de comparatie la “t” timp dupa inceperea studiului.

Comparatiile privind gradul total de dizolvare au luat in calcul parametrul Arie de Sub

Curba (ASC), estimat utilizand metoda trapezoidala.

Modele predictive in silico

Au fost realizate simulari computerizate pentru estimarea ratei si gradului de absorbtie

regionala, utilizand modelul ACAT (Advanced Compartmental Absorption and Transit Model

= Model Compartimental Avansat de determinare a Absorbtiei si Tranzitului), asociat

versiunii 8.0 a programului GastroPlus™ (dezvoltat de Simulations-Plus Inc.; Lancaster, CA,

USA). In specificatiile modelului, tractul gastrointestinal apare divizat in noua compartimente

consecutive descrise ca stomac, duoden, jejun (format din doua compartimente distincte),

Pagina|33

ileon (format din trei compartimente distincte), cecum si colon ascendant; pe langa acest

factor de fragmentare unde este luat in calcul pH-ul specific fiecarui compartiment, modelul

mai tine cont si de efluxul intestinal al medicamentului si metabolism [Tubic et. al., 2006].

Au fost rulate simulari diferite pentru modul pre-prandial si post-prandial.

Datele de farmacocinetica si constantele de transfer inserate in model sunt cele ce s-au obtinut

pe cale experimentala in cadrul studiilor in vivo descrise anterior.

Corelarea punct cu punct a datelor experimentale obtinute in vivo si in vitro (corelare de tip A)

a fost realizata cu ajutorul modulului IVIVC Plus ModuleTM integrat in programul

GastroPlus™.

Pentru estimarea fractiei absorbite (FRA) necesara corelarii, a fost utilizata o abordare de

deconvolutie bazata pe modelul Loo-Riegleman. Fractia de medicament absorbita la fiecare

timp de evaluare a fost reprezentata grafic versus procentul corespunzator de medicament

dizolvat la timpul respectiv iar apoi s-a aplicat o analiza bazata pe constructia unei regresii

lineare pentru a evalua corelarea obtinuta.

Rezultatele testelor de dizolvare in mediu gastric nu sunt prezentate in acest rezumat

(pot fi studiate in capitolul integral) deoarece s-a demonstrate faptul ca sunt irelevante din

punct de vedere fiziologic si nu se coreleaza cu datele obtinute in-vivo.

Dizolvarea a fost incompleta atat in mediul intestinal pre-prandial (FaSSIF) cat si in

mediul intestinal simulat post-prandial (FeSSIF), date reprezentate in Figura III.12.

Clopidogrel release in simulated interstinal media

0 50 1000

50

100

FaSSIF

FeSSIF

SIF

Time (min)

% R

elea

sed

Figura III.12 Dizolvarea in vitro a clopidogrelului in medii compendiale simuland conditiile

intestinale (SIF) si in medii biorelevante intestinale ce simuleaza conditiile pre-prandiale si post-

prandiale

Pagina|34

Desi adaosul sarurilor biliare a crescut solubilitatea clopidogrelului prin intermediul

micelelor, asa cum se poate observa prin compararea mediului compendial SIF cu cel FaSSIF,

cedarea in mediu intestinal a ramas in continuare modesta (doar 60% in decurs de 2 ore).

Cantitatea de substanta activa eliberata in mediu simulat post-prandial a fost semnificativ mai

mare (80% cedare in decurs de 2 ore), permintand astfel sa concluzionam ca si in mediu

intestinal se aplica acelasi principiu de corelare invers proportionala intre solubilitate si pH.

Diferenta dintre curbele de dizolvare SIF si FeSSIF, deja vizibila pe grafic, a fost pusa

in perspectiva prin calcularea factorului de similaritate (unde valoarea calculata pentru f2 a fost

26.1) si a ratiei ASC FeSSIF/SIF (2.56).

Cunoscut fiind faptul ca absorbtia clopidogrelului are loc aproape exclusiv in mediu

intestinal [Lins, 1999; Müller et. al., 2003], este de asteptat ca aceste diferente de cedare

observate in vitro sa aiba impact asupra absorbtiei in vivo si astfel biodisponibilitatea

clopidogrelului dupa administrarea in conditii post-prandiale sa fie mai mare decat cea in

conditii pre-prandiale. Rezultatele obtinute in mediile ce simuleaza conditii intestinale indica

faptul ca solubilitatea clopidogrelului este strans corelata cu pH-ul mediului, avand loc o

dizolvare completa si rapida la pH 1.2 - 1.6 in contrast cu o marcata tendinta spre precipitare

la pH-urile mai bazice ce se regasesc in mediul intestinal (6.5 - 6.8).

Rezultatele sunt in concordanta cu datele de biodisponibilitate publicate de

FDA in dosarul NDA (New Drug Application), document in care se descrie evaluarea in studii

clinice de eficienta terapeutica a interactiuniunilor de tip medicament-mancare pentru

produsul farmaceutic original Plavix 75 mg. Totodata, rezultatele sunt in perfecta concordanta

cu curba de solubilitate versus pH generata in silico pentru clopidogrel utilizand programul

GastroPlusTM (profil prezentat in Figura III.13).

Figura III.13 Profil de solubilitate versus pH pentru clopidogrel, generat in programul

GastroPlusTM

Pagina|35

Stabilitatea clopidogrelului a fost testata in intervale de cate 48 ore pentru toate

mediile de dizolvare utilizate in studiul in vitro. Degradarea clopidogrelului nu a depasit

pragul de 2% din cantitatea initiala in medii intestinale.

Simularea absorbtiei regionale in diversele compartimente ale tractului

gastrointestinal, realizata cu ajutorul modelului ACAT, a indicat faptul ca absorbtia are loc

majoritar in intestinul subtire si in colon, iar in stomac aceasta este neglijabila (simulare

prezentata mai jos in Figura III.14).

Figura III.14 Simularea distributiei regionale a absorbtiei pentru clopidogrel, pe parcursul

tractului gastrointestinal

Aceste predictii demonstreaza faptul ca fractia de clopidogrel dizolvata in mediu

gastric nu este si absorbita in acest compartiment. Urmand acest rationament, devine clar

faptul ca dizolvarea completa a clopidogrelului in mediu gastric ar putea duce implicit la o

biodisponibilitate crescuta doar daca aceasta cantitate ar putea ramane dizolvata pe intreagul

parcurs catre compartimentul gastrointestinal unde se realizeaza absorbtia sistemica. Datele

prezentate anterior au aratat insa faptul ca fractia de clopidogrel eliberata in mediu stomacal

este ulterior supusa unei tendinte de a precipita in compartimentele unde fluidele intestinale au

un pH mai ridicat. Este posibil ca acest efect de precipitare observat sa fi fost chiar usor

subestimat in vitro, acolo unde solubilitatea intestinala a atins punctul de saturatie chiar si in

conditii volumetrice si de agitare ideale. Daca luam in considerare si faptul ca volumul

fiziologic normal al fluidelor intestinale este estimat la aproximativ 80 mL [Mudie et. al.,

2014] dupa ce un om bea 240 mL de apa (cazul aplicabil in cadrul studiilor in care au fost

evaluate biodisponibilitatea orala pre- si post-prandiala) iar volumul mediilor de dizolvare

utilizate in vitro este de 500 sau 1000 mL (in functie de tipul de fluid simulat), devine clar

Pagina|36

faptul ca atingerea punctului de saturatie si ulterior precipitarea clopidogrelului eliberat la

nivel stomacal sunt inevitabile. Se poate deci spune ca ideea dezvoltarii unui model IVIVC ce

ia in calcul ca date in vitro rezultatele testelor de dizolvare obtinute in mediu gastric este pur si

simplu nerealista.

0 5 10 150

1000

2000

3000

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (p

g/m

L)

0 5 10 150

5000

10000

15000

20000

Subj 1Subj 2Subj 3Subj 4Subj 5Subj 6Subj 7Subj 8Subj 9Subj 10Subj 11Subj 12Subj 13Subj 14Subj 15Subj 16Subj 17

Subj 19Subj 18

Subj 20Subj 21Subj 22Subj 23Subj 24

Subj 26Subj 27

Subj 25

Time (h)

Co

nce

ntr

atio

n (

pg

/mL

)

Figura III.15 Profilele farmacocinetice medii si individuale obtinute dupa administrarea de clopidogrel

(n=27 voluntari, doza=75 mg, conditii pre-prandiale)

Coeficientul de variatie intra-individuala estimat prin modelul ANOVA, aplicat pe seturi

replicate de date privind Cmax transformate logaritmic anterior rularii testului statistic, a fost

mai mare de 30%, permitand astfel sa concluzionam faptul ca clopidogrelul poate fi clasificat

ca produs medicamentos foarte variabil. Modelul ANOVA utilizat a luat in calcul tratamentul,

perioada de administrare, si interactiunea subiect-tratament ca efecte fixe.

0 5 10 15 20 250

2000

4000

6000

8000

10000

Time (h)

Co

nc

en

tra

tio

n (

pg

/mL

)

0 5 10 150

5000

10000

Subj 1Subj 2Subj 3Subj 4Subj 5Subj 6Subj 7Subj 8Subj 9Subj 10Subj 11Subj 12

Time (h)

Co

nc

entr

atio

n (

pg

/mL

)

Figura III.16 Profilele farmacocinetice medii si individuale obtinute dupa administrarea de clopidogrel

(n=12 voluntari, doza=75 mg, conditii post-prandiale)

Pagina|37

Parametrii farmacocinetici principali determinati pentru clopidogrel dupa administrarea pre-

prandiala si post-prandiala sunt prezentati in tabelul III-10.

Tabelul III-10. Parametrii farmacocinetici principali in conditii pre- si post-prandiale

Pre-prandial (N=27)

Date medii ± deviatie standard

Post-prandial (N=12)

Date medii ± deviatie standard

Cmax (ng/mL) 1.71 ± 3.23 7.48 ± 1.34

ASC0-t (ng/mL x h) 2.99 ± 4.78 11.29 ± 3.0

AUC0-∞ (ng/mL x h) 3.09 ± 4.78 11.58 ± 3.38

Kel (1/h) 0.132 ± 0.063 0.071 ± 0.012

Conform datelor obtinute, administrarea clopidogrelului dupa masa ii creste atat rata

de absorbtie (Cmax) cat si gradul total de absorbtie (ASC), iar in acelasi timp reduce

variabilitatea inter-individuala.

Modelarea compartimentala a datelor medii a demonstrat, in pofida variabilitatii

crescute a datelor sursa, o potrivire buna cu solutiile bicompartimentale de modelare atat

pentru datele pre-prandiale (Figura III.17) cat si pentru cele post-prandiale (Figura III.18).

Figura III.17 Modelarea compartimentala a datelor medii de farmacocinetica obtinute in conditii pre-

prandiale; a. linear-linear, b. log-linear

Pagina|38

Figura III.18 Modelarea compartimentala a datelor medii de farmacocinetica obtinute in

conditii post-prandiale; a. linear-linear, b. log-linear

Prezentarea logaritmica a datelor arata faptul ca partea terminala a curbelor a putut fi bine

definita prin intermediul unei regresii lineare, permitand astfel estimarea corecta a constantei

de eliminare si utilizarea ulterioara a acesteia in calcule pentru a se determina fractia absorbita

(FRA). Constantele de transfer derivate din model sunt prezentate in Tabelul III-11.

Tabelul III-11. Constante de transfer in conditii pre- si post-prandiale, obtinute prin modelare

bicompartimentala

Parametru Unitate de

masura

Valoare

Pre-prandial Post-prandial

ke 1/h 1.09 1.31

k12 1/h 0.51 0.56

k21 1/h 0.19 0.13

ka 1/h 1.79 2.15

Unde:

ke = constanta ratei de eliminare de ordin I din compartimentul central;

ka = constanta ratei de absorbtie de ordin I;

k12 si k21 = constantele ratelor de transfer de ordin I dintre compartimentul central si

cel periferic.

Din moment ce farmacocinetica clopidogrelului a fost cel mai bine descrisa prin modele

bicompartimentale atat in conditii de repaus alimentar cat si dupa hranire, a fost utilizata o

Pagina|39

abordare de deconvolution bazata pe modelul Loo-Riegleman pentru estimarea fractiei

absorbite in vivo (FRA). Rezultatele (Tabelul III-12) au fost utilizate pentru dezvoltarea unei

corelatii punct-la-punct (de grad A) intre dizolvarea in vitro (FRD - fractia dizolvata) si

absorbtia in vivo (FRA).

Tabelul III-12. Fractiile dizolvate si absorbite luate in calcul pentru dezvoltarea modelului

IVIVC

Conditii pre-prandiale Conditii post-prandiale

FRA FRD (FaSSIF) FRD (SIF) FRA FRD (FeSSIF)

0.350 0.139 0.108 0.174 0.107

0.556 0.277 0.235 0.317 0.258

0.685 0.367 0.269 0.426 0.377

0.911 0.476 0.337 0.632 0.651

0.965 0.490 0.349 0.731 0.704

0.978 0.507 0.362 0.777 0.722

0.981 0.530 0.354 0.797 0.760

0.983 0.528 0.359 0.805 0.767

0.984 0.554 0.360 0.811 0.775

Corelatiile in medii intestinale biorelevante (FaSSIF si FeSSIF), s-au dovedit a fi

liniare (figurile III.19 si III.20). In ceea ce priveste administrarea post-prandiala, un aspect

remarcabil este faptul ca panta de corelatie liniara este foarte aproape de 1, ceea ce sugereaza

o suprapunere intre dizolvarea in vitro si absorbtia in vivo. Panta calculata pentru corelarea

pre-prandiala a fost mai mare decat unitatea (1.74), lucru care reflecta o supraestimare a

fractiei de medicament absorbit; aceasta limitare a fost cauzata de faptul ca nu au fost luat în

considerare in model date privind biodisponibilitatea absoluta (din cauza lipsei acestor date

din literatura de specialitate).

Datele de dizolvare obtinute in mediu compendial (SIF) au putut fi corelate doar

printr-o ecuatie exponentiala FRA/ FRD (Figura III.19). Corelarea non-lineara este cauzata de

solubilitatea scazuta a clopidogrelului in mediul de dizolvare. In absenta agentilor fiziologici

cu efect surfactant, mediul SIF prezinta o tendinta generala de subestimare a cineticii de

eliberare a medicamentelor bazice [Pahomi et. al., 2012].

Pagina|40

0.0 0.2 0.4 0.60.0

0.5

1.0

y=1.743x+0.086

r2=0.9902

FaSSIF

y=0.219e4.184x

r2=0.9944

SIF

FRD

FR

A

Figura III.19 IVIVC in mediu intestinal biorelevant (FaSSIF) si compendial (SIF) in conditii pre-

prandiale

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

0.5

1.0

y=0.9484x+0.068

r2=0.9912

FeSSIF

FRD

FR

A

Figura III.20 IVIVC in mediu intestinal biorelevant (FaSSIF) si compendial (SIF) in conditii post-

prandiale

Datele de farmacocinetica au aratat faptul ca in vivo expunerea sistemica la clopidogrel

este de 4 ori mai mare atunci cand administrarea se face in conditii post-prandiale. S-a aratat,

de asemenea, ca administrarea dupa o masa reduce variabilitatea intre subiecti in ceea ce

priveste atat rata (Cmax) cat si amploarea (ASC) absorbtiei.

S-au stabilit corelatii liniare intre datele reale de farmacocinetica obtinute in vivo si

datele in vitro de dizolvare în medii intestinale simulate care mimeaza conditiile fiziologice

pre-prandiale (FaSSIF) si post-prandiale (FeSSIF). Modelul IVIVC dezvoltat pentru conditiile

post-prandiale a relevat o similaritate remarcabila (panta de corelatie liniara foarte aproape de

1), demonstrand astfel validitatea corelatiei si faptul ca ecuatiile de regresie pot fi folosite

pentru estimarea profilurilor de absorbtie pe baza datelor de dizolvare in vitro. Modelele pot fi

folosite ca substitute pentru testarea biodisponibilitatii in vivo, fiind mult mai ieftine si mai

rapide decat realizarea unui studiu pilot de bioechivalenta ca instrument de screening initial

pentru formularile generice.

Pagina|41

Cresterea solubilitatii atunci cand administrarea medicamentului se realizeaza dupa o

masa este datorata atat faptului ca in mod fiziologic sunt prezente concentratii mai mari de

agenti tensio-activi cat si faptului ca nivelul pH-ului in compartimentele de absorbtie scade si

el in comparatie cu conditia de repaus alimentar. Aceasta crestere a solubilitatii duce la randul

ei la o reducere semnificativa privind variabilitatea absorbtiei. Puse in perspectiva, aceste date

confirma faptul ca solubilitatea scazuta a clopidogrelului in mediile biologice prezente la locul

de absorbtie reprezinta una din sursele importante de variabilitate ce afecteaza farmacocinetica

clopidogrelului.

III.3 Evaluarea cailor de metabolizare prin mecanisme de conjugare a clopidogrelului:

studii farmacocinetice pe soareci si subiecti umani sanatosi ce descriu absorbtia,

disponibilitatea si eliminarea clopidogrelului acil glucuronid

Datorita tendintei clopidogrelului acil glucuronid de reconversie la clopidogrel in vitro, unul

dintre obiectivele cercetarii a fost acela de a evalua daca un proces similar este posibil si in

vivo prin trans-esterificare sau sub actiunea glucuronidazei. Deoarece nu este disponibil un

standard de clopidogrel acil glucuronid potrivit pentru uz uman, a fost efectuat un studiu pe

animale. Am determinat farmacocinetica si metabolismul clopidogrelului acil glucuronid

dupa administrarea metabolitului la o rasa de soareci (C57BL) care, asemeni omului, dispune

de enzima lizozomala glucoronidaza in tesuturile din ficat, rinichi si tractul intestinal [Gad,

2007].

Un al doilea scop important al cercetarii este acela de a stabili daca clopidogrelul acil

glucuronid este implicat in circuite de reciclare enterohepatica si, daca da, de a caracteriza

procesul din punct de vedere cantitativ si calitativ (stiind ca hidroliza bacteriala este uneori

asociata procesului de recirculare, identificarea eventualului compus rezultat in urma unei

asemenea hidrolize prezinta un interes special). Investigatiile au presupus compararea datelor

farmacocinetice la om pentru clopidogrel si metabolitii clopidogrel acid carboxilic si

clopidogrel acil glucuronid, dupa administrarea unui comprimat de 75 mg de Plavix, cu sau

fara administrare ulterioara de carbune activ (regim conceput pentru a intrerupe ciclul

enterohepatic [Elomaa et. al., 2001; Wang et. al., 2014] fara a modifica absorbtia). Pentru o

intelegere mai amanuntita a caii metabolice clopidogrel - clopidogrel acid carboxilic -

clopidogrel acil glucuronid au fost colectate, in cadrul aceluiasi studiu de interactiune cu

carbunele activat, date privind principala lor cale de excretie (urina sau materie fecala).

Intrucat intreruperea ciclului enterohepatic prin efectul ligand al carbunelui activ asupra bilei

are ca rezultat si modificarea cineticii de excretie pentru un analit reciclat (excretia este

Pagina|42

accelerata prin captarea bilei), datele de excretie renala colectate pentru clopidogrel acil

glucuronid in prezenta si respectiv absenta carbunelui activat au fost coroborate cu

rezultatele PK inainte de a se emite o concluzie cu privire la implicarea metabolitului intr-un

proces de reciclare enterohepatica. Determinarea modului in care se excreta clopidogrelul

acil glucuronid (nemodificat/conjugat in continuare) se numara de asemenea printre

obiectivele studiului.

Studiu de farmacocinetica cu administrarea pe cale orala si intravenoasa a

clopidogrelului acil glucuronid la soareci

Toate procedurile utilizate au fost in concordanta cu standardele formulate in cea de a 8-a

editie a Ghidului privind ingrijirea si utilizarea animalelor de laborator (Academia Nationala

de Stiinte, Tipografia Academiei Nationale, Washington D.C.). Animalele de laborator

(C57BL/6 soareci, masculi, greutate 20 ± 4g, varsta 25 ± 1 zile) s-au nascut, au fost crescute si

ingrijite la Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie

Cantacuzino, situat in Bucuresti, Romania. Partea experimentala a avut loc in sectia de

farmacologie a Institutului National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica (ICCF)

situat in Bucuresti, Romania. Studiul a fost efectuat conform unui design paralel, pe un lot de

71 animale de laborator (5 pe fiecare timp de recoltare dupa fiecare mod de administrare, plus

6 animale tratate cu solutie salina normala, doar pentru a obtine plasma blank pentru

prepararea de probe analitice pentru controlul calitatii). Animalele au fost randomizate pe

brate de tratament si au primit, in conditii sterile, o doza de 200 µl de solutie proaspat

preparata de 1,25 mg/ml clopidogrel acil glucuronid in solutie salina normala, fie per os (prin

gavaj), fie intravenos (prin injectarea in vena caudala). Probele de sange (150 μl) au fost

colectate in tuburi continand K2EDTA, racite in prealabil, la 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa doza

orala sau la 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa administrarea intravenoasa.

Nu au fost identificate concentratii de clopidogrel parinte peste LLOQ-ul metodei analitice in

nici una dintre probele de plasma recoltate de la soareci, ceea ce ne face sa concluzionam ca,

fie concentratiile au fost mai mici de 0.01 ng/ml, fie, cel mai probabil, nu s-a format deloc

clopidogrel. In calitate de unici analiti detectati (dintre cei trei analiti determinati in plasma),

profilurile farmacocinetice medii ale clopidogrelului acil glucuronid si acid carboxilic,

obtinute dupa administrarea intravenoasa si orala de clopidogrel acil glucuronid la soareci,

sunt prezentate in Figura III.22, graficele A si B.

Pagina|43

Figura III.22 Metabolitii determinati in plasma, dupa administrarea de clopidogrel acil glucuronid intravenos (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp de recoltare) si oral (n = 30 paralel, 5 animale

pe fiecare timp de recoltare)

In Figura III.23 am prezentat prin suprapunere si pe scara ln-lineara, curbele farmacocinetice

medii pentru ambii metaboliti, dupa administrarea pe cale intravenoasa si orala:

Figura III.23 Curbe medii de clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic in plasma, dupa administrarea de clopidogrel acil glucuronid pe cale intravenoasa si orala la soareci (prezentare

suprapusa pe scala ln-lineara)

Parametrii farmacocinetici estimati pentru clopidogrel acil glucuronid si acid carboxilic de

clopidogrel dupa administrarea intravenoasa si orala de 200µl de solutie 1.25mg/ml

clopidogrel acil glucuronid la soareci:

Administrare intravenoasa (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp

de recoltare)

Administrare orala (n = 30, paralel, 5 animale pe fiecare timp

de recoltare) Cmax

[±SD] (ng/ml)

ASC0-t

[±SD] (ng*ora/ml)

Tmax

(ore)

Cmax

[±SD] (ng/ml)

ASC0-t

[±SD] (ng*ora/ml)

Tmax (ore)

Clopidogrel acil glucuronid

23454 [±1755]

15425 [±8645]

0.3 2280

[±331] 4586

[±807] 1.0

Pagina|44

Administrare intravenoasa (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp

de recoltare)

Administrare orala (n = 30, paralel, 5 animale pe fiecare timp

de recoltare) Cmax

[±SD] (ng/ml)

ASC0-t

[±SD] (ng*ora/ml)

Tmax

(ore)

Cmax

[±SD] (ng/ml)

ASC0-t

[±SD] (ng*ora/ml)

Tmax (ore)

Acid carboxilic de clopidogrel

18395 [±1382]

99265 [±4980]

6.0 45000

[± 5207] 93660

[±13806] 1.0

Raportul procentual al ariilor de sub curba determinate in intervalul de recoltare (0-8 ore) a

fost de 29.73% [ASC0-8 clopidogrel acil glucuronid x 100 / ASC0-8 clopidogrel acid

carboxilic], sugerand faptul ca clopidogrel acil glucuronid este supus unei hidrolize pre-

sistemice intense, ce duce la formarea clopidogrelului acid carboxilic si nu a clopidogrelului

parinte.

Dupa administrarea directa de clopidogrel acil glucuronid la soareci pe cale orala (gavaj) si

intravenos (vena caudala), analiza HPLC/MS-MS a probelor farmacocinetice recoltate post-

doza a aratat ca nu au loc reactii care sa duca la generarea de clopidogrel parinte. In timp ce

trans-esterificarea in vivo la clopidogrel nu a avut loc, hidroliza care duce la formarea de

clopidogrel acid carboxilic a fost cel mai important proces metabolic observat pentru

clopidogrel acil glucuronid.

Datele obtinute in urma administrarii orale au scos la iveala o metabolizare foarte rapida a

clopidogrelului acil glucuronid in primele 2 ore de la administrare, care a avut loc probabil in

tractul gastro-intestinal prin degradare chimica si/sau hidroliza enzimatica. Ratia procentuala

a ariilor de sub curba determinate dupa administrarea pe cale orala vs administrare iv,

estimata pentru metabolitul conjugat in intervalul de recoltare (0-8 ore) a fost de 29.73%.

In cazul caii intravenoase, deoarece metabolizarea a fost limitata doar la degradarea

sistemica a clopidogrelului acil glucuronid, rata conversiei la forma de acid carboxilic a fost

mai scazuta. Mai precis, datele obtinute cu administrarea orala au aratat ca atat clopidogrelul

acil glucuronid administrat, cat si clopidogrelul acid carboxilic format, au atins nivelele

plasmatice maximale simultan, la o ora dupa dozarea prin gavaj; pe de alta parte, dupa

injectarea intravenoasa in coada timpul scurs pana la atingerea nivelelor plasmatice maxime

pentru clopidogrel acid carboxilic a fost de 6 ore si concentratiile maxime atinse au fost de

2.5 ori mai scazute decat dupa doza orala. Totusi, expunerea totala la acidul carboxilic de

clopidogrel a fost aproape identica, indiferent de calea de administrare a clopidogrelului acil

glucuronid (raportul mediu al ariilor de sub curba i.v./p.o. a fost de 1.05), aratand astfel ca

conversia sistemica este si ea foarte semnificativa (asa cum era de asteptat, avand in vedere

Pagina|45

faptul ca fractiile lizozomale si microzomale ce contin beta-glucuronidaza si esteraze sunt

abundent raspandite in ser si organe, altele decat ficatul, in organismul soarecilor C57BL/6

[Peng et. al., 2013; Tegelstrom et. al. 1981; Lusis et. al., 1977]).

Studiu asupra excretiei si farmacocineticii clopidogrelului parinte, clopidogrelului acid

carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid, dupa administrarea orala a 75 mg

clopidogrel la om

Sase subiecti sanatosi, adulti, au fost inrolati si au incheiat studiul privind farmacocinetica si

excretia la om. Populatia studiului a constat din 3 barbati si 3 femei care nu erau gravide si

nu alaptau, cu varste cuprinse intre 18 si 51 de ani (varsta medie 32.17 ± 14.48).

Studiul s-a desfasurat la Spitalul Clinic al Ministerului Sanatatii din Republica Moldova,

situat in Chisinau. Protocolul studiului a fost revizuit si aprobat de un Comitet Etic

Institutional si toti cei 6 subiecti inrolati au fost informati cu privire la medicatia si

procedurile studiului si si-au dat consimtamantul pentru participarea la studiu. Investigatiile

clinice au fost facute cu respectarea principiilor din Declaratia de la Helsinki.

Medicatia administrata a constat intr-o doza orala unica din medicamentul referinta (Plavix

75 mg, achizitionat de pe piata), in fiecare perioada de studiu.

Design-ul a fost incrucisat: intr-una din perioadele studiului subiectii au primit doar

clopidogrel si in cealalta clopidogrel plus un regim ce consta in administrarea de 20 g

carbune activ suspendat in 240 ml de apa la 6, 12, 24, 36, 48 si 60 de ore de la administrarea

clopidogrelului. Probele de sange (4 ml) pentru cuantificarea clopidogrelului parinte,

clopidogrelului acid carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid in plasma au fost colectate

in tuburi racite in prealabil, continand K2EDTA ca anticoagulant, la 1, 2, 6, 9, 24, 36, 48 si

72 de ore de la administrarea dozei de clopidogrel.

In acelasi studiu a fost colectata urina in ambele perioade, pana la 72 de ore post-doza, in

timp ce materiile fecale au fost colectate pe aceeasi perioada de timp, dar numai atunci cand

clopidogrelul a fost administrat fara carbune activ (din experienta anterioara se crede ca

prezenta carbunelui in proba de scaun duce la rezultate ambigue).

Profilele de concentratie vs. timp pentru clopidogrel parinte, clopidogrel acil glucuronid si

clopidogrel acid carboxilic, obtinute de la subiecti umani dupa administrarea de clopidogrel

cu si fara carbune, sunt prezentate in Figura III.24.

Pagina|46

Figura III.24 Curbele farmacocinetice medii pentru cei trei analiti, dupa administrarea de clopidogrel

la subiecti umani (n = 6) cu si fara carbune (model display linear-linear la graficele 3-A, C, E si ln-

linear la graficele 3-B, D, F)

Pentru cei doi metaboliti, profilele sunt practic superpozabile, indiferent de administrarea de

carbune, in timp ce pentru clopidogrel nivelele circulante inregistrate pe parcursul fazei

terminale de eliminare au fost usor crescute cand a fost administrat si carbune. Analiza ASC

a scos la iveala faptul ca cresterea nu a fost semnificativa din punct de vedere statistic

0.000

0.250

0.500

0.750

1.000

0 12 24 36

Con

cent

rati

e de

clo

pido

grel

(ng

/mL

)

Timp (ore)

A. Curbe medii de Clopidogrel dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara

administrare ulterioara de carbune activat (linear-linear)

Fara carbune Cu carbune

0.000

0.001

0.010

0.100

1.000

0 12 24 36 Con

cent

rati

e de

clo

pido

grel

(ng

/mL

)

Timp (ore)

B. Curbe medii de Clopidogrel dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara

administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)


0

100

200

300

400

500

600

0 12 24 36

Clo

pido

grel

aci

l glu

curo

nid

(ng/

mL

)

Timp (ore)

C. Curbe medii de Clopidogrel acil glucuronid dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (linear-

linear)


0.0

0.1

1.0

10.0

100.0

1000.0

0 8 16 24

Clo

pido

grel

aci

d gl

ucur

onid

(ng

/mL

)

Timp (ore)

D. Curbe medii de Clopidogrel acil glucuronid dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om

cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)


0

600

1200

1800

2400

3000

3600

4200

0 12 24 36 48

Clo

pido

grel

aci

d ca

rbox

ilic

(ng/

mL

)

Timp (ore)

E. Curbe medii de Clopidogrel acid carboxilic dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (linear-

linear)


1

10

100

1000

10000

0 12 24 36 48

Clo

pido

grel

aci

d ca

rbox

ilic

(ng/

mL

)

Timp (ore)

F. Curbe medii de Clopidogrel acid carboxilic dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om

cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)


Pagina|47

(valoarea p data de testul ANOVA pentru efectul tratamentului a fost de 0.055, peste nivelul

de semnificatie de 0.05).

TABELUL III-14 Principalii parametrii farmacocinetici determinati pe voluntari umani (n =

6) pentru clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic si clopidogrel acil glucuronid dupa

administrarea orala de Plavix 75mg cu si fara administrare ulterioara de carbune activ (intr-

un studiu randomizat, dublu-incrucisat):

Parametru

Fara

carbune

(medie

geom.)

Cu

carbune

(medie

geom.

Raportul

carbune/

fara

carbune

(%)

Rezultatele ANOVA

pentru tratament

ca efect fix

(valoarea p, interpretare)

Clopidogrel Cmax [±DS]

(ng/ml)

0.700

[±0.402]

0.741

[±0,343]

105.939

% 7.51009E-01, N.S.

ASC0-t

[±DS]

(ng*ora/ml)

1.778

[±1.559]

2,396

[±0.982]

134.796

% 5.53473E-02, N.S.

Clopidogrel

acid

carboxilic

Cmax [±DS]

(ng/ml)

2735.808

[±587]

2589.044

[±729] 94.635% 6.34597E-01, N.S.

ASC0-t

[±DS]

(ng*ora/ml)

9599.435

[±4468]

10039.278

[±1460]

104.582

% 8.04498E-01, N.S.

Clopidogrel

acil

glucuronid

Cmax [±DS]

(ng/ml)

428.937

[±83]

419.236

[±74] 97.738% 6.53555E-01, N.S.

ASC0-t

[±DS]

(ng*ora/ml)

1372.074

[±673]

1513.754

[±591]

110.326

% 3.44311E-01, N.S.

Pentru clopidogrel parinte, timpul mediu de injumatatire (t½) a fost de 8.1 ore in conditii

standard de administrare si 10.6 ore cand a fost administrat si carbune; s-a constatat ca

aceasta diferenta nu este semnificativa din punct de vedere statistic (testul-T pentru

esantioane perechi aplicat a returnat o valoare de 0.082, peste nivelul de semnificatie de

0.05). Pentru clopidogrel acid carboxilic, t½ a fost de 7.8 ore pentru clopidogrel administrat

singur si 6.8 ore cand a fost administrat si carbune, in timp ce pentru clopidogrel acil

glucuronid acelasi t½ de 5.6 ore a fost estimat pentru ambele regimuri de administrare.

Pagina|48

Din moment ce concentratiile de clopidogrel au ramas practic nemodificate, indiferent daca

s-a administrat sau nu carbune, se poate spune ca programul de administrare pentru agentul

de captare al bilei a fost corect definit pentru a nu modifica absorbtia [Stass et. al., 2005;

Taft, 2009; AACT, 2005] si ca clopidogrelul (in sine) nu este implicat in niciun ciclu

enterohepatic (presupunand ca regenerarea clopidogrelului prin reciclare ar fi avut loc in

mod normal, intreruperea procesului ar fi rezultat in reducerea concentratiilor de medicament

in prezenta carbunelui).

Avand in vedere datele farmacocinetice obtinute pentru clopidogrel acil glucuronid, mai ales

referitoare la timpul de injumatatire (care a fost de 5.6 ore, indiferent de administrarea de

carbune) si rezultatele comparatiei intre profilele plasmatice ale metabolitului generate in

prezenta si absenta carbunelui activ (proportia cu/fara carbune de 0.98 pentru Cmax si 1.10

pentru ASC), se poate concluziona ca orice reciclare entero-hepatica a clopidogrelului acil

glucuronid care ar putea avea loc este nesemnificativa. Concluzia este intarita si de testele

statistice aplicate pentru compararea parametrilor farmacocinetici primari ai clopidogrel acil

glucuronid in cele doua conditii de administrare (testul ANOVA de verificare a termenului

“tratament” ca efect fix a returnat valori ale lui p peste nivelul de semnificatie statistica

(0.05) pentru datele Cmax si ASC0-t).

Date cantitative colectate in studiul asupra excretiei si farmacocineticii clopidogrelului

parinte, clopidogrelului acid carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid, dupa

administrarea orala a 75 mg clopidogrel la om

Am constatat ca aproximativ 15% dintr-o doza de clopidogrel administrata (calculata ca

raport micromolar) este recuperata in urina sub forma de analiti cuantificabili.

0

10

20

30

40

Urina Materie fecala



Clopidogrel Clopidogrel acil glucuronid

Clopidogrel acid carboxilic

Rec

uper

are

tota

la (

mic

roM

)

Recuperarea totala a analitilor din probe de urina si materie fecala

Figura III.25 Recuperarea totala de clopidogrel parinte, clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic din probele de urina si scaun pe parcursul a 72 h post-doza, dupa administrarea de

clopidogrel la subiecti umani (n = 6)

Pagina|49

Cei mai indelungati timpi de recuperare au fost pentru clopidogrel acid carboxilic (excretia

pe cale urinara continua in intervalul de recoltare de 60 pana la 72 de ore post-doza) si pentru

clopidogrel acil glucuronid (recuperat in urina pana la 60 de ore post-doza). Pentru

clopidogrel au fost identificate doar urme in urina (recuperare totala mult sub 0.001 microM)

pana la 36 de ore post-doza, in timp ce, asa cum era de asteptat, clopidogrelul neschimbat

care nu a fost absorbit la nivel intestinal a fost recuperat mai ales in fecale. Cantitatea de

analiti recuperata din probele de scaun a reprezentat doar 1.2% din doza administrata.

Presupunand ca datele sunt normal repartizate (ceea ce este greu de verificat pe numarul

actual de observatii), a fost folosit testul t unilateral pentru esantioane independente pentru

a compara datele referitoare la excretia urinara in intervalele de timp de 0-12 h, 12-24 h, 24-

36 h, 36-48 h, 48-60 h si 60-72 h, pentru cei trei analiti, dupa administrarea de clopidogrel cu

sau fara administrare ulterioara de carbune activ (vezi Figura III.26).

0

10

20

30

40

Cu carbune

Fara carbune

Cu carbune

Fara carbune

Cu carbune

Fara carbune

Clopidogrel Clopidogrel acil glucuronid

Clopidogrel acid carboxilic

0.00 0.00

18.18

31.35

4.25 4.27

Rec

uper

are

tota

la (

mic

roM

)

Recuperarea totala a analitilor in urina in prezenta si in abseta carbunelui medicinal activat

Figura III.26 Recuperarea totala de clopidogrel, clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic din probele de urina, dupa administrarea de clopidogrel la subiecti umani (n = 6) cu sau

fara carbune activ

S-a descoperit ca diferentele cu privire la cantitatile de analiti ce au fost recuperate in

conditiile cu si fara carbune pe parcursul seriei de intervale studiate nu au fost semnificative

din punct de vedere statistic (valorile p: pentru clopidogrel 0.231, pentru clopidogrel acid

carboxilic 0.488 si pentru clopidogrel acil glucuronid 0.181).

Recuperarea urinara pe intervale de colectare pentru clopidogrel acil glucuronid este

prezentata in Figura III.27 (graficul din stanga), in timp ce cantitatea de urina eliminata in

aceste intervale este descrisa in Figura III.27 (graficul din dreapta).

Pagina|50

Figura III.27 Recuperarea de clopidogrel acil glucuronid din urina (n = 6), expusa pe intervale de colectare (stanga) si cantitatea de urina excretata pe intervale de colectare (dreapta)

Nu a fost identificata nicio diferenta semnificativa din punct de vedere statistic in

recuperarea urinara a clopidogrelului acil glucuronid cu sau fara carbune carbune activat, in

niciunul din intervalele de colectare.

In urma analizei datelor acumulate, clopidogrel acil glucuronid poate fi caracterizat ca un

metabolit terminal al clopidogrelului, important din punct de vedere cantitativ dar incapabil

sa contribuie la regenerarea de compusi implicati in lantul metabolic ce duce la formarea

metabolitului activ. Totusi, nu poate fi exclus potentialul acilului glucuronid de a juca alte

roluri importante in activitatea clopidogrelului.

Dupa cuantificarea celor trei analiti in probe de scaun si insumarea cantitatilor recuperate s-a

constatat faptul ca reprezinta doar 1.2% din doza administrata, destul de putin comparativ cu

rezultatele studiului de bilant de masa, publicat anterior in literatura de specialitate [Lins et.

al., 1999], care a aratat o recuperare fecala cumulativa a radioactivitatii intre 35 si 57% dupa

o singura administrare de 75 mg de clopidogrel etichetat C14. Acest fapt este un puternic

indicator ca alti metaboliti (si/sau produse de degradare) inca necaracterizati sunt implicati in

acest proces de excretie prin materie fecala. Rezultatul este in concordanta cu Rezumatul

Caracteristicilor Produsului pentru Plavix, unde se afirma ca douazeci de metaboliti distincti

ai clopidogrelului au fost identificati in matrice biologice.

Datele cu privire la excretia urinara confirma ceea ce am presupus pe baza rezultatelor

farmacocinetice prezentate anterior, de la aceiasi subiecti, si anume ca derivatul acil

glucuronid nu este supus unei reciclari entero-hepatice majore, in cazul in care este supus

vreunei reciclari. Daca s-ar fi intamplat acest lucru, administrarea de carbune ar fi accelerat

excretia metabolitului si nu invers. De asemenea, nu exista dovezi ca vreunul dintre cei trei

analiti cuantificati este implicat in reciclarea entero-hepatica.

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

12 24 36 48 60 72

Clopidogrel acil glucuronid

Rec

uper

are

tota

la (

mic

roM

)

Cu carbune

Fara carbune

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

12 24 36 48 60 72

Volum de urina

mL

Cu carbune

Fara carbune

Pagina|51

In concluzie, in ciuda unei mari afinitati catre aceasta reactie observata mai ales in vitro, nu

s-au gasit dovezi care sa sugereze ca clopidogrel acil glucuronid ar putea fi reconvertit in

vivo la clopidogrel parinte prin trans-esterificare. Pe baza compararii profilelor

farmacocinetice obtinute dupa administrarea de clopidogrel singur si in prezenta carbunelui

activ, se poate afirma ca este destul de improbabil si ca alti metaboliti, in afara de

clopidogrel acil glucuronid, sa fie capabili de a reforma clopidogrel (ca atare), prin

participarea intr-un ciclu entero-hepatic. In concluzie, cantitatea de clopidogrel convertita de

carboxilesteraza la acid carboxilic inactiv (cam 85% dintr-o doza administrata), nu redevine

disponibila pentru metabolizare de catre izoenzimele CYP, astfel incat sa poate fi oxidata si

sa formeze metabolitul tiolic activ.

III.4 Evaluarea interactiunilor medicamentoase intre clopidogrel si substraturi

competitoare sau inhibitori CYP2C19 sau CYP3A4 si determinarea impactului lor

asupra ratei de formare a metabolitului activ H4: studii in vitro realizate pe microzomi

hepatici

Desi pana in prezent au fost formulate multe ipoteze cu privire la motivele pentru care unii

pacienti nu raspund sau au un raspuns diminuat la tratamentul cu clopidogrel, impactul

individual sau chiar si cumulat al factorilor celor mai citati nu explica pe deplin faptul ca

aproximativ 20% pana la 40% din populatia tratata prezinta un raspuns suboptimal la regimul

standard de terapie [Zhang H et. al., 2014]. Factorii cel mai adesea incriminati sunt

variabilitatea intra si inter-individuala cu privire la formarea metabolitului activ, rezistenta

generala la xenobiotice si reactivitatea trombocitara individuala pre-tratament [Gurbel et. al.,

2003; Müller et. al., 2003].

In ceea ce priveste variabilitatea inter-individuala crescuta a ratei de formare a metabolitului

activ (tiolic), s-a demonstrat existenta unei legaturi intre polimorfismul genetic al izoenzimei

CYP2C19, formarea metabolitului activ si evenimente adverse clinice. Desi aceasta legatura

este una logica avand in vedere faptul ca izoenzima este implicata in ambele procese oxidative

ce conduc la formarea metabolitului, corelarea dintre genotipul individual si raspunsul la

tratament reuseste sa explice numai 12% din variabilitatea totala cu privire la eficacitatea

tratamentului cu clopidogrel [Krishna et. al., 2012; Nissen et. al., 2011; Shuldiner et. al.,

2009]. Clopidogrelul este un promedicament; pentru a rezulta metabolitul activ care inhiba

agregarea plachetară, clopidogrelul trebuie metabolizat pe calea izoenzimelor citocromului

P450 [Dansette et. al., 2012; Tuffal et. al., 2011]. In vitro si in vivo, clopidogrelul este

metabolizat pe doua cai metabolice principale: una mediata de esteraze care determina

Pagina|52

hidroliza la derivatul sau carboxilic inactiv (85% dintre metabolitii circulanti) si una mediata

de izoenzimele citocromului P450. In vederea activarii, clopidogrelul este metabolizat mai

intai la metabolitul intermediar 2-oxo-clopidogrel. Metabolizarea consecutiva a metabolitului

intermediar 2-oxo-clopidogrel determina formarea metabolitului activ, un derivat tiolic al

clopidogrelului. In vitro, aceasta cale metabolica este mediata de CYP3A4, CYP2C19,

CYP1A2 si CYP2B6 [RCP Clopidogrel Medana, 2012]. Rezultatele obtinute intr-un studiu

propriu realizat in vivo pe 12 voluntari sanatosi [date prezentate in capitolul experimental

III.1], in care s-au cuantificat atat concentratiile de 2-oxo-clopidogrel cat si cele de metabolit

activ, sugereaza faptul ca cea de a doua etapa oxidativa limiteaza rata de formare a H4.

Testele in vitro efectuate de Kuzui si colaboratori folosind izoforme umane P450 exprimate

prin ADNc au demonstrat ca clopidogrelul este metabolizat la 2-oxo-clopidogrel, precursorul

imediat al metabolitului sau activ farmacologic într-o reactie catalizata de CYP1A2, CYP2B6

si CYP2C19 cu o contributie individuala la formarea de 2-oxo-clopidogrel de 35.8, 19.4 si,

respectiv, 44.9%. Folosind 2-oxo-clopidogrel ca substrat, a fost necesara adaugarea de

glutation la sistem pentru detectarea metabolitului activ al clopidogrelului. CYP2B6,

CYP2C9, CYP2C19 si CYP3A4 au contribuit la producerea metabolitului activ iar

contributiile lor individuale s-au dovedit a fi 32.9, 6.76, 20.6 si, respectiv, 39.8%. Studiile au

demonstrat ca CYP2C19 a contribuit substantial la ambele etape de oxidare necesare pentru

formarea metabolitului activ si ca CYP3A4 a contribuit substantial la a doua etapa oxidativa

[Kazui et. al., 2010]. Aceste rezultate explica efectul polimorfismului genetic al CYP2C19

dar, de asemenea, identifica CYP3A4 ca fiind principala izoenzima responsabila pentru

conversia oxoclopidogrelului la H4 activ.

Desi in anul 2010 FDA a aprobat un nou prospect pentru clopidogrel, ce contine un

avertisment cu privire la eficacitatea diminuata a acestuia la pacientii cu o capacitate

insuficienta de a converti medicamentul la forma sa activa [Holmes et. al., 2010], exista date

in literatura ce sugereaza ca relatia dintre genotipul CYP2C19*2 si agregarea plachetara nu

explica decat in proportii mici variabilitatea totala a raspunsului terapeutic observata la

pacienti in urma tratamentului cu clopidogrel [Shuldiner et. al., 2009]. Prin urmare, se impune

sa luam in calcul si faptul ca vasta majoritate a pacientilor sub tratament cu clopidogrel

primeste concomitent si alte tratamente de fond iar aproximativ 50% din xenobioticele

existente pot fi considerate substraturi competitoare pentru CYP 3A4.

Prin prezentele teste s-a dorit identificarea altor factori importanti (in afara de polimorfismul

genetic CYP2C19) ce ar putea contribui la variabilitatea raspunsului terapeutic la clopidogrel

prin testarea potentialelor interactiuni la nivel metabolic intre clopidogrel / oxo-clopidogrel si

Pagina|53

alte medicamente administrate uzual in practica medicala concomitent cu clopidogrelul printr-

o abordare cinetica ce ia in calcul concentratiile realizate in plasma de competitorii/inhibitorii

testati.

Microzomi hepatici umani caracterizati cu privire la activitatea izoenzimatica individuala, au

fost utilizati ca sursa de enzime CYP [InVitroCYPTM H-classTM Human Liver Microsomes,

Celsis In Vitro Inc, Baltimore, SUA]. Preparatul contine microzomi de la 50 de donori

apartinand ambelor sexe si atat continutul enzimatic final in CYP, FMO si UGT cat si datele

demografice ale donatorilor individuali sunt cunoscute, iar media obtinuta este una

reprezentativa pentru populatia generala, permitand astfel extrapolarea realista a rezultatelor

obtinute in-vitro.

Microzomii au fost selectati ca sistem preferat de testare deoarece, spre deosebire de

hepatocite, ei permit cuantificarea aportului isoenzimelor CYP fara interferente din partea

altor factori de confuzie precum transportul intra-celular. Microzomii hepatici reprezinta un

model biologic bine caracterizat, preparat din tesuturi care sunt analizate si selectate astfel

incat mixul final sa prezinte activitate mare peste intreg panoul de enzime relevante ale

citocromului P450.

Sistemul redox utilizat ca sursa de energie regeneranta a fost compus din glucoza-6-fosfat,

glucozo-6-fosfat dehidrogenaza si NADP in tampon fosfat de potasiu [rapidSTARTTM

NADPH Regenerating System, XenoTech LLC, Lenexa, SUA].

In mixul de incubare a mai fost utilizata si fluorura de potasiu in scopul de a inchide/minimiza

impactul cantitativ al cailor orizontale care conduc la formarea de metaboliti carboxilici ai

clopidogrelului.

Desi exista literatura care sugereaza ca formarea in vitro a metabolitul tiolic activ al

clopidogrelului este dependenta de adaugarea de glutation redus (GSH) in amestecurile de

incubare [Gong et. al., 2012], testele efectuate in scopul de a optimiza continutul amestecului

de incubare au aratat ca metabolitul este format chiar si in absenta GSH, dar cu o scadere de

70% a ratei de formare.

Reactiile au fost realizate in mixuri de incubare de 300μL ce contineau urmatoarele

componente la concentratiile finale indicate in paranteze:

• Microzomi hepatici (2.00 mg/mL)

• Substrat (clopidogrel 1 μM/ 10 μM sau 2-oxo-clopidogrel 1 μM/10 μM)

• Solutie tampon Fosfat Sodic (50mM, pH 7.4)

• Clorura de magneziu (3.0mM)

• EDTA (1.0mM, pH 7.4)

Pagina|54

• Glucozo-6-fosfataza (12.5mM, pH 7.4)

• Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (2.5 Unitati/mL)

• NADP (2.5mM, pH 7.4)

• Glutation redus (10 mM)

• Fluorura de Potasiu (100 mM)

± Inhibitor (omeprazol, simvastatin, atorvastatin, gliclazid, glimepirid sau naringenina in

raport de 10:1 sau 1:1 sau 0.1:1 fata de substratul probei: clopidogrel 1/ 10 μM sau 2-oxo-

clopidogrel 1/ 10 μM)

• Apa purificata pana la un volum final de 300 μL

Au fost preparate probe de control al conceptului [conform tabelului III-16] prin excluderea

anumitor componente din mixul standard de incubare.

Tabel III-16. Probe de calibrare a sistemului in vitro si identificare a tipurilor de reactii ce au loc in

mixul de incubare

Microzomi Mix NADPH GSH KF Scop

✓ ✓ ✓ NU Determinarea cantitativa si calitativa a metabolitilor rezultati

atunci cand actiunea esterazelor nu este inhibata

✓ ✓ NU ✓ Testarea ipotezei conform careia formarea metabolitului activ

este dependenta de prezenta glutationului

✓ NU ✓ ✓

Determinarea dependentei de un sistem energetic a reactiilor

de metabolizare. Prin urmare, orice metabolit obtinut in aceste

probe este rezultat in urma actiunii esterazelor si nu a

izoenzimelor hepatice

NU ✓ ✓ ✓ Determinarea dependentei de izoenzime hepatice a reactiilor

de metabolizare.

NU NU ✓ ✓ Determinarea stabilitatii substratului (clopidogrel/oxo-

clopidogrel) in mixurile de incubare

Pentru aceste teste de metabolizare realizate cu clopidogrel si 2-oxo-clopidogrel ca substrat,

probele complete si probele de control au fost incubate in aceleasi conditii.

Pentru a putea determina curbe de conversie, s-au incubat probe timp de 15, 30 si 60 minute.

Pentru oprirea reactiilor de metabolizare, dupa expirarea timpului dorit de incubare, probele au

fost imediat tratate cu un volum egal (300μL) de acetonitril la 4° C.

Pe baza concentratiilor de metabolit activ determinate in probele unde substratul a fost incubat

in prezenta diferitilor inhibitori/competitori in raport de concentratie 0.1, 1.0 si 10.0, s-au facut

reprezentari grafice si s-a modelat dependenta intre variabile in scopul predictiei inhibitiei in

vivo in functie de raporturile uzuale intre concentratiile plasmatice terapeutice. In graficele de

Pagina|55

mai jos, pe axa “y” sunt prezentate concentratiile de metabolit activ determinate in probe iar

pe axa “x” proportiile de concentratie inhibitor:substrat la care s-au obtinut rezultatele. Apoi,

pe baza ecuatiei care descrie cel mai bine datele experimentale [coeficientul de corelatie R2 cel

mai mare], s-au calculat concentratiile de metabolit activ care ar rezulta daca ratia

substrat:inhibitor in proba ar fi una fiziologic-relevanta. Pentru determinarea raportului

relevant substrat-inhibitor pentru fiecare pereche testata, s-au luat in calcul rapoartele

fiziologice ale concentratiilor plasmatice maxime (Cmax) realizate dupa administrarea unei

doze unice din fiecare medicament – calculate pe baza datelor obtinute in studii de

farmacocinetica. Prin introducerea in ecuatie a acestui raport fiziologic-relevant, s-a putut

prezice concentratia de metabolit activ care s-ar forma si respectiv, puterea inhibitorie maxima

a fiecarui competitor/ inhibitor.

Puterea inhibitorie maxima a fost calculata procentual iar ca 0% inhibitie au fost considerate

mediile valorilor de metabolit activ rezultate dupa 60 minute de incubare a clopidogrelului 1

μM, clopidogrelului 10 μM, 2-oxo-clopidogrelului 1μM si respectiv 2-oxo-clopidogrelului 10

μM. Pe langa faptul ca toate testele au fost realizate in triplicat, utilizarea a doua concentratii

diferite de substrat in aceleasi conditii de raport inhibitor:clopidogrel/2-oxo-clopidogrel

permite un control aditional asupra acuratetii si reproductibilitatii ecuatiilor predictive.

In Figura III-28 [A - D] de mai jos sunt prezentate graficele de formare a metabolitului activ

atunci cand activitatea CYP nu este inhibata/redusa competitiv prin incubarea concomitenta a

altor medicamente.

Pagina|56

Figura III-28. Metabolizarea clopidogrelului si 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4, utilizand microzomi

hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

Pagina|57

Cresterile semnificative si graduale inregistrate pe parcursul celor 60 de minute de incubare

reflecta functionalitatea sistemului energetic regenerant utilizat pentru a cataliza activitatea

CYP. Prezenta oxo-clopidogrelului in sistem in cantitati semnificative in reactiile ce au ca

substrat clopidogrelul si alura aproape paralela a celor doua curbe de conversie sugereaza ca

intr-adevar exista limitari substantiale a ratei de conversie in cea de-a doua etapa oxidativa,

conversia la H4 neputand sa tina pasul cu formarea 2-oxo-clopidogrelului. Limitele ratei de

conversie a 2-oxo-clopidogrelului la H4 sunt vizibile si prin faptul ca multiplicarea

concentratiei de substrat nu duce la cresteri proportionle in formarea de H4, observatie

valabila si atunci cand se porneste de la clopidogrel ca substrat, in contextul in care

concentratia microzomilor in probe asigura faptul ca sistemul nu este saturat la concentratiile

testate.

Teste de interactiuni:

Atorvastatina: este o substanta medicamentoasa din grupul inhibitorilor HMG-CoA-

reductazei, utilizata frecventa in prevenirea evenimentelor cardiovasculare si tratamentul bolii

coronariene in asociere cu clopidogrelul. Atorvastatina este metabolizata de izoenzima 3A4 a

citocromului P450 [RCP TORVACARD, 2009] fiind astfel un substrat competitor in a doua

etapa oxidativa a clopidogrelului.

Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM

atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD)

Ratie fiziologica Cmax = 5.354 (ATO + 2-OH)

y = -10.83ln(x) + 129.3 R² = 0.89397

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10.0

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4

111.13 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 24.23%

atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD)

Ratie fiziologica Cmax = 5.354 (ATO + 2-OH)

y = -48.25ln(x) + 233.83 R² = 0.95166

0

90

180

270

360

450

0.10 1.00 10.00

Metabolit

ac

v H4 (n

g/mL)

Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ clopidogrel

Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4


Figura III-29. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta atorvastatinei, utilizand microzomi

hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicate

Pagina|58

Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM

atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax = 0.484 (ATO + 2-OH)

y = -29.13ln(x) + 736.63 R² = 0.98269

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.0

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4


atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax = 0.484 (ATO + 2-OH)

y = -251.1ln(x) + 1561.2 R² = 0.99581

0

500

1000

1500

2000

2500

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ Ox0-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4


Figura III-30. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta atorvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul atorvastatinei puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 20%, destul de

substantiala avand in vedere faptul ca aceasta molecula este doar substrat pentru CYP3A4, si

pare sa derive exclusiv din inhibarea celei de a doua etape oxidative (de la 2-oxo-clopidogrel

la H4 activ).

Simvastatina: este o substanta medicamentoasa ce face parte tot din grupul inhibitorilor HMG-

CoA-reductazei, utilizata frecventa in prevenirea evenimentelor cardiovasculare si tratamentul

bolii coronariene in asociere cu clopidogrelul. Este metabolizata de izoenzima 3A4 a

citocromului P450 [RCP SIMVASTATIN, 2006] fiind astfel un substrat competitor in a doua

etapa oxidativa a clopidogrelului.


simvastatina (Simv. 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 6.782

y = -5.452ln(x) + 77.118 R² = 0.98828

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Simvastatin / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4



y = -25.89ln(x) + 137.18 R² = 0.94128

0

90

180

270

360

450

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Simvastatin / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4


Figura III-31. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta simvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

Pagina|59



y = -6.509x + 428.2 R² = 0.9759

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Simvastatin / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4



y = ‐168.4ln(x) + 1163.4 R² = 0.98011

0

500

1000

1500

2000

2500

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Simvastatin / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4


Figura III-32. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta simvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul simvastatinei puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 45% pentru a

doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) si 55% global (de la clopidogrel la

H4) avand astfel un potential mult mai mare de a cauza interactiuni nedorite la administrarea

concomitenta cu clopidogrelul, comparativ cu atorvastatina (reprezentant al aceluiasi grup

terapeutic).

Omeprazol: este un medicament pentru tratamentul ulcerului gastro-duodenal si al bolii de

reflux gastro-esofagian din grupul inhibitorilor pompei protonice. Deoarece printre indicatiile

sale terapeutice se numara si profilaxia ulcerelor la pacientii cu risc crescut, este in mod

frecvent asociat tratamentului standard clopidogrel + acid acetilsalicilic pentru a combate

efectul iritant gastric al celui din urma. Metabolismului sau este dependent in principal de

CYP2C19, responsabil pentru formarea metabolitului major in plasma (hidroxil-omeprazol)

iar CYP3A4 este izoenzima responsabila pentru formarea de omeprazol sulfona. Ca o

consecinta a afinitatii omeprazolului catre CYP2C19, exista un potential pentru inhibarea

competitiva si interactiuni metabolice medicamentoase cu alte meldicamente care reprezinta

substrat pentru CYP2C19 [RCP OMEPRAZOL LPH, 2015]. Desi in momentul de fata

Rezumatul Caracteristicilor Produsului pentru omeprazol nu discuta si puterea sa inhibitorie

asupra CYP2C9 (posibil deoarece este mai mica decat cea asupra CYP2C19), aceasta a fost

observata prin studii de interactiuni medicamentoase si descrisa in literatura [Li et. al., 2004].

Pagina|60


omeprazol (Omeprazol 20mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 371.531

y = -11.68ln(x) + 96.06 R² = 0.95708

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Omeprazol / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4



y = ‐10.11ln(x) + 91.14 R² = 0.90306

0

90

180

270

360

450

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

ml)

Raport concentratii Omeprazol / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4


Figura III-33. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta omeprazolului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat



y = -24.72ln(x) + 235.42 R² = 0.95749

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.0

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Omeprazol / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4



y = -145.7ln(x) + 951.37 R² = 0.99023

0

500

1000

1500

2000

2500

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

cvti

v H

4 (n

g/m

L)

Raport concentratii Omeprazol / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4


Figura III-34. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta omeprazolului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul omeprazolului puterea inhibitorie maxima globala pare sa fie extrem de ridicata

suprimand in proportie de aproximativ 82% formarea de metabolit activ H4 pornind de la

clopidogrel, atunci cand acesta din urma este administrat in momentul de maxima abundenta a

omeprazolului in circulatia sistemica. Trebuie mentionat in cazul testelor realizate cu

omeprazol pornind de la clopidogrel, ca este probabil ca rezultatele privind puterea inhibitorie

sa fie supraestimate deoarece punctul ce reprezinta ratiile fiziologice ale Cmax se afla intr-o

zona de extrapolare a curbei (extrapolare realizata in baza ecuatiei predictive) situata mult in

Pagina|61

afara graficului construit. Daca intelegem insa faptul ca situatiile prezentate in graficele din

acest capitol reprezinta cel mai rau scenariu posibil in care clopidogrelul si competitorul sau

ating simultan Cmax si corelam aceasta informatie cu date din literatura in care se arata ca dupa

administrarea concomitenta a omeprazolului [Tmax = 2h] cu clopidogrel [Tmax clopidogrel =

0.75h, conform datelor prezentata in Capitolul III.1], expunerea la metabolitul activ este

redusa cu 46% [Wang et. al., 2015], putem sa concluzionam ca in realitate supraestimarea nu

pare sa fie una substantiala.

Pe langa efectul global puternic, putem observa in graficele de conversie de la 2-oxo-

clopidogrel la H4 activ faptul ca rata de formare prin cea de-a doua etapa oxidativa este redusa

cu aproximativ 80% prin efectul inhibitor asupra CYP2C9 si CYP2C19 si competitor asupra

CYP3A4.

Gliclazid: este un medicament din clasa sulfonamide - derivati de uree, utilizat in

managementul diabetului zaharat non-insulino-dependent (de tip 2) al adultului, atunci cand

regimul dietetic, efortul fizic si scaderea in greutate nu sunt suficiente pentru a controla

glicemia [RCP Gliclazida Krka 60 mg, 2013]. Intrucat pacientii ce sufera de diabet sunt expusi

unui risc mai mare de aparitie a evenimentelor cardiovasculare comparativ cu populatia

generala, tratamentul concomitent cu antidiabetice orale si antiagregante plachetare este unul

des intalnit in practica medicala. Gliclazida este substrat CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19

[Sultanpur et. al., 2010; Elliot et. al., 2007; Zhang et. al., 2007].


gliclazid (Gliclazid 30mg SD/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 674.188

y = 96.175x-0.093 R² = 0.95575

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Gliclazid / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4



y = -15.71ln(x) + 172.25 R² = 0.95679

0

90

180

270

360

450

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Gliclazid / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4


Figura III-35. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta gliclazidei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

Pagina|62



y = -29.5ln(x) + 526.75 R² = 0.99523

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Gliclazid / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4



y = -182.9ln(x) + 1928.7 R² = 0.98554

0

700

1400

2100

2800

3500

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Gliclazid / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4


Figura III-36. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta gliclazidei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul gliclazidei, puterea inhibitorie maxima cauzata prin interferenta cu CYP2C9 si

CYP3A4 se situeaza in jurul valorii de 48% pentru a doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-

clopidogrel la H4 activ) si 65% global (de la clopidogrel la H4), demonstrand faptul ca

afinititatea glicazidei ca substrat competitor pentru CYP2C19 este mai mare decat cea a

clopidogrelului fiind astfel afectata semnificativ si prima etapa oxidativa (de la clopidogrel la

2-oxo-clopidogrel).

Glimepirid este un alt reprezentant al grupei farmacoterapeutice antidiabetice orale -

sulfonamide - derivati de uree, utilizat (asemeni glicazidei) in managementul diabetului

zaharat non-insulino-dependent (de tip 2), atunci cand regimul dietetic, efortul fizic si

scaderea in greutate nu sunt suficiente pentru a controla glicemia. Potentialul de interactiune

cu clopidogrelul rezulta din faptul ca glimepiridul este substrat competitor pentru CYP2C9

[RCP Anaryl 1 mg, 2009; Tirkkonen et. al. 2010], izoenzima implicata in cea de-a doua etapa

oxidativa.


Pagina|63


glimepirid (Glimepirid 1mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 48.259

y = -15.18ln(x) + 109.36 R² = 0.97744

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Glimepirid / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4



y = -22.27ln(x) + 156.02 R² = 0.99188

0

90

180

270

360

450

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Glimepirid / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4

69.69 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ

Putere inhibitorie maxima: 65.27%

Figura III-37. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta glimepiridului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat



y = -32.58ln(x) + 501.33 R² = 0.99783

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Glimepirid / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4



y = -195.9ln(x) + 1487.6 R² = 0.98793

0

700

1400

2100

2800

3500

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Glimepirid / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4



Figura III-38. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta glimepiridului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul glimepiridului, puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 45% pentru a

doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) dar tot 65% global (de la

clopidogrel la H4), sugerand ca nu este o alternativa mai sigura decat gliclazidul in ceea ce

priveste potentialul de a interactiona cu clopidogrelul.

Naringenina: este flavonona (un tip de flavonoid) predominanta din sucul de grapefruit, care

se gaseste de asemenea in portocale si in coaja de tomate. Prezinta efect inhibitor asupra

CYP3A4, CYP2C9 si CYP2C19 [Ho et. al. 2001; Lu et. al., 2011] ceea ce sugereaza ca are un

potential ridicat de a interactiona cu clopidogrelul. Valoarea Cmax luata in calcul pentru a

Pagina|64

estima ratia fiziologica naringenina:clopidogrel este cea obtinuta dupa ingestia a 8 ml suc

proaspat de portocale per Kg corp [Erlund et. al., 2001].

y = -9.707ln(x) + 117.77 R² = 0.9622

0

40

80

120

160

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Naringenina / Clopidogrel

Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta naringeninei: formarea metabolitului activ H4

Incubare Clopidogrel 1 μM naringenina (8ml/kg corp suc portocale/Clopi 75mg SD); Ratie fiziologica Cmax= 137.923



Figura III-39. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta naringenina, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

y = ‐9.5755x + 592.02 R² = 0.9352

0

150

300

450

600

750

900

0.10 1.00 10.00

Met

abol

it a

ctiv

H4

(ng/

mL

)

Raport concentratii Naringenina / Oxo-clopidogrel

Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta naringeninei: formarea metabolitului activ H4

Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM naringenina (8ml/kg corp suc portocale/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 12.476



Figura III-40. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta naringenina, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat

In cazul naringeninei, puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 42% pentru a

doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) si 52% global (de la clopidogrel la

H4), demonstrand ca asocierea intre clopidogrel si sucul de portocale sau grapefruit poate sa

reduca semnificativ eficienta medicamentului dar si ca potentialul de interactiune este mai mic

decat in cazul medicamentelor ce concureaza pentru aceleasi trei izoenzime.

Prezenta oxo-clopidogrelului in sistem in cantitati semnificative in reactiile ce au ca substrat

clopidogrelul si alura aproape paralela a celor doua curbe de conversie (clopidogrel -> 2-oxo-

clopidogrel si 2-oxo-clopidogrel -> H4 activ) sugereaza ca intr-adevar exista limitari

substantiale a ratei de conversie in cea de-a doua etapa oxidativa, conversia la H4 neputand sa

tina pasul cu formarea 2-oxo-clopidogrelului. Limitele ratei de conversie a 2-oxo-

Pagina|65

clopidogrelului la H4 sunt vizibile si prin faptul ca multiplicarea concentratiei de substrat nu

duce la cresteri proportionle in formarea de H4, observatie valabila si atunci cand se porneste

de la clopidogrel ca substrat, in contextul in care concentratia microzomilor in probe asigura

faptul ca sistemul nu este saturat la concentratiile testate.

In conditii relevante din punct de vedere fiziologic (luand in calcul ratiile de Cmax obtinute in

studii farmacocinetice), conversia clopidogrelului la metabolitul activ este inhibata de

comedicatia testata cu urmatoarea ordine de potenta: omeprazol > glimepirid > gliclazid >

simvastatin > naringenina > atorvastatin.

0

25

50

75

100

atorvastatin simvastatin gliclazid glimepirid naringenina omeprazol

Pu

tere

inh

ibit

orie

max

ima

(%)

Puterea inhibitorie asupra formarii de metabolit activ H4 pornind de la clopidogrel

Figura III-41. Puterea inhibitorie maxima prezisa pentru medicamentele testate asupra metabolizarii

clopidogrelului la metabolit activ H4

Este interesant de observat faptul ca nu toate substraturile competitoare CYP3A4 au putere

inhibitorie similara si ca in pofida abundentei acestei izoenzime in mediul hepatic, se observa

interferente semnificative atunci cand clopidogrelul intra in competitie cu medicamente ce au

o afinitate mai mare catre CYP3A4. De asemenea, judecand dupa diferentele observate intre

puterea inhibitorie maxima a simvastatinei si atorvastatinei, putem deduce si faptul ca

afinitatea pentru izoenzima poate sa varieze substantial in cadrul aceleiasi clase de compusi,

impunandu-se un studiu individual pentru selectarea celei mai bune optiuni terapeutice atunci

cand se prevede co-administrarea cu clopidogrel.

Un efect inhibitor marcat a fost inregistrat si pentru glimepirid, substrat cu afinitate mare

pentru CYP2C9. Puterea inhibitorie maxima este foarte similara cu cea a glicazidului, care

este substrat competitor al clopidogrelului pentru nu una ci trei enzime catalizatoare

Pagina|66

(CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19), insa pare ca afinitatea specifica pentru ele nu este una atat

de ridicata.

Naringenina, desi este inhibitor CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19, are un potential de a

interactiona cu clopidogrelul mult mai redus atunci cand este administrata in cantitati uzuale

(estimarile sunt facute pentru un consum de 400 mL fresh de portocale pentru o persoana cu

masa corporala de 50 kg) decat cel al omeprazolului, desi acesta din urma este doar substrat

competitor pentru CYP3A4 si inhibitor CYP2C9/ CYP2C19.

Probabil cel mai important mesaj de retinut este acela ca nu putem aplica o logica prea

elementara in ceea ce priveste potentialul medicamentelor de a interactiona cu clopidogrelul.

De exemplu, nu putem spune ca un substrat competitor ce afecteaza doar o izoenzima nu are

un potential semnificativ de a interfera cu rata de formare a metabolitului activ H4. In realitate

impactul depinde de potenta inhibitorului, afinitatea competitorului si rata de conversie a

reactiei cu care medicamentul interfera.

Dupa cum poate fi observat in figura III-42 de mai jos, efectul inhibitor global observat pentru

medicamentele testate este datorat in cea mai mare parte interferentei cu a doua etapa

oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ), chiar daca acest lucru nu ar fi fost neaparat

predictibil judecand dupa datele disponibile in literatura cu privire la implicarea individuala a

izoenzimelor CYP in aceasta reactie.

0

25

50

75

100

atorvastatin simvastatin gliclazid glimepirid naringenina omeprazol

Pu

tere

inh

ibit

orie

max

ima

(%)

Puterea inhibitorie asupra formarii de metabolit activ H4 pornind de la 2-oxo-clopidogrel si contributia la efectul inhibitor global

Inhibarea etapei clopidogrel => 2-oxo-clopidogrel Inhibarea etapei 2-oxo-clopidogrel => H4

Figura III-42. Puterea inhibitorie maxima prezisa pentru medicamentele testate asupra metabolizarii clopidogrelului la metabolit activ H4

Pagina|67

Cel mai probabil explicatia acestui fenomen sta tocmai in faptul ca cea de-a doua etapa

oxidativa, care este deja destul de lenta, este mult mai susceptibila interferentelor externe

tocmai din cauza limitarilor pre-existente.

Global, putem concluziona ca testele de interactiune in-vitro sunt o unealta utila in

identificarea potentialelor interactiuni medicamentoase ce pot afecta formarea metabolitului

activ (si consecutiv eficienta clopidogrelului) iar utilizarea lor ar trebui sa fie incurajata

intrucat, dupa cum am aratat, potentialul inhibitor nu poate fi dedus, extrapolat pe clase de

compusi sau pe tipuri de interferenta (competitie/inhibitie). De asemenea, s-ar impune ca in

viitorul apropiat clinicienii sa dea dovada de o mai mare responsabilizare cu privire la

medicamentele pe care le prescriu pentru uz concomitent cu clopidogrelul. De exemplu: chiar

avem nevoie sa co-administram omeprazol pentru a combate efectul a 100mg/zi acid

acetilsalicilic din cadrul tratamentului dual antiagregant plachetar?...nu ar putea oare sa fie el

inlocuit cu famotidina, care nu are efect inhibitor asupra izoenzimelor citocromului 450?!

IV.2 CONCLUZII FINALE Scopul colectiv al proiectelor de cercetare realizate a fost acela de a contribui la o intelegere

mai amanuntita a surselor de variabilitate ce afecteaza raspunsul individual la

tratamentul cu clopidogrel si de a evalua solutii optimizate de administrare pentru

maximizarea expunerii la metabolitul farmacologic activ.

1) Au fost identificate surse de variabilitate care pot afecta determinarile farmacocinetice

fara a fi insa in realitate o sursa de variabilitate in raspuns terapeutic. In particular,

testele de stabilitate realizate pentru depistarea potentialelor cai de metabolizare ex-

vivo ale 2-oxo-clopidogrelului au aratat ca sub actiunea paroxonazei-1, in mediu ex-

vivo are loc o conversie a acestuia la un metabolit cu o structura si un timp de

retentie foarte similare cu cele ale metabolitului activ (un izomer “endo” al

acestuia) care este influentata de conditiile de prelevare (anticoagulant) si de

pastrare/prelucrare a probelor (temperatura). Evitarea reconversiei clopidogrelului

acil glucuronid la clopidogrel parinte s-a dovedit un alt aspect important pentru a

obtine rezultate corecte.

2) S-a aprofundat evaluarea metabolismului conjugativ al clopidogrelului, caracterizand

in particular clopidogrelul acil glucuronid. In urma analizei tuturor datelor acumulate,

clopidogrel acil glucuronid poate fi caracterizat ca un metabolit terminal al

clopidogrelului, important din punct de vedere cantitativ dar incapabil sa

contribuie la regenerarea de compusi implicati in lantul metabolic ce duce la

Pagina|68

formarea metabolitului activ. In ciuda unei mari afinitati catre reactii de

transesterificare, observata clar in vitro, nu s-au gasit dovezi care sa sugereze ca

clopidogrel acil glucuronid ar putea fi reconvertit in vivo la clopidogrel. Pe baza

compararii profilelor farmacocinetice obtinute dupa administrarea de clopidogrel

singur si in prezenta carbunelui activ, se poate afirma si ca este destul de improbabil

ca alti metaboliti, in afara de clopidogrel acil glucuronid, sa fie capabili de a

reforma clopidogrel (ca atare), prin participarea intr-un ciclu entero-hepatic. In

concluzie, cantitatea de clopidogrel convertita de carboxilesteraza la acid carboxilic

inactiv (cam 85% dintr-o doza administrata), nu redevine disponibila pentru

metabolizare de catre izoenzimele CYP, astfel incat sa poate fi oxidata si sa formeze

metabolitul tiolic activ.

3) Din punct de vedere al metabolismului oxidativ, s-au efectuat o serie de teste prin care

s-a dorit identificarea altor factori importanti (in afara de polimorfismul genetic

CYP2C19) ce ar putea contribui la variabilitatea raspunsului terapeutic la clopidogrel:

interactiunile medicamentoase. S-au testat potentiale interactiuni la nivel metabolic

intre clopidogrel / oxo-clopidogrel si alte medicamente administrate uzual in

practica medicala concomitent cu clopidogrelul, printr-o abordare cinetica

utilizand microzomi hepatici umani “in vitro”. In conditii relevante din punct de

vedere fiziologic (luand in calcul ratiile de Cmax obtinute in studii farmacocinetice),

conversia clopidogrelului la metabolitul activ este inhibata de comedicatia testata

cu urmatoarea ordine de potenta: omeprazol > glimepirid > gliclazid >

simvastatin > naringenina > atorvastatin. Aceste rezultate se coreleaza bine cu

datele de ordin farmacodinamic din studii clinice deja publicate si subliniaza faptul ca

o atentie sporita ar trebui dedicata in practica medicala pentru a evita interactiuni

potential periculoase.

4) Observatiile “in vitro” si “in vivo” au aratat clar ca metabolismul oxidativ este

aproape de saturatie la dozele clinice uzuale si poate fi postulat ca viteza si

compartimentul de cedare/absorbtie vor dicta in mare parte disponibilitatea

pro-medicamentului pentru metabolizarea oxidativa.

5) O alta observatie importanta este aceea ca solubilitatea scazuta a clopidogrelului in

mediile biologice prezente la locul de absorbtie reprezinta una din sursele

importante de variabilitate ce afecteaza farmacocinetica clopidogrelului.

6) Este interesant insa ca eficienta de conversie a medicamentului parinte la

metabolitul activ se coreleaza mai degraba cu timpul de rezidenta a

Pagina|69

clopidogrelului in compartimentul central decat cu concentratiile plasmatice

realizate de acesta. Motivul pentru care observam acest comportament este acela ca a

doua sau ambele etape oxidative mediate de izoenzimele CYP450 limiteaza rata de

conversie. Astfel, reinventarea clopidogrelului ca medicament eficient pentru un

procent mai mare din populatia tratata se va baza, cel mai probabil, pe dezvoltarea

unor forme farmaceutice cu eliberare prelungita.

REFERINTE BIBLIOGRAFICE CITATE IN REZUMAT

AACT (American Academy of Clinical Toxicology) and European

Association of Poisons Centres and Clinical Toxicologists (2005) Position Paper:

Single-Dose Activated Charcoal, Clinical Toxicology 43: 61-87.

Adkins S., Gan K.N., Mody M., La Du B.N. (1993) Molecular basis for the

polymorphic forms of human serum paraoxonase/arylesterase: glutamine or arginine

at position 191, for the respective A or B allozymes. American Journal of Human

Genetics 52(3): 598–608.

Billecke S., Draganov D., Counsell R., Stetson P., Watson C., Hsu C., La Du

B.N. (2000) Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze

lactones and cyclic carbonate esters. Drug Metabolism and Disposition28(11): 1335-

1342.

Bouman H.J., Schomig E., van Werkum J.W., Velder J., Hackeng C.M.,

Hirschhäuser C., Waldmann C., Schmalz H.G., ten Berg J.M., Taubert D. (2011)

Paraoxonase-1 is a major determinant of clopidogrel efficacy. Nature Medicine 17(1):

110-116.

Dansette P. M., Rosi J., Bertho G., Mansuy D. (2012) Cytochromes P450

catalyze both steps of the major pathway of clopidogrel bioactivation, whereas

paraoxonase catalyzes the formation of a minor thiol metabolite isomer. Chemical

Research in Toxicology 25(2): 348-356.

Dressman, J.B., Amidon, G.L., Reppas, C., Shah V.P. (1998) Dissolution

testing as a prognostic tool for oral drug absorption: immediate release dosage forms.

Pharmaceutical Research 15(1): 11-22.

Elliot D.J., Suharjono Lewis B.C., Gillam E.M., Birkett D.J., Gross A.S.,

Miners J.O. (2007) Identification of the human cytochromes P450 catalysing the rate-

limiting pathways of gliclazide elimination. British Journal of Clinical Pharmacology

64(4): 450-457.

Elomaa K., Ranta S., Tuominen J., Lähteenmäki P. (2001) The possible role of

enterohepatic cycling on bioavailability of norethisterone and gestodene in women

using combined oral contraceptives, Contraception 63(1): 13-18.

EMA-CHMP (European Medicines Agency - Committee for Medicinal

Products for Human Use), Guideline on the investigation of bioequivalence

[CPMP/EWP/QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **], 20 January 2010 Disponibil on-line la

adresa:

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/01/WC50007003

9.pdf

Erlund I., Meririnne E., Alfthan G., Aro A. (2001) Plasma kinetics and urinary

excretion of the flavanones naringenin and hesperetin in humans after ingestion of

orange juice and grapefruit juice. Journal of Nutrition 131(2): 235-241.

FDA-CDER (U.S. Food and Drug Administration - Center for Drug

Evaluation and Research), Guidance for Industry: Food-Effect Bioavailability and

Fed Bioequivalence Studies, 2002. Disponibil on-line la adresa:

http://www.fda.gov/downloads/RegulatoryInformation/Guidances/UCM126833.pdf

FDA New Drug Application (NDA) dossier for the innovator clopidogrel

product (Plavix). Disponibil on-line la adresa:

http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2002/20-

839S019_Clopidogrel%20Bisulfate_EAfonsi.pdf

FDA-CDER (U.S. Food and Drug Administration - Center for Drug

Evaluation and Research), Product-Specific Recommendations for Generic Drug

Development: Draft Guidance on Clopidogrel Bisulfate, Recommended Oct 2005,

Revised Aug 2008. Disponibil on-line la adresa:

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm083

335.pdf

Furlong M. T., Savant I., Yuan M., Scott L., Mylott W., Mariannino T.,

Kadiyala P., Roongta V., Arnold M.E. (2013) A validated HPLC-MS/MS assay for

quantifying unstable pharmacologically active metabolites of clopidogrel in human

plasma: Application to a clinical pharmacokinetic study. Journal of chromatography.

B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 926: 36-41.

Gad S.C. (2007) The mouse, in Animal models in toxicology (2nd Edition,

Shayne C. Gad) pp 19 -146, CRC Press (Taylor & Francis Group, LLC), Florida.

Gong I.Y., Crown N., Suen C.M., Schwarz U.I., Dresser G.K., Knauer M.J.,

Sugiyama D., DeGorter M.K., Woolsey S., Tirona R.G., Kim R.B. (2012) Clarifying

the importance of CYP2C1 and PON1 in the mechanism of clopidogrel bioactivation

and in vivo antiplatelet response. European Heart Journal 33(22): 2856 – 2864a.

Gurbel P.A., Bliden K.P., Hiatt B.L., O’Connor C.M. (2003) Clopidogrel for

coronary stenting: response variability, drug resistance, and the effect of pretreatment

platelet reactivity. Circulation 107(23): 2908-2913.

Holmes D.R. Jr., Dehmer G.J., Kaul S,. Leifer D., O'Gara P.T., Stein C.M.

(2010) A Report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on

Clinical Expert Consensus Documents and the American Heart Association Endorsed

by the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions and the Society of

Thoracic Surgeons: clopidogrel clinical alert: approaches to the FDA “boxed

warning”. Circulation 122(5): 537-557.

Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. (2001) Inhibition of human CYP3A4

activity by grapefruit flavonoids, furanocoumarins and related compounds. Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 4(3): 217-227.

Jantratid E., Janssen N., Reppas C., Dressman J.B. (2008) Dissolution media

simulating conditions in the proximal human gastrointestinal tract: an update.

Pharmaceutical Research 25(7): 1663-1676.

Karazniewicz-Lada M., Danielak D., Tezyk A., Zaba C., Tuffal G., Glowka F.

(2012) HPLC–MS/MS method for the simultaneous determination of clopidogrel, its

carboxylic acid metabolite and derivatized isomers of thiol metabolite in clinical

samples. Journal of Chromatography B 911: 105-112.

Kazui M., Nishiya Y., Ishizuka T., Hagihara K., Farid N.A., Okazaki O., Ikeda

T., Kurihara A. (2010) Identification of the human cytochrome P450 enzymes

involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its

pharmacologically active metabolite, Drug Metabolism and Disposition 38(1): 92-99.

Krishna V., Diamond G.A., Kaul S. (2012) Do platelet function testing and

genotyping improve outcome in patients treated with antithrombotic agents? The role

of platelet reactivity and genotype testing in the prevention of atherothrombotic

cardiovascular events remains unproven. Circulation 125 (10): 1288-1303.

Lassoued M.A., Khemiss F., Sfar S. (2011) Comparative study of two in vitro

methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus Everted

Gut Sac. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 14(1): 117-127.

Li X.Q., Andersson T.B., Ahlström M., Weidolf L. (2004) Comparison of

inhibitory effects of the proton pump-inhibiting drugs omeprazole, esomeprazole,

lansoprazole, pantoprazole, and rabeprazole on human cytochrome P450 activities.

Drug Metabolism and Disposition 32(8): 821-827.

Li Y.H., Song, M., Tai-Jun Hang T.J. (2015) Development of an LC−MS/MS

method for determination of 2-oxo-clopidogrel in human plasma, Journal of

Pharmaceutical Analysis 5(1): 12-17.

Lins R., Broekhuysen J., Necciari J., Deroubaix X. (1999) Pharmacokinetic

profile of 14C-labeled clopidogrel. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 25(Suppl

2): 29-33.

Lindegardh N., Davies G.R., Tran T.H., Farrar J., Singhasivanon P., Day N.P.,

White N.J. (2006) Rapid Degradation of Oseltamivir Phosphate in Clinical Samples

by Plasma Esterases, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(9): 3197–3199.

Lusis A.J., Paigen K. (1977) Relationships between levels of membrane-

bound glucuronidase and the associated protein egasyn in mouse tissues. The Journal

of Cell Biology 73: 728-735.

Lu W.J., Ferlito V., Xu C., Flockhart D.A., Caccamese S. (2011) Enantiomers

of naringenin as pleiotropic, stereoselective inhibitors of cytochrome P450 isoforms.

Chirality 23(10): 891-896.

Mudie D.M., Murray K., Hoad C.L., Pritchard S.E., Garnett M.C., Amidon

G.L., Gowland P.A., Spiller R.C., Amidon G.E., Marciani L. (2014) Quantification of

Gastrointestinal Liquid Volumes and Distribution Following a 240 mL Dose of Water

in the Fasted State. Molecular Pharmacology 11(9): 3039-3047.

Müller I., Besta F., Schulz C., Massberg S., Schönig A., Gawaz M. (2003)

Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris

scheduled for elective coronary stent placement. Thrombosis and Haemostasis 89

(5):783–787.

Nissen S.E. (2011) Pharmacogenomics and clopidogrel: irrational exuberance?

Journal of the American Medical Association, 306 (24): 2727-2728.

Pahomi G., Corlan G., Anuta V., Sandulovici R.C., Mircioiu I. (2012) Study

of the influence of bile salts and lecithin on distribution of ketoconazole between

plasma and methylene chloride. Farmacia 60(6): 809-821.

Peng L., Cui J.Y., Yoo B., Gunewardena S.S., Lu H., Klaassen C.D., Zhong

X.B. (2013) RNA-Sequencing Quantification of Hepatic Ontogeny of Phase-I

Enzymes in Mice. Drug Metabolism and Disposition 41(12): 2175–2186.

RCP (Rezumatul Caracteristicilor Produsului) Clopidogrel Medana 75 mg

comprimate filmate, versiune revizuita Martie 2012.

RCP (Rezumatul Caracteristicilor Produsului) Plavix, revizuit 26 Iulie 2013.

Shuldiner A.R., O'Connell J.R., Bliden K.P., Gandhi A., Ryan K., Horenstein

R.B., Damcott C.M., Pakyz R., Tantry U.S., Gibson Q., Pollin T.I., Post W., Parsa A.,

Mitchell B.D., Faraday N., Herzog W., Gurbel P.A. (2009) Association of

cytochrome P450 2C19 genotype with the antiplatelet effect and clinical efficacy of

clopidogrel therapy. Journal of the American Medical Association 302(8): 849-857.

Silvestro L., Gheorghe M., Iordachescu A., Ciuca V., Tudoroniu A., Rizea

Savu S., Tarcomnicu I. (2011) Development and validation of an HPLC-MS/MS

method to quantify clopidogrel acyl glucuronide, clopidogrel acid metabolite, and

clopidogrel in plasma samples avoiding analyte back-conversion. Analytical and

Bioanalytical Chemistry 401(3): 1023-1034.

Silvestro L., Gheorghe M.C., Tarcomnicu I., Savu S., Savu S.R., Iordachescu

A., Dulea C. (2010) Development and validation of an HPLC–MS/MS method to

determine clopidogrel in human plasma. Use of incurred samples to test back-

conversion. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications

878(30): 3134–3142.

Stass H., Kubitza D., Moller J.G. and Delesen H. (2005) Influence of activated

charcoal on the pharmacokinetics of moxifloxacin following intravenous and oral

administration of a 400 mg single dose to healthy males. British Journal of Clinical

Pharmacology 59(5): 536-541.

Sultanpur C.M., Satyanarayana S., Reddy N.S., Kumar K.E, Kumar S. (2010)

Drug–drug Interaction between Pravastatin and Gemfibrozil (Antihyperlipidemic)

with Gliclazide (Antidiabetic) in Rats. Journal of Young Pharmacists 2(2): 152 -155.

Taft D.R. (2009) Drug excretion, in Pharmacology: Principles and Practice

(Hacker M, Messer WS II and Bachmann KA eds.), pp 175-199, Academic Press

(Elsevier), Massachusetts.

Taubert D., Kastrati A., Harlfinger S., Gorchakova O., Lazar A., von

Beckerath N., Schömig A., Schömig E. (2004) Pharmacokinetics of clopidogrel after

administration of a high loading dose. Thrombosis and Haemostasis 92(2): 311-316.

Tegelstrom H., Ryttman H. (1981) Sex differences and androgenic regulation

of esterases in the house mouse. Herreditas 94:189-201.

Tirkkonen T., Heikkilä P., Huupponen R., Laine K. (2010) Potential CYP2C9-

mediated drug-drug interactions in hospitalized type 2 diabetes mellitus patients

treated with the sulphonylureas glibenclamide, glimepiride or glipizide. Journal of

Internal Medicine 268(4): 359-366.

Topol E.J.; Schork N.J. (2011) Catapulting clopidogrel pharmacogenomics

forward. Nature Medicine 7(1): 40-41.

Tubic M., Wagner D., Spahn-Langguth H., Bolger M.B., Langguth P. (2006)

In silico modeling of non-linear drug absorption for the P-gp substrate talinolol and of

consequences for the resulting pharmacodynamic effect. Pharmaceutical Research

23(8): 1712-1720.

Tuffal G., Roy S., Lavisse M., Brasseur D., Schofield J., Delesque Touchard

N., Savi P., Bremond N., Rouchon M.C., Hurbin F., Sultan E. (2011) An improved

method for specific and quantitative determination of the clopidogrel active

metabolite isomers in human plasma. Thrombosis and Haemostasis 105(4): 696-705.

Vertzoni M., Diakidou A., Chatzilias M., Soderlind E., Abrahamsson B.,

Dressman J.B., Reppas C. (2010) Biorelevant media to simulate fluids in the

ascending colon of humans and their usefulness in predicting intracolonic drug

solubility. Pharmaceutical Research 27(10): 2187-2196.

Wang X., Mondal S., Wang J., Tirucherai G., Zhang D., Boyd R.A., Frost C.

(2014) Effect of activated charcoal on apixaban pharmacokinetics in healthy subjects,

American Journal of Cardiovascular Drugs 14(2): 147-154.

Wang Z.Y., Chen M., Zhu L.L., Yu L.S., Zeng S., Xiang M.X., Zhou Q.

(2015) Pharmacokinetic drug interactions with clopidogrel: updated review and risk

management in combination therapy, Therapeutics and Clinical Risk Management 11:

449-467.

Zhang H., Hollenberg P.F., Clopidogrel: Pharmacology, Clinical Uses and

Adverse Effects, Chapter 4 “From Mechanism to Therapeutics: Overcoming Inter-

Individual Variability in Clopidogrel Therapy”. Nova Science Publishers, New York,

2014; p121.

Zhang Y., Si D., Chen X., Lin N., Guo Y., Zhou H., Zhong D. (2007) nfluence

of CYP2C9 and CYP2C19 genetic polymorphisms on pharmacokinetics of gliclazide

MR in Chinese subjects. British Journal of Clinical Pharmacology 64(1): 67-74.

Zhu Y., Zhou J. (2013) In Vitro Biotransformation Studies of 2-Oxo-

clopidogrel: Multiple Thiolactone Ring Opening Pathways Further Attenuate Prodrug

Activation. Chemical Research in Toxicology 26: 179-190.

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - umfcd.ro · coronariana, boala vasculara periferica si boala...

Documents

Transcript of REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT - umfcd.ro · coronariana, boala vasculara periferica si boala...