reactii ag-ac

REACII IMUNOLOGICE IN DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILORImunologia ofer laboratorului de microbiologie mijloace complexe de diagnostic care au la baz specificitatea dintre antigen (ag) i anticorp (ac). O parte din tehnicile imunologice utilizate n microbiologie sunt versiuni moderne ale tehnicilor descoperite la nceputul secolului (reacii de aglutinare, precipitare i de fixare a complementului), iar altele, cum sunt cele imunoenzimatice (Elisa), imunoblot, imunofluorescena etc., s-au dezvoltat n ultimele decade i au adus un ajutor substanial microbiologiei medicale.Reaciile antigen-anticorp. Cuplarea antigenului cu anticorpul omolog duce la formarea complexului ag-ac. Legarea efectiv dintre cei doi reactani constituie reacia primar i este, de regul, neobservabil. ntr-o faz urmtoare are loc reacia secundar care face vizibil macroscopic reacia ag-ac prin fenomene fizice (aglutinarea complexelor imune, precipitarea lor) sau biologice (neutralizare, fixare a complementului). Starea fizic a antigenului este, n general, responsabil de natura reaciei secundare precum i de denumirea anticorpului corespunztor. Aceeai molecul de anticorp poate fi descris, de fapt, prin fiecare din urmtorii termeni:aglutinine - produc agregarea antigenelor celulare de suprafa,lizinele - favorizeaz distrugerea membranelor celulare (cu participarea complementului),precipitinele - formeaz precipitate cu antigene solubile (de obicei proteine),antitoxinele - neutralizeaz exotoxinele bacteriene.Aplicaiile practice ale reaciei Ag-Ac se bazeaz pe specificitatea cuplrii celor doi reactani.Reaciile ag - ac sunt utilizate n diagnosticul de laborator al infeciilor, att ca metode directe de recunoatere a microbilor sau a antigenelor lor n probele clinice sau n culturile izolate, precum i ca metode indirecte de evideniere i titrare a anticorpilor specifici n serul pacienilor.Sensibilitatea reaciilor diagnostice imunologice este mult superioar reaciilor chimice, ceea ce are ca urmare posibilitatea unor erori de ordin tehnic. Din acest motiv este obligatoriu ca la fiecare test diagnostic ce are la baz o reacie ag-ac (chiar i dac ac utilizai sunt ac monoclonali) s se verifice reacia printr-un martor sigur pozitiv i unul sigur negativ.Reaciile ag-ac pot fi calitative (simpla detectare a ag sau ac) i cantitative. n reaciile cantitative se determin titrul reactivului (ag-ului sau ac-ului). Acesta se exprim printr-o fracie ordinar cu numrtorul 1 i reprezint cantitatea reactivului cercetat.Titrul este diluia maxim a unuia dintre reactivi la care mai este vizibil reacia cu cantiti constante i definite ale reactivului omolog.6.1. Reacia de aglutinareReacia de aglutinare este o reacie ag-ac foarte sensibil n care antigenul este corpuscular (bacterii, eritrocite sau particule de latex pe care s-au adsorbit antigene specifice). Anticorpii (aglutininele) reacioneaz cu antigenele de suprafa ale particulelor i determin ntr-o faz urmtoare aglutinarea lor, n grmezi vizibile cu ochiul liber.Reacia de aglutinare direct, activ se petrece prin cuplarea unui ag corpuscular aflat n suspensie cu ac omolog. Aglutinatele formate se depun i las supernatantul limpede. Ag poate fi reprezentat de o suspensie bacterian, respectiv de corpi bacterieni ntregi, vii sau omori, precum i de hematii, leucocite etc.Dac antigenul este o bacterie ciliat, aglutinarea poate avea aspect macroscopic diferit, n funcie de sediul antigenelor implicate n reacie. Astfel, dac antigenele sunt situate pe corpul bacterian, vorbim de aglutinare somatic O, care este grunjoas, ferm i rezist la agitare. Dac antigenele se afl pe flageli, are loc aglutinarea flagelar H cu aspectul unor fulgi de zpad care se desfac cu uurin.Reacia de aglutinare pasiv (indirect) este o variant a reaciei de aglutinare care a aprut ca urmare a necesitii de a evidenia antigene necorpusculare, care nu produc n mod normal o aglutinare macroscopic vizibil. Aceste ag devin corpusculare prin adsorbia lor pe suprafaa unor particule, care joac rolul unui suport material, inert din punct de vedere imunologic. Astfel de particule sunt latexul de polistiren n reacia de latex aglutinare, suspensia de hematii n reacia de hemaglutinare pasiv, precum i particule de colesterol, particule coloidale de aur etc.Reacia de aglutinarea pasiv invers reprezint o alt variant a aglutinrii pasive i presupune adsorbia ac pe un suportul pasiv. Acesta poate fi latexul n latex aglutinare pasiv invers, suspensia de hematii n hemaglutinarea pasiv invers sau S.aureus1 n reacia de coaglutinare.Tehnica reaciilor de aglutinare. n funcie de complexul ag-ac studiat, reaciile de aglutinare se pot efectua fie n tuburi, (tehnic mai laborioas, dar care permite cuantificarea reaciei), fie pe lam (reacie mai rapid, dar mai puin sensibil, care ofer doar relaii calitative).Pentru a obine rezultate corecte printr-o reacie de aglutinare trebuie respectate anumite condiii. Astfel, unele reacii se petrec la 37C pe cnd altele la 4C. De asemenea, n cazul unei concentraii prea mari de anticorpi n serul imun, aglutinarea este inhibat i apare dac se dilueaz serul. Acest fenomen este denumit fenomen de prezon. Din acest motiv trebuie inut cont de titrul indicat pe fiolele ce conin serurile imune, att pentru reaciile n tuburi, precum i cel pentru reaciile de aglutinare pe lam.Aplicaiile practice. Reaciile de aglutinare sunt utilizate att n diagnosticul serologic pentru evidenierea ac necunoscui n serurile de cercetat, prin intermediul antigenelor cunoscute, precum i n cel bacteriologic pentru identificarea bacteriilor cu ajutorul anticorpilor cunoscui.1. Reaciile de serodiagnostic se efectueaz n tuburi i se utilizeaz pentru titrarea ac din serul bolnavilor. Ele se aplic n infeciile n care diagnosticul bacteriologic nu este ntotdeauna concludent sau germenii sunt greu de cultivat, ca, de pild, n serodiagnosticul febrei tifoide2 (analiza seric calitativ), al brucelozei3(reacia Wright), al tifosului exantematic4 (reacia Weil-Felix) etc.Vom prezenta n continuare reacia de aglutinare n tuburi prin procedeul Wright, utilizat n serodiagnosticul brucelozei.Principiu: se pun n contact diluii din serul de bolnav cu cantiti fixe de ag brucelic.Tehnic: se folosete ca ag o suspensie de Brucella, n concentraie de 10 miliarde pe ml, n soluie clorurat izotonic fenolat 5/1000. Serul de bolnav trebuie s fie proaspt, limpede, nehemolizat, inactivat 20 la 56C (pentru distrugerea unor eventuali ac aglutinani). n tuburile de aglutinare se fac diluii n soluie clorurat izotonic, peste care se adaug o cantitate fix de 0,5 ml din suspensia antigenic (diluat 1/10), dup schema de mai jos:Tuburile se agit i se las 24 de ore la 37C i apoi o or la temperatura camerei. Citirea se face cu ochiul liber. Se consider reacie pozitiv, prezena unui sediment n form de umbrel, care prin agitare se desface n grunji. Titrul reaciei este indicat de diluia maxim de ser la care mai are loc aglutinarea (eprubeta n care dup o agitare uoar depozitul se desface n grunji). Reacia este negativ atunci cnd suspensia rmne omogen.Interpretarea reaciei: n comparaie cu martorul pentru antigen, intensitatea aglutinrii se noteaz astfel:++++= aglutinare total cu limpezirea complet a supernatantului,+++= aglutinare 75% cu limpezirea aproape complet a supernatantului,++= aglutinare 50%, fr limpezirea complet a supernatantului,+= aglutinare 25% fr limpezirea supernatantului.Titrul de diagnostic este la diluia de 1/100, dac intensitatea aglutinrii este de minimum 50% (++).Interpretarea reaciei: o aglutinare(++) la diluia de 1/50 a serului este socotit dubioas,(++) la titrul 1/100 : reacie slab pozitiv, (++) la titrul 1/200-1/400: reacie pozitiv, (++) la titrul de 1/800 sau mai mult : reacie intens pozitiv.n general, un titru de 1/80, sau mai mare, n a doua sptmn de boal poate fi interpretat ca infecie.Exist situaii cnd se practic teste screening de evidenierea calitativ a unor anticorpi n serurile unei colectiviti, prin aglutinare pe lam. n cazurile pozitive, se impune repetarea reaciei de aglutintare n tuburi, pentru confirmarea i titrarea anticorpilor.2. Reaciile de diagnostic bacteriologic se efecteaz pe lam (excepional n tuburi).a. Reaciile de aglutinare directe sunt rapide, mai puin costisitoare i la ndemna tuturor laboratoarelor i utilizeaz seruri imune ce conin anticorpi. n laboratoarele de hematologie reacia de hemaglutinare se utilizeaz n determinarea grupelor sanguine.n diagnosticul microbiologic aceste reacii se folosesc la identificarea unor enterobacterii pe baza structurii antigenice (Salmonella, Shigella, Escherichia coli enteropatogen).n principiu se pun n contact pe lam seruri imune cunoscute cu tulpina de identificat. Pe baza serului cu care tulpina va aglutina se poate stabili cu uurin identitatea tulpinii de cercetat.Tehnic: pe o lam degresat se pune o pictur de ser aglutinant, de exemplu antidizenteric sau antitific. Cu ajutorul ansei bacteriologice se ia o mic cantitate de cultur microbian de cercetat, dezvoltat pe un mediu solid i se depune alturi de pictura de ser. Se umecteaz ansa n ser i se emulsioneaz cultura microbian pn se obine o suspensie omogen. Dup cteva minute, n cazul n care microbul este de aceeai specie cu cel care a servit la prepararea serului aglutinant, se observ formarea unor grunji, emulsia devenind neomogen, aglutinat. n cazul apariiei unei aglutinri, se controleaz caracterul specific cu un martor. n orice identificare prin aglutinare pe lam trebuie controlat tulpina dac nu este n form R(rough), care aglutinez spontan n ser fiziologic i deci nu poate fi identificat.Datorit posibilelor nrudiri antigenice, n reacie ar trebui folosite doar seruri monovalente adsorbite, deci care conin ac fa de un anumit ag al bacteriei respective.b. Reaciile de aglutinare pasiv sunt reacii n care antigenul este adsorbit pe particule inerte cum sunt latexul, hematiile etc. Dac pe particulele inerte se adsorb anticorpi, vorbim de o reacie pasiv invers.Latexaglutinarea pasiv este utilizat n laboratorul de microbiologie n diagnosticul serologic al unor infecii bacteriene (streptococice, cu treponema etc.), parazitare (cu toxoplasma etc.) i mai ales n numeroase infecii virale, datorit dificultii de cultivare a virusurilor.Un exemplu clasic de latex-aglutinare l constituie diagnosticul artritei reumatoide. n aceast afeciune pacientul produce ac (de regul IgM) mpotriva propriilor sale IgG. Testul const n absorbia IgG pe particule de latex i punerea lor n contact cu serul bolnavului. Producerea aglutinrii indic prezena ac, deci un test pozitiv. Ac este denumit factor reumatoid.Latexaglutinarea pasiv invers este utilizat pentru detectarea antigenelor prin intermediul anticorpilor adsorbii pe suprafaa particulelor de latex. Exist numeroase kit-uri comerciale preparate de diferite firme n acest scop, pe care laboratorul de microbiologie le utilizeaz n identificarea diverilor ageni patogeni pe baza structurii lor antigenice ca, de pild, a grupului de streptococi, a tulpinilor de Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli etc.Coaglutinarea este tot o aglutinare pasiv invers bazat pe proprietatea proteinei A a S. aureus de a reaciona spontan cu fragmentul Fc al imunoglobulinelor i de al fixa la suprafaa corpului bacterian. Se utilizeaz frecvent n identificarea diverilor ageni infecioi.n rutin a intrat determinarea grupelor de streptococi. Dac ac antistreptococici (imunoglobuline), cunoscui, specifici de grup5 se pun n contact cu proteina A a stafilococilor ei se vor lega n mod nespecific prin fragmentul Fc ocupat de proteina A. Fragmentele Fab rmase libere reacioneaz n mod specific cu streptococii din cultura microbian cercetat, permind astfel identificarea grupului n raport cu serul care produce aglutinarea.Prin latexaglutinare i coaglutinare se poate pune un diagnostic rapid prin identificarea bacteriilor direct din produsul biologic recoltat de la pacient. Acest aspect este important n meningite care pun n pericol viaa pacientului.Reacia de hemaglutinare pasiv. Aceast reacie utilizeaz hematiile ca suport inert pentru antigene i are numeroase aplicaii n virusologie i bacteriologie. Una dintre ele este diagnosticul serologic al sifilisului. Antigene extrase din tulpina de referin de Treponema pallidum Nichols6 sunt adsorbite pe suportul reprezentat de suspensia de hematii de berbec sau curcan i puse apoi n contact cu serul de cercetat. Prezena n ser a ac antitreponema duce la pozitivarea reaciei. Avantajul reaciei de hemaglutinare invers este uurina citirii i interpretrii.In practica de laborator de rutin se utilizeaz reacii de aglutinare, care de fapt nu au la baza lor o reacie propriu-zis ag-ac, ci care au aspectul macroscopic al unei aglutinri. Astfel de reacii sunt, de pild, cele de hemaglutinare care se bazeaz pe proprietatea hemaglutinant a unor virusuri. Ele se utilizeaz la identificarea i titrarea virusurilor hemaglutinante. Fa de virusurile hemaglutinante organismul produce anticorpi hemaglutino-inhibani, a cror titrare are valoare diagnostic.6.2.Reacia de precipitareEste o reacie antigen-anticorp care apare n urma punerii n contact a unui antigen solubil sau n stare coloidal cu anticorpul omolog. Complexul insolubil care se formeaz devine vizibil sub form de precipitat.Precipitatul apare numai dac moleculele de anticorp i antigen sunt cel puin bivalente (s aib minimum dou situsuri de combinare). Un situs de combinare de pe molecula de anticorp va reaciona cu un determinant antigenic al moleculei de antigen i cellalt situs de combinare poate reaciona cu un determinant antigenic al altei molecule de antigen. n acest mod se va forma o reea tridimensional, care va crete pn va deveni insolubil i va forma precipitatul. Concentraia electroliilor i valoarea pH-ului joac un rol important n apariia precipitatului.Reaciile de precipitare se utilizeaz n practica curent pentru identificarea antigenelor necunoscute cu ajutorul anticorpilor omologi prezeni n seruri imune de referin, preparate pe iepure sau alt animal i mai rar n scop invers, pentru identificarea anticorpilor.Antigenele din reacie (extracte bacteriene, filtrate de culturi microbiene sau oricare alt protein) se numesc precipitinogene, iar anticorpii de care se leag, precipitine.Reacia de precipitare este deosebit de sensibil (cantiti infime de reactani pot fi identificate) i are aplicaii n diverse domenii cum sunt microbiologia, imunologia, imunochimia, medicina judiciar etc.Reaciile de precipitare se petrec n mediu lichid sau semisolid (gel).6.2.1. Reacii de precipitare n mediu lichid1. Reacia de precipitare inelar, denumit i metoda interfacial, este reacia calitativ cea mai simpl. Se introduce, n tuburi nguste cu diametrul de 2-4mm, mai nti un volum din soluia de antigen care trebuie s fie limpede, apoi, cu o pipet efilat, se prelinge uor pe peretele eprubetei un volum egal din serul imun. Serul trebuie s se scurg lent, pentru a nu se amesteca cu antigenul. Dac serul este introdus cu precauie, el se va plasa la extremitatea inferioar a tubului i va fi net separat de antigen. Dup 5 - 20 de minute, apare un precipitat inelar alburiu, la limita de separare a reactivilor (reacie pozitiv). Inelul de precipitare va fi absent la martorul negativ (care conine ser normal i soluie de antigen).Avantajele acestei reacii sunt rapiditatea i simplitatea. Rezultatele sunt calitative (identific antigenul) i nu indic numrul sistemelor antigen-anticorp implicate.Se utilizeaz:pentru evidenierea apariiei anticorpilor la un animal n curs de imunizare;n laboratorul clinic pentru: diagnosticul de boal (meningit), diagnosticul retrospectiv al antraxului (reacia ASCOLI), stabilirea grupelor de streptococi beta-hemolitici;n controlul alimentelor pentru identificarea originii crnii;n medicina judiciar pentru determinarea originii umane sau animale a unei pete de snge etc.Exemplificm reacia de precipitare n inel prin reacia Ascoli, de diagnostic retrospectiv al infeciei crbunoase.Reacia de termoprecipitare Ascoli este o reacie care are loc ntre un ser imun anticrbunos i un antigen precipitant obinut din resturile de organe ale animalelor suspecte de a fi murit n urma unei infecii crbunoase. Buci de piele, resturi de diverse organe se mojresc, se dilueaz 1/10 cu ser fiziologic, se fierb 10' i se filtreaz. Lichidul obinut este antigenul ASCOLI. Dac animalul de la care provin organele a fost infectat, reacia n inel va fi pozitiv.Reacia de floculare este o reacie de precipitare cantitativ i este utilizat n laboratoarele de microbiologie pentru titrarea toxinelor sau a antitoxinelor. ntruct precipitarea se produce numai n zona de echivalen a celor doi parteneri de reacie, cunoscnd titrul unuia putem stabili titrul celuilalt.n principiu, se introduc ntr-un un ir de tuburi, care conin o cantitate fix de ser al crui titru n antitoxine dorim s-l aflm, doze crescnde de toxin (antigen). Tuburile se menin 24h la +4C. Dac le vom studia atent, vom observa c precipitarea s-a produs doar n tuburile din mijlocul irului. Aa cum rezult i din figur, n primele tuburi, n zona excesului de ac, se fixeaz toate ag formnd complexe ag-ac invizibile iar n supernatant este prezent ac liber. n zona unde cei doi reactani sunt n cantiti echivalente se formeaz o reea mare, vizibil, n care moleculele de antigen alterneaz regulat cu cele de anticorp. n fine, n ultimele tuburi, ag sunt n exces i din nou reeaua nu se mai poate forma. Aceasta este teoria reelei (Marrack, 1934) care explic reacia de precipitare cantitativ.Se pot obine curbe care exprim cantitatea de anticorpi coninut n precipitat n funcie de cantitatea de antigen. Aspectul curbelor difer n funcie de animalul imunizat, precum i de antigenul fa de care este imunizat.6.2.2. Reacii de precipitare n gelSe bazeaz pe proprietatea soluiilor de ag i ac de a difuza lent n mediu semisolid (gel de agar, agaroz, amidon, gelatin) i de a precipita vizibil sub form de linii, arcuri sau inele n zonele n care se ntlnesc n proporie optim (zone de echivalen).Dac o soluie conine mai multe antigene, n contact cu anticorpii omologi vor produce n gel tot attea linii de precipitare cte sisteme ag-ac se formeaz simultan.n principiu se utilizeaz urmtoarele tehnici:imunodifuzia simpl (uni i bidimesional),imunodifuzia dubl (uni i bidimesional).Imunodifuzia simpl unidimensional (OUDIN). ntr-o eprubet cu diametru de 2-3 mm se introduce geloz n care a fost ncorporat anticorpul cunoscut. Pe suprafaa gelozei solidificate se depune antigenul i se inchide eprubeta. Antigenul va migra n geloz i va forma o zon de precipitare acolo unde este n echivalen cu anticorpul. Dac exist mai multe sisteme ac-ag, vor aprea tot attea zone de precipitare. Aceast tehnic permite separarea simultan a mai multor sisteme antigen anticorp.Imunodifuzia radial simpl bidimensional (MANCINI). Anticorpul este nglobat n gel, iar antigenul se depune ntr-un godeu practicat n mediu. Ag va difuza n gel i n zona de echivalen cu ac se va forma un inel de precipitare n jurul godeului. Diametrul inelului este proporional cu concentraia de Ag.Aceast metod se utilizeaz n practic pentru determinarea cantitativ a concentraiei proteinelor plasmatice: imunoglobuline (IgG, IgM, IgA), proteinele sistemului complement, proteina C reactiv.Tehnica imunogramei. Imunograma (dozarea IgG, IgM i IgA serice) este cea mai frecvent utilizare a imunodifuziei radiale Mancini. Se utilizeaz imunoplci, comercializate de Institutul Cantacuzino. Acestea sunt plci de material plastic incolor, cu diametrul de aproximativ 5 cm, ce conin mediu gelozat cu 9 godeuri practicate n grosimea sa (8 godeuri periferice i un godeu central).In mediu este nglobat anticorpul specific i un colorant care difer pentru fiecare imunoglobulin cercetat: albastru pentru IgG, rou pentru IgA i verde pentru IgM. n godeuri se depun serurile de cercetat (n acest caz imunoglobulinele de testat au rol de ag) i placa se menine 48 de ore la temperatura camerei.Citire i interpretare: se msoar diametrele inelelor de precipitare din jurul godeurilor i se calculeaz concentraia de Ig cu ajutorul unei curbe de referin.Imunodifuzia dubl unidimensional se efectueaz tot n tuburi cu diametru de 2-3mm care conin geloz n care s-a incorpat anticorpul, un strat de geloz simpl iar deasupra, fie un strat lichid, fie un strat de geloz n care se afl antigenul. Deci, anticorpul i antigenul sunt separate de un strat de geloz. Cei doi parteneri de reacie vor migra unul spre cellalt, producnd n stratul intermediar zone de precipitare. Reacia este foarte sensibil.Imunodifuzia dubl i bidimensional. Att ag ct i ac se depun la suprafaa mediului n godeuri (Ouchterlony) sau difuzeaz unul spre cellat din dou benzi de hrtie mbibate cu ac respectiv ag, aezate pe suprafaa gelozei la distan una de cealalt (Elek). Reactanii difuzeaz unul spre cellalt n mediu i precipit n locul de echivalen sub forma de linii sau arcuri. Este o metod calitativ utilizat pentru caracterizarea antigenelor n amestec.Viteza de difuzare a antigenelor depinde de mrimea i forma lor. Liniile care se formeaz pot fi interpretate astfel nct s se determine dac reactanii sunt identici sau diferii.Prin tehnica Outcherlony se evidenia n trecut antigenul HBs n serul pacienilor suspeci de infecie cu virusul hepatitei B. Testul Elek se utilizeaz i astzi la evidenierea toxinei bacilului difteric.6.2.3. Metode de imunoprecipitare n gel combinate cu electroforezaImunoelectroforeza (Grabar i Williams) asociaz electroforeza cu imunodifuzia dubl radial. Ea presupune separarea electroforetic a componentelor nainte de a difuza i precipitarea lor ulterioar cu un ser imun. Aceast metod se aplic amestecurilor antigenice complexe, care nu pot fi separate prin metodele descrise mai sus, de pild separarea proteinelor plasmatice.Imunoelectroforeza se efectueaza ntr-un gel subire turnat pe o plac de sticl. Gelul conine un tampon care modific mobilitatea electric a proteinelor. Unul dintre reactani, serul uman, dac vrem s punem n eviden diversele fraciuni proteice plasmatice, se depune ntr-un godeu. Placa se plaseaza n cmp electric. Diversele fraciuni proteice din plasm migreaz n cmp n funcie de ncrctura lor electric i se separ n decurs de cteva ore.Pentru a evidenia vizual separarea se decupeaz n gel un an paralel cu direcia de migrare a ag, n care se depune ac omolog, n cazul nostru, ser anti-om1 . Acesta va difuza pasiv prin gel (timp de 48 de h), va ntlni componentele antigenice separate electroforetic i va forma cu acestea precipitate vizibile sub forma de arcuri cu poziii caracteristice. Preparatul se usuc i se coloreaz pentru a pune n eviden liniile de precipitare.Imunoelectroforeza n rachet rezultat din asocierea tehnicii Mancini cu imunoelectroforeza, permite o apreciere cantitativ relativ a antigenelor.Antigenele n concentraii diferite se depun n godeuri iar ac este nglobat n gel. pH-ul gelului este ales astfel nct ac sa rmn imobil iar ag s se ncarce negativ. Placa se plaseaz n cmp electric, ag migreaz i reacioneaz cu ac, rezultnd un precipitat sub forma de rachet. nlimea arcurilor este direct proporional cu cantitatea de ag. Comparnd nlimea probei cu un standard se poate determina concentraia de ag. Reacia se poate utiliza i n sens invers, pentru determinarea cantitativ a ac.Contraimunoelectroforeza se desfoar dup acelai principiu ca cel al imunodifuziei duble, dar sensibilitatea acestei metode este mai mare. Reacia are loc n gel, al crui pH este stabilit astfel nct ac s se ncarce pozitiv, iar ag negativ (ac vor avea ncrctur electronegativ slab iar ag sarcin electronegativ mai mare). Ambii reactani se depun n godeuri. Placa se plaseaz n cmp electric, orientat cu godeul ce conine ac spre anod i godeul cu ag spre catod. Astfel particulele ionice vor migra n sens contrar (ac+ spre catod i ag- spre anod) i la locul de ntlnire vor forma arcuri de precipitare.Cu toate c este o metod calitativ, are avantajul sensiblitii deosebite i a rapiditii.Contraimunoelectroforeza se utilizeaz pentru detectarea rapid a antigenelor n umori. Ag HBs al virusului hepatitei B, de pild, era depistat prin aceast metod nainte de introducerea n practica de rutin a tehnicii Elisa.6.3. Reacia de fixare a complementului (RFC)RFC este o reacie ag-ac utilizat n diagnosticul serologic al multor infecii ca, de pild, n sifilis i se bazeaz pe proprietatea complexelor antigen-anticorp, de a fixa complementul, care nu va mai fi disponibil unui al doilea sistem ag-ac, sistemul indicator, format din hematii de oaie i ser antioaie.Principala diferen ntre RFC i celelalte reacii serologice studiate pn n prezent const n faptul c, pentru a obine o reacie vizibil, sunt necesare dou reacii antigen-anticorp care se desfoar secvenial, prima reacie reprezentnd sistemul test iar a doua sistemul indicator.In reacia de fixare a complementului se utilizeaz:sistemul test, ce include: un antigen cunoscut i serul de cercetat;sistemul complement, n cantitate cunoscut, predeterminat;sistemul indicator ce include: eritrocite de oaie (cu rol de antigen) i ser de iepure ce conine anticorpi antieritrocite de oaie (hemolizine ce sensibilizeaz eritrocitele de oaie, dar care fr complement nu vor putea liza aceste hematii).Principiul reaciei de fixare a complementului. Aceast reacie are loc n dou faze. n prima faz se pun n contact serul de cercetat, deci serul n care vrem s evideniem prezena sau absena anticorpilor, antigenul specific cunoscut i o cantitate cunoscut, predeterminat de sistem complement.n cazul n care serul de cercetat conine anticorpi specifici fa de antigenul utilizat se formeaz un compex specific antigen-anticorp. Adugnd sistemul complement acesta este fixat devenind parte integrant din complexul antigen-anticorp. Deoarece aceast reacie nu este vizibil macroscopic se introduce n reacie, n faza a doua a acesteia, sistemul indicator. Eritrocitele de oaie sensibilizate prin hemolizin nu vor fi lizate, deoarece complementul a fost fixat de ctre complexul antigen-anticorp din sistemul test. Aceasta este interpretat ca reacie pozitiv i indic prezena anticorpilor n sistemul test.n cazul n care serul de cercetat nu conine anticorpi specifici fa de antigenul specific cunoscut, n prima faz a reaciei nu se va forma compexul antigen-anticorp specific. Complementul rmne liber n reacie (nefixat) i este capabil s produc liza eritrocitelor de oaie sensibilizate din sistemul indicator. Acesta este interpretat ca reacie negativ i indic absena anticorpilor din sistemul test.Pregtirea reactivilor. Serul de cercetat trebuie recoltat n condiii sterile, n recipiente curate i sterile. nainte de efectuarea reaciei serul va fi centrifugat i apoi, obligatoriu, inactivat 30 de minute la 56C pentru distrugerea complementului propriu asfel fiind evitate reaciile fals pozitive cauzate de puterea anticomplementar a serului.Antigenul. n funcie de natura infeciei, antigenele utilizate pot fi suspensii microbiene n ser fiziologic steril, extracte bacteriene sau autolizate pentru diagnosticul infeciilor bacteriene sau suspensii de corpusculi elementari, extracte de organe infectate sau embrionare pentru cele virotice.Pentru ca aceste antigene s poat fi utilizate n reacia de fixare a complementului, ele trebuie titrate din punct de vedere al puterii anticomplementare i al puterii antigenice.Titrarea puterii anticomplementare a antigenului. Indiferent de natura lor, antigenele pot, n anumite proporii, s fixeze nespecific o anumit cantitate de complement n lipsa anticorpului specific, proces cunoscut ca putere anticomplementar a antigenului. Dac ntr-o reacie antigenul se gsete n exces, acesta poate fixa nespecific complementul i poate mpiedica hemoliza, rezultnd reacii fals pozitive. De aceea este necesar titrarea, n prealabil, a puterii anticomplementare a antigenului utilizat i folosirea acestuia, n reacie, n proporii situate n afara zonei de aciune anticomplementar.Prin titrarea puterii anticomplementare a antigenului se nelege determinarea cantitii maxime de antigen care singur, n absena anticorpului, nu fixeaz nici cea mai mic cantitate de complement (n eprubet rezult o hemoliz complet).Titrarea puterii antigenice. Puterea antigenic reprezint cantitatea minim de antigen care n prezena anticorpului specific fixeaz complementul. Pentru determinarea puterii antigenice se titreaz aceast cantitate minim de antigen care se utilizeaz apoi n reacia de fixare a complementului.Titrarea puterii antigenice se face n comparaie cu un ser standard (specific antigenului) cu un coninut cunoscut de anticorpi. Puterea antigenic va fi cu att mai mare cu ct permite decelarea unei cantiti mai mari de anticorpi n serul de cercetat.Complementul este prezent n serul proaspt recoltat de la un animal sntos. n general se utilizeaz serul de cobai, care conine cea mai mare cantitate de complement. Pentru a evita variaiile titrului complementului, se amestec 5-10 ml snge obinut de la 4-5 cobai sntoi, recoltat prin puncie cardiac. Dup coagularea sngelui se decanteaz serul, se centrifugheaz i se pstreaz la frigider (+4C) pn n momentul ntrebuinrii. Complementul astfel obinut se titreaz obligatoriu naintea fiecrei reacii de fixare a complementului, deoarece titrul su prezint, n timp, variaii destul de importante. Pentru aceasta, complementul se dilueaz 1/10 n ser fiziologic 8,5 n momentul ntrebuinrii. Prin titrare se determin unitatea complementar, adic doza minim de complement care produce hemoliza total a unui mililitru de sistem hemolitic n 30 de minute la 37C.Exist preparate comerciale de complement liofilizat.Tehnica reaciei. n opt eprubete de hemoliz se repartizeaz cte 1ml sistem hemolitic indicator. n primele apte eprubete se adaug cantiti crescnde de complement diluat 1/10 ncepnd cu 0,10 ml i crescnd cu cantitatea de 0,05ml n fiecare eprubet pn la 0,40 ml. Se completeaz cu ser fiziologic steril pn la volumul final de 2,5 ml pentru fiecare eprubet, se agit bine i amestecul se incubeaz timp de 30 de minute la 37C,dup care se face citirea.Titrul complementului este indicat de eprubeta n care se gsete cantitatea cea mai mic de complement, deci n care se produce o hemoliz total. n reacia propriu-zis se va utiliza cantitatea imediat superioar.Dac eprubeta numrul doi reprezint unitatea complementar=0,15ml (cantitatea cea mai mic de complement ce a hemolizat complet n 30 de minute la 37C, 1ml sistem hemolitic) n reacia de fixare a complementului se va ntrebuina cantitatea imediat superioar=0,20 ml.Sistemul hemolitic este compus din eritrocite de oaie sau berbec i ser hemolitic anti eritrocite de oaie, preparat pe iepure.Pentru prepararea serului hemolitic se recolteaz steril, snge din vena jugular a unui berbec sntos. Sngele recoltat se introduce ntr-un balon cu perle de sticl care se agit 10-15 minute pentru defibrinare. Eritrocitele rezultate sunt splate de plasm prin centrifugare. Pentru aceasta sunt introduse ntr-o eprubet de centrifug pe care se marcheaz nivelul superior, pn unde se gsea plasma, nlocuit cu ser fiziologic steril. Se aplic o centrifugare de 10-12 minute dup care supernatantul se decanteaz i se nlocuiete din nou cu ser fiziologic steril pn la nivelul marcat anterior. Sedimentul de eritrocite rmne n suspensie n ser fiziologic. Centrifugarea pentru splarea eritrocitelor se aplic de 3-4 ori pn cnd serul fiziologic rmne limpede, incolor.Dup ultima centrifugare eritrocitele sunt readuse la volumul iniial cu soluia de ser fiziologic. Eritrocitele astfel splate sunt inoculate la iepure n vena marginal a urechii. Se practic 3 inoculri la intervale de 4 zile astfel: 5ml, 3ml, 1ml. nainte de ultima inoculare se face sensibilizarea iepurelui cu 1ml eritrocite diluate 1/10. Dup 8 zile de pauz se realizeaz o sngerare de prob pentru a determina titrul serului hemolitic obinut. Dac titrul este suficient de ridicat se practic sngerarea definitiv, n mod steril, fie prin puncie cardiac fie din artera carotid. Sngele se las s coaguleze, se decanteaz serul, se centrifugheaz pentru ndeprtarea tuturor eritrocitelor, dup care se inactiveaz. Se obine astfel un ser de iepure cu aciune hemolitic asupra eritrocitelor de oaie. Dup titrare serul hemolitic se repartizeaz n fiole.Pentru recoltarea i pregtirea eritrocitelor de oaie sau de berbec tehnica este identic cu cea utilizat pentru prepararea serului hemolitic. n ziua n care se practic reacia, se recolteaz steril snge de berbec, se introduce n balon cu perle de sticl care se agit pentru realizarea defibrinrii dup care se spal cu ser fiziologic steril prin centrifugare de 3-4 ori. Dup ultima splare se ndeptreaz complet serul fiziologic i se pstreaz numai depozitul de eritrocite.Pentru titrarea serului hemolitic sunt necesare: eritrocite de oaie, complement i ser fiziologic steril 8,5. Suspensia de eritrocite se obine astfel: 1,5 ml sediment de eritrocite de oaie + 98,5 ml soluie de ser fiziologic steril 8,5 = suspensie 1,5% de eritrocite n ser fiziologic.ntr-o serie de 10 eprubete de hemoliz se fac diluii succesive de ser hemolitic ncepnd de la diluia 1/100, 1/500, 1/1000 etc., pn la 1/4000. Apoi se repartizeaz cte 1 ml din fiecare diluie de ser hemolitic n fiecare eprubet. Se adaug n toate eprubetele cte 1 ml din suspensia de eritrocite 1,5% i apoi cte 0,5 ml complement diluat 1/10 n ser fizilogic (n afar de ultima). Eprubetele se agit i se menin la termostat la 37C timp de 30 de minute, dup care se face citirea.Titrul serului hemolitic este reprezentat de unitatea hemolitic = cantitatea minim de ser care n volumul total de 2,5 ml i n prezena a 0,5 ml complement diluat 1/10 a podus n 30 de minute liza total a 1 ml suspensie de eritrocite 1,5%. Dac eprubeta 5 este ultima n care s-a produs hemoliza total dup 30 de minute, nseamn c serul are titrul de 1/2000, adic: dac 1 ml din diluia de ser 1/200 a hemolizat 2000 ml suspensie de eritrocite 1,5%, atunci 1 ml din serul brut va hemoliza 2000 ml de suspensie de eritrocite 1,5%. n reacia de fixare a complementului se utilizeaz ntotdeauna o cantitate de 4 ori mai mare dect cea reprezentat de titrul obinut. Deci, dac titrul obinut este 1/2000, n reacie se va utiliza titrul de 1/500.Pentru a se poduce sensibilizarea eritrocitelor nainte de utilizarea n reacie, acest amestec se agit bine i se menine la termostat la 37C timp de 30 de minute.Tehnica propriu-zis. ntr-un ir de cinci eprubete se pun n contact, n prima etap, serul de cercetat, antigenul specific diluat 1/10 i complementul diluat 1/10 (toate elementele sunt preparate i titrate nainte de efectuarea reaciei). Eprubetele se agit energic i se menin la frigider la 4C timp de 16 ore (timp n care se produce sau nu fixarea complementului de ctre compexul antigen-anticorp, n funcie de prezena respectiv absena anticorpilor n serul de cercetat). n a doua etap se adaug sistemul hemolitic indicator i se menine la termostat la 37C pentru nc 30 de minute dup care se face citirea reaciei.Se menine la 37C timp de 30 de minute dup care se face citireaCitirea reaciei ncepe ntotdeauna cu martorii.1.Martorul pentru serul de cercetat ( eprubeta 2) trebuie s fie ntotdeauna hemolizat.2.Martorul pentru antigen (eprubeta 3) trebuie s fie ntotdeauna hemolizat.3.Martorul pentru complement (eprubeta 4) trebuie s fie ntotdeauna hemolizat.4.Martorul pentru sistemul hemolitic (eprubeta 5) trebuie s fie ntotdeauna nehemolizat.Interpretarea reaciei de fixare a complementuluiDac n eprubeta cu serul de cercetat exist hemoliz total reacia este negativ, notat -, adic nu exist anticorpi specifici n serul de cercetat.Dac n eprubeta cu serul de cercetat nu exist hemoliz, aceasta poate fi de diferite grade. Reacia este pozitiv, exist anticorpi specifici n serul de cercetat i se noteaz n funcie de intensitate cu : +, ++, +++, ++++.

REACII CU ANTICORPI MARCAIReaciile cu anticorpi marcai au fost introduse n scopul de a mri sensibilitatea i specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Moleculele de anticorpi pot fi marcate cu substane radioactive, fluorescente sau cu enzime i se utilizeaz n radioimunodozri, n imunofluorescen i respectiv n testele Elisa.7.1. ImunofluorescenaImunofluorescena, descris n 1941 de Coons, este o metod care permite, datorit conjugrii anticorpilor cu o substan fluorescent, evidenierea optic prin microscopie n lumin ultraviolet, a complexelor antigen-anticorp. Cea mai frecvent utilizat substan fluorescent este izotiocianatul de fluorescein cu o fluorescen verde, urmat de rhodamina B cu fluorescen orange.Exist mai multe tehnici, dar toate au acelai principiu, i anume evidenierea partenerului de reacie cutat prin punerea lui n contact cu al doilea partener al reaciei antigen - anticorp marcat cu o substan fluorescent.Imunofluorscena directImunofluorescen direct este una din cele mai rapide, sensibile i specifice metode de diagnostic utilizat n diagnosticul microbiologic. Prin aceast metod se pot identifica microorganisme (sau antigenele lor) direct din produsele biologice, precum i din culturi. De asemenea, se pot evidenia diverse antigene prezente n esuturi.Frotiul pe care se afl antigenul de evideniat se coloreaz cu un conjugat fluorescent de anticorpi specifici timp de aproximativ 30 de minute. Dup acest interval de timp n care anticorpii marcai se fixeaz de antigenele specifice, se spal lama pentru a ndeprta excesul nefixat de anticorpi fluoresceni. Lama se examineaz la microscopul cu lumin UV. Dac antigenul cutat este prezent, pe lam se vor observa complexele antigen-anticorpi fluorescente pe fondul ntunecat al microscopului. Dac, dimpotriv, antigenul este absent, fluorescena va lipsi.La ora actual sunt disponibile seruri imune pentru identificarea multor microorganisme, ca de pild: Boredetella pertussis i parapertussis, Escherichia coli enteropatogen, Franciscella tularensis, Haemophilus influenzae, specii de Klebsiella, specii de Legionella, leptospire, listerii, Neisseria gonorrhoeae i meningitidis, Pseudomonas pseudomallei, salmonele, shigele, stafilococi, pnumococi, streptococi de diverse grupe, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Candida albicans etc. De asemenea se identific i virusuri, cum sunt: Adenovirusuri, Herpesvirusuri, virusurile gripale, virusul rabic etc.Prezentm n continuare evidenierea Chlamydiei trachomatis n secreiile cervicale prin IF, deoarece cea mai accesibil posibilitate de diagnostic n aceste infecii, cultivarea chlamydiilor, este posibil numai n culturi de celule.Principiu: corpusculii elementari sau reticulai din secreia recoltat din colul uterin se evideniaz cu anticorpi monoclonali fluoresceni antichlamydia.Materiale:1. Lame pentru microscop cu fluorescen2. Trus cu anticorpi monoclonali fluoresceni anti-MOMP (proteina de suprafa a chlamydiei) care coine anticorpi marcai liofilizai, soluie de reconstituire, lichid de montaj al preparatului i lamele pentru montaj.3. Lame de control pozitive i negative.4. Microscop cu epifluorescen.Tehnica:se aduc toi reactivii la temperatura camerei cu 30 de minute nainte de nceperea lucrului;se efectueaz lamele prin rularea tampoanelor pe godeul lamei, acoperind ntreaga suprafa a godeului, care la sfrit trebuie s prezinte o opacitate discret, semn al unui numr suficient de celule;se usuc lamele complet la temperatura camerei;se fixeaz preparatele cu alcool metilic pn la evaporarea complet a acestuia;se agit flaconul cu anticorpi monoconali reconstituii cu lichid de reconstituire i se pipeteaz 30 microlitri de reactiv pe fiecare godeu, inclusiv pe martorul pozitiv i negativ;se incubeaz lamele n camer umed la 37C timp de 15 minute;se spal preparatele atent cu ap deionizat timp de 10 secunde;se usuc lamele la temeratura camerei la ntuneric; se monteaz preparatele prin depunerea pe godeu a unei picturi de lichid de montaj i aplicarea unei lamele;citirea se face la microscopul cu epifluorescen, mai nti cu obiectivul 40x, iar apoi pentru confirmare cu obiectivul 100x cu imersie; citirea se ncepe cu martorii;InterpretareCorpusculii elementari apar ca nite formaiuni punctiforme fluoescente de culoare verde galben-deshis pe fondul colorat brun rocat al celulelor. Se examineaz obligatoriu ntreg preparatul.Metoda are avantajul unei sensibiliti i specificiti sporite, precum i cel al rapiditii. Dezavantajele sunt: costul ridicat al reactivilor, accesul la un microscop cu fluorescen cu performan ridicat, precum i faptul c examinarea corect a fiecrui preparat n parte este dificil i obositoare pentru examinator.Imunofluorescena n sandwichSe utilizeaz pentru evidenierea unor anticorpi antitisulari. Pe preparatul din esutul de studiat se aplic o soluie care conine antigenul corespunztor. Dup ce acesta s-a unit cu anticorpul se acoper preparatul cu anticorpi fluoresceni fa de antigenul aplicat anterior.Imunofluorescena indirectAceast variant a IF este utilizat n general pentru evidenierea anticorpilor ntr-un mediu biologic, ca de pild anticorpii anti-Treponema pallidum din ser), diagnosticul sediului unei infecii urinare etc.Pe lama care va fi utilizat se afl fixat antigenul specific pentru imunoglobulina cutat n serul pacientului. Se acoper lama cu serul de cercetat i se incubeaz pentru o perioad de timp prevzut de tehnic. n acest timp, anticorpii specifici din ser se vor fixa pe antigenele de pe lam. Dup splarea preparatului, pentru ndeprtarea excesului de anticorpi, acesta se acoper cu anticorpi anti-imunoglobulin fluoresceni. n cazul n care n serul de cercetat anticorpii cutai au fost prezeni, anticorpii anti-Ig uman se vor fixa de acetia, formnd complexe antigen-anticorpi fluorescente, vizibile microscopic n lumn UV.n acelai mod se pot evidenia i diverse antigene, cu seruri imune i cu anticorpi fluoresceni fa de anticorpii serurilor imune. Imunofluorescena indirect este mai sensibl dect cea direct.O aplicaie a IF indirecte este evidenierea complexelor antigen-anticorp n urin, marker al infeciilor urinare nalte.Imunofluorescena cu fixare de complementSe bazeaz pe proprietatea complemenului de a se lega de complexele antigen-anticorp. n acest caz se utilizeaz anticorpi fluoresceni anticomplement. Dezavantajul este c nu toate complexele ag-ac fixeaz complementul, ci numai cele n care anticorpii sunt IgG1, IgG2, IgG3 sau IgM. Ca i tehnica sandwich, acest tip de IF este mai puin utilizat n laboratorul de microbiologie.7.2.Reacii imunologice cu anticorpi marcai cu enzime - Elisa (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)Reaciile ag-ac utilizate n scop diagnostic s-au simplificat foarte mult din punct de vedere tehnic prin adsorbia ferm (immunosorbent) a unuia din partenerii reaciei (ag sau ac) pe un suport solid. Anticorpii utilizai pentru identificarea antigenului sunt marcai cu o enzim (peroxidaz) capabil s descompun un substrat cromogen (OPD = orto-difenilamin). Intensitatea culorii obinute este direct proporiional cu concentraia partenerului cutat din complexul ag-ac.Metoda Elisa direct de detectare a unui anticorp n serul pacientului. Pe pereii godeurilor unei microplci este adsorbit un anumit antigen fa de care cutm anticorpii corspunztori din ser. Dac se introduce n godeu serul de cercetat, anticorpii (dac exist) se vor fixa de antigenele legate ferm de peretele godeului i nu vor mai putea fi ndeprtai prin splare.Se adaug un al doilea anticorp - anti-Ig uman, marcat cu peroxidaz. n cazul n care exist anticorpii cutai n serul de cercetat, anti-Ig uman marcat cu o enzim se va lega de acetia. Excesul de anti-Ig se ndeprteaz prin splare. Dup adugarea unui substratului cromogen (OPD), acesta va fi descompus de peroxidaza legat de anti-Ig. Se produce o reacie de culoare, a crei intensitate se citete fotometric. Rezultatul este,deci, cantitativ.n cazul unei reacii negative, deci n absena anticorpilor cutai n serul de cercetat, antigenele de pe godeul microplcii rmn libere iar anti-Ig uman nu are de ce s se fixeze i este ndeprtat prin splare. Dup adugarea substratului cromogen, reacia de culoare nu va apare daorit absenei enzimei.

Metoda Elisa n dublu sandwich de detectare a unui antigen. De data aceasta pe godeurile microplcii se afl imobilizat anticorpul specific antigenului cutat. Se introduce n godeu materialul de testat. Dac acesta conine antigenul specific, acesta va forma un complex ag-ac cu anticorpul fixat pe godeu. Se adaug apoi un anticorp, marcat cu perozidaz, specific antigenului respectiv. Acesta se va fixa de anticorp. Se adaug substratul cromogen care se va descompune ntr-un compus colorat. Dac antigenul este absent n materialul de testat, reacia de culoare nu mai apare.Testele Elisa au uurat i mbuntit enorm diagnosticul de laborator al infeciilor, att a celor bacteriene i micotice, dar mai ales virale. Este de neimaginat astzi diagnosticul serologic al multor afeciuni fr testele imunoenzimatice.7.3. Teste RIA (radioimmunoassay)Testele RIA i Elisa deriv din tehnici care se bazeaz pe acelai principiu, dar la RIA antigenele sunt marcate radioactiv. Din cauza dificultilor tehnice i riscului de iradiere, precum i datorit sensibilitii mai bune a testelor Elisa, testele RIA au fost nlocuite de cele Elisa n laboratorul de microbiologie clinic.Evidenierea antigenelor prin RIA are la baz principiul competiiei. Astfel, pe un suport solid sunt fixai anticorpi fa de antigenul pe care vrem s-l evideniem n serul pacientului. Se adaug ser de pacient. Dac acesta conine antigenul cutat, deci ntr-o reacie pozitiv, acesta se va fixa pe anticorpii corespunztori de pe suport. ntr-un timp ulterior al reaciei se adaug antigene marcate radioactiv care nu vor mai gsi situsuri libere de combinare. Radioactivitatea va fi foarte sczut. Dac dimpotriv, reacia este negativ, nu se vor fixa antigene din ser i situsurile de combinare vor rmna libere pentru ag marcate radioactiv. n aceast situaie radioactivitatea va fi mare.7.4. Metoda Western blotEste metoda de referin n diagnosticul serologic n SIDA datorit sensibilitii ei deosebite. Ea combin electroforeza cu reacie cu anticorpi marcai fie radioactiv, dar mai frecvent cu enzime.n principiu se separ electroforetic, ntr-un gel de poiacrilamid, moleculele antigenului infecios n funcie de dimensiunea lor. Separarea electroforetic este urmat de un electrotransfer pe un suport solid de nitroceluloz. Acesta este incubat cu serul pacientului. Anticorpii vor reaciona cu fraciunile antigenice specifice de pe suport. Complexele agac formate se evideniaz prin anticorpi marcai cu enzime (mai rar radioactiv).7.5. Anticorpii monoclonali n diagnosticul microbiologicn decursul rspunsului imun normal se activeaz mai multe clone de limfocite B, care produc anticorpi cu afinitate mai mare sau mai mic pentru antigenul respectiv, astfel c n ser vom gsi un amestec de anticorpi. Acest aspect se explic prin faptul c, n general, antigenele au mai muli epitopi. Astfel, dac 2 antigene au pe lng epitopii specifici i epitopi comuni, vor induce formarea de anticorpi policlonali care vor reactiona cu ambele antigene prin epitopii comuni (reacie ncruciat).Pentru a preveni reaciile ncruciate, s-au preparat seruri monospecifice prin adsorbia unei pri din anticorpi. Nici specificitatea acestor seruri nu este satisfctoare nici n diagnostic i nici n cercetare.Astfel a aprut necesitatea preparrii n laborator a unor anticorpi cu specificitate perfect care s fie sintetizai de o singur clon de limfocite B. Acetia sunt anticorpii monoclonali, care s-au obinut n laborator prin izolarea n cadrul unui rspuns imun policlonal a unui singur limfocit B i hibridizarea lui cu o celul tumoral care s-i confere imortalitate.Produsul de fuziune, hibridomul, unete imortalitatea celulei tumorale cu specificitatea celulei B.Anticorpii monoclonali sunt foarte valoroi ntruct recunosc un singur epitop. Ei nu reacioneaz ncruciat dect n cazuri de excepie cnd structurile sunt extrem de asemntoare.Foarte multe echipe de cercettori se ocup n ultimul deceniu cu prepararea anticorpilor monoclonali antibacterieni, antivirali i antiparazitari n scop diagnostic. Acetia se utilizeaz mai ales acolo unde cultivarea microorganismului cutat este dificil (sifilis, infecii cu chlamydii, toxoplasme, diverse virusuri etc).Anticorpii monoclonali servesc att n evidenierea direct a germenilor n produsele biologice, ceea ce scurteaz considerabil durata diagnosticului, precum i n diagnosticul serologic. n IF, Elisa, Ria, Western-blot se utilizeaz numai anticorpi monoclonali.Pe lng avantajele mai sus menionate privind specificitatea i rapiditatea metodelor ce folosesc anticorpi monclonali se mai adaug i faptul c odat realizat o clon celular productoare de anticorp, acesta poate fi obinut n cantiti infinite, cu proprieti constante.

1