1 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Report Stiintific Asupra stadiului de implementare a proiectului de cercetare FUNCTIONALIZAREA CU PLASMA A SONDELOR NANOSCOPICE in perioada ianuarie, 2015 – decembrie, 2015

Grant CNCSIS, IDEI PN II 267/2011.

Grant director: Lucel Sirghi

Studiul fortelor de interactiune dintre varfurile sondelor AFM functionalizate cu plasma si specimene biologice (proteine si membrane lipidice)

 

1. Interactiunea intre varfurile sondelorAFM functionalizate cu plasma si biomolecule fibrilare (tropocolagen de tip I)

Microscopia cu Forta Atomica permite investigarea forțelor de legatura și a proprietăților

mecanice la nivelul unei singure molecule prin măsurători simultane ale forței și deplasarii cu

rezolutii de 10pN și, respectiv, 0,1 nm (Lavery, R.; Lebrun, A.; Allemand, J.-F.; Bensimon, D.;

Croquette, V. J. Phys.: Condens. Matter. 2002, 4, R383-R414). Astfel de investigatii au fost

facute pentru studiul moleculelor de DNA (Smith, S.; Cui, B., Y.; Bustamante, C. Science 1996,

271, 795-799), RNA (Abels, J. A.; Moreno-Herrero, F.; Van der Heijden, T.; Dekker, C.;

Dekker, N. H. Biophys. J. 2005, 88, 2737-2744), proteine (Rief, M.; Gautel, M.; Oesterhelt, F.;

Fernandez, J. M.; Gaub, H. E. Science 1997, 276, 1109-1112), polizaharide si alte biomolecule

formate de lungi lanturi polimerice (Bemis, J. E.; Akhremitchev, B. B.; Walker, G. C. Langmuir

1999, 15, 2799-2805). În aceste măsurători, un moleculele sunt legate fizic sau chimic de corpuri

mai mari (sonde nanoscopice) ce pot fi deplasate cu o precizie spațială sub actiunea unei forte

controlabile. In cazul tehnicii AFM, un capăt al unei molecule este legat de vârful sondei AFM și

celălalt capăt este legat de un substrat. Pentru a face acest lucru, moleculele de studiat sunt

depozitate pe un substrat de unde sunt culese de vârful AFM (Figura 1). Suprafețele vârfului și

substratului sunt adesea functionalizate chimic pentru a lega capetele moleculelor studiate prin

interacțiuni chimice specifice. Adsorbția fizică (nespecifică) a moleculelor pe suprafețele

sondelor AFM și a substratutrilor poate fi, de asemenea, folosita ca modalitate de legare a

moleculele. De asemenea, există experimente in care moleculele sunt „culese” de vârful sondelor

AFM direct de pe substratul lor natural, ca și în cazul moleculelor de colagen de pe tendoane și a

2 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

polizaharidelor de pe membranele bacteriilor. În toate aceste experimente, vârful sondei AFM

apasa pe suprafața specimenului pentru un anumit timp pentru a facilita formarea unei legaturi

intre suprafata acestuia si una din molecule specimenului. Legarea unei molecule de vârful

sondei AFM este inidcata de variatia caracteristica a forței entropice de intindere a moleculei

observată în timpul retragerii vârfului pe curba forță-deplasare. Pozițiile exacte ale locurilor de

legare a moleculelor pe vârful sondelor AFM si pe substrat sunt, de obicei, necunoscute. Cu toate

acestea, procedurile care sunt utilizate în mod obișnuit pentru analiza curbelor forță-extensie

pentru o singura molecula obținute în măsurătorile AFM consideră că aceste poziții sunt exact pe

varful sondei AFM si, respectiv, pe substrat, exact sub vârful sondei AFM. Având în vedere

condițiile experimentale descrise mai sus, este rezonabil să se presupună că există o anumită

distanta laterală (masurata in directia perpendiculara pe direcția de deplasare a sondei AFM), r,

intre locurile de legare a moleculei pe vârful sondei AFM și, respectiv, substrat (Fig. 1). In acest

stiudiu am investigat proprietățile mecanice ale moleculeor de colagen de tip I (purificate din

coada de sobolan) și a explicat rezultatele obtinute luând în considerare efectul distanței r dintre

locurile de legare a moleculelor pe vârful sondelor AFM și, respectiv, substrat.

Fig. 1 Schita experimentului AFM de intidere a unei singure molecule legata la capete de varful sondei AFM si de substrat. In general, distanta laterala, r, intre locurile de ancorare a moleculei de varful sondei AFM si, respective, substrat nu poate fi controlata in aceste experimente.  

3 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

1.1Depunereamoleculeordecolagenpesubstraturidesiliciusimicapentrupreparareaprobelorutilizatainspectroscopiadefortaatomica

Colagenul de tip 1 este cea mai abundenta proteina ce formeaza tesutul fibril conectiv

extracelular. Monomerul de colagen (tropocollagen) este stabilizat în soluții acide (de obicei în

HCI sau acid acetic). Neutralizarea soluțiilor monomerice de colagen conduce, de obicei, la

formarea de fibre de colagen intr-un proces entropic de auto-asamblare a monomerilor de

colagen. Substraturile hidrofobe favorizează acest proces de auto-asamblare a monomerilor de

colagen in solutie proaspăt neutralizată de colagen [Biomaterials. 2007; 28 (4): 576-85]. Prin

urmare, în protocolul nostru de preparare a probelor AFM, moleculele de colagen au fost depuse

din soluție de colagen proaspăt diluată din soluția stoc (concentrație ~ 4 mg / ml de la Sigma

Aldrich) pe substraturi hidrofile ca siliciu (100) și mică clivata proaspăt. Înaintea depunerii,

substraturile de siliciu au fost curățate și hydrophilized în plasmă de vapori de apă. Substraturile

hidrofile au fost imersate pe durate variabile de timp în solutii acide, stabilizate si diluate, de

colagen de tip I purificat din coadă de șobolan (10 µg/ml). Soluțiile diluate de colagen au fost

preparate din soluția stoc de diluare în soluție apoasă de acid acetic cu concentrație 0.1 M.

Fig. 2 a) Imaginea AFM (1 µm 1µm) a stratului de collagen depus pe substrat de siliciu pe o durata de 12 ore. b) Imaginea AFM (1 µm 1µm) a stratului de collagen depus pe substrat de siliciu pe o durata de 2 ore. Imaginile AFM au fost obtinute in modul tapping in air (suprafete dezhidratate).

a)  b)

4 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

După preparare, soluția diluată de colagen a fost utilizata imediat pentru prepararea probei sau au

fost depozitata la 4 ° C în recipiente sterile. Soluțiile diluate pot fi utilizate pentru pregătirea

probei timp de câteva zile. Cantitatea de colagen depusa pe substraturi de siliciu depinde de

timpul de depunere. Figura 1 a) prezintă un strat subțire de colagen de tip I depus peste noapte

(timp de depunere 12 ore). După depunere, probele au fost spălate cu grijă cu apă deionizată și

usucate sub un curent slab de argon. Apoi, probele au fost montate pe aparatul AFM pentru

scanare. Un strat omogen de molecule de colagen se observă In imaginile din Figura 2. Figura 2

b) arată filmul de colagen depus pe parcursul a 2 ore. Filmul de colagen depus este încă omogenă

și mult mai subțire decat cel depus in 12 ore (Figura 2 a). Substratul de siliciu este vizibil (zona

întunecată pe imaginea topografica). Această probă a fost utilizată pentru măsurători de

spectroscopie de forță atomică în apă deionizată pură. Alternativ, moleculele de monomer

colagen s-au depus pe mică proaspăt clivata. Pentru a face acest lucru, substraturi mica proaspăt

clivate au fost imersate timp de 10 minute în soluție de colagen diluat. Apoi, substraturile au fost

spălate cu grijă cu apă deionizată și uscate. Figura 3 prezintă o imagine AFM (modul de tapping)

in care se vad molecule individuale de colagen pe substratul de mică. Densitatea de molecule pe

substrat este foarte mica și există zone intinse care nu sunt acoperite de molecule. Profilul de

înălțime pentru șase molecule de colagen cu diametrul de aproximativ 1,5 nm (valorile maxime

ale înălțimii pe profilul din Figura 3 b). Lungimea moleculelor este aproximativ 300 nm.

Fig. 3 a) Imaginea AFM (5µm 5µm) a moleculelor de collagen pe substrat de mica. Imaginea a fost obtinuta in modul tapping in aer (proba dezhidratata) b) Profilul de inaltime pentru 6 molecule de collagen. Dimensiunea lateral a moleculelor este mult marita datorita efectului de convolutie a formei varfului sondei AFM cu suprafata probei.

a)  b)

5 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

1.2 Modele teoretice ale moleculelor formate din lanturi lungi de atomi

Moleculele formate din lanțuri lungi de atomi sunt tratate cu ajutorul fizicii statistice.

Întinderea acestor molecule necesita o forta care sa reduca numărul de configurații posibile ele

lanțului atomic și, prin urmare, o scădere a entropiei moleculei. Dacă in acest proces energia

internă a moleculei nu se schimba, forța necesară pentru a intinde molecula de-a lungul unei

direcții este pur entropica. In acest caz, dependența forței de intindere, F, pe distanța de extensie

a moleculei, L, poate fi obținută cu ajutorul unor modele matematice simple ale moleculelor.

Modelele cele mai utilizate sunt lanț cu legaturi libere (FJC free joint chain) și lanț ca un vierme

(WLC worm like chain). Modelul FJC consideră molecula ca un lanț lung format dintr-un număr

mare, n, de unități identice rigide de lungime Lk (lungime Kuhn). Unitățile sunt interconectate

prin articulații ce se pot roti liber și orientarea lor perfecta pe o directie da lungimea de contur a

moleculei, Lc = nLk. Datorită mișcării termice, unitățile lanțului molecular sunt orientate

aleatoriu. În cazul în care lanțul este întins de o forță, unitățile lanț nu mai sunt orientate în mod

aleatoriu, ci aliniate predominant de-a lungul direcției de întindere. Prin urmare, lungimea

moleculei de-a lungul direcției de întindere, L, crește cu intensitatea forței aplicate. Modelul

prezice următoarea dependența forței de intindere:

ck

B LLL

TkLF /)( 1

, (1)

unde T este temperatura absolută, kB, constanta Boltzmann, și -1, inversul funcției Langevin.

Deoarece nu există nici o expresie analitică exactă pentru -1, sunt utilizate formule

aproximative. O extindere serie a funcției,

...875

1539

175

297

5

93)( 7531 xxxxx , (2)

aproximeaza destul de bine valorile functiei pentru valori mici ale intinderii moleculelor (x =

L/Lc < 0.5), dar da erori importante la valori mari pentru x > 0,5. O formula aproximativa

satisfacatoare pentru intreg domeniul de valori ale intinderii moleculelor este formula Padé

(Cohen, A. Rheol. Acta 1991, 30, 270-273):

2

21

1

3)(

x

xxx

. (3)

6 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Deoarece în experimentele AFM de întindere a unei singure molecule, curbele de forță sunt

obtinute de obicei în zona de valori mari ale extensiei moleculelor (x = L/Lc > 0.5), eq 3 este

utilizata pentru a fita curbele forța-distanta experimentale cu modelul JFC.

Modelul WLC ia in considerare energia elastica inmagazinata in lantul atomic al

moleculei. Indoirea lantului atomic pe o mica portiune de lungime, L, cu un mic unghi, ,

necesita o energie elastica:

2

2

Tk

L

LE Bp , (4)

unde Lp este lungimea de persistenta, un parametru ce caracterizeaza flexibilitatea lantului

atomic al moleculei. Cu cât este mai flexibila o molecula, cu atat este mai mare lungimea

persistenta. Nu există o formulă analitică exactă pentru forța de intindere a lantului atomic al

unei molecule in modelul WLC. O formula de interpolare aproximativă care functioneaza bine in

special la extensii mici (L/Lc > 0.2) sau mari (L/Lc > 0.8) este (Bustamante, C.; Marko, J. F.;

Siggia, E. D.; Smith, S. Science 1994, 265: 1599-1600):

4

1

)/1(4

1)(

ccp

B

L

L

LLL

TkLF , (5)

O formula aproximativa mai buna a fost propusa de Bouchiat (Bouchiat, C.; Wang, M. D.;

Allemand, J.-F.; Strick, T.; Block, S. M.; Croquette, V. Biophys. J. 1999, 76, 409-413):

7

24

1

)/1(4

1)(

i

i

i

ci

ccp

B

L

L

L

L

LLL

TkLF , (6)

cu a2 = -0.5164228, a3 = -2.737418, a4 = 16.07497, a5 = -38.87607, a6 = 39.49944, and a7 = -

14.17718. Această formulă crește acuratețea formulei aproximative data de ecuația (5) până la

0.01% si a fost utilizată în studiul de față pentru a se fita curbele experimentale cu modelul

WLC.

7 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

1.3.InteractiuneavarfurilorprobelorAFMhidroxilateinplasmacumoleculeledecolagen

Hidroxilarea sondelor AFM comerciale (MLCT de la Bruker) de nitrură de siliciu a fost

realizată prin expunerea suprafetei acestora la acțiunea plasmei in vapori de apă pentru un timp

de 10 minute. Reactorul cu plasmă a fost descris în rapoartele științifice anterioare. Pe scurt,

sondele AFM au fost plasate pe un suport de sticlă (o placa de sticlă de dimensiuni 2 cm 2cm

2 mm) montata in centrul unui catod din tantal al unei descărcari luminiscente in curent

continuu (tensiune de descărcare de aproximativ 500V și intensitatea curentului de descărcare de

3 mA) în vapori de apă la o presiune de aproximativ 20 Pa. Tratamentul a dus la îndepărtarea

moleculelor de contaminanți adsorbite pe suprafețele sondelor AFM și generarea de grupări

hidroxil pe suprafață (așa cum au dovedit măsurătorile XPS prezentate în rapoartele științifice

anterioare). Suprafațele hidroxilate ale sondelor AFM păstrate în conditii normale de laborator

nu este stabila datorită oxidării suprafeței și adsorbției de molecule a contaminantilor din aer.

Din acest motiv, probele AFM hidroxilate au fost folosite imediat după tratamentul cu plasmă în

măsurătorile de spectroscopie de forta atomica sau au fost silanizate. Sondele AFM hidroxilate și

probele de colagen proaspad preparate au fost montate pe microscopul cu forta atomica si celula

de lichid a acestuia a fost umpluta cu apă deionizată. Apoi, s-au efectuat experimentele de

spectroscopie cu forță atomica prin apropierea și retragerea fata de suprafata probei a sondei

AFM cu o viteză de 1 m/s. Măsurătorile tipice de spectroscopie cu forță atomica au constat în

colectarea de curbe de forta în 20 20 de puncte distribuite uniform pe o suprafata de 1 1μ2 de

pe suprafata filmului subțire de colagen depus pe siliciu timp de 2 ore (Fig. 2b). Unele dintre

curbele de forta au indicat o dependența tipică corespunzătoare întinderii uneia sau mai multor

molecule de colagen. Figura 4 prezintă o curbă tipică forță-distanță, care este atribuită intinderii

unei singure molecule de colagen pe parcursul retragerii sondei AFM (graficul in roșu). În timpul

mișcării de apropiere (graficul în albastru), forța de interacțiune fluctuează în jurul lui zero, ceea

ce indică lipsa de forțe de raza lunga între suprafetele vârfului AFM și proba. După contactul

vârfului sondei AFM cu suprafata probei (valoare zero a distanței de separare tip-probă), vârful

este împins spre probă cu o forță liniar crescatoare pana la o valoare maximă de aproximativ 2

nN (nu apare pe grafic). Apoi vârful a fost retras (grafic în roșu) și forța de împingere a scăzut la

zero. După ce vârful sondei AFM s-a detașat de suprafața probei, forța de interacțiune fluctueaza

în jurul valorii zero pentru o perioadă de timp si apoi indica o crestere in sensul de atracție

(valori negative).

8 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Fig. 4 Curba de forta versus distanta tipica ce indica variatia specifica intinderii unei molecule de collagen si ruperea legaturii atunci cand forta de intindere atinge valoarea maxima Fb.

Fig. 5. Exemplu de fitare a curbei de forta versus distant masurata pe durata retragerii varfului sondei AFM cu modelul WLC. Semnul fortei de intindere a fost schimbat, ea fiind indicata prin valori positive.

Acest lucru este atribuit întinderii unei molecule de colagen fixate intr-un anumit loc la vârful

sondei AFM și într-un alt loc pe substratul de siliciu. Forța de intindere a moleculei crește până

cand molecula de colagen se desprinde fie de vârful AFM, fie de substrat, cand forța scade brusc

la zero. Forța de întindere maximă măsurată în timpul retragerii varfului sondei AFM este

atribuită fortei legaturii moleculei cu suprafata varfului AFM sau al substratului, Fb. Aproximativ

10% din curbele forță-distanță au indicat această variatie tipică a forței cu distanța. Figura 5

prezintă un exemplu de fitare a curbei forță-distanță măsurată în timpul retragerii varfului sondei

AFM cu predicția modelului WLC. Fitarea datelor experimentale cu modelul WLC determina

valori ale parametrilor moleculari ca lungimea de contur (L0) si lungimea de persistenta (Lp).

9 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Lungimile de contur și persistenta pentru molecula de colagen de tip I a fost măsurată prin

analiza de configuratiilor geometrice ale moleculelor depuse pe substraturi de mică (H. H.

Lovelady et al, Biopolymers 10 2013, p. 329). Valori în jurul valorii de 14 nm pentru Lp și 300

nm pentru L0 au fost raportate în literatura de specialitate, bazate pe masuratori directe de

întindere a unei singure molecule [Y. L. Sun și colab., J. Biomech. 37 (11) (2004) 1665-1669]. S-

a arătat că tăria ionică și pH-ul mediului de măsura poate afecta în mare măsură valorile lui Lp. În

experimentele de întindere a moleculelor de colagen tip I descrise în prezentul raport de cercetare

pH-ul mediului de măsurare a fost variat de la 6 la 4 fără a se observa o modificare semnificativă

a rezultatelor. Figurile 6 a) și b) prezintă statistic valorile L0 și Lp obținute prin fitarea a 100 de

curbe de forță experimentale cu modelul WLC. Valorile L0 sunt, de obicei sub 300 nm, cu o

probabilitate maximă în jurul valorii de 70 nm. După cum se observă cu ușurință, hidroxilarea

vârful AFM nu a schimbat vizibil rezultatele. Această distribuție mare de valori L0 este atribuită

incertitudinii pozitiilor legaturilor moleculelor cu substratul și cu vârful sondei AFM.

Hidroxilarea vârfului sondelor AFM nu a avut nici un efect vizibil asupra distribuției valorilor

L0, fapt care indica că site-urile de legare a moleculelor nu sunt controlate de legături de

hidrogen. Un alt motiv al intervalului mare de valori observat pentru L0 este distanța laterală, r,

între punctele de ancorare ale moleculelor pe substrat și, respectiv, pe vârful sondei AFM. Figura

7 a) ilustrează cazul care apare cel mai frecvent, atunci când r nu este 0 și moleculele de colagen

nu sunt întinse de-a lungul axei verticale. Acest lucru afectează în mare măsură curba forță-

distanță, așa cum este ilustrat în Fig. 7 b) ce prezinta rezultatele simulării WLC pentru diferite

valori ale lui r.

a) b)

Fig. 6. Distributiile valorilor lungimilor de contur, L0, si de persistenta, Lp, determinata de fitarea a 100 de curbe de forta experimentale obtinute cu sonde AFM hidroxilate si netratate cu modelul WLC.

10 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

a) b)

Fig. 7. a) Schita ilustrand intinderea unei singure molecule atunci cand exista o distant nenula intre punctele de ancorare a molecule pe substrat si, respective, pe varful sondei AFM. B) Simularea WLC a fortei de intindere pentru diferite valori ale lui r (Lp = 1nm).

Întinderea moleculelor de-a lungul unei directii oblice rezulta într-o scădere aparentă a lui Lp

(creștere a forței de întindere) și L0. Acesta este motivul pentru care valorile L0 găsite prin fitarea

curbelor experimentale (Fig. 6) au valori mai mici decât 310 nm, lungimea conturului moleculei

colagenului de tip I. Valorile Lp găsite în studiul de față sunt mult mai mici decât valoarea de

14,5 nm raportata în literatura de specialitate, indicând o moleculă mult mai rigida. După cum sa

menționat mai sus, una din cauzele valori mai mici de Lp obtinuta în acest studiu este efectul

distanței laterale dintre punctele de ancorare ale moleculelor pe substrat și, respectiv, pe vârful

AFM,. Întinderea moleculelor de-a lungul unei direcții oblice are, de asemenea, efecte asupra

valorilor masurate pentru forța de legatura. Senzorul de forta al aparatului AFM este proiectat

pentru a măsura forța verticală, ceea ce înseamnă că în timpul întinderii unei molecule se

determina curba experimenta Fz (z) si nu F(L) (vezi Fig. 7a). Aceasta înseamnă că forța de rupere

a legaturilor, Fb, este de fapt mai mare decât forța de detasare a moleculelor, măsurată pe

verticala. Deoarece în experimentele de întindere a moleculelor valorile lui r nu pot fi controlate,

distributia valorilor fortei de legatura se largeste spre valori mai mici (Fig. 8). Se observa o mică

diferență între distribuțiile valorilor lui Fb măsurate cu sonde AFM hidroxilate si, respectiv,

netratate. Hidroxilarea cu plasma crește ușor probabilitatea de măsurare de valori mai mari ale

forței de legatura (130 Pn). Deasemenea, hidroxilarea sondelor AFM a crescut ușor rata de

succes (de la 10% până la circa 15%) a ancorarii moleculelor de vârful sondelor AFM.

11 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Fig. 8. Distributia valorilor fortei de legatura masurata in 100 experimente de intindere a moleculelor de collagen tip I cu varfuri AFM hidroxilate si, respective, netratate.

Ancorarea moleculelor de colagen la vârful AFM netratat este guvernată de forțe fizice de

suprafață (încărcare electrica și Van der Waals), in timp ce pentru plasmă varfurile AFM

hidroxilate ancorarea moleculelor este determinată de formarea de legături de hidrogen între

grupari OH de la suprafața vârfului și atomii de oxigen din secvența de aminocizi glicină-

prolină-hidroxiprolina din structura primară a moleculei de colagen. 

2. Interactiunea sondelor AFM functionalizate cu plasma cu bistraturile lipidice pe support solid

2.1FunctionalizareasondelorAFMprinactivareacuplasmaasuprafetelorsisilanizare

Funcționalizarea sondelor AFM prin silanizare și proprietățile suprafețelor functionalizate au

fost descrise pe larg în raportul științific anterior (RS 2014). Aici este data o scurtă descriere a

procesului de funcționalizare a suprafațelor sondelor AFM, proces care a fost efectuat în două

etape. În prima etapă, suprafața sondelor AFM comerciale (MLCT din Bruker) a fost activată

prin tratament cu plasmă in vapori de apă. În a doua etapă, suprafețele active au fost

functionalizate prin incubare în soluție de organosilani în etanol pentru a realiza chemisorpția si

self-asamblarea moleculelor de silan funcționalizate pe suprafața activă a sondelor AFM. În

prima etapă, sondele AFM au fost expuse la plasma luminii negative a unei descarcari

luminiscente în vaporii de apă la presiune scăzută. Sondele AFM au fost montate pe catodul unei

camere de descărcare care a fost vidata pana la o presiune minimă de 0,05 Torr, dupa care s-au

12 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

introdus vapori de apă până la presiunea de lucru (0.2 - 0.4 torr). Apoi, a fost generata plasma

printr-o descărcare electrică in cc prin aplicarea unei tensiuni de descărcare de 400-600 V între

catod și pereții metalici ai camerei (anodul) pentru a menține un curent constant de descărcare de

5 mA timp de aproximativ 10 minute. Astfel, nitrura de siliciu și suprafețele de siliciu ale

sondelor AFM comerciale au fost activate prin îndepărtarea impurităților și generarea de grupări

hidroxil de suprafață.

După activarea cu plasmă a suprafațelor, sondele AFM au fost incubate timp de 24 de ore

într-o soluție 15% (greutate/volum) de ODT (Octadecyltrichlorosilane, (CH2)17SiCl3, (Sigma

Aldrich, puritate 99.99%), pentru a genera grupări funcționale CH3 pe suprafețele lor. Timpul de

ncubare a fost ales in asa fel incat sa se atinga platoul de saturație a procesului de chemosorbtie.

După incubare, probele AFM au fost spălate succesiv cu etanol și apă distilată pentru a îndepărta

excesul de material (molecule adsorbite fizic) prezente pe suprafețele tratate. Pentru a evita

contaminarea si oxidarea în aer, sonde AFM funcționalizate au fost depozitate în apă distilată

pana utilizarea lor în măsurători AFM.

2.2Preparareabistraturilordelipidepesupportsolid

Procedeul de obținere și caracterizarea de bistraturi de lipide depuse pe substrat de mică au

fost descrise în detaliu în raportul științific anterior (RS 2014) Pe scurt, bistraturi de

fosfatidilcolina (30% puritate), (Sigma Aldrich), s-au depus pe substrat de mica proaspăt clivata

prin metoda de fuziune a lipozomilor din mici lipozomi mici unilamelari (SUV). Filme subțiri de

lipide au fost depuse în recipiente de sticlă cilindrice cu diametrul de 1,5 cm prin uscare in vid

înaintat dintr-o soluție de fosfolipide dizolvate în cloroform pur (Sigma-Aldrich), timp de cel

puțin 4 ore. Apoi, filmele de lipide au fost resuspendate în solutie PBS standard (137 mM NaCl,

2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, KH2PO4 1,8 mM; Sigma-Aldrich), pentru a forma o suspensie

de lipozomi cu concentrație de lipide 1 mM. Solutia obtinuta a fost agitata continuu pentru a

promova hidratarea lipidelor si formarea lipozomi multilamelari (MLV), lipozomi care au fost

apoi divizati în SUV-uri cu diametre de zeci de nm prin sonicarea solutie pana la claritate (~ 20

min). Substraturile de mica proaspăt clivate au fost incubate timp de 45 min în suspensia de

lipozomi la temperatura camerei, timp in care veziculele unilamelare adera la substratul mica, se

aplatizeaza, și în cele din urmă colapseaza formand portiuni de substrat acoperite cu bistraturi de

lipide. Excesul de vezicule si lipide de pe substrat a fost îndepărtat prin clătire ușoara cu solutie

13 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

PBS și resuspendarea lor în solutie PBS proaspăta. Probele au fost apoi transferate în celula

lichid a microscopului cu forță atomică și au fost lăsate să se echilibreze termic înainte de

efectuarea măsurătorilor.

Fig. 9. Schema depunerii de bistraturi de lipide pe support solid (SLBs) de mica din solutie de lipozomi unilamelari.

2.3StudiulinteractiunidintresondeleAFMfunctionalizatesiSLBs

În raportul științific anterior am studiat interacțiunea dintre suprafața hidrofobă a sondelor

AFM acoperite cu un film subțire de CFx si bistraturile de lipide pe suport solid (SLBs) prin

măsurători de spectroscopie cu forta atomica. În acest studiu ne concentram pe procesul de

formare de nanotuburi (fire) de lipide prin tragerea sub o forță constantă a lipidelor din SLBs. In

acest scop am preparat sonde AFM (MLCT de la Bruker) cu suprafețe hidrofile și hidrofobe prin

funcționalizarea lor cu grupari hidroxil și de metil, conform protocolului descris în secțiunea 2.1.

După preparare, probele constand in SLBs de phosphatydilcholina au fost montate in celula de

lichid a microscopului, care a fost umpluta imediat cu apă deionizată. Sondele AFM

funcționalizate au fost montate pe dispozitivul de prindere al capului microscopului și cufundate

imediat în lichidul din celula de lichid al AFM pentru a evita contaminarea si oxidarea suprafeței

acestora. Pentru a evita contaminarea sondei AFM în timpul scanării suprafaței probei,

măsurătorile de spectroscopie de forță s-au efectuat fără scanarea prealabila a suprafeței probei,

prezența SLBs pe substrat de mică fiind indicată prin curbele forță-distanță caracteristice tragerii

de nanotuburi de lipide de catre suprafetele hidrofile/hidrofobe ale sondelor AFM

functionalizate.

14 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

Fig. 10. Curba tipica de forță înregistrata la apropierea (albastru), și retragerea (roșu) vârfului sondei AFM catre si de la suprafața SLBs. Desentele inserate in figura arată schematic diferite molente ale interactiunii vârfului AFM su suprafata probei. 1) Vârful AFM este departe de suprafață și se apropie fără

a interacționa cu aceasta (F 0) 2) Vârful AFM comprimarea bistratul cu o forță de împingere crescatoare; 3) Vârful AFM indenteaza bistratul de lipide. 4) în timpul mișcării de retragere, vârful AFM se detașează de substrat. 5) În timpul retrageri, vârful AFM este trage un nanotub de lipide cu o forță constantă de aproximativ 40 pN. 6) La o anumită distanță, structura firului de lipide colapseaza.  

Curbele de forța caracteristice interactiunii varfurilor AFM functionalizate cu grupari metil

nu diferă notabil de curbele forță-distanță caracteristice achizitionate cu varfuri AFM acoperite

cu straturi subtiri de CFx, care au fost raportate în raportul științific anterior (RS 2014) (Fig. 10).

Cand vârful AFM hidrofob se apropie de probă (1) se observa o forță de respingere slabă ce

apare ca urmare a perturbarii legăturilor de hidrogen între moleculele de apă dîn apropierea

suprafeței hidrofile a SLBs. Această forță de respingere slabă a fost nu este observata în cazul

masuratorilor efectuate cu sonde AFM hidroxilate. După contactul cu suprafata SLBs, vârful

AFM începe să apese pe SLBs, membrana lipidică suferind o comprimare (2) urmata, la o

anumită valoare a forței de îapasare (1.5 nN) de penetrarea SLBs (3). În timp ce vârful este în

15 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

contact cu bistratul și continuă să apese pe substratul de mica, lipidele aderă la suprafața

hidrofilă/hidrofobă a sondei (Fig. 10) cu capetele lor hidrofile, respectiv cu cozile hidrofobe. In

timpul retragerii vârfului AFM (4) se observa formarea de nanotuburi de lipide conectate la

sonda AFM și SLBs, fenomen caracterizat printr-o forță constantă, care se menținute pe distanțe

de cateva sute de nm (5). Valoarea constantă a forței sugerează formarea de structuri cilindrice

(nanotuburi) cu diametru constant care sunt trase din bazinul de fosfolipide al membranei. Aceste

nanotuburi de lipide joacă un rol functional important in biologia celulara si ofera un instrument

valoros de studiu experimental a proprietăților mecanice ale lipidelor. Figura 11 ilustrează

detaliile structurale ale unui nanotub de lipide, așa cum rezultă din dinamica simulări moleculare

(Baoukina și colab., 2012, Bio tphysical J. 102, 1,866-1,871). Formarea nanotuburilor de lipide

între vârful AFM și bistratul de lipide depus pe suport solid este indicată printr-o forță de atracție

constantă înregistrată în timpul retragerii vârfului (fig. 10). La o anumită distanță, structura

devine instabila si colapseaza, fapt care este indicat de scăderea bruscă la zero a forței de trager.

Forța constantă de tragere a nanotubului indica o dependenta liniară a energiei libere de formare

a nanotuburilor de lipide de lungimea lor, corespunzând unei structuri de diametru constant.

Forța de tragere a tubului de lipide, F, depinde de raza acestora, R, prin relatia F = 2Kb/R, unde

Kb pentru fosfatidilcolina este 50kBT = 200 pNnm, unde kB este constanta Boltzmann si T este

temperatura absoluta a camerei (VA Harmandarisa, M. Desernob, 2006, J. Chem Phys 125,

204905;... D. Koster și colab, 2,005 , Phys. Rev. Lett. 94, 068101).

Fig. 11. Arhitectura unui nanotub de lipide obținut prin simulare de dinamica moleculara. Simularea a fost efectuată pe o membrană bistrat DOPC compusă din 18432 molecule de fosfolipide, supusa unei forțe de 100 kJ/molnm [Baoukina et al., 2012, Biophysical J. 102, 1866–1871].

Un număr de aproximativ 500 de curbe de forta care au indicat tragerea de nanotuburi de

lipide au fost prelucrate în scopul de a studia efectul funcționalizarii suprafaței vârfurilor AFM

16 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

asupra prrocesului de formare a nanotuburilor. Analiza statistică a valorilor forței de tragere și a

lungimi de rupere a nanotuburilor găsite în experimentele efectuate cu varfuri AFM

functionalizate cu grupari hidroxil și metil sunt prezentate in histogramele dîn Fig. 12. Natura

suprafeței vârfurilor AFM a afectat valorile fortei de tragere a lipidelor si a lungimii de rupere a

acestora. Structura nanotuburilor de lipide este de așteptat să fie diferita pentru cele două tipuri

de suprafețe. Pentru vârfurile cu suprafața hidrofila, lipidele sunt absorbite pe suprafața cu

capurile hidrofile, formând astfel un naotub dintr-un strat dublu cilindric. Pentru vârfurile cu

suprafața hidrofoba lipidele sunt adsorbie pe suprafața cu cozile hidrofobe (prin interacțiuni van

der Waals) și nanotuburile sunt formate dintr-un singur strat de lipide. Forța de tragere nu

depinde de raza varfului sondei, ci doar la modulul de încovoiere a stratului de lipide si de raza

de curbură a tubului. După cum se observă în Fig. 12 a), forța de extragere a nanotuburilor de

lipide este puțin mai mare pentru vârful AFM hidrofob decât pentru vârful AFM hidrofil.

Această diferență se explică prin diferența de structură a nanotuburilor, acestea fiind formate

dintr-un strat dublu de lipide (modulul de incovoiere și raza de curbura mai mari) pentru vârful

AFM hidrofil și de un singur strat de lipide (raza de curbura modulul de incovoiere mai mici). Cu

toate acestea, diferența în valorile fortei de tragere a nanotuburilor nu este foarte mare deoarece

forța depinde de raportul dintre modulul de incovoiere si raza de curbura aceste marimi fiind

interdependente.

a) b)

Fig. 12. Histogramele valorilor fortei de tragere si lungimii de rupere a nanotuburilor de lipide obtinute in aproximativ

500 experimente de tragere de tuburi de lipide cu varfuri AFM functionalizate cu grupari hidroxil și, respectiv, metil.

Experimentele au fost efectuate în apă deionizată.

17 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

a) b)

Fig. 13. Histogramele valorilor fortei de tragere si lungimii de rupere a nanotuburilor de lipide obtinute in aproximativ

500 experimente de tragere de tuburi de lipide cu varfuri AFM hidroxilate in apă deionizată și, respectiv, solutie PBS.

Am observat o dependență puternică a forței de tragere a nanotuburilor de lipide de tăria ionică a

mediului de măsurare. Astfel în experimente efectuate cu varfuri AFM hidroxilate, forța de

extragere a nanotuburilor de lipide a scăzut cu un factor de 2, prin schimbarea mediului de

măsurare din apă deionizată (tăria ionică mica la pH neutru) la soluție PBS (tăria ionică mare la

pH neutru). Această schimbare poate fi explicata de modificarea valorii modului de incovoiere a

bistratului de lipide odata cu variația tăriei ionice a mediului de masura. Adăugarea de ioni în

soluție ecraneaza sarcinile electrice de suprafață și astfel reduce energia de suprafață necesara

indoirii membranilor de lipide.

3. Diseminare

Rezultatele descrise in prezentul raport de cercetare au fost disseminate partial intr-o lucrare

stiintifica publicata intr-o revista de specialitate ISI si in doua lucrari prezentate la conferinte

internationale:

1. L. Sirghi, V. Tiron, and M. Dobromir, Single asperity friction force between diamond-like carbon thin

film surfaces, Diamond Related Materials 52 (2015) 38-42.

2. Lucel Sirghi, Aurelia Apetrei, Viorel Anita and Marius Dobromir, Functionalization of Atomic force

microscopy probes by thin film depositions, InterAcademia 2015 -The 9th International Conference on

Global Research and Education, September 28-30, 2015, Hamamatsu, Japan, oral presentation

18 L. Sirghi, RS 2015 IDEI 267/2011  

3. F. Samoila, V. Anita, L. Sirghi, Cleaning of silicon surface by surface dielectric barrier discharge, 32nd

International Conference on Phenomena in Ionized Gases (ICPIG 2015), July 26-30, 2015, Iasi,

Romania, poster presentation

December 02, 2015 Director,

Prof. dr. habil. Lucel Sirghi,