RAPORT ȘTIINŢIFIC ȘI TEHNIC IN EXTENSO

Proiect Nr. 123/2012, cu titlul: ‘Generarea și investigarea unor noi peptide antimicrobiene, cu dimensiune redusă. Corelarea structurii peptidelor cu

funcţia lor’ (BIOPEP) PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0595

Etapa IV: Investigarea acţiunii antimicrobiene a peptidelor proiectate. Peptide bioactive la nivelul membranelor biomimetice (partea a II-a) Activitatea IV.1: Corelarea dintre caracteristicile structurale, concentrația electrolitului, activitatea patogenă litică și specificitatea peptidelor sintetizate și testate pe diverse linii de agenți patogeni (e.g., C. albicans, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) (P1, P2, P3)

Activitatea IV.2: Corelarea structurii peptidelor sintetizate cu proprietățile de transport printr-un singur oligomer de OmpF (CO)

CO – Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” din Iaşi -UAIC;

P1 – Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice şi Moleculare, Cluj Napoca - INCDTIM;

P2 – Institutul Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Fizică şi Inginerie Nucleară “Horia Hulubei” - IFIN-HH;

P3 – Universitatea „Babeş - Bolyai”, Cluj-Napoca-UBB.

REZUMATUL ETAPEI

Ţinând cont de activitatea antimicrobiană studiată în etapa trecută, s-a evaluat

comportamantul în diferite medii al unor peptide semnificative din cele 8 sintetizate. Astfel, s-a

urmărit modul în care peptidele interacţionează cu membranele lipidice model precum şi

accesibilitatea resturilor de triptofan la mediu (cu ajutorul stingătorilor precum acrilamida).

Efectele modificărilor la nivelul structurii primare (înlocuirea resturilor de triptofan cu resturi

de arginină sau histidină) sunt observate în modul de interacţiune al peptidelor cu membranele

lipidice. Rezultatele experimentale au arătat că peptidele sunt adsorbite pe suprafaţa

membranelor lipidice ale lipozomilor, o parte din resturile de triptofan fiind ancorate în

membrană şi mai puţin expuse mediului apos, restul rămânând expuse mediului apos. Peptidele

prezintă o afinitate mai crescută pentru membranele lipozomilor preparaţi din DOPC/DPPG,

lipozomi ce imită membranele bacteriene, comparativ cu membranele lipozomilor preparaţi din

DOPC, lipozomi ce imită membranele celulelor de mamifer.

Dintre cele 8 peptide antimicrobiene cu lungime de 9 aminoacizi, P3, P5, P6 şi P7 au fost

simulate computaţional pentru a înţelege modul de interacţiune cu modelul membranar

bacterian. Concluzia principală este că histidina are un efect de modulare a activităţii

antimicrobiene cu cea mai bună localizare pentru inserţie în bistrat la un singur capăt. Histidina

de la un capăt (P6) este cheia mecanismului de inserţie a peptidei în membrana bacteriană.

Activităţile de cercetare desfăşurate în această etapă de implementare a proiectului de

către partenerul P3 au avut ca scop principal îmbunătăţirea activităţii antimicrobiene a

peptidelor obţinute în etapele anterioare de derulare a proiectului. Astfel, plecând de la

rezultatele obţinute anterior cu privire la concentraţia minimă inhibitorie, caracterul bactericid

şi factorul hemolitic pentru cele 8 peptide sintetizate, au fost selecţionate peptidele P6 şi P7,

pentru care s-a urmărit creşterea activităţii biologice prin obţinerea de complecşi de argint sau

prin obţinerea de structuri care prezintă mai multe unităţi peptidice legate de o unitate centrală.

De asemenea, au fost obținuți produşi fluorescenţi în vederea utilizării lor pentru marcarea

peptidelor antimicrobiene, care au fost caracterizați atât din punct de vedere structural cât şi al

proprietăţilor optoelectronice.

Cercetările au arătat că unele peptide antimicrobiene pot distruge celulele procariote la

concentrații sub cele necesare activității litice, indicând interacțiunea dintre aceste peptide și

anumite ținte intracelulare, inhibând sinteza peretelui celular sau alterând activitatea

enzimatică, sinteza proteinelor sau a acizilor nucleici (Z. Oren and Y. Shai, Eur. J. Biochem

1996;S.C. Chan et al., J. Pept. Sci, 1998). Mecanismele prin care aceste peptide permează peretele

celular al bacteriilor pentru a accesa ținte intracelulare nu sunt încă complet elucidate. În cazul

bacteriilor Gram-negative, a priori interacțiunii cu membrana internă fosfolipidică, peptidele

trebuie să traverseze membrana externă a peretelui celular. O potențială cale de permeație

pentru trecerea peptidelor în spațiul periplasmatic ar fi porinii apoși prezenți din abundență în

membrana externă a bacteriilor Gram-negative (C. Danelon et al., Biophys. Chem., 2003; T.

Schirmer, J. Struct. Biol., 1998).

În urma investigațiilor efectuate în cadrul etapei IV a proiectului, am pus în evidență

interacțiunea dintre peptidele selectate P5 și P8 și interiorul unui astfel de por proteic inserat

într-un bistrat lipidic planar reconstituit, evidențiind posibilitatea peptidelor de a transloca prin

intermediul porului apos de partea cealaltă a membranei lipidice. De asemenea, am pus în

evidență influența unor caracteristici fizico-chimice ale mediului (tărie ionică, pH) asupra

procesului de translocare, în corelație cu structura peptidelor sintetizate.

DESCRIEREA ŞTIINŢIFICĂ ŞI TEHNICĂ

Caracterizare structurală a bistratului lipidic în prezenţa /absenţa peptidei P6

Materiale şi metode

Compuşii de pornire sunt 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine şi 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, achiziţionaţi de la firma Sigma-Aldrich. În continuare, abreviem aceşti compuş de start ca POPC şi DOPG.

Într-o prima etapă s-au obţinut filme lipidice aplicând următorul protocol:

Film POPC: într-un balon cu fund rotund de 50 ml se dizolvă 49.6 mg POPC în 2 ml de cloroform. Soluţia obţinută este supusă evaporării la rotavapor (aprox 2 ore) în atmosferă controlată de azot şi la temperatura de 40 oC. După evaporarea cloroformului, peste filmul de POPC rezultat se adaugă 0.3 ml ciclohexan (solvent utilizat pentru îndepărtarea completă a urmelor de chloroform). Soluţia obţinută se evaporă la rotavapor în condiţiile menţionate mai sus, obţinându-se un film alb. Acesta este supus liofilizării timp de o zi. În urma acestui proces s-a obţinut film POPC uscat.

Filmul astfel obţinut a fost apoi supus hidratării, în camera de hidratare, la 25 oC şi 85% umiditate pentru două zile. Nivelul de hidratare final este de 14.34% (w). Rezultatul acestei hidratări constă în formarea de vezicule lipidice (vezicule POPC).

Film POPC+DOPG: într-un balon cu fund rotund de 50 ml se dizolvă 42.5 mg POPC si 7.5 mg DOPG (raport masic: 85:15) în 2 ml de cloroform. Soluţia obţinută este supusă evaporării la rotavapor (aprox 2 ore) în atmosferă controlată de azot şi la temperatura de 40 oC. După evaporarea cloroformului, peste filmul de POPC+DOPG rezultat se adaugă 0.3 ml ciclohexan (solvent utilizat pentru îndepărtarea completă a urmelor de chloroform). Soluţia obţinută se evaporă la rotavapor în condiţiile menţionate mai sus, obţinându-se un film alb. Acesta este supus liofilizării timp de o zi. În urma acestui proces s-au obţinut film POPC+DOPG uscat.

Filmul astfel obţinut a fost apoi supus hidratării, în camera de hidratare, la 25 oC şi 85% umiditate pentru două zile. Nivelul de hidratare final este de 13.66% (w). Rezultatul acestei hidratări constă în formarea de vezicule lipidice (vezicule POPC+DOPG).

POPC-P6: Pentru obţinerea amestecului peptidă - membrană lipidică s-a aplicat următorul protocol: într-un balon cu fund rotund de 50 ml se dizolvă 44.85 mg POPC si 2.12 mg P6 într-un amestec 3 ml de cloroform si 0.3 ml metanol. Evaporarea solvenţilor organici se face cu ajutorul rotavaporului urmând protocolul descris anterior privind obţinerea filmelor lipidice. Prin plasarea în camera de hidratare (25 oC şi 80% umiditate / 48 ore) a probei astfel obţinute se obtine un complex peptide-membrana cu un grad de hidratare de 13.89% (POPC-P6).

Analiză 31P RMN

Spectrele 31P HPDEC au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker AVANCE III 500 MHz ce operează la frecvenţele Larmor de 202.4 MHz şi respectiv 499.99 MHz, corespunzătoare atomilor 31P şi 1H, la temperatura camerei, cu un cap de probă de 4 mm. Spectrele au fost înregistrate atât în condiţii statice cât şi la o frecvenţă de rotaţie de 2.4 kHz. Experimentul HPDEC este un experiment de tip „onepulse”, aplicat pe canalul 31P, înregistrarea spectrului

facându-se în condiţii de decuplare a protonilor. Durata pulsului de 90o aplicat pe canalul 31P a fost de 3 μs, iar câmpul de decuplare pe canalul protonilor a fost de 25 kHz.

Spectrele RMN 31P statice ale celor două tipuri de vezicule lipidice, POPC si POPC+DOPG sunt prezentate în Figura 1, forma de linie de tip pulbere cu simetrie axială (constând dintr-un peak la câmpuri mari, δ⊥ şi un umăr la câmpuri joase, δ11, cu ∆δ = |δ11 - δ⊥| ∼ 47 ppm) confirmând formarea structurii bi-strat (H. Saito, I. Ando, A. Ramamoorthy, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2010).

Fig.1.a) Spectrele 31P ale veziculelor lipidice POPC (negru) şi POPC+DOPG (roşu) înregistrate

în condiţii statice; b) Spectrele 31P RMN ale veziculelor lipidice POPC (negru) şi POPC+DOPG (roşu) înregistrate în condiţii de rotaţie a probei la 2.2 KHz.

Analizând spectrele din figura 1 a), în cazul veziculelor formate prin combinarea celor două fosfolipide, se observă prezenţa celor două componente (POPC şi DOPG), precum şi o uşoară deplasare chimică a componentei POPC. Acest lucru este mult mai evident în cazul spectrelor 31P RMN obţinute în condiţii de rotaţie a probei prezentate în figura 1 b).

Deplasarea uşoară a liniei izotrope corespunzătoare POPC în cazul veziculelor de tip POPC+DOPG faţă de cazul veziculelor de tip POPC indică modificarea uşoară a vecinătăţii chimice a nucleului 31P .

Fig.2. a) Spectrele 31P RMN ale veziculelor lipidice POPC (negru) şi complexului membrană-lipidă POPC+P6 (roşu) înregistrate în condiţii statice; b) Spectrele 31P RMN ale veziculelor lipidice POPC (negru) şi ale complexului membrană-lipidă POPC-P6 (roşu) înregistrate în condiţii de rotaţie a probei la 2.5 KHz.

Acţiunea peptidei P6 asupra veziculelor de tip POPC a fost analizată prin măsurători 31P RMN. Spectrelor 31P ale complexului peptidă-membrană au fost înregistrate atât în condiţii statice, cât şi în condiţii de rotire a probei cu o frecvenţa de rotaţie de 2.5 kHz, acestea fiind prezentate în figurile 2 a) şi b). Analiza spectrelor arată influenţa peptidei P6 asupra veziculelor lipidice de tip POPC. Lărgirea liniei izotrope (spectrele din Fig.2.b)) indică existenţa unei dezordini structurale a grupării PO4 fără a afecta însă integritatea bistratului.

Mecanismul de acţiune al peptidelor P3, P5, P6, P7 asupra modelului membranar bacterian

Metode

Experimentele in vivo precedente au arătat că din cele 8 peptide (P1 – P8) a căror activitate antimicrobiană a fost testată pe diferite culturi bacteriene, P6 este cea mai activă, P7 este cea mai hemolitică, P5 este controlul (fără histidină, şi deci cu sarcina electrică cea mai mare, +5 – toate celelalte peptide sunt cationice cu sarcina +4), iar P3 este cea mai puţin activă.

Pentru identificarea la nivel molecular a modului de acţiune a peptidelor antimicrobiene P3, P5, P6, P7 s-au efectuat 4 seturi de câte 7 simulări de dinamică moleculară fiecare, a modelului membranar bacterian ca un bistrat lipidic cu ~112 lipide cu componenţa POPC:DOPG 85:15. Fiecare set a fost simulat împreună cu o peptidă antimicrobiană: P3, P5, P6, P7 pentru 0.15 μs, cu un timp total de simulare de 4 x 7 x 0.15 μs = 4.2 μs. Fiecare sistem a fost simulat la 24˚C şi în condiţii fiziologice de salinitate (0.15 M), a conţinut 40,000 – 50,000 atomi.

Rezultate

Figura 3 arată evoluţia în timp a distanţei minime normale la suprafaţa membranară a fiecărei peptide. În toate cazurile, odată ce peptida a „recunoscut” membrana, a interacţionat puternic cu ea, fapt indicat de timpul minim petrecut în acest stadiu (3.0% – 10.6%). De notat este faptul că peptida cea mai puţin activă petrece cel mai mult timp inserată în membrană. Însă aceste figuri indică faptul că peptida cea mai activă (P6) petrece în mod evident cel mai mult timp continuu inserată în membrană şi la adâncimile de inserţie cele mai mari. De asemenea, se observă că peptida cea mai hemolitică (P7), adică cu afinitate considerabilă faţă de modelele membranare de mamifer, are afinitatea cea mai scăzută faţă de membrana model bacterian (petrece cel mai mult timp în zona de „recunoaştere” şi contact cu membrana – >30% faţă de <20% celelalte 3 peptide – şi cel mai puţin timp în zona de legare de membrană, respectiv inserţie – <55% faţă de >65%-70% celelalte 3 peptide) dintre cele 4 peptide.

Tabel 1. Nr. mediu de atomi de fosfor pe tipuri de lipide de lângă AMP, mediat pe ultima 100 ns

# mediu atomi P lângă AMP

P3 (His-3) P5 (fără His) P6 (His-1) P7 (His-5)

<POPC>100ns 9.18 ± 0.78 8.77 ± 0.68 8.24 ± 0.85 7.35 ± 1.18 <DOPG>100ns 1.02 ± 0.20 1.88 ± 0.36 1.78 ± 0.51 1.74 ± 0.47

Tabelul 1 indică faptul că Histidina are puţină influenţă asupra afinităţii lipidelor anionice la peptidele antimicrobiene, dar o menţine. Deoarece experimentele in vitro indică o scară de activitatea antimicrobiană P6 >> P5 > P7 > P3, putem trage concluzia că nu există corelaţie între

numărul de atomi de fosfor / lipide şi activitatea antimicrobiană a acestora. Astfel, întrebarea următoare care trebuie adresată este înţelegerea importanţei Histidinei în mecanismul de acţiune antimicrobiană.

Fig.3. Distanţa minimă a peptidelor: a) P3, b) P5, c) P6, respectiv d) P7, până la suprafaţa membranară. Fiecare din cele 7 traiectorii e colorată diferit. Liniile orizontale împart aceste distanţe în categorii de interacţiune a peptidei cu membrana: (i) peste 15Å (linia roşie punctată) peptida nu interacţionează cu membrana; (ii) între 7.5Å şi 15Å peptida „recunoaşte” membrana; (iii) între 3.1Å şi 7.5Å aceasta intră în contact cu ea, (iv) între 0Å şi 3.1Å se leagă de suprafaţa membranară, iar (v) sub 0Å se inserează în membrană. Cifrele indică procentul din timpul simulării petrecut în fiecare din aceste categorii de interacţiune.

Numărul mediu de atomi de fosfor mediat pe ultima 100ns calculat în jurul fiecărui

aminoacid al peptidelor (netabelat) arată că primii aminoacizi sunt cei care interacţionează cu bistratul lipidic. Tabelul 2 arată aceste medieri în jurul primului aminoacid, calculat separat pe fiecare tip de lipidă.

Tabel 2. Nr. mediu de atomi de fosfor pe tipuri de lipide de lângă primul aminoacid al AMP, mediat pe ultima 100 ns

# mediu atomi P lângă AA1 al AMP

P3 (Arg) P5 (Arg) P6 (His) P7 (Arg)

<POPC>100ns 4.74 ± 0.52 4.24 ± 0.35 3.65 ± 0.60 4.45 ± 0.77 <DOPG>100ns 0.30 ± 0.46 1.30 ± 0.26 0.76 ± 0.30 1.32 ± 0.21

Numărul foarte mic de lipide anionice în vecinătatea lui P3 se datorează afinităţii ridicate a His-3 faţă de anioni. Astfel, primii trei aminoacizi iau o poziţie paralelă cu suprafaţa bistratului, explicând procentajul ridicat al timpului petrecut la suprafaţa bistratului (vezi Fig.3). Acest lucru împiedică inserţia lui P3 adânc în bistrat, ceea ce explică de ce e peptida cu activitatea cea mai redusă. Numărul cel mai mic de lipide este în jurul terminalului peptidei celei mai active, P6, datorită poziţiei favorabile la capăt de peptide a Histidine, combinată cu sarcina electrică locală redusă. Astfel, această configuraţie primară permite aranjarea spaţială a backbone-ului peptidei într-o conformaţie paralelă cu normala la suprafaţa bistratului. Aceasta, combinată cu sarcina electrică locală redusă favorizează inserţia mai uşoară a peptidei în bistrat, ceea ce se corelează cu activitatea antimicrobiană cea mai ridicată a peptidei P6 (vezi Fig.4).

Fig.4. Secţiune transversală a bistratului lipidic POPC:DOPG 85:15 (model membranar bacterian) (atomii de fosfor POPC în tan, DOPG în roşu, cozile în cilindrii gri), împreună cu peptida antimicrobiană P6 (cilindrii coloraţi astfel: Arginina în albastru, Histidina în verde, Triptofanul în alb). Apa este suprafaţa reprezentată în cyan.

Concluzii

Dintre cele 8 peptide antimicrobiene cu lungime de 9 aminoacizi, P3, P5, P6 şi P7 au fost simulate computaţional pentru a înţelege metoda de interacţiune cu modelul membranar bacterian. Concluzia principală este că Histidina are un efect de modulare a activităţii antimicrobiene cu cea mai bună localizare pentru inserţie în bistrat la un singur capăt. Histidina de la un capăt (P6) este cheia mecanismului de inserţie a peptidei în membrana bacteriană.

Pentru o mai buna înţelegere a modului de acţiune a AMP-urilor şi a specificității lor crescute pentru membranele bacteriene, s-au realizat studii pe membrane model cu structură asemănătoare cu a celor biologice. Utilizând membranele model avem un control asupra condiţiilor de producere a interacţiunii studiate putând obţine informaţii despre factorii care influenţează acest fenomen. AMP-urile sintetizate şi caracterizate în fazele trecute prezintă în structură 3 sau 4 resturi de triptofan (Trp). Astfel s-au realizat studii de fluorescenţă statică (precum, analiza maximului de emisie al Trp şi stingerea fluorescenţei Trp) pentru a determina modul de interacţie al AMP-urilor cu membranele model.

Peptidele antimicrobiene interacţionează cu biomembranele ducând la o schimbare a permeabilităţii acesteia şi, în final, la moartea celulei. Deşi modul de acţiune nu este încă bine elucidat, au fost propuse câteva modele, precum: (i) modelul de pori toroidali, (ii) modelul „barrel stave” şi (iii) modelul „carpet”. Aceste mecanisme sunt mai uşor puse în evidenţă prin investigarea interacţiunii dintre peptidele antimicrobiene şi membrane lipidice model, precum lipozomii.

Deoarece AMP-urile obţinute prezintă în structura lor aminoacizi aromatici (Trp) informaţiile despre starea peptidelor s-au putut obţine utilizând studii de fluorescenţă statică (analiza maximului de emisie al Trp şi stingerea fluorescenţei Trp).

Din cele 8 peptide sintetizate, studiile s-au realizat pe 5 peptide reprezentative: P1, P3, P5, P6 si P7. P1 şi P3 au 3 resturi de Trp şi au dovedit o eficienţă antimicrobiană scazută, deşi nu prezintă activitate hemolitică. P5 conţine 4 resturi de Trp şi are o structură simetrică, fiind peptida control. P5 a dovedit că prezintă o activitate antimicrobiană crescută atât pentru bacteriile Gram-negative cât şi cele Gram-pozitive, însă prezintă şi o activitate hemolitică importantă la concentraţii 33.33 μM. P6 conţine tot 4 resturi de Trp ca şi P5, dar s-a dovedit mai puţin hemolitică, fiind peptida cu indicele terapeutic cel mai mare. P7 are 4 resturi de Trp, activitate antimicrobiană scăzută şi nu produce hemoliză. Toate cele 3 peptide studiate prezintă o sarcină electrică netă pozitivă, caracteristică care poate facilita interacţiile cu membranele bacteriene (încărcate negativ).

Prepararea membranelor lipidice model

Experimentele s-au realizat pe diferite tipuri de lipozomi unilamelari mari (LUV) cu diferite compoziţii lipidice. În primul rând s-au preparat lipozomi numai din dioleoilfosfatidilcolină (DOPC), ca membrană model a membranelor de mamifer. Al doilea tip de lipozomi care au fost preparaţi au fost lipozomii încărcaţi negativ, pentru a imita membranele bacteriene, din: DOPC (85%) şi dipalmitolifosfatidilglicerol - DPPG (15%), DPPG fiind o lipidă care prezintă o sarcină negativă la nivelul capului polar.

Sunt prezentate pe scurt protocolul de preparare a lipozomilor şi metodele utilizate pentru a caracteriza interacţiunea peptidelor sintetizate cu membrana lipidică a lipozomilor.

Lipozomii, independent de compoziţia lor, au fost preparaţi după urmatorul protocol:

- s-au preparat soluţii stoc de DOPC şi DPPG, fiecare la o concentraţie de 12.5 mg/mL în cloroform şi metanol+cloroform (1:1) respectiv;

- din soluţia stoc de lipide s-a luat cantitatea necesară pentru prepararea diferitelor tipuri de lipozomi şi s-a diluat cu o soluţie metanol+cloroform (1:1);

- soluţia de lipide a fost uscată sub flux de azot până s-a format un film lipidic pe fundul eprubetei;

- filmul lipidic este hidratat cu 1 mL tampon fosfat (PBS) 10 mM şi apoi vortexat până s-a desprins de pe eprubetă, ducând astfel la formarea unei suspensii care va conţine vezicule multilamelare (MLV);

- suspensiile de MLV au fost supuse la 7 cicluri de îngheţ/dezgheţ şi apoi au fost extrudate printr-o membrană de 200 nm de 11 de ori (cicluri complete) până s-a obţinut o populaţie omogenă de LUV-uri;

- pentru lucru, suspensia de LUV este diluată cu PBS până ce s-a ajuns la concentraţia lipidică de 50 μM.

Spectrele de emisie fluorescentă ale peptidelor s-au înregistrat folosind λex = 285 nm λem= 310 - 500 nm, fantele de pe calea de excitare/emisie de 3 şi un increment de 1 nm. Fluorimetrul utilizat pentru acest experiment este Fluoromax 3 (Horiba Jobin Yvon), prevăzut cu posibilitatea de termostatare a compartimentului probei, înregistrările realizându-se la o temperatură constantă de 24 oC. De asemenea programul de operare al aparatului are posibilitatea de înregistrare a spectrelor folosind corecţii realizate în raport cu sensibilitatea spectrală a fotomultiplicatorului de emisie.

Stingerea fluorescenţei resturilor de Triptofan

Prin acest experiment s-a urmărit accesibilitatea restului de Trp din peptide la stingători, în acest caz acrilamida, pentru 3 condiţii diferite: (i) peptida în PBS, (ii) peptida în lipozomi preparaţi din DOPC şi (iii) peptida în lipozomi preparaţi dintr-un amestec de DOPC:DPPG.

Stingerea fluorescenţei este descrisă de ecuaţia Stern-Volmer:

unde:

F0, F – reprezintă intensitatea fluorescenţei în absenţa/prezenţa stingătorului kq – constanta biomoleculară de stingere; τo - timpul de viaţă a fluoroforului în absenţa stingătorului; [Q] – concentraţia stingătorului şi KD – constanta Stern-Volmer (KS-V).

Cu cât constanta de stingere este mai mică, cu atât mai puţin accesibil este Trp pentu stingător. Folosind ecuaţia Stern-Volmer s-a calculat raportul Fo/F şi s-a reprezentat în funcţie de concentraţia stingătorului, determinându-se KS-V.

Rezultate şi discuţii

Deplasarea maximului de emisie

O evidenţă în interacţiei dintre AMP-uri şi membranele lipidice ale lipozomilor o avem comparând spectrele peptidelor în PBS cu cele obţinute când aceastea au fost puse în prezenţa de LUV-uri cu diferite compoziţii lipidice. Poziţia şi intensitatea maximelor de emisie ne oferă informaţii despre localizarea restului de triptofan din peptide. Când triptofanul se află într-un

mediu hidrofil, în cazul nostru PBS, prezintă o intensitate scăzută a emisiei fluorescente cu un maxim în jurul valorii de 350 nm, similar cu rezultatul obiţinut pentru peptide (vezi figura 5 pentru P3). Modificarea mediului din jurul restului de triptofan (mediul devine mai hidrofob), duce la o deplasare hipsocromă şi hipercromă a maximului de emisie a triptofanului. Astfel, în figura 5 se poate observa că emisia P3 în prezenţa lipozomilor este la 351 nm pentru lipozomii preparati din DOPC şi la 350 nm pentru lipozomii preparaţi dintr-un amestec de DOPC/DPPG.

Fig.5. Spectrele emisiei fluorescente pentru P3 în PBS, în lipozomi preparaţi din DOPC sau dintr-un amestec de DOPC:DPPG.

Lipozomii preaparaţi din DOPC nu prezintă sarcină electrică, DOPC-ul fiind o lipidă zwiter-

ionică, pe când prezenţa de DPPG în membrană face ca lipozomii preparaţi din amestecul de DOPC/DPPG să fie încarcaţi negativ. Deoarece P3 are o sarcină +6, poate să interacţioneze electrostatic cu capetele lipidelor. Comparativ cu spectrul P3 în PBS intensitatea spectrelor P3 în lipozomi a crescut pana la de 3 ori. Desi se observă o creştere a intensităţii maximelor de emisie fluorescentă, deoarece deplasarea maximului este numai de 7 nm în cazul lipozomilor preparaţi din DOPC şi 8 nm pentru cei preparaţi din DOPC/DPPG, putem considera că numai o parte din resturile de triptofan ale peptidei rezidă într-un mediu mai puţin hidrofil. Acest lucru se poate observa şi din lărgimea spectrului, lărgime care este comparabilă cu cea observată în cazul peptidei în PBS. Rezultatele sumarizate sunt prezentate în tabelul 3.

Tabelul 3: Lungimea de undă a maximelor de emisie a cele 5 peptide studiate în diferite medii (PBS, lipozomi preparaţi din DOPC sau un amestec de DOPC/DPPG). Δλ pentru peptidele studiate calculată faţă de situaţia în PBS

Peptida λem(max) / nm Δλ / nm PBS DOPC DOPC/DPPG DOPC DOPC/DPPG

P1 352 346 341 8 11 P3 358 351 350 7 8 P5 353 339 337 14 16 P6 351 338 337 13 14 P7 354 352 348 2 6

Pe baza rezultatelor obţinute pentru petidele studiate, putem spune doar că acestea sunt adsorbite pe suprafaţa membranei.

Stingerea fluorescenţei resturilor de Trp în prezenţa Acrilamidei

În Figura 6 este prezentată familia de curbe de emisie fluorescentă a P6 în PBS în prezenţa unor concentraţii crescatoare de stingător. Spectrele sunt prelucrate pentru a elimina semnalul datorat PBS-ului sau a PBS-ului cu stingător. În figură se poate observa că intensitatea maximului de fluorescență scade liniar cu creşterea concentraţiei de stingător, poziţia acestuia fiind însă nemodificată.

Figura 6. Familia de curbe fluorescente obţinute pentru P6 în PBS în prezenţa de concentraţii crescatoare de stingător (începând de la 0.01 până la 0.15 M)

Mai departe, pentru fiecare spectru în parte, s-au calculat rapoartele dintre intensităţile fluorescenţei, Fo/F (Fo – reprezintă intensitatea fluorescenţei în absenţa stingătorului, F - intensitatea fluorescenţei în prezenţa stingătorului). Conform ecuaţiei Stern-Volmer, acest raport depinde liniar (datorită prezenţei unei singure clase de fluorofori) de concentraţia de stingător [Q] (Figura 7). Similar au fost prelucrate rezultatele obţinute pentru restul de peptide în toate condiţiile înregistrate.

Figura 7. Reprezentarea grafică a raportului Fo/F în funcţie de concentraţia de stingător, conform ecuaţiei Stern-Volmer. Datele sunt prezentate pentru P6 în PBS, suspensii de DOPC şi DOPC:DPPG.

În figura 7 este reprezentată dependenţa raportului Fo/F, pentru P6 în PBS sau în lipozomi preparaţi din DOPC sau un amestec de DOPC:DPPG. Reprezentarea aceasta ne permite să observăm în ce condiţii resturile de Trp din P6 sunt mai puţin accesibile pentru stingător, deci

cel mai bine inserat în membrana lipidică. Din figură observăm că cel mai puţin stinse sunt resturile de Trp în situaţia în care peptida este inserată în lipozomii preparaţi din DOPC/DPPG, dar şi a celor preparaţi din DOPC. În PBS se observă stingerea cea mai pronunţată. Constanta KS-V a fost obţinută pentru fiecare condiţie şi este prezentată în Tabelul 4.

Tabelul 4. Constantele de stingere Stern-Volmer (KS-V) determinate pentru cele 5 peptide studiate în diferite medii (PBS, lipozomi preparati din DOPC sau un amestec de DOPC/DPPG)

Conditii experimentale

KS-V (M-1) P1 P3 P5 P6 P7

PBS 32.16 ± 0.68 12.18 ± 0.39 19.48 ± 0.53 27.65 ± 1.46 28.70 ± 0.31 DOPC 15.55 ± 0.84 5.11 ± 0.26 7.57 ± 0.42 6.96 ± 0.45 10.71 ± 0.46

DOPC:DPPG 10.14 ± 0.30 4.95 ± 0.40 4.09 ± 0.19 7.46 ± 0.36 5.72 ± 0.35

Prezenţa a 4 resturi de Trp duce la creşterea activităţii antimicrobiene a peptidelor studiate, dar şi la o creştere a efectului hemolitic produs. Cele mai eficiente peptide s-au dovedit a fi P6 urmată de P8, peptide cu 4 Trp. Spre deosebire de P5 şi P7 care prezintă tot 4 Trp, aceste peptide au una sau mai multe resturi de Arg înlocuite cu resturi de His. Înlocuirea unui rest de Trp cu un rest de His duce însă la scăderea eficienţei peptidelor (P1-P4).

O evidenta in interacţiei dintre AMP-uri şi membranele lipidice ale lipozomilor o avem comparând spectrele peptidelor în PBS cu cele obţinute când aceastea au fost puse în prezenţa de LUV-uri cu diferite compoziţii lipidice.

Deşi cele 5 peptide prezintă 3 sau 4 resturi de triptofan se obţin constante de singere apropiate cand acestea se afla doar în PBS (Tabel 4). În studii precedente s-a arătat că interacţia dintre acrilamidă şi Mel este influenţată de compoziţia şi tăria ionică a mediului (Raghuraman, 2006). În cazul peptidelor studiate am obţinut valori (≈ 28-30 M-1) un pic mai mari decât cele raportate precedent, (18 M-1) (Raghuraman, 2006). Constantele de stingere obţinute pentru peptide în prezenţa de lipozomi sunt de cel puţin 2 ori mai mici decât cele obţinute în PBS dovedind o interacţie între peptide şi membrana lipozomilor. Aceste valori variază şi cu compoziţia lipidică, astfel, valorile cele mai mici (accesibilitatea triptofanului redusă) au fost obţinute pentru lipozomii preparaţi din amestec de DOPC:DPPG. Astfel, putem spune că prezenţa de sarcini negative în membrana lipozomilor duce la o interacţie mai puternică cu aceste peptide şi deci la o ancorare mai bună a peptidei (Trp) în membrană.

Aceste rezultate pot explica parţial afinitatea crescută a acestor peptide pentru membranele bacteriene.

Concluzii

Peptidele prezintă mecanisme diferite de interacţie cu membranele lipidice:

• Peptidele sunt doar adsorbite pe suprafaţa membranelor lipidice ale lipozomilor, o parte din resturile de triptofan fiind ancorate în membrană şi mai puţin expse mediului apos, restul rămânând expuse mediului apos.

• Peptidele prezintă o afinitate mai crescută pentru membranele lipozomilor preparaţi din DOPC/DPPG, lipozomi ce imită membranele bacteriene, comparativ cu membranele lipozomilor preparaţi din DOPC, lipozomi ce imită membranele celulelor de mamifer.

Perspective: Continuarea experimentelor şi la restul de peptide şi completarea

rezultatelor cu date de timpi de viaţă ai fluorescenţei Trp în prezenţa Acrilamidei.

Activităţile de cercetare desfăşurate în etapa 2015 de implementare a proiectului de către partenerul P3 au avut ca scop principal îmbunătăţirea activităţii antimicrobiene a peptidelor obţinute în etapele anterioare de derulare a proiectului.

Astfel, plecând de la rezultatele obţinute anterior cu privire la concentraţia minimă inhibitorie, caracterul bactericid şi factorul hemolitic pentru cele 8 peptide sintetizate, au fost selecţionate 2 peptide (P6 şi P7, Schemele 1 şi 2) pentru care s-a urmărit creşterea activităţii biologice prin: a) obţinerea de complecşi de argint şi b) obţinerea de structuri care prezintă mai multe unităţi peptidice legate de o unitate centrală.

Un alt obiectiv important l-a reprezentat obţinerea de produşi fluorescenţi şi caracterizarea acestora atât din punct de vedere structural cât şi a proprietăţilor optoelectronice, în vederea utilizării lor pentru marcarea peptidelor antimicrobiene.

a) Obţinerea de complecşi de argint ai peptidelor antimicrobiene.

Ionii de argint sunt cunoscuţi ca fiind eficienţi împotriva unei game largi de microorganisme. Astfel, pentru îmbunătăţirea activităţii antimicrobiene a peptidelor, având în vedere prezenţa în structura acestora a mai multor unităţi capabile să coordineze ionul de argint (ex. atomii de azot din catenele laterale ale Trp şi His), s-a realizat reacţia de complexare a P7 cu triflat de argint în soluţie tampon de carbonat la pH = 7.

Schema 1

O

NH2

NH

NH

H2NO

NH

HN

NHH2N

OHN

NHO

NH

NHOH

N

NH

NO

NH

NHOH

N

NHO

NH

NH

HN NH2

OHN

NH

HN NH2

NH2 + CF3SO3Ag

P7: RRWWHWWRR

[RRWWHWWRR]Ag+

Formarea complexului a fost pusă în evidenţă prin spectroscopie de masă de înaltă rezoluţie cu ionizare în electrospray [HRMS (ESI+)] fiind identificate picuri caracteristice pentru [P7+Ag]+: calculat 1631.7274, găsit 1631.7058; [P7+Ag+CF3SO3H]+: calculat 1781.6872, găsit 1781.6646 şi respectiv pentru peptidă necomplexată [P7+H]+: calculat 1523.8144, găsit: 1523.8079 (Figura 8).

HRMS (ESI+) calc. pentru C74H99N28O9

Fig.8. Spectrul [HRMS (ESI+)] pentru reacţia de complexare între P7 şi Ag+

b) Obţinerea de structuri care prezintă mai multe unităţi peptidice legate de o unitate centrală a fost realizată prin reacţia de condensare iminică între grupările aldehidice din compusul 1 şi capătul N-terminal al peptidei P6. Produsul obţinut a fost redus in situ cu borohidrură de sodiu în metanol (Schema 2).

Schema 2

O

NH2HN

N

O

NH

HN

NHH2N

OHN

NH

O

NH

NH

OHN

NH

HN NH2

O

NH

NH

OHN

NH

O

NH

NH

HN NH2

OHN

NH

HN NH2

NH2

P6 - HRWWRWWRR

+

CHO

CHOOHC

OHC

2

1

1. DCM/MeOH, t.a.

2. NaBH4

CH2NH-HRWWRWWRR

CH2OHRRWWRWWRH-HNH2C

HOH2C

2

Creşterea numărului de echivalenţi de peptidă utilizată în reacţie poate permite introducerea, într-o singură etapă, a 4 secvenţe peptidice într-o singură structură moleculară.

Formarea compusului 2 a fost pusă în evidenţă prin HRMS(ESI+).

c) În vederea obţinerii de peptide marcate cu fluorofori au fost sintetizaţi şi au fost studiate proprietăţile de fluorescenţă în mediu apos pentru trei serii de compuşi care conţin una, două sau trei unităţi 1,3,4-oxadiazolice cu diferiţi substituenţi ce prezintă diferite proprietăţi electronice. Compuşii care conţin doar substituenţi donori de electroni au prezentat emisii la lungimi de undă mai mari. Acelaşi comportament se observă pentru deplasările Stokes. De

1000 1500 2000 2500 3000m/z

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

1631.7058

1523.8079

1781.6646

1931.6229

2081.58152231.5403728.3704

1131.4255 2337.43601367.70732659.3342 2917.1912 3116.4172

asemenea, acelaşi efect a fost observat şi pentru compuşii care conţin un singur inel heterociclic substituit cu grupări push-pull. (Figura 9).

Figura 9. Spectrele de excitare (linii punctate) şi de emisie (linie continuă) a compuşilor sintetizaţi (apă, 5 x 10-7 mol/L).

În vederea realizării celei de-a doua activități, în cadrul acestei etape am investigat interacțiunea dintre peptidele selectate P5 (RRWWRWWRR-NH2) și P8 (HRWWRWWRH-NH2), sintetizate anterior, și un nanopor proteic natural având diametrul interior de aproximativ 2-3 nm (diametrul interior minim ~1.5 nm). Structura moleculară a acestor două peptide este ilustrată în figura 10 a). Structura primară a peptidei P8 diferă prin înlocuirea celor două arginine N- și C-terminale ale peptidei P5 cu doi aminoacizi histidină. În condiții de pH neutru, P5 are o sarcină electrică netă de +6, iar P8 de +4. La valori ale pH-ului sub pKa-ul resturilor de histidină (pKaHis = 6.04), acestea se protonează, astfel încât cele două peptide vor avea aceeași sarcină electrică netă, +6.

Fig.1.a) Structura moleculară a celor două peptide utilizate: P8, respectiv P5 (roșu – resturile de histidină, orange – resturile de arginină, cyan – resturile de triptofan); b) schema reacţiei reversibile de asociere dintre peptida P8 și porul proteic; c) ilustrare a unor evenimente de blocaj de durată τoff, induse în urma pătrunderii peptidelor P8 în lumenul porului apos; τon reprezintă intervalul de timp dintre două evenimente de blocaj consecutive.

Am urmărit inserția unui singur por proteic într-o membrană lipidică bistratificată reconstituită prin metoda Montal & Mueller, astfel încât interacțiunile peptidă-por observate în mod indirect prin înregistrarea fluctuațiilor de curent ionic mediat de canalul proteic la aplicarea din exterior a unei diferențe de potențial transmembranară, să fie la nivel uni-

molecular. Peptidele interacționează cu porul conform unei reacții bimoleculare simple, așa cum este exemplificat în figura 10 b) pentru peptida P8, unde kon și koff reprezintă constantele de viteză ale reacțiilor directă, de asociere, respectiv inversă, de disociere, dintre peptidă și nanopor. În momentul pătrunderii unei peptide în lumenul porului proteic, în curentul ionic înregistrat prin canalul ionic liber apar evenimente de blocaj, așa cum poate fi observat în figura 10 c). τon reprezintă intervalul de timp dintre două evenimente de blocaj succesive, iar τoff reprezintă durata unui blocaj, adică timpul de rezidență al peptidei în interiorul porului.

Am pus în evidență abilitatea peptidelor de a pătrunde în lumenul porului apos și am investigat aceste interacțiuni de asociere peptidă-por în diferite condiții de mediu, ținând cont și de caracteristicile structurale ale celor două peptide. Pentru peptida P8, am realizat experimente la două concentrații diferite ale soluției electrofiziologice: 0.5 M KCl, respectiv 1 M KCl, pentru concentrații diferite de peptidă: 1.75, 2.50, 3.25, respectiv 5,00 µM. În figura 11 pot fi observate înregistrări originale ale fluctuațiilor curentului ionic prin porul proteic în urma interacțiunii cu peptida P8, la o diferență de potențial aplicată de +50 mV (necesară mobilizării electroforetice a peptidelor cationice în interiorul porului), la pH = 7.

Fig.11. Înregistrări originale ale fluctuaţiilor curentului ionic prin porul proteic în urma interacţiunii cu peptida P8, la o diferenţă de potenţial aplicată de +50 mV, pH = 7, la două valori ale tăriei ionice: 0.5 M KCl, respectiv 1 M KCl, pentru concentraţii diferite de peptidă: 1.75, 2.50, 3.25, respectiv 5,00 µM.

Din aceste înregistrări se observă că frecvența evenimentelor de blocaj crește cu creșterea concentrației și, de asemenea, că blocajele sunt mai frecvente la o valoare mai mică a tăriei ionice.

Prelucrând statistic datele experimentale am determinat timpul mediu de rezidență al peptidei P8 în interiorul porului, τoff, respectiv timpul mediu dintre două evenimente de blocaj succesive, τon, la o diferență de potenșial aplicată de +50 mV. Ținând cont de faptul că viteza de asociere a reacției reversibile, rataon, este inversul timpului mediu τon, iar viteza de disociere, rataoff, este inversul timpului mediu τoff, am determinat acești parametri ai reacției pentru toate cele patru concentrații de peptidă, respectiv pentru cele două tării ionice ale soluției electrofiziologice. Așa cum poate fi observat în figura 12, viteza de asociere a reacției depinde liniar de concentrația de peptidă, iar constanta de viteză de asociere, kon, poate fi determinată

din panta acestei dependențe (rataon = kon[P8]). Viteza de disociere a reacției nu depinde de concentrația de peptidă și este numeric egală cu constanta de viteză de disociere, koff (rataoff = koff).

Fig.12. a) Dependenţa de concentraţia de peptidă a vitezelor de asociere, rataon, respectiv disociere, rataoff, ale reacţei reversibile dintre peptida P8 și porul proteic, la două valori ale tăriei ionice a soluţei electrofiziologice: 0.5 M KCl, respectiv 1 M KCl, menţinută la pH = 7 cu o soluţie tampon de 10 mM HEPES. Diferenţa de potenţial aplicată a fost de +50 mV. b) Valorile constantelor de viteză de asociere și disociere, kon, respectiv koff, pentru cele două valori ale tăriei ionice investigate. Liniile punctate corespund intervalelor de confidenţă în care valoarea medie adevărată se găseşte cu o certitudine de 90%.

La tărie ionică mai mare constanta de viteză de asociere este mai mică. Acest lucru se explică ținând cont de faptul că la intrarea în canalul proteic analizat sunt prezenți o serie de aminoacizi încărcați din punct de vedere electric care conferă intrării în lumenul porului apos o sarcină netă de -7, la pH neutru. Astfel, scăderea vitezei de asociere la 1 M KCl se datorează ecranării interacţiunilor electrostatice dintre peptida cationică şi sarcina electrică netă negativă de la baza lumenului. Scăderea observată în rataoff și koff se datorează scăderii mobilității electroforetice a peptidelor în por (creșterea intensității forței electroforetice de întârziere datorată norului de contraioni din jurul peptidei, care se opune mișcării acesteia în câmpul electric aplicat) odată cu creșterea tăriei ionice a soluției electrolitice, astfel încât, la tărie ionică mai mare, timpul de rezidență al peptidelor în interiorul porului este mai mare.

În continuare, am comparat interacțiunea dintre peptidele P8 și P5 și porul proteic, în condiții de pH acid, pH = 4.4, la o tărie ionică de 2 M KCl. La această valoare a pH-ului, cele două histidine din structura peptidei P8 vor fi protonate (vezi figura 10 a)), și sarcina electrică netă a acesteia crește cu +2. Astfel, cele două peptide care diferă doar prin cei doi aminoacizi N- și C- terminali (arginine la P5, histidine la P8), vor avea același număr de aminoacizi în structura primară, N = 9, și aceeași sarcină electrică netă, Q = +6.

Înregistrările fluctuațiilor de curent ionic prin porul apos au arătat că la pH = 4.4, peptidele cationice interacționează cu porul și pătrund în canalul ionic și la aplicarea unor diferențe de potențial negative, contrar sensului forței electroforetice care antrenează mișcarea peptidei în por. Acest lucru se datorează faptului că, porul apos investigat este ușor anionic selectiv, selectivitate care crește la valori acide ale pH-ului. Astfel, transportul net al anionilor hidratați dintr-o parte în cealaltă a membranei lipidice, conform polarității câmpului electric aplicat, va antrena molecule de apă ce vor da naștere unui flux electroosmotic care se opune forței electroforetice. Acest lucru este ilustrat în figura 13 pentru peptida P8. Peptidele sunt adăugate în sistem de partea trans a membranei lipidice.

Fig.13. a) Înregistrări ale curentului ionic prin porul proteic la aplicarea unei diferenţe de potenţial de +50 mV (sus), respectiv -50 mV (jos), care ilustrează fenomene de blocaj induse de pătrunderea peptidelor în interiorul porului apos. Concentraţia soluţiei electrolitice este de 2 M KCl, menţinută la pH = 4.4 cu o soluţie tampon de 5 mM MES. b) Reprezentare schematică a sensului forţei electroforetice, respectiv a fluxului electroosmotic, care determină translocarea peptidei prin canalul ionic, în funcţie de polaritatea câmpului electric aplicat. Peptidele sunt reprezentate cu roşu şi au fost adăugate de partea trans a membranei, într-o concentraţie de 30 µM.

Am monitorizat şi înregistrat interacţiunea dintre cele două peptide selectate şi un singur por proteic pentru diferite valori ale diferenţei de potenţial aplicate, atât pozitive cât şi negative, şi am determinat seturi de valori pentru timpul de rezidenţă al peptidei în por, τoff, respectiv timpul mediu dintre două evenimente de blocaj succesive, τon. Prelucrarea statistică a acestor date a generat dependenţele timpilor medii de disociere, respectiv asociere, de diferenţa de potenţial aplicată ilustrate în figura 14.

Fig.14. Dependenţa timpului mediu de rezidenţă al peptidei în por, τoff (stânga), respectiv a timpului mediu dintre două evenimente de blocaj succesive, τon (dreapta), de diferenţa de potenţial aplicată, pentru peptida P5 (triunghiuri orange), respectiv P8 (triunghiuri cyan). Liniile punctate corespund intervalelor de confidenţă în care valoarea medie adevărată se găseşte cu o certitudine de 90%. Concentraţia soluţiei electrolitice este de 2 M KCl, menţinută la pH = 4.4 cu o soluţie tampon de 5 mM MES.

Aşa cum a fost menţionat mai sus, cele două peptide au aceeaşi lungime, aceeaşi sarcină electrică netă la pH acid, şi compoziţie foarte asemănătoare. Cu toate acestea, timpul de rezidenţă al peptidei în por este mai mare pentru peptida P5 decât pentru P8, posibil datorită volumului mai mare al aminoacidului arginină în comparaţie cu cel al aminoacidului histidină. De asemenea, în stare protonată, hidrofobicitatea aminoacidului histidină devine mai mică decât a argininei, fapt ce ar putea facilita translocarea peptidei de-a lungul interiorului hidrofil al porului. Acest aspect ar putea explica şi frecvenţa mai mare a evenimentelor de blocaj pentru peptida P8, a cărei hidrofobicitate redusă facilitează interacţiunea peptidă-por şi accesul în lumenul acestuia.

În urma acestor studii am analizat din punct de vedere cinetic interacțiunea dintre peptide și un por proteic apos, determinând constantele de viteză ale reacției reversibile. Am arătat că interacțiunile peptidă-por sunt influențate de condițiile de mediu, tăria ionică a soluției electrofiziologice, respectiv pH, în corelaţie cu diferite caracteristici structurale ale peptidelor. Am pus în evidenţă posibilitatea peptidelor de a transloca de partea cealaltă a membranei lipidice prin intermediul porilor proteici apoşi, sugerând o posibilă cale de permeaţie a peretelui celular al bacteriilor Gram-negative şi de acces al acestora în spaţiul periplasmatic, de unde ulterior îşi exercită efectul litic asupra membranei interne.

Rezultatele științifice obținute în cadrul acestei etape a proiectului au fost diseminate prin 10 articole științifice publicate și în curs de publicare și 19 prezentări în cadrul unor conferințe naționale și internaționale, după cum urmează:

Articole:

1. Irina Schiopu, Sorana Iftemi, Tudor Luchian, Nanopore investigation of the stereoselective interactions between Cu2+ and D,L-histidine amino acids engineered into an amyloidic fragment analogue, 2015, Langmuir 31(1), 387-396

2. Alina Asandei, Mauro Chinappi, Jong-kook Lee, Chang Ho Seo, Loredana Mereuta, Yoonkyung Park, Tudor Luchian, Placement of oppositely charged aminoacids at a polypeptide termini determines the voltage-controlled braking of polymer transport through nanometer-scale pores, 2015, Scientific Reports (Nature Publishing Group) 5:10419

3. Alina Asandei, Mauro Chinappi, Hee-Kyoung Kang, Chang Ho Seo, Loredana Mereuta, Yoonkyung Park, Tudor Luchian, Acidity-Mediated, Electrostatic Tuning of Asymmetrically Charged Peptides Interactions with Protein Nanopores, 2015, ACS Applied Materials & Interfaces 7(30), 16706-16714

4. Mauro Chinappi, Tudor Luchian, Fabio Cecconi, Nanopore tweezers: Voltage-controlled trapping and releasing of analytes, 2015, Physical Review E 92, 032714

5. Mihaela Bacalum, Mihai Radu, Cationic Antimicrobial Peptides Cytotoxicity on Mammalian Cells: An Analysis Using Therapeutic Index Integrative Concept, 2015, International Journal of Peptide Research and Therapeutics 21(1), 47-55

6. Diana Savu, Ileana Petcu, Mihaela Temelie, Cosmin Mustaciosu, Nicoleta Moisoi, Compartmental stress responses correlate with cell survival in bystander effects induced by the DNA damage agent, bleomycin, 2015, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 771, 13-20

7. Mihaela Bacalum, Bogdan Zorila, Mihai Radu, Investigating the anticancer activity of some cationic antimicrobial peptides in epithelial tumor cells, 2015, Romanian Reports in Physics, acceptat

8. Alia Colniţă, Daniel Marconi & Ioan Turcu, Fabrication of Interdigitated Electrodes Using Molecular Beam Epitaxy and Optical Lithography, 2015, Anal. Lett., acceptat, DOI: 10.1080/00032719.2015.1033719

9. Daniel Marconi, Alia Colniţă & Ioan Turcu, The Influence of Deposition Rate on the Structure and Morphology of Gold/Silicon(111) Growth by Molecular Beam Epitaxy, 2015, Anal. Lett., acceptat, DOI: 10.1080/00032719.2015.1022823

10. Codruta C. Paraschivescu, Niculina D. Hădade, Anca G. Coman, Arnaud Gautier, Federico Cisnetti, Mihaela Matache, Symmetrical and non-symmetrical 2,5-diaryl-1,3,4-oxadiazoles: synthesis and photophysical properties, 2015, Tetrahedron Letters 56(25), 3961-3964

Conferinţe:

Internaţionale:

1. I. Schiopu, A. Asandei, S. Iftemi, L. Mereuta, T. Luchian, Copper determined beta-amyloid peptides misfolding: a single molecule assay, 10th European Biophysics Congress, July 18-22, 2015, Dresden, Germany (poster presentation)

2. Alina Asandei, Loredana Mereuta, Tudor Luchian, Single-molecule investigation of peptide conformational changes with a protein nanopore, Gordon Research Conferences frontiers of science, Membrane Protein Folding, 21-26 iunie 2015, Bentley University, Boston (poster presentation)

3. Daniel Marconi, Alia Colniţă, Maria Miclăuş, Ioan Turcu, Fabrication of interdigitated electrodes by molecular beam epitaxy technique for molecular detection, 10th European Biophysics Congress, July 18-22, 2015, Dresden, Germany (poster presentation)

4. A. Colniţă, N. E. Dina, D. Vodnar, N. Leopold, L. David, The discrimination of Gram-positive bacteria using Raman and SERS spectroscopies, 10th European Biophysics Congress, July 18-22, 2015, Dresden, Germany (poster presentation)

5. A Colniţă, D.Marconi, Diana Bogdan, Silvia Neamțu, Flavia Martin, Ioan Turcu, Fabrication of interdigitated electrodes for molecular sensing applications, 10th International Conference Processes in Isotopes and Molecules, 23-25 Sept 2015, Cluj-Napoca, Romania (poster presentation)

6. Daniel Marconi, Alia Colniţă, Radu Tiberiu Brătfălean, Ioan Turcu, Fabrication of nanostructured silicon films for biosensing applications, 10th International Conference Processes in Isotopes and Molecules, 23-25 Sept 2015, Cluj-Napoca, Romania (poster presentation)

7. Radu Tiberiu Brătfălean, Daniel Marconi, Alia Colniţă, I. Turcu, Differentiation of Gram-positive bacteria using vibrational spectroscopies and Principal Component Analysis, 10th International Conference Processes in Isotopes and Molecules, 23-25 Sept 2015, Cluj-Napoca, Romania (poster presentation)

8. Lorant Janosi, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Octav Căldăraru, Mihaela Bacalum, Niculina Hădade, Ion Grosu, Ioan Turcu, Synthesis and investigation of novel small antimicrobial peptides, European Biotechnology Congress 2015, 07–09 May, Bucuresti, Romania (oral presentation)

9. Lorant Janosi, Ioan Turcu, Interaction mechanisms of short ARG-TRP-HIS based antimicrobial peptides with membrane models, 10th European Biophysics Congress, July 18-22, 2015, Dresden, Germany (poster presentation)

10. Lorant Janosi, Ioan Turcu, Mechanisms of Interaction of Short Cationic Antimicrobial Peptides with Lipid Membrane Models, 10th International Conference Processes in Isotopes and Molecules, 23-25 Sept 2015, Cluj-Napoca, Romania (oral presentation)

Naţionale:

1. Schiopu Irina, Iftemi Sorana, Apetrei Aurelia, Luchian Tudor, Nanopore-based assay for chiral recognition by metals, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (oral presentation)

2. Sorana Iftemi, Marta de Zotti, Fernando Formaggio, Claudio Toniolo, Lorenzo Stella, Tudor Luchian, Electrophysiology studies of Trichogin GA IV activity in reconstituted planar lipid membranes, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (poster presentation)

3. Alina Asandei, Loredana Mereuta, Tudor Luchian, Braking of peptide passage across nanopores with oppositely charged aminoacids at the peptide termini, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (poster presentation)

4. Mihaela Bacalum, Florina Zorila, Therapeutic potential of de novo synthesized antimicrobial peptides, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (oral presentation)

5. Ioan Dorobantu, Livia Neagu, Mihaela Bacalum, Cristina Ionescu, Cristian Ion, Antoniu Moldovan, Obtaining of nanoimunosorbent SiO2-2,4dichlorophenoxyacetic acid and its physico-chemical characterization, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (poster presentation)

6. Bogdan Zorila, Mihaela Bacalum, Aurel Popescu, Study of the interaction between antimicrobial peptides and model cell membranes by time resolved fluorescence, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (poster presentation)

7. Maria-Cristina Pașcanu, Niculina D. Hădade, Ion Grosu, Cyclic peptides: Synthesis and Binding Properties, Zilele Academice Ieșene, A XXV-a sesiune de comunicări ştiinţifice "Progrese in știinţa compușilor organici si macromoleculari", 24-26 Septembrie 2015, Iasi, Romania (poster presentation)

8. Alia Colniță, Nicoleta Elena Dina, Dan Vodnar, Nicolae Leopold, Diana Bogdan, Leontin David, Ioan Turcu, Differentiation of Gram-positive bacteria using vibrational spectroscopies and Principal Component Analysis, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (poster presentation)

9. Lorant Janosi, Ioan Turcu, Mechanisms of Interaction of Short Arginine-, Tryptophan- and Histidine-Based Antimicrobial Peptides with Lipid Membranes, 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania (oral presentation)

Premii:

• Alina Asandei et al. won the Best Poster Prize at the 13th National Conference on Biophysics CNB 2015, with International Participation, June 4-6, 2015, Timisoara, Romania, for the work: "Braking of peptide passage across nanopores with oppositely charged aminoacids at the peptide termini"

Director de proiect,

Prof.univ.dr. Tudor LUCHIAN

Decembrie, 2015