Raport HEALinSiDE Etapa 2 FINAL...Activitate 2.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului Obiectiv...

HEAL inSiDE – Etapa 2 1 / 66

RAPORT ŞTIINŢIFIC DE ETAPĂ

Contract nr. 99 ⁄ 2018, cu titlul „ Design de peptide antimicrobiene cu potenţial

terapeutic ridicat: predicţie in silico şi validare experimentală” (HEAL inSiDE)

PN-III-P1-1.1-TE-2016-0032

Etapa 2

Această etapă are 4 obiective împărţite în 15 activităţi. Deoarece acest document

constituie un raport al activităţii ştiinţifice, obiectivele 2.1 şi 2.4, marcate în gri, sunt

doar enumerate. Obiectivele ştiinţifice ale acestei etape sunt 2.2 şi 2.3, având 9

activităţi. Raportul ştiinţific este împărţit în următoarele secţiuni: (1) Introducere, (2)

Rezumatul etapei, (3) Descrierea ştiinţifică şi tehnică, cu subsecţiunile: (3.1)

Programe şi modele utilizate, (3.2) Protocol obţinere candidaţi peptidici, (3.2)

Simulări atomistice, (3.3) Simulări coarse-grained, (3.4) Calcule de potenţial de forţă

medie (PMF), (3.5) Clasificare afinităţi şi protocol propunere noi candidaţi peptidici

antimicorbieni, (3.6) Protocoale şi experimente MIC/MBC şi SERS (4) Concluzii

etapă şi (5) Bibliografie. Sumar activităţi:

Obiectiv 2.1 Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative

Activitate 2.1.1 Planificarea activităţilor administrative

Activitate 2.1.2 Organizarea de întâlniri de grup regulate în scopul: (i) identificării

potenţialelor probleme ştiinţifice; (ii) planificării activităţilor

ştiinţifice viitoare

Activitate 2.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului

Obiectiv 2.2 Propunerea de noi candidaţi AMP (nAMP) cu trecere

uşoară/activitate ridicată împotriva membranelor model bacteriene

şi cu afinitate scăzută faţă de membranele model de mamifer

Activitate 2.2.1 Generarea listelor iniţiale de candidaţi peptidici: din baze de date

şi prin generarea de secvenţe de aminoacizi


Activitate 2.2.2 Determinarea afinităţii de legare a peptidelor din simulări de

dinamică moleculară/docking

Activitate 2.2.3 Clasificarea afinităţii folosind calcule de potenţial de forţă medie

(PMF) transmembranar obţinute cu metoda FR

Activitate 2.2.4 Testarea auto-asocierii peptidelor/formării porilor membranari şi

testarea activităţii peptidice în complecşii peptidă-membrană

model bacterian/de mamifer prin simulări CG

Activitate 2.2.5 Calcularea PMF-ului de înaltă precizie pentru peptidele cele mai

puţin/cele mai active împotriva modelelor membranare

bacteriene/de mamifer

Activitate 2.2.6 Analizarea rezultatelor Act.2.2.4 şi 2.2.5 şi propunerea de noi

candidaţi peptidici antimicrobieni

Obiectiv 2.3 Validarea experimentală a nAMP prin monitorizarea activităţii

antimicrobiene şi a compoziţiei membranelor bacteriene

Activitate 2.3.1 Manipularea patogenilor şi pregătirea probelor pentru măsurători

MIC/MBC şi SERS

Activitate 2.3.2 Calcularea MIC şi MBC pentru nAMP propuse folosind metoda

difuzometrică

Activitate 2.3.3 Obţinerea compoziţiei membranelor bacteriene folosind HTS-

SERS

Obiectiv 2.4 Diseminare rezultate proiect

Activitate 2.4.1 Diseminare rezultate în cadrul întâlnirilor regulate ale grupului

Activitate 2.4.2 Diseminare rezultate prin participare la conferinţe şi publicaţii

Activitate 2.4.3 Întocmire raport ştiinţific de etapă, concluzii şi prespective


▪ 1. Introducere

Conform datelor furnizate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii rezistenţa

antimicrobiană este în creştere şi reprezintă o ameninţare tot mai mare la adresa

sănătăţii publice [1]. Una din prinicipalele cauze este determinată de dezvoltarea

insuficientă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2].

Pe lângă potenţialului terapeutic ridicat, peptidele antimicrobiene naturale prezintă

acţiune bactericidă, antiinflamatoare şi anticancer, cu selectivitate ridicată pentru

celulele bacteriene în comparaţie cu cele de mamifer [3,4]. Cu toate acestea,

posibilitatea ca bacteriile să dezvolte diferite strategii de rezistenţă bacteriană

(modificări în sarcina de suprafaţă) împotriva activităţii peptidelor naturale sugerează

necesitatea unor noi abordări în design-ul unor noi peptide antimicrobiene. Creşterea

siguranţei şi eficacităţii noilor medicamente este esenţială pentru noile peptide

(extrase din fragmente de proteine şi din biblioteci peptidice sau concepute în mod

secvenţial).

Abordările de cercetare ale peptidelor

antimicrobiene pot fi clasificate în 3

categorii [5]: bazate pe şablon

(peptidele sunt tratate ca secvenţe de

aminoacizi, limitate la proprietăţile lor

individuale, cum ar fi hidrofobicitatea,

încărcarea / sarcina electrică etc.),

modele privind relaţia cantitativă

structură-activitate, QSAR (analize

numerice care descriu relaţiile dintre

proprietăţile peptidelor ca intrări şi activitatea biologică ca ieşire, limitată de funcţia

utilizată) şi studiile biofizice (modelare moleculară bazată pe energie liberă, dinamică

moleculară etc., limitată de scală, modele de membrane).

În această etapă combinăm şablonul cu metodele biofizice teoretice pentru predicţia

unei liste limitate de peptide. Acestea sunt ulterior rafinate şi testate experimental

pentru a valida protocolul de predicţie in silico propus în acest proiect şi descris în

această etapă.

Fig. 1. Inserarea peptidelor antimicrobiene în membrană [5]


▪ 2. Rezumatul etapei

A doua etapă a acestui proiect totalizează 15 activităţi (enumerate pe primele două

pagini ale acestui raport), pentru atingerea a 4 obiective principale: (O2.1)

Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative; (O2.2) Propunerea de noi

candidaţi AMP (nAMP) cu trecere uşoară/activitate ridicată împotriva membranelor

model bacteriene şi cu afinitate scăzută faţă de membranele model de mamifer;

(O2.3) Validarea experimentală a nAMP prin monitorizarea activităţii antimicrobiene

şi a compoziţiei membranelor bacteriene; (O2.4) Diseminarea rezultatelor

intermediare obţinute în această etapă.

Sumarul activităţii ştiinţifice de etapă (O2.2 şi O2.3) este următorul:

Activităţile pentru propunerea de noi candidaţi antimicrobieni (nAMP) sunt:

propunera unei liste iniţiale de candidaţi (3.2), pe baza unui algoritm clar,

având ca scop (a) filtrarea acestora la un număr restrâns prin docking (3.3),

iar apoi (b) clasificarea afinităţii acestora prin PMF transmembranar (3.4) şi (c)

simulări CG de testare a auto-asocierii acestora/formării de pori

transmembranari (3.5) pentru testarea activităţii lor asupra membranelor.

Activitatea celor mai buni candidaţi a fost testată prin PMF de adeziune şi la

model membranar de mamifer (3.6). În final, s-a propus o listă de noi

candidaţi peptidici (creată pe baza rezultatelor anterioare), care, împreună cu

cei mai buni candidaţi deja prezenţi în baza de date PepBank, au fost propuse

pentru validare experimentală (3.7).

Experimentele au fost împărţite în două mari categorii (i) testele de MIC/MBC

pentru activitate antimicrobiană şi cele de viabilitate celulară a peptidelor

propuse (3.8) şi (ii) experimentele SERS (3.9). Acestea sunt abordări diferite

care au fost folosite pentru a valida experimental noile peptide antimicrobiene

propuse, precum şi a verifica activitatea acestora asupra celulelor de mamifer.

Descrierea detaliată a activităţilor este realizată la secţiunea 3, începând cu

prezentarea programelor şi metodelor care au fost folosite din partea teoretică,

precum şi a programelor şi protocoalelor din partea experimentală (3.1).


Raportul ştiinţific de etapă se încheie cu câteva concluzii majore asupra rezultatelor

obţinute, precum şi o listă de referinţe folosite în acest raport.


� 3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică

3.1. Programe şi modele / protocoale utilizate

NAMD [6] – cod de dinamică moleculară care este proiectat pentru paralelizarea

eficientă a simulărilor de sisteme biomoleculare de largi dimensiuni. NAMD este

accesibil pentru utilizare gratuită, pentru o perioadă nelimitată de timp şi este bazat

pe un design modern şi tehnologii de programare avansate. Versiunile recente ale

codului (NAMD 2.12 – NAMD2.13) includ accelerări semnificative pe partea de

paralelizare a codului folosind setul de instrucţiuni CUDA ale motoarelor grafice

(GPU).

GROMACS [7] – cod de dinamică moleculară proiectat în principal pentru

biomolecule (proteine, lipide), dar este utilizat şi în studiul altor sisteme (polimeri).

Permite paralelizarea mult mai eficientă a simulărilor coarse-grained.

VMD [8] – program de vizualizare şi modelare dezvoltat pentru sisteme

biomoleculare, eficient în pregătirea configuraţiilor iniţiale şi postanaliza traiectoriilor

NAMD/GROMACS.

CHARMM [9, 10] – câmp de forţe atomistic al cărui calcul al energiei potenţiale se

realizează după descrierea de mai jos:

( ) ( ) [ ] ( )

( )

2 2 2

0 0 0

12 6

21,3 1,3

0

1 cos( )

2

b

i j ij ij

ij ub

i, j i, jij ij ij

U k b b k k n k

q q r rk b b

r r r

θ ψ ωθ θ ψ δ ω ω

εε −

= − + − + + − + −

+ + − + −

∑ ∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑

bonds angles dihedrals impropers

min min

atoms atoms Urey Bradley

MARTINI [11] – câmp de forţe semi-atomistic / coarse-grained (CG) care modelează

ca o singură particulă 4 sau 3 atomi grei împreună cu atomii de hidrogen aferenţi.

Câmpul de forţe Martini 2 a fost rafinat în mai multe etape prin îmbunătăţirea

câmpului pentru proteine, apă şi ioni (a fost dezvoltat inclusiv câmp de forţe polarizat

[12]) şi extinderea acestuia asupra unui număr impresionant de lipide [13-16].

Tcl/Tk – limbaj de scripting foarte eficient în generarea de structuri în format

PDB/GRO şi pentru analiza datelor obţinute din postanaliza VMD. Limbajul este


compatibil cu VMD şi astfel poate fi folosit şi în cadrul postanalizei traiectoriilor în

VMD.

Python [17] – limbaj de programare avansat uşor de utilizat de tip iterativ, imperativ

şi cu un interpretor interactiv.

Microsoft Excel – utilitar de analiză rapidă a fişierelor de tip bază de date în mod

text.

Vina [18] – program open-source folosit pentru calcule de andocare moleculară.

Viteza şi acurateţea programului au fost îmbunătăţite faţă de AutoDock 4, datorită

unei noi funcţii de scor, eficient optimizate şi capabilă de multithreading.

AutoDockTools [19] – set de programe utilitare de la AutoDock, utilizat de noi

pentru conversia eficientă a structurilor standard PDB în structuri flexibile PDBQT.

Chimera [20] – program complex pentru vizualizare interactivă şi analiză a

structurilor moleculare, precum şi de date legate de acestea, cum ar fi: hărţi de

densitate, asocieri supramoleculare, alinieri de secvenţe, rezultate andocări,

traiectorii şi ansamble conformaţionale.

MIC – concentraţia minimă inhibitorie (minimum inhibitory concentration) este cea

mai mică concentraţie a agentului testat care inhibă vizibil creşterea tulpinilor

bacteriene.

MBC – concentraţia minimă bactericidă (minimum bactericidal concentrations) este

cea mai mică concentraţie a agentului testat care inhibă complet/omoară o anumită

tulpină bacteriană.

Protocol de preparare in situ a substratului SERS de argint (Ag) – Protocol

îmbunătăţit pentru sinteza in situ a nanoparticulelor de Ag (AgNPs – Ag nano-

particles) [21–24] derivat din reţeta clasică propusă de către Leopold et al. [25] care

constă în reducerea azotatului de Ag (AgNO3) cu hidroxilamină hidrocloridă (hya).


3.2. Protocol obţinere şi listă iniţială de candidaţi

Peptidele au fost extrase din baza de date PepBank [26, 27], dintr-un total de 21.691 peptide. S-a utilizat modulul de “Căutare Avansată” cu următoarele opţiuni:

i) Scor: > 0.6

ii) Secvenţa Peptidică: _____

iii) Sarcina netă: > +3

iv) Procent aminoacizi hidrofobi: peste 20%

v) Lungimea candidatului: până la 18 aminoacizi

În continuare au fost urmaţi următorii paşi:

1) Cele 464 peptide rezultate au fost ordonate după descreşterea sarcinii nete şi a procentului de aminoacizi hidrofobi conţinuţi.

2) Peptidele selectate au fost apoi importate în programul Microsoft Excel 2010 şi s-au eliminat duplicatele (Data Tools – Remove Duplicates). Au rămas astfel un număr de 372 peptide unice (vezi Tabel1).

3) Fişierele conţinând structura tri-dimensională iniţială, în formatul PDB, au fost generate utilizând programul tleap din AMBER12 [28].

a) tleap, varianta în consolă a xleap, funcţionează interactiv sau prin intermediul unui fişier de input în care se specifică toate comenzile necesare. În cazul de faţă am utilizat un fişier de input denumit tleap.in:

tleap -f tleap.in

Conţinutul fişierului tleap.in ce crează 2 structuri este exemplificat mai jos:

source /opt/amber12/dat/leap/cmd/leaprc.ff12SB pept = sequence { NCYS ARG PRO PRO CARG } savepdb pept 001_CRPPR.pdb pept = sequence { NGLY THR LEU ARG CPHE } savepdb pept 010_GTLRF.pdb quit

b) Pentru conversia secvenţelor peptidice din exprimarea cu o literă (specificate astfel în PepBank [26, 27]) în cea cu trei litere (necesară în tleap), s-a utilizat un script în limbajul Python [17]:

infile = open("peptdb_1let.txt", "r") outfile = open("output.txt", "w") c = {'C': 'CYS', 'D': 'ASP', 'S': 'SER', 'Q': 'GLN', 'K': 'LYS', 'I': 'ILE', 'P': 'PRO', 'T': 'THR', 'F': 'PHE', 'N': 'ASN', 'G': 'GLY', 'H': 'HIS', 'L': 'LEU', 'R': 'ARG', 'W': 'TRP', 'A': 'ALA', 'V':'VAL', 'E': 'GLU', 'Y': 'TYR', 'M': 'MET'} def lengthen(x): z = '' for i in range(len(x)):


z += c[x[i]] z += ' ' return z for line in infile: outfile.write(lengthen(line.rstrip())) outfile.write('\n') infile.close() outfile.close()

Programul Microsoft Excel 2010 a fost utilizat în continuare pentru a crea structura comenzilor necesare în fişierul de input tleap.in, pentru toate peptidele. Acestea au fost apoi salvate separat în două fişiere care au fost apoi concatenate utilizând comenzile în limbajul Python [17]:

with open("peptdb_tleap.txt", "r") as file1, open("peptdb_names.txt") as file2: for line1, line2 in zip(file1, file2): print (line1) print (line2)

Crearea fişierelor PDB a decurs apoi automat prin apelarea tleap.in, conţinând toate structurile.

#Index 6637 4427 1569 1732 1607 1583 1562 2286 1561 6195 6284 6285 6539 1560 1655 1656 1657 1660 5007 5008 6369 5365 883 6143 5710 1564 1568 1606 1608 1559 5291 1576 1998 1800 1566 4981 2209 1835 1862 1866 1867

Sequence SLYARRRRRRVRVKGG GRFRRRSMRRRMKGG KLLKLLLKLWKKLLKLLK PAWRKAFRWAKRMLKKAA KWKLFKKIPKFLHLAKKF KNLRRIIRKIIHIIKKYG KKYKAYFKLKCKK RQIKIWFQNRRMKWKK KKWKMRRNQFWVKVQRG RLVRRVARRKSMRGG RRWCFRVCYKGFCYRKCR RRWCFRVCYRGFCYRKCR SGRRRALRRRIKGG KKVVFKVKFKK LRKLRKRLLR LRKMRKRLMR LRLLRKLKRR LRRLRRRLLR KWCFRVCYRGICYRKCR KWCFRVCYRGICYRRCR RWCFRVCYRGICYRKCR MVKLRLKRCGRK ACSRPKAKAKAKAKDQTK RGGRLCYCRRRFCVCVGR QCRRLCYKQRCVTYCRGR KLALKLALKALKAALKLA KLLKLLLKLLLKLLK KWKLFKKIGAVLKVL KWKLLKKIGAVLKVL KKVVFKVKFK MLEKKLFLKALKKK KLVFFKKKK TQAKRKKSLAMFLR RAFIASRRIKRP KLKLKFKLKQ KRYGGFLRRQFKV YRMKLPKSAKPVSQMR RLRLRIGRR RRKWRRWHL RRRWHRWRL RRRWRRLTV

Length 16 15 18 18 18 18 13 16 17 15 18 18 14 11 10 10 10 10 17 17 17 12 18 18 18 18 15 15 15 10 14 9 14 12 10 13 16 9 9 9 9

Charge 8 8 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Neutral 0.12 0.2 0 0.06 0.11 0.11 0.08 0 0.06 0.13 0.28 0.28 0.21 0 0 0 0 0 0.29 0.29 0.29 0.17 0.11 0.39 0.28 0 0 0.07 0.07 0 0 0 0 0.08 0 0.15 0.12 0.11 0.11 0.11 0

Polar 0.06 0.07 0 0 0 0.06 0 0.19 0.18 0.07 0 0 0.07 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.17 0 0.17 0 0 0 0 0 0 0 0.21 0.08 0.1 0.08 0.19 0 0 0 0.11

Pos 0.5 0.53 0.39 0.39 0.39 0.39 0.54 0.44 0.41 0.47 0.39 0.39 0.5 0.55 0.6 0.6 0.6 0.6 0.35 0.35 0.35 0.5 0.39 0.33 0.33 0.28 0.33 0.33 0.33 0.5 0.43 0.56 0.36 0.42 0.5 0.38 0.31 0.56 0.56 0.56 0.56

Neg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.06 0 0 0 0 0 0 0 0.07 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Hydroph 0.31 0.2 0.61 0.56 0.5 0.44 0.38 0.38 0.35 0.33 0.33 0.33 0.21 0.45 0.4 0.4 0.4 0.4 0.35 0.35 0.35 0.33 0.28 0.28 0.22 0.72 0.67 0.6 0.6 0.5 0.5 0.44 0.43 0.42 0.4 0.38 0.38 0.33 0.33 0.33 0.33

Score 0.6 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.66 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.8 0.6 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.6 0.67 0.68 0.68 0.68 0.68

Tabel 1 – pagina 1


#Index 6096 6142 6139 6141 4552 6272 1190 4855 5159 5545 1590 4879 1133 2060 1546 5077 1127 1535 1609 1637 1973 2037 1992 4813 4814 1026 1027 1110 1996 6164 6182 1129 3811 2768 2825 879 2475 2482 1836 2500 5186 3994 868 1793 1997 5152 3675 880 1321 2355 5297 1490 2765 4825 1864 1050 4148 4638 4920 1345 5149 5150 1200 1313 2098 3265 3712 5141 7323 822

Sequence RFNRLSPRRAMQALQTRT RGGRLCYCRRRFCICV RGGGLCYCRRRFCVCVGR RGGRLCYCRPRFCVCVGR GVKSLKRRRCY RRGSTRYMQALRTRT CQKRYRGHKITHKMIC IVRRACCSDRRCRWRCG LRTNKGTHYQRMTRMSK PDPAKTAPKKKSKKAVT KRRRLSSRA KFFRKKSHYHSRTTS AMARAASAAALARRR WKLFKKILKVL KFFKFFKFFK LKLKSIVSWAKKVL ALRLAIRKR IWRVWRRWK KWRRWVRWI LIYRRRLMK SWLSKTAKKLIGAVLKVL VRRFPWWWPFLRR TIKALVSRCRAKAAV INWKKIKSIIKAAMN INWKKIKSLIKAAMS ARKAAKKA ARKKAAKA AGLRLKKAAIHR TQAKRKKALAMA RICRIIFLRVCR RLCRIVVIRVCR ALWKNMLKGIGKLAGK FITLLLRKFICSITKKC AKFRLMQALRTRT apaRLRRGSRaaa WYKIAFQRNRK aaPRrRprAaa aaRRrPprAaa RLYLRIGRR aaTRKRRaa LVrRKrL FRPALIVRTKGTRL TWYKIAFQRNRK QMARIPKRLARH TQAKRKKSLAMA LRPAVIVRTKGK EMRLSKFFRDFILQRKK YKIAFQRNRK FKCRRWQWRM QKKIRVRLSA MLMPKRTKYR HMRSAMSGLHLVKRR AKEKIRIRLKAYDHR IRFRNATMQALRTRT RRRRASVA HLRRCGKKPYILMACS GGKWSKRSVVGWPAVR HLLQLRKMIKKMTNKE KIMAKPSKFYEQLRGR FQWQRNMRKVR LRPAFIRPKGK LRPAVIRPKGK CSRNLSEIKLLISRARK FGGFTGARKSARKLANQ YQTLRRRVKRSLVVPTD DKRLPYFFKHLFSNRTK ESRLPKIRFDFIFPRKK LPWRTSLLPSLPLRRRP YGGFLRRIRPKLKWDNQ KIAFQRNRK

Length 18 16 18 18 11 15 16 17 17 17 9 15 15 11 10 14 9 9 9 9 18 13 15 15 15 8 8 12 12 12 12 16 17 13 13 11 11 11 9 9 7 14 12 12 12 12 17 10 10 10 10 15 15 15 8 16 16 16 16 11 11 11 17 17 17 17 17 17 17 9

Charge 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Neutral 0.06 0.38 0.44 0.44 0.18 0.07 0.31 0.29 0.12 0.18 0 0.13 0 0 0 0 0 0 0 0 0.06 0.15 0.07 0 0 0 0 0.17 0 0.17 0.17 0.19 0.12 0 0.15 0 0.18 0.18 0.11 0 0 0.14 0 0.17 0 0.17 0 0 0.1 0 0.1 0.2 0.07 0 0 0.31 0.25 0.06 0.12 0 0.27 0.27 0.06 0.18 0.06 0.12 0.12 0.24 0.18 0

Polar 0.33 0 0 0 0.09 0.33 0.12 0.06 0.35 0.18 0.22 0.33 0.07 0 0 0.14 0 0 0 0 0.17 0 0.13 0.2 0.2 0 0 0 0.17 0 0 0.06 0.18 0.23 0.08 0.18 0 0 0 0.11 0 0.14 0.25 0.08 0.25 0.08 0.12 0.2 0.1 0.2 0.1 0.13 0 0.33 0.12 0.06 0.12 0.19 0.12 0.27 0 0 0.24 0.24 0.24 0.18 0.06 0.18 0.12 0.22

Pos 0.28 0.31 0.28 0.28 0.45 0.33 0.31 0.35 0.29 0.35 0.56 0.33 0.27 0.36 0.4 0.29 0.44 0.44 0.44 0.44 0.22 0.31 0.27 0.27 0.27 0.5 0.5 0.33 0.33 0.33 0.33 0.25 0.24 0.31 0.31 0.36 0.36 0.36 0.44 0.44 0.57 0.29 0.33 0.33 0.33 0.33 0.35 0.4 0.4 0.4 0.4 0.27 0.4 0.27 0.5 0.25 0.25 0.31 0.31 0.36 0.36 0.36 0.29 0.24 0.29 0.29 0.35 0.24 0.29 0.44

Neg 0 0 0 0 0 0 0 0.06 0 0.06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12 0 0 0 0 0 0.13 0 0 0 0 0.06 0.06 0 0 0 0.06 0 0.06 0.06 0.12 0 0.06 0

Hydroph 0.33 0.31 0.28 0.28 0.27 0.27 0.25 0.24 0.24 0.24 0.22 0.2 0.67 0.64 0.6 0.57 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.54 0.53 0.53 0.53 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.47 0.46 0.46 0.45 0.45 0.45 0.44 0.44 0.43 0.43 0.42 0.42 0.42 0.42 0.41 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.36 0.36 0.36 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.33

Score 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.68 0.68 0.68 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.68 0.6 0.6 0.69 0.69 0.68 0.68 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.81 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.81 0.68 0.68 0.6 0.6 0.81 0.68 0.65 0.6 0.68 0.6 0.6 0.68 0.69 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.68 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.81



#Index 846 2181 2807 3816 5060 1673 6140 4998 4999 6176 5157 3873 6716 2093 7485 4301 4305 4558 1242 1690 4020 5534 1614 1523 4799 4800 4801 5119 2819 1126 1130 1131 1155 2479 4729 4808 4815 1861 2826 4810 1307 4726 5151 1563 4803 4818 5259 2453 2457 2458 2462 2472 2499 5107 2455 2469 1516 1518 2821 5702 5886 1466 1654 3672 1024 1880 1052 2345 5173 878

Sequence RKRLQVQLSIRT RIQRGPGRAFVTIGK ANIKSAIKRAKTSEK FLDERNYIKKKRHKL LGPALITRKPLKGKP LVRGCWTKSYPPKPCFVR RGGRLCYCRGWICFCVGR KTRRRFDYMQALHTRT KTRRRFDYMQALQTRT RKKWHGWTRW LRrFRrP FLGLGPRGKKPRNF SRGKSMMQALRTRT YLKGCWTKSYPPKPCFSR YPRSIYIRRRHPSPSLTT GLQPIKRRRCF GLSNVKRRRCF GVQSLKRRRCF DLLYKNKPRYPKRNRE MKRPPGFSPFRSSRIG GALRGCWTKSYPPKPCK PAQPFRIKKRQGPFERP LARLLARLLARL INLKALAALAKKIL INLKAIAAFAKKLL INLKAIAALAKKLL INLKAIAALVKKVL LNLKALLAVAKKIL apaAVRFRRLaaa ALLLAIRKR ALWLAIRKR ALYLAIRKR AWLLAIRKR aaRIKRWaa IKWKAILDAVKKVL INWKGIAAMAKKLL INWKKMAATALKMI RRKWLWLW apaVVGRKVRaaa INWKGIAAMKKLL FASLLGKALKALAKQ IKITTMLAKLGKVLAHV LRPAVIVRTKAL KLAKLAK INLLKIAKGIIKSL INWLKLGKKVSAIL MKAIFVLKGWWRTS aaGRIKRaa aaIRKTRaa aaIRRPRaa aaKRLPRaa aaPRLRRaa aaTRIKRaa LLLRRQFYR aaHIrKprWaa aaLRrIprHaa ILAVCIAVNSRRR ILPWKWPWWPWRR apaGHYRLKRaaa QAIVSKARRPYIL QLHVNKARRVYIL GWWYKGRARPVSAVA LRIPCCPVNLKRLLVVV EMRISRIILDFLFLRKK AKKARA RYYRIK IRYCWLRR KIRVRLSA LSYRKLRF WYKIAFQRNR

Length 12 15 15 15 15 18 18 16 16 10 7 14 14 18 18 11 11 11 16 16 17 17 12 14 14 14 14 14 13 9 9 9 9 9 14 14 14 8 13 13 15 17 12 7 14 14 14 9 9 9 9 9 9 9 11 11 13 13 13 13 13 15 17 17 6 6 8 8 8 10

Charge 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Neutral 0 0.27 0 0.07 0.33 0.33 0.44 0.06 0 0.2 0.14 0.36 0.07 0.33 0.22 0.27 0.18 0.18 0.12 0.31 0.41 0.29 0 0 0 0 0 0 0.08 0 0 0 0 0 0 0.07 0 0 0.15 0.08 0.07 0.12 0.08 0 0.07 0.07 0.07 0.11 0 0.11 0.11 0.11 0 0 0.18 0.18 0.08 0.23 0.23 0.08 0.08 0.2 0.24 0 0 0 0.12 0 0 0

Polar 0.33 0.13 0.27 0.07 0.07 0.11 0 0.25 0.31 0.1 0 0.07 0.36 0.17 0.28 0.09 0.18 0.18 0.12 0.19 0.12 0.12 0 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0 0 0 0 0 0 0 0.07 0.14 0 0 0.08 0.13 0.12 0.08 0 0.14 0.14 0.14 0 0.11 0 0 0 0.11 0.11 0 0 0.15 0 0 0.15 0.15 0.07 0.06 0.06 0 0 0 0.12 0.12 0.2

Pos 0.33 0.27 0.33 0.4 0.27 0.22 0.22 0.31 0.31 0.4 0.57 0.29 0.29 0.22 0.22 0.36 0.36 0.36 0.38 0.25 0.24 0.29 0.25 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.23 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.29 0.21 0.21 0.38 0.23 0.23 0.2 0.18 0.25 0.43 0.21 0.21 0.21 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.27 0.27 0.23 0.23 0.23 0.23 0.23 0.2 0.18 0.29 0.5 0.5 0.38 0.38 0.38 0.3

Neg 0 0 0.07 0.13 0 0 0 0.06 0.06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12 0 0 0.06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.07 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12 0 0 0 0 0 0

Hydroph 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.31 0.31 0.3 0.29 0.29 0.29 0.28 0.28 0.27 0.27 0.27 0.25 0.25 0.24 0.24 0.75 0.71 0.71 0.71 0.71 0.71 0.69 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0.64 0.64 0.64 0.62 0.62 0.62 0.6 0.59 0.58 0.57 0.57 0.57 0.57 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.55 0.55 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.53 0.53 0.53 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Score 0.81 0.67 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.68 0.6 0.6 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.68 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.68 0.68 0.6 0.69 0.68 0.69 0.65 0.6 0.81



#Index 1538 2353 4097 4290 2057 2182 5170 5213 1181 1756 2659 5885 7329 2467 2504 5335 2463 2464 2465 2473 2474 2476 2480 2481 2483 5117 6860 7144 7493 459 1317 1602 2154 4902 4903 5187 3831 856 2797 1084 1365 1726 2913 4927 4933 5071 1829 6937 7464 819 5156 6007 6253 1525 3488 3673 3674 3859 3870 6720 824 2466 2478 2488 4542 5003 2784 3827 3832 3874

Sequence KASIFLKTRV QAKIRVRLSA GFFWKWRIGR GLLKRIKTLL WHWRHRIPLQLAAGR RKLRPHWLHFHPVAV LSRAFTMMQALRTRT MARIAGVNIPTGKRVPI CKLLKTFLSKWIC PKLLKTFLSKWIG AEKRIKVEKKVVV QLHVNKARRPYIL YGGFLRRQFKVVT aaKTrIprGaa aaVRrGprSaa MRNIKVKPFLN aaKRTPRaa aaKRTSRaa aaKRTTRaa aaPRPKRaa aaPRPRRaa aaPRTRRaa aaRKKRDaa aaRNRRSaa aaRRTPRaa LMVKPRKHW SYVLARRSR VRPARHWWK YSLRARPRF RFLLGRR FHRRIKA KVGFFKR LRMKLPK KhRAlkA KhRLlkA LVrSRrW FLGIGHWGKKARNF SLVRNRRVITIQ ALRRMQVLQTRT VKIKK GAIPIRRHIR PAKSARSVRA ARSNlLRhIR KKHSHYWVRY KLKGPWWPKA LHKLVRHGRW RKVVTDFFKNIPQRI TLNKVYKFDRDRRFL YLSGKTKVQSMANLPQRF IAFQRNRK LRREYMQALRTRT QSHISKARRPYIL RQAQGWNKFRGAW IPTSPITTTYFFFKKK EIRQTHNIFFNFFKRR EMRKPDGALFNLFRRR EMRKSNNNFFHFLRRI FLGKIWPSYKGRPGNF FLGKVWPLSKGRPGNF SRKRAFDYMQALQTRT KRLQVQLSIRT aaKSrRprEaa aaRHrSprHaa aaSRrSprSaa GVCYRSKRYCY KVHGSLARAGK ALKRQGRTLYGFGG FLGFGPWGKKPRNF FLGIGPWGKKPRNF FLGLGPWGKKPRNF

Length 10 10 10 10 15 15 15 17 13 13 13 13 13 11 11 11 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 7 7 7 7 7 7 7 14 12 12 5 10 10 10 10 10 10 15 15 18 8 13 13 13 16 16 16 16 16 16 16 11 11 11 11 11 11 14 14 14 14

Charge 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Neutral 0 0 0.2 0.1 0.27 0.33 0 0.24 0.15 0.15 0 0.15 0.15 0.18 0.18 0.09 0.11 0 0 0.22 0.22 0.11 0 0 0.11 0.22 0 0.22 0.11 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0 0.29 0 0 0 0.3 0.1 0.1 0.2 0.3 0.3 0.07 0 0.11 0 0 0.15 0.15 0.12 0.06 0.12 0.06 0.31 0.31 0 0 0.09 0.27 0.09 0.27 0.27 0.29 0.36 0.36 0.36

Polar 0.2 0.2 0 0.1 0.07 0 0.33 0.12 0.15 0.15 0 0.15 0.15 0.09 0.09 0.18 0.11 0.22 0.22 0 0 0.11 0 0.22 0.11 0 0.22 0 0.11 0 0 0 0 0 0 0.14 0.07 0.33 0.33 0 0 0.2 0.2 0.1 0 0 0.2 0.13 0.33 0.25 0.23 0.23 0.23 0.31 0.25 0.06 0.25 0.12 0.12 0.31 0.36 0.09 0.09 0.27 0.09 0.09 0.14 0.07 0.07 0.07

Pos 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.18 0.23 0.23 0.38 0.23 0.23 0.27 0.27 0.27 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.21 0.25 0.25 0.6 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.27 0.33 0.17 0.38 0.31 0.23 0.23 0.19 0.25 0.31 0.25 0.19 0.19 0.25 0.27 0.36 0.27 0.27 0.27 0.27 0.21 0.21 0.21 0.21

Neg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.07 0.13 0 0 0.08 0 0 0 0.06 0.12 0.06 0 0 0.06 0 0.09 0 0 0 0 0 0 0 0

Hydroph 0.5 0.5 0.5 0.5 0.47 0.47 0.47 0.47 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.45 0.45 0.45 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.42 0.42 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.39 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.38 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36 0.36

Score 0.68 0.65 0.6 0.6 0.68 0.67 0.6 0.6 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.86 0.68 0.68 0.67 0.6 0.6 0.6 0.6 0.81 0.6 0.69 0.68 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.81 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.81 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6



#Index 3880 5122 5494 5554 3410 80 1773 5183 6067 2155 2985 5327 7220 757 1819 3120 4863 4991 5121 6178 6319 1840 3690 5217 5501 6729 7143 6212 3835 3836 3837 3847 3848 3853 3854 3866 3867 3868 3882 3883 4932 5158 6691 7148 1763 5589 6064 6095 267 375 425 511 4619 4911 5475 7194 3879 4360 5538 5594 5746 2966 3315 3753 4640 6655 4918 6239 3750 4187

Sequence FLGMGPWGKKPRNF LNVRPKMQALQTRT NSKYVSKQKFYSWG PFATFMRGTHRRAT DWRISETIRNLIFPRRK CKRAVR PRRARV LVPRRR RARPRF LRMKLPKPP ATRVPRKHW MQNQRIRIR WHKTWRVKG KSHYRHISPAKV RHKIQLRQNIIT CWVGGKKCVLSR KAKTMQALQTRT KSTVMQALRTRT LNRKMQALQTRT RKRHMQALQTLT rslrplPPLPLR RMWPSSTVNLSAGRR EPVKKKDLKKATVPL MDDRGLLLVKKKKHG NSVVLGKKQRFHSWG SRLVGYCTRSPAVCR VRLPGKLLRSCERGF RPLSYRPPFPFGFPSVRP FLGKGWSPFKGRPGNF FLGKIWPSCKGRPGNF FLGKIWPSHKGRPGNF FLGKIWPSHRGRPGNL FLGKIWPSNKGRPGNF FLGKIWPSNRGRPGNF FLGKIWPSSKGRPGNF FLGKLWPSSKGRPGNF FLGKMWPSNKGRPGNF FLGKRTPLWGCRPGNF FLGRIWPSHKGRPGNF FLGRLWPSNKGRPGNF KKYQSAARMQGTHWPT LRSFGCRFGTCTVQKL SQKRLITGMQALQTRT VRYADENVRTKEAKKK PLPRRPPRAA PKWRHGYTRF RAKRPLppip RFKRPLppip GRRVLGR LSPWKKR PGRRLRM RGLMGRR HKFRWHR KhSRlkA NRHIRRL WFrPRrS FLGMGPRGKQPRNF GNTKKAVPGFYGTR PCKNFFWKTFSSCK PMRGVMQGTHRRAT QGMIGTLTSKRIKQ ASVTKWSINNKNQFHTR DRMPCRNFFWKTFSSCK FEDGKKVRFFKSNKETIK HLRWASGGPRMQGTHWRT SPAAHFPRSIPRPGPIRT KIAEKFSGNRR RPPGFTPFRKA FDGVRKKSRGKSLEY GGWYDRKHRRPAPLS

Length 14 14 14 14 17 6 6 6 6 9 9 9 9 12 12 12 12 12 12 12 12 15 15 15 15 15 15 18 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 10 10 10 10 7 7 7 7 7 7 7 7 14 14 14 14 14 17 17 18 18 18 11 11 15 15

Charge 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Neutral 0.36 0.07 0.07 0.21 0.06 0.17 0.17 0.17 0.17 0.33 0.22 0 0.22 0.25 0.08 0.33 0 0 0 0.08 0.33 0.13 0.13 0.2 0.2 0.27 0.27 0.39 0.38 0.38 0.38 0.38 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.38 0.38 0.31 0.19 0.25 0.06 0 0.4 0.3 0.4 0.4 0.29 0.14 0.29 0.29 0.29 0.14 0.14 0.14 0.36 0.29 0.21 0.29 0.14 0.06 0.18 0.06 0.33 0.39 0.09 0.36 0.13 0.33

Polar 0.07 0.36 0.36 0.21 0.18 0 0 0 0 0 0.11 0.33 0.11 0.17 0.33 0.08 0.42 0.42 0.42 0.33 0.08 0.33 0.07 0 0.27 0.2 0.07 0.11 0.12 0.12 0.12 0.12 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.12 0.12 0.19 0.31 0.25 0.44 0.12 0 0.1 0 0 0 0.14 0 0 0 0.14 0.14 0.14 0.14 0.21 0.29 0.21 0.36 0.47 0.24 0.17 0.22 0.17 0.18 0.09 0.13 0.07

Pos 0.21 0.21 0.21 0.21 0.29 0.5 0.5 0.5 0.5 0.33 0.33 0.33 0.33 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.2 0.33 0.33 0.2 0.2 0.27 0.17 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.19 0.38 0.3 0.3 0.3 0.3 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.43 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.18 0.24 0.33 0.17 0.17 0.36 0.27 0.33 0.27

Neg 0 0 0 0 0.12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.13 0.13 0 0 0.07 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.06 0.17 0 0 0.09 0 0.13 0.07

Hydroph 0.36 0.36 0.36 0.36 0.35 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 0.3 0.3 0.3 0.3 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.28 0.28 0.28 0.27 0.27 0.27 0.27

Score 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.86 0.68 0.6 0.6 0.67 0.6 0.6 0.6 0.85 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.86 0.86 0.86 0.86 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6



#Index 4928 5520 6594 6726 6519 6522 6523 6540 4989 6159 6298 6309 6326 301 4359 4433 4856 5458 5863 5998 775 1762 2147 2752 4987 4995 4996 5013 6078 6279 6282 6283 6976 4348 4349 4352 4355 6063 5531 2032 4027 4976 4979 6160 6276 6277 6372 6708 6872 2417 5437

Sequence KKKRHDVEIPHVRAS NYQYSPPPPPKKKYY SKGKKANKDVELARG SRLPSCKRSYCSVAH sgRKMRMG sgRKRVGA sgRKSKVV sgRRRLNM KSRWQQSYSTRM RHGSMQALRTRT RSKTMQALQTRT rslrplPPIPGR rslrplPPLPRP HFGPSKPPLPIKTRIT GNRPVYIPPPRPPHPRL GRKYKMHHFRWEGPPKD IVRRGCCSDPRCAWRCG NNRPVYIPQPRPPHPRL QKIAEKFSGTRRG QRPRLSHKGPMPF RYRGDLGRR PLPRRPPRA KTGGPIYKR AHKHWRPRT KSLKNINRP KTLRNTNRL KTRRMRIDQ KWKWPDRPK RCLCRRGVC RRPTMMKHT RRRPFYHSP RRTVKSAPQ TRPRWHKHA GNNRPIYIPQPRPPHPRL GNNRPVYIPQPRPPHPRI GNNRPVYIPQPRPPHPRL GNNRPVYISQPRPPHPRL RAINCQRNSRDSSGRVNV PAGSRMQGTHRRAT VPPPVPPRRR GARSlTRhQR KRPPGFSPFR KRPPGWSPLR RHGTVKHARH RRPEHTKARW RRPPGFTPFR RWPKRHLSGH SRDVlRRhNR TAIRKCNPRT RHPTLTRSPTLRNIQ NGRCCHPACARKYNC

Length 15 15 15 15 8 8 8 8 12 12 12 12 12 16 17 17 17 17 13 13 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 18 18 18 18 18 14 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 15 15

Charge 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Neutral 0.2 0.33 0.13 0.27 0.25 0.25 0.12 0.12 0 0.17 0 0.42 0.42 0.38 0.53 0.35 0.41 0.41 0.15 0.38 0.22 0.44 0.33 0.33 0.11 0 0 0.22 0.44 0.22 0.33 0.11 0.33 0.44 0.44 0.44 0.39 0.11 0.29 0.5 0.2 0.4 0.4 0.4 0.2 0.4 0.4 0.1 0.2 0.2 0.47

Polar 0.07 0.2 0.13 0.27 0.12 0.12 0.25 0.25 0.5 0.33 0.5 0.08 0.08 0.19 0.06 0 0.06 0.18 0.23 0.15 0 0 0.11 0.11 0.33 0.44 0.22 0 0 0.22 0.11 0.33 0.11 0.17 0.17 0.17 0.22 0.39 0.29 0 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.13

Pos 0.33 0.2 0.33 0.2 0.38 0.38 0.38 0.38 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.19 0.18 0.29 0.24 0.18 0.31 0.23 0.44 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.44 0.44 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.17 0.17 0.17 0.17 0.22 0.21 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2

Neg 0.13 0 0.13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12 0.06 0 0.08 0 0.11 0 0 0 0 0 0.11 0.11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.06 0 0 0 0 0 0 0.1 0 0 0.1 0 0 0

Hydroph 0.27 0.27 0.27 0.27 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.24 0.24 0.24 0.24 0.23 0.23 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.21 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Score 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.86 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.85 0.68 0.67 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.68 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.61 0.6


Tabelul 1 indică lista de candidaţi peptidici aleşi din baza de date PepBank, secvenţa

acestora, lungimea, sarcina totală, precum şi procentajele de aminoacizi neutrii,

polari, pozitivi, negativi şi hidrofobi pe care îi conţine. Ultima coloană indică scorul

acestuia în baza de date (cu cât mai mare, cu atât gradul de încredere / de

cunoaştere a acesteia este mai ridicat).


3.3. Simulări docking

Analiza de andocare a fost utilizată cu scopul de a prezice afinitatea relativă

specifică a peptidelor faţă de membranele de mamifer, şi respectiv faţă de cele

bacteriene. Această analiză se bazează pe un algoritm nedeterminist care

calculează minimul funcţiei de scalare ce corespunde celui mai probabil conformer al

unei perechi specifice receptor-ligand. Deoarece algoritmul genetic Lamarkian

utilizat de Autodock Vina 5 este non-determinist şi deci fiecare căutare poate să

conducă la rezultate diferite, în fişierul de configuraţie al codului s-a solicitat

calcularea a 20 de moduri de legare pentru fiecare simulare, iar operaţia a fost

repetată de 10 ori pentru fiecare sistem. În acest fel, am obţinut 200 de conformeri

de andocare pentru fiecare caz, număr suficient de mare pentru evaluarea

specificităţii de interacţiune (se poate evita astfel considerarea unor interacţiuni

aparent puternice şi specifice, dar care nu sunt reproductibile).

Liganzii constatau din cele 372 peptide (vezi Tabelul 1) selectate din Pepbank

conform procedurii descrise în secţiunea 3.2, iar receptorii au constat din patru tipuri

de membrane: membrana bacteriană simplă şi complexă, şi respectiv membrana de

mamifer simplă şi complexă (determinate ca fiind optime în prima etapă a

proiectului):

• Membrana bacteriană simplă – formată din lipide dioleoyl-fosfatidylcolină

(DOPC) şi dioleoyl-fosfatidylglicerol (DOPG) în raport de 85:15

• Membrana bacteriană complexă – formată dintr-un mix de lipide: 1-palmitoyl-

2-vacenoyl-fosfatidyletanolamină (PVPE), 1-palmitoyl-2-vacenoyl-

fosfatidyletanolamină (PVPG), 1-palmitoyl-2-vacenoyl-cardiolipină (PVCL2) în

raport de 90:5:5

• Membrana de mamifer simplă – formată din lipide 1-palmitoyl-2-oleoyl-

fosfatidylcolină (POPC)

• Membrana de mamifer complexă – formată din mix ternar de lipide:

dipalmotoyl-fosfatidylcolină (DOPC), dilinoleyl-fosfatidylcolină (DLiPC) şi

colesterol (CHOL), în raport de 50:30:20


Pentru fiecare sistem, toate datele au fost listate, organizate şi clasificate ierarhic

pentru a identifica siturile de interacţiune preferenţiale ale ligandului (peptidei

candidat) cu membranele – dacă există, interacţiuni neobişnuit de puternice, sau

diferenţe remarcabile în geometrie şi energie între membranele bacteriene şi cele de

mamifer.

Întocmirea unei liste exhaustive de peptide a permis urmărirea mai multor factori

care pot să influenţeze modul de interacţiune între peptida candidat şi membrană: (i)

geometria andocării – prin evaluarea localizării peptidelor funcţie de lungime; (ii)

afinitate – prin evaluarea energiei de legare; (iii) tip de aminoacid – cu referire la

dimensiunea aminoacidului, la caracteristicile hidrofobe/hidrofile,la reziduurile polare,

pozitive sau negative; (iv) specificitate de andocare – prin compararea rezultatelor

aceleiaşi peptide în interacţiune cu membranele bacteriene şi cele de mamifer.

Geometria andocării: Pentru peptidele de mărime mică (5 sau 6 aminoacizi)

andocarea se realizează în aceleaşi situsuri la toate peptidele. Membranele simple

formeaza în mod natural „pocket”-uri pe care orice peptidă mică le poate ocupa,

aşadar pentru peptidele mici specificitatea geometrică este irelevantă. Pentru

peptidele de mărime medie şi mare această specificitate poate varia, dar nu există o

corelare directă între tipologia andocării şi dimensiunea peptidei. De asemenea,

există o specificitate uşor mai ridicată pentru una dintre laturile membranei

comparativ cu partea opusă – posibil „pocket”-uri mai bine definite (din punct de

vedere geometric).

Afinitatea de legare: Cele mai multe dintre peptidele evaluate au o energie de

legare mică spre medie (în jurul a 6 kcal/mol). Există totuşi câteva peptide care

interacţionează mai puternic cu membranele, dar aceste valori ale energiei de

interacţiune, luate individual nu sunt neapărat relevante. Criteriul de selecţie în acest

caz trebuie să fie o diferenţă de minim 1 kcal/mol între interacţiunea cu membrana

bacteriană faţă de cea de mamifer.

Rolul componenţei peptidelor: Se observă o relativă specificitate faţă de

membrană, dar nu şi faţă de tipul de peptide: toate preferă aceleaşi situsuri,

indiferent care e configuraţia peptidei. La membranele simple, caracteristicile

hidrofobe / hidrofile, sau reziduurile polare, pozitive sau negative din componenţă au

un rol mai mic decat dimensiunea şi geometria peptidelor. La membranele


complexe, nu au neapărat specificitate de colocalizare într-un pocket anume, ci mai

degrabă specificitate pentru o anumită componentă a membranei – de exemplu

specificitate la „pocket”-urile care conţin colesterol.

Specificitate de andocare: Ne interesează ca peptida să aibă afinitate crescută

pentru membrana bacteriană, fie ea simplă sau complexă, şi o afinitate redusă

pentru membranele de mamifer. În Tabelul 2 este prezentată o listă cu un număr

redus de peptide în vederea selectarii câtorva candidaţi potenţiali pentru activităţile

următoare (teoretice şi experimentale). ∆E este un indicativ de specificitate de legare

bacteriană (pozitiv pentru bacterial simplu şi negative pentru bacterial complex).

Acesta este calculat astfel:

∆E= Emax(BS-MS, BS-MC) – Emax(BC-MS, BC-MC)

Dacă diferenţa în valoare absolută este mai mare de 1 kcal/mol, candidatul peptidic

prezintă specificitate bacteriană. În ultima coloană din Tabelul 2 sunt evidenţiaţi cu

roşu câţiva posibili candidaţi peptidici existenţi în baza de date PepBank.


Mărime Nume_Secvenţă Energie de legare [kcal / mol] / Specificitate ∆∆∆∆E1 ∆∆∆∆E2 ∆∆∆∆E1 ∆∆∆∆E2 ∆∆∆∆E

BS BC MS MC BS BC Specif.bact. 6

6

7

8

9

9

9

9

10

10

10

10

10

10

11

11

12

13

14

14

15

15

15

15

15

16

16

16

16

16

17

17

17

18

18

18

18

5183_LVPRRR

6067_RARPRF

1602_KVGFFKR

1861_RRKWLWLW

1836_RLYLRIGRR

2481_AARNRRSAA

2752_AHKHWRPRT

7144_VRPARHWWK

1559_KKVVFKVKFK

1657_LRLLRKLKRR

2913_ARSNLLRHIR

4027_GARSLTRHQR

4290_GLLKRIKTLL

4297_KKHSHYWVRY

2466_AAKSRRPREAA

4542_GVCYRSKRYCY

6164_RICRIIFLRVCR

5886_QLHVNKARRVYIL

3873_FLGLGPRGKKPRNF

4801_INLKAIAALVKKVL

3690_EPVKKKDLKKATVPL

4813_INWKKIKSIIKAAMN

4814_INWKKIKSLIKAAMS

4879_KFFRKKSHYHSRTTS

6272_RRGSTRYMQALRTRT

3835_FLGKGWSPFKGRPGNF

3853_FLGKIWPSNRGRPGNF

3870_FLGKVWPLSKGRPGNF

4148_GGKWSKRSVVGWPAVR

6720_SRKRAFDYMQALQTRT

2098_YQTLRRRVKRSLVVPTD

4433_GRKYKMHHFRWEGPPKD

5545_PDPAKTAPKKKSKKAVT

1673_LVRGCWTKSYPPKPCFVR

4348_GNNRPIYIPQPRPPHPRL

4352_GNNRPVYIPQPRPPHPRL

6212_RPLSYRPPFPFGFPSVRP

-7.6

-8.0

-7.3

-7.8

-7.1

-7.2

-7.3

-7.4

-6.4

-7.2

-7.0

-6.9

-6.5

-6.9

-6.7

-7.6

-6.6

-7.1

-7.8

-6.0

-6.1

-6.2

-5.7

-5.8

-6.7

-6.9

-7.6

-7.8

-7.8

-6.7

-5.4

-7.0

-6.5

-7.1

-7.2

-8.2

-7.4

FS pock

FS

S pock

N

S

N

N

PS

FN

N

S

N

N

N

N

S ?

N

N

N

FN

N

N

N

S ?

N

N

S

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

-6.1

-6.6

-6.8

-6.4

-6.7

-6.3

-6.6

-5.9

-5.5

-5.9

-6.6

-5.9

-4.8

-6.5

-6.0

-6.6

-6.5

-6.4

-6.6

-5.7

-5.2

-5.2

-5.9

-6.2

-6.0

-7.1

-7.0

-6.7

-6.3

-5.9

-6.5

-5.8

-5.4

-6.5

-7.3

-7.6

-7.6

N pvcl+pvpe

N any pock

S pvcl

N pock

N

N

N

FN

FN

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N ? pvcl

pvp

N

N

FN

N

pvp

N

N

N

N

N

N

N

-6.6

-7.4

-6.3

-6.7

-7.1

-7.6

-7.1

-6.4

-5.1

-6.0

-6.6

-6.4

-5.5

-6.3

-6.2

-7.4

-5.8

-6.0

-7.3

-5.7

-5.5

-5.8

-5.8

-5.2

-5.7

-6.1

-6.7

-6.5

-6.7

-5.7

-6.7

-5.9

-5.1

-6.7

-6.9

-7.2

-6.6

S pock

S pock

N

FN

S

S

N

N

S

N

S

N

S

N

S ?

S

N

S

N

N

N

N

N

N (F)

N

N

S ?

N

N

N

S ?

S

S

N

N

N

N

-6.6

-6.4

-6.5

-6.5

-6.1

-6.1

-6.1

-7.2

-5.3

-6.1

-5.8

-5.6

-5.7

-5.6

-5.6

-6.2

-5.6

-6.5

-6.4

-5.0

-5.1

-5.2

-4.8

-5.9

-6.1

-7.4

-5.4

-6.1

-6.0

-5.6

-5.4

-6.4

-5.4

-6.1

-6.3

-6.9

-6.3

S pock/chl

S pock/chl

N

PS chl

N

N

chl

N

N

N

N

N

dlipc/dppc

N

N

N

chl

chl

N

dppc

N

N

N

N

dlipc

dlipc

N

dppc

S dppc

? Chl

N

N

chl/dppc

N

S dppc

N

N

-1.0

-0.6

-1.0

-1.1

0.0

0.4

-0.2

-1.0

-1.3

-1.2

-0.4

-0.5

-1.0

-0.6

-0.5

-0.2

-0.8

-1.1

-0.5

-0.3

-0.6

-0.4

0.1

-0.6

-1.0

-0.8

-0.9

-1.3

-1.1

-1.0

1.3

-1.1

-1.4

-0.4

-0.3

-1.0

-0.8

-1.0

-1.6

-0.8

-1.3

-1.0

-1.1

-1.2

-0.2

-1.1

-1.1

-1.2

-1.3

-0.8

-1.3

-1.1

-1.4

-1.0

-0.6

-1.4

-1.0

-1.0

-1.0

-0.9

0.1

-0.6

0.5

-2.2

-1.7

-1.8

-1.1

0.0

-0.6

-1.1

-1.0

-0.9

-1.3

-1.1

0.5

0.8

-0.5

0.3

0.4

1.3

0.5

0.5

-0.4

0.1

0.0

0.5

0.7

-0.2

0.2

0.8

-0.7

-0.4

0.7

0.0

0.3

0.6

-0.1

-1.0

-0.3

-1.0

-0.3

-0.2

0.4

-0.2

0.2

0.1

-0.3

0.2

-0.4

-0.4

-1.0

0.5

-0.2

-0.3

0.1

-0.6

-0.2

-0.5

1.3

-0.2

0.2

-0.8

-0.3

0.9

-0.9

-0.4

-0.4

-0.9

0.1

-0.2

-0.7

-0.1

0.0

-1.1

-0.3

0.1

0.3

-1.6

-0.6

-0.3

-0.3

-1.1

0.6

0.0

-0.4

-1.0

-0.7

-1.3

-1.5

-1.4

-0.5

-1.4

-0.4

-0.9

-0.7

-1.5

-0.9

-1.3

-0.4

-1.0

-1.7

-0.4

-0.7

-1.0

-0.1

-0.7

-1.2

-0.3

-0.9

-1.0

0.2

0.4

-0.7

0.2

-0.6

-1.1

-1.5

-0.8

1.1

-1.2

-1.1

-0.6

0.1

-0.6

0.2

Tabel 2. Primă selecţie redusă de peptide rezultată în urma analizei de andocare. Prescurtări: BS – model membrană bacteriană simplă, BC – model membrană bacteriană complexă, MS – model membrană de mamifer simplă, MC – model

membrană de mamifer complexă, ∆Ε1=(B-MS), ∆E2=(B-MC), ∆E – specificitate de legare bacteriană.


La pasul următor, am ales din tabelul 2 o listă scurtă de candidaţi peptidici, care

leagă puternic cel puţin una din modelele membranare bacteriene şi slab cel puţin

una din modelele de mamifer (vezi tabelul 3). Acestea au fost propuse pentru a fi

testate prin metode de dinamică moleculară coarse-grained, descris la 3.5.

Identificativ peptidă Secvenţă Criteriu adiţional de selectare

4290 GLLKRIKTLL Specificitate bacteriană puternică

3853 FLGKIWPSNRGRPGNF Diferenţă legare BS şi MC puternică Diferenţă legare BC şi MC puternică

6067 RARPRF Specificitate bacteriană puternică Diferenţă legare BS şi MC puternică

4148 GGKWSKRSVVGWPAVR Specificitate bacteriană puternică Diferenţă legare BS şi MC puternică

3870 FLGKVWPLSKGRPGNF Diferenţă legare BS şi MC puternică Specificitate bacteriană

2098 FLGVWPLSKGRPGNF Specificitate bacteriană

1861 RRKWLWLW Specificitate bacteriană puternică Diferenţă legare BS şi MC puternică

1559 KKVVFKVKFK Diferenţă legare BS şi MS puternică

2481 AARNRRSAA

Tabel 3. Listă peptide propusă pentru simulări coarse-grained.


3.4. Clasificare afinitate prin PMF transmembranar

Calculele potenţiale de forţă medie (PMF) se fac prin metode la neechilibru (ABF

method [30, 31], FR method [32, 33] sau cvasiechilibru (Umbrella Sampling method

[34]). Metodele din urmă însă nu sunt fezabile datorită difuziei foarte scăzute a

proteinelor prin membrană. Datorită experienţei directorului de proiect în construirea

PMF-urilor la neechilibru, vom folosi metoda FR-method pentru determinarea

afinităţii transmembranare, şi astfel a clasificării acestor afinităţi.

Metode

Au fost realizate simulări FR method [32, 33] a două din cele mai promiţătoare

peptide (obţinute din clasificarea făcute prin docking) pe model membranar bacterian

DOPC:DOPG 85:15, şi anume peptidele 4290 (GLLKRIKTLL) şi 3853

(FLGKIWPSNRGRPGNF). Modelul molecular folosit pentru calculele de PMF

transmembranar a fost cel atomistic. Coordonata de reacţie (RC) de-a lungul căreia

s-au efectuat calculele de energie liberă a fost distanţa de-a lungul axei z,

perpendiculare pe membrană, de la aproximativ 3 nm distanţă de suprafaţa

membranei până aproape de centrul membranei. Simulările au fost efectuate

urmărind următorul protocol:

a) S-a efectuat o simulare de echilibrare a sistemului cu candidatul peptidic la 3

nm de suprafaţa proteică timp de 50 ns;

b) S-a efectuat o „tragere” a peptidei (din conformaţia de la 50 ns) în poziţia de

la suprafaţa modelului membranar (câţiva Ǻngstrom sub valoarea medie a

atomilor de fosfor a fosfolipidelor). Pentru prevenirea deplasării membranei,

centrul de masă a atomilor de fosfor de la suprafaţa membranei a fost constrâns

de-a lungul axei perpediculare la membrană (axa z) la valoarea de echilibru a

acestora, însă le-a fost permisă difuzia în planul membranar;

c) După ce ligandul a ajuns la capătul celălalt al RC s-a efectuat încă o

echilibrare de 50 ns, cu centrul de masă al ligand-ului restrâns la acea poziţie;

d) Apoi s-au efectuat „trageri” ale ligand-ului în ambele sensuri (R – către poziţia

andocată la proteină a ligand-ului şi F – către poziţia liberă a ligand-ului). De-a

lungul acestora s-a calculat şi lucrul mecanic necesar efectuării acestor deplasări;


e) Din valorile medii ale lucrului mecanic în cele două direcţii s-a calculat întregul

profil al PMF-ului [32], conform ecuaţiei:

∆U = (<WF> – <WR>) / 2 (1)

f) Ciclul (c) – (e) s-a repetat şi pentru următoarele segmente din interiorul

membranei, la viteze mult mai mici decât în apă;

g) În final s-a calculat un PMF transmembranar prin adiţia PMF-urilor calculate

pe fiecare segment. De aici s-au extras minimele (de adeziune la membrană şi

maximele (barierele de inserţie în membrană).

Câmp de forţe şi simulări. Toate simulările folosite în calculele de PMF au fost

efectuate cu NAMD [6], folosind câmpul de forţe CHARMM [9,10, 35].

Construcţia candidatului peptidic antimicrobian şi a sistemului a fost realizată

prin concatenarea sistemului model membranar cu candidatul peptidic antimicrobian,

obţinut cu programul tleap din software-ul AMBER12 [28], descris la secţiunea 3.2.

Construcţia fişierelor de input. Au fost generate cel puţin 3 fişiere de input F şi cel

puţin 3 fişiere de input R, după ce acestea au fost echilibrate restricţionat câte 50ns

la capetele a celor 3/4 segmente în care a fost împărţit RC-ul de-a lungul căruia s-a

făcut calculul de PMF. Sistemele iniţiale folosite în tragerile F/R au fost alese la

intervale de 10 ns din aceste echilibrări.

Rezultate şi discuţii

Din simulările F şi R s-au calculat prima dată profilele de lucruri mecanice din care s-

au calculat mediile acestora (calcul exemplificat pentru unul din candidaţii peptidici în

Fig. 2). Tragerile transmembranare au fost împărţite pe segmente de lungimi mici (5

Å), minimizând dificultatea tragerilor prin membrană, datorate difuziei mult mai mici a

peptidelor prin lipide decât prin apă.


Fig. 2. Exemplu de profile de lucru mecanic pentru tragerile F (stânga) şi R

(dreapta). Profilele arătate sunt pentru tragerile peptidei 4290 către (F) şi dinspre (R) modelul membranar bacterian DOPC:DOPG 85:15 (linii punctate). Fiecare segment

este reprezentat în altă culoare. Valorile medii calculate pe segmente sunt îngroşate.

Un calcul preliminar al profilului potenţialului de forţă medie transmembranar (adică

pe mai multe segmente), calculat conform ecuaţiei (1) este prezentat în Fig. 3.

Profilele obţinute pentru candidaţii 4290 şi 3853 sunt comparate cu cele ale unei

peptide antimicrobiene propuse recent [36].

Fig. 3. Comparaţie profile de potenţial de forţă medie. PMF-urile candidaţilor

peptidici 4290 (roşu) şi 3853 (albastru) relativ la membrana DOPC:DOPG 85:15 sunt comparate cu ale unei peptide antimicrobiene (negru).


Acesta indică următoarele: (i) sub nivelul atomilor de fosfor (linia punctată) interacţia

dintre peptidă şi proteină este de respingere (cum este de aşteptat), şi (ii) peptida nu

mai interacţionează cu modelul membranar la o distanţă mai mare de 20 Å de nivelul

atomilor de fosfor pentru 4290 şi P6 (lungimi similare de 10, respectiv 9 aminoacizi),

respectiv peste 25 Å pentru candidatul peptidic 3835 (lungime 16 aminoacizi). Luând

acestea în considerare, se observă un minim de interacţiune al candidaţilor peptidici

cu membrana la o distanţă medie a atomilor de fosfor de ~5.5 Å de pentru peptida

4290, respectiv 2-6 Å pentru peptida 3853, cu puteri de interacţie în primă

aproximaţie de ~4.8 kcal/mol (4290), respectiv de ~8.1 kcal/mol (3853). Poziţiile de

interacţie sunt mai îndepărtate comparat cu o peptidă antimicrobiană cunoscută [36],

explicată prin mărimile mai mari ale noilor candidaţi peptidici propuşi. Valorile de

interacţie cu suprafaţa membranară sunt de asemenea mai mici datorită sarcinii

totale mai mici a acestora.

În tabelul 4 sunt listate afinităţile de legare la DOPC:DOPG 85:15 (model simplu

apropiat membranei plasmatice a bacteriilor Gram-pozitive).

Afinitate / barieră membranară [kcal / mol]

Peptidă / membrană DOPC:DOPG 85:15

AMP ref.: P6–HRWWRWWRR -14.4 / >38

3853–FLGKIWPSNRGROGNF -8.1 / > 24

4290–GLLKRIKTLL -4.8 / > 15

Tabel 4. Clasificare afinitate preliminare calculată din PMF prin FR method.

Concluzii

Calculul de PMF folosind metoda FR-method [32, 33] este o abordare inovatoare şi

extrem de utilă în extragerea de informaţii la nivel energetic, nu doar pentru

afinitatea anumitor canditaţi peptidici la modele membranare, dar şi pentru un calcul

de profil de energie liberă transmembranară. În acest caz însă, trebuie subliniat că

aceste rezultate preliminarii sunt obţinute pentru candidaţii peptidici care acţionează

asupra unui model membranar bacterian ca monomeri! Concret:

� PMF-ul preliminar obţinut pentru peptidei GLLKRIKTLL (4290) are un minim de

adeziune de 4.8 kcal/mol, respectiv o barieră de trecere prin membrană

estimativă de peste 15 kcal/mol.


� PMF-ul preliminar obţinut pentru peptidei FLGKIWPSNRGROGNF (3853) are un

minim de adeziune de 8.1 kcal/mol, respectiv o barieră de trecere prin membrană

estimativă de peste 24 kcal/mol.

� Simulările de „tragere” a peptidelor sunt de asemenea un indicator al modului de

asociere / disociere a peptidelor de modelul membranar folosit. În cazul peptidei

4290, asocierea cu membrana este puţin facilitată de interacţia electrostatică

dintre aminoacizii cationici şi sarcinile negative de pe suprafaţa membranară dată

de head-grup-uri, dar mai ales de ale celor de la DOPG (anionice), iar transportul

transmembranar e facilitat de aminoacizii hidrofobi. În cazul peptidei 3853,

interacţiunea electrostatică, dar nu numai, par să faciliteze interacţia acesteia cu

membrana.

� Valorile afinităţilor pentru modelul bacterian simplu sunt calitativ similare cu cele

obţinute în docking, însă sunt calculate pentru monomeri şi poate să nu fie

clasamentul final. Astfel, 4290 are afinitatea cea mai scăzută dintre cei doi

candidaţi.

� Bariera de trecere (parţială) transmembranară poate fi luat ca un indiciu al

timpului de penetrare a acesteia. Astfel, 4290 pare mai promiţător datorită barierei

transmembranare relativ scăzute.


3.5. Simulări coarse-grained

Sisteme simulări coarse-grained

Înţelegerea mecanismelor de interacţiune la nivel molecular a peptidelor cu diferitele

fosfolipide din compoziţia membranelor de mamifer şi bacteriene este imperios

necesară anterior realizării testelor experimentale. Au fost realizate simulări ale

sistemelor alcătuite din peptide propuse din simulări de docking şi 2 tipuri de

bistraturi lipidice simple şi complexe: (i) de mamifer şi (ii) bacterian. Modelele

membranare şi peptidele utilizate în simulările de dinamică moleculară coarse-

grained (CG) sunt sintetizate în Tab. 5.

Tabel 5. Detalii simulări. Componenţa sistemelor folosite în simulările CG Model membranar Index Secvenţă aminoacizi Timp (µs) Nr. atomi Mamifer simplu 3853 FLGKIWPSNRGRPGNF 6 164151

6067 RARPRF 8 168055 4148 GGKWSKRSVVGWPAVR 4 173671 3870 FLGKVWPLSKGRPGNF 8 167542

complex 3853 FLGKIWPSNRGRPGNF 4 154419 6067 RARPRF 4 160627 4148 GGKWSKRSVVGWPAVR 4 161785 3870 FLGKVWPLSKGRPGNF 8 155704 4290 GLLKRIKTLL 8 153531 d2 LLTKKIKKTLL 4 156496 d3 LLTKIKKTLL 8 156318 d6 LLTKIRPRLL 8 154831

Bacterial simplu 3853 FLGKIWPSNRGRPGNF 8 143295 6067 RARPRF 8 167692 4148 GGKWSKRSVVGWPAVR 6 160192 3870 FLGKVWPLSKGRPGNF 8 154207 2098 FLGVWPLSKGRPGNF 8 158542 1861 RRKWLWLW 8 155659 1559 KKVVFKVKFK 8 155404 4290 GLLKRIKTLL 8 152211 2481 AARNRRSAA 8 154971 d1 GLLKKKKLLG 8 154721 d2 LLTKKIKKTLL 8 154993 d3 LLTKIKKTLL 8 155028 d4 LLTKIKKLL 8 154475

complex 3853 FLGKIWPSNRGRPGNF 8 169393 6067 RARPRF 8 150327 4148 GGKWSKRSVVGWPAVR 8 165258 d5 LLTKIKKPGNF 8 154569


Construcţia peptidelor

Structurile iniţiale ale peptidelor sunt generate pe baza secvenţelor obţinute din

simulările de docking prezentate anterior. În urma selecţiei celor mai eficiente

peptide, s-a realizat design-ul unor noi peptide cu potenţial antimicrobian.

Secvenţele de aminoacizi aferente peptidelor propuse sintetizate în Tab. 5 au fost

folosite pentru generarea structurilor atomistice. Pe baza structurii atomistice,

acestea au fost transformate în rezoluţie semi-atomistică (CG) folosind scriptul

python Martinize [37]. Acest script a fost utilizat în generarea fişierelor de topologie.

Construcţia sistemului

Coordonatele iniţiale din fişierele de input ale structurilor utilizate în simulări au fost

obţinute din simulările CG ale modelelor membranare plasmatice de mamifer şi

bacteriene (simetric simplu/ternar). Componenţa lipidică a acestor bistraturi: mamifer

simplu POPC, ternar DPPC:DLiPC:CHOL şi bacterian simplu DOPC:DOPG, ternar

PVPE:PVPG:PVCL2. Ulterior au fost adăugate 49 de peptide identice localizate într-

o reţea tip grid pătratică.

Sistemele coarse grained astfel obţinute au fost solvatate (model MARTINI

polarizable water [12]) şi neutralizate cu ajutorul ionilor de sodiu si clor pentru a avea

concentraţia molară de 0.15 mol/L.

Câmpul de forţe

Câmpul de forţe MARTINI 2.2P [13] a fost folosit în toate simulările coarse-grained.

Pentru reproducerea de acurateţe a propietăţilor moleculelor în soluţie am utilizat

câmpul de forţe CG pentru ioni monovalenţi. [38]

Protocoale de simulare

Programul Gromacs [7] versiunea 5.1.4 a fost utilizat în toate simulările efectuate,

folosind un pas de integrare de 20 de fs. Un ansamplu NPT a fost folosit la 1 bar şi

310 K. Presiunea constantă a fost menţinută de o cuplare slabă semi-izotropă,

folosind un timp de relaxare de 2 ps. Temperatura constantă a fost menţinută prin

cuplarea separată a peptidelor cu membrana şi a apei cu ionii la o baie termică de

310 K folosind un timp de relaxare de 1 ps. Anterior rulării sistemelor, au fost


realizate minimizarea şi echilibrararea membranelor. Detalii despre sisteme

(mărimea sistemelor/timpul de simulare) sunt sintetizate în Tabelul 5.

Tabel 6. Reprezentări grafice ai candidaţilor peptidici în diferitele modele membranare simulate (laterala membranei – stânga şi deasupra ei – dreapta)

Model membranar Index Snapshot 4 µs

Index Snapshot 4 µs

Mamifer simplu 3853 6067

4148 3870

complex 3853 6067

4148 3870

4290 d2

d3 d6


Bacterial simplu 3853 6067

4148

3870

4290 2098

d1 d2

d3 d4

complex 3853

6067

4148

d5

Reprezentare a sistemelelor CG model utilizate: mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină) – POPC(mov); simetric ternar (fosfatidilcoline+cholesterol) –DPPC(albastru),DLiPC (roz),CHOL (alb) şi bacteriene simetric simplu (fosfolipide neutre+încărcate) – DOPC(verde), DOPG (magenta); simetric ternar (fosfolipide (neutre+încărcate)+cardiolipină) – PVPE (cyan), PVPG (galben), PVCL2 (albastru), peptide (colorarea diferita dupa numele aminoacizilor). Moleculele de apă şi ionii au fost excluşi pentru claritate.


Testarea activităţii peptidelor selectate provenite din PepBank s-a realizat în primul

rând prin identificarea peptidelor care prezintă inserţie în membrane bacteriană.

Testarea initială antibacteriană s-a efectuat pe modelul membranar aferent

bacteriilor Gram-pozitive. Au fost realizate simulări CG ale unor sisteme de mari

dimensiuni care au în componenţă 49 de peptide unice (vezi Tab. 6). În particular, au

fost studiate 9 tipuri de peptide (3853, 6067, 4148, 3870, 2098, 1861, 1559, 4290 şi

2481), propuse în secţiunea 3.3.

În cazul peptidei 3853, s-a realizat autoasocirea peptidelor şi inserţia parţială a

clusterului format în membrana bacteriană simplă. Pe durata simulării, 8 µs,nu a fost

observată formarea porilor membranari, dar avem activitate bacteriană. Peptida

3870 are un comportament asemănator.

Peptidele 6067 şi 4148 nu prezintă activitate bacteriană, prezentând lipsa afinităţii

peptidelor la membrană, atât sub formă de monomeri 6067, cât şi clusteri 4148,

2098.

Spre deosebire de peptide 3853, peptida 4290, nu prezintă autoasociere, dar putem

observa activitatea antibacteriană ridicată, aproape toate peptidele se inserează în

membrana bacteriană simplă. Pe durata simulării, 8 µs,nu a fost observată formarea

porilor membranari, doar o puternică activitate bacteriană.

În continuare, s-a efectuat testarea antibacteriană pe modelul membranar aferent

bacteriilor Gram-negative (Escherichia coli). Peptidele 3853 şi 4148 prezintă

activitate şi pe această membrană bacteriană. Observăm autoasocirea peptidelor şi

inserţia parţială a clusterului format în modelul membranar bacterian complex.

În cazul peptidei 6067, observăm o activitate bacteriană redusă. Aceasta nu

prezintă autoasociere.

În pasul următor, am testat activitatea peptidei impotriva membranei de mamifer.

Peptida 4290, prezintă o inserţie mai redusă în modelul de mamifer complex, decât

în modelul bacterian simplu. Aceasta prezintă o afinitate redusă la membrana de

mamifer, rămânând sub formă de monomeri. Astfel, peptida 4290 reprezintă un bun

candidat pentru testarea experimentală ulterioară.


În acest sens am pornit de la secvenţa acesteia (GLLKRIKTLL) în design-ul de noi

peptide antimicrobiene (d1 – d6) prin simplificare şi variaţii (descrise la secţiunea

3.7), care au fost testate prin simulări CG, asemenea celor din PepBank.

Astfel, d1 (GLLKKKKLLG), deşi a prezintă o sarcină mai mare (+4), cele 4 lizine de

la mijloc îi cresc rigiditatea şi astfel peptide rămâne în speţă în soluţie.

Pentru d2 (LLTKKIKKTLL) am păstrat simetria, KKTLL la margini, însă am introdus

isoleucina la mijloc, pentru a menţine flexibilitatea peptidei 4290. Afinitatea creşte

semnificativ faţă de d1, însă insuficient. Aceasta se datorează fie sarcinii mai mari,

fie simetriei, care astfel are pe ambele părţi aceeaşi (slabă) afinitate la membrană.

Pentru d3 (LLTKIKKTLL) am menţinut simetria TLL de la capetele peptidei (ca la d2),

însă am reintrodus asimetria din mijloc, revenind la o singură lizină pe o parte a

acesteia. Răspunsul sistemului a fost cel aşteptat, cu afinitate mai ridicată faţă de

4290 la modelul membranar DOPC:DOPG 85:15, dar cu afinitate mai ridicată şi faţă

de modelul complex de mamifer.

Renunţarea la d4 (LLTKIKKLL) la unul din tirozine, şi astfel accentuarea asimetriei a

adus îmbunătăţiri neglijabile faţă de 4290.

La d5 (LLTKIKKPGNF) am introdus combinat motivele de la 4290 şi capăt 3853

(prezent la mai multe peptide asemănătoare, cu afinitate ridicată atât prin docking,

cât şi PMF – vezi secţiunile precedente). Această combinaţie însă a dus la

autoasocierea d5 în mod similar cu 3853, dar fără aderenţă la membrană.

La d6 (LLTKIRPRLL), am combinat motivele din 4290 cu arginina în combinaţie cu

prolina, un motiv iarăşi prezent în 3853. Această combinaţie a dus la un

comportament similar d3, sugerând slaba influenţă a prolinei asupra activităţii

peptidice, cel puţin în acest context.

Concluzii

Am extins seria de simulări ale sistemelor formate din peptide extrase din

PepBank (disponibile date structurale limitate) şi peptide propuse pe bază de

secvenţe. Scopul simulărilor CG este de a explora măsura în care acestea pot

fi utilizate pentru a ajuta predicţia de structură proteică şi modul de acţiune a

candidaţilor peptidici. Nici un candidat nu a format pori transmembranari.


3.6. PMF de adeziune la membrană

În această secţiune s-a lucrat la creşterea gradului de acurateţe a profilelor de

potenţial de forţă medie (PMF) de adeziune nu doar la membranele bacteriene, cât

şi la cele de mamifer pentru candidaţii peptidici propuşi.

Metode

Calculele de PMF au fost realizate prin aceeaşi metodă, FR method [32, 33].

Modelul molecular folosit în aceste simulări a fost atomistic. Spre exemplificare au

fost făcute calculele pentru doi candidaţi peptidici, 4290 (GLLKRIKTLL) şi 3853

(FLGKIWPSNRGRPGNF). Modelele membranare pe care au fost făcute aceste

PMF-uri sunt modelul bacterian DOPC:DOPG 85:15 şi modelul de mamifer POPC.

Coordonata de reacţie (RC) folosită a fost tot axa z, perpendiculară suprafeţei

membranare. Distanţa de adeziune a unei peptide a fost de la o distanţă în care

monomerul este liber, în solvent (apă salină la concentraţia fiziologică, 0.15M), care

depinde de mărimea acestuia (4290 – 3nm, 3853 – 4nm). Simulările au urmărit un

protocol similar cu cel de la secţiunea 3.4:

a) S-a efectuat o simulare de echilibrare a sistemului membranar împreună cu

peptida restricţionată la poziţia de neinteracţiune cu membrana timp de 50 ns;

b) S-a efectuat o „tragere” a peptidei (din conformaţia de la 50 ns) în poziţia de

la suprafaţa modelului membranar (câţiva Angstrom sub valoarea medie a

atomilor de fosfor a fosfolipidelor). Pentru prevenirea deplasării membranei,

centrul de masă a atomilor de fosfor de la suprafaţa membranei a fost

constrâns de-a lungul axei perpediculare la membrană (axa z) la valoarea de

echilibru a acestora, însă le-a fost permisă difuzia în planul membranar;

c) Odată ce candidatul peptidic a ajuns la celălalt capăt al RC s-a efectuat încă o

echilibrare de 50 ns, cu centrul de masă al ligand-ului restrâns la acea poziţie;

d) Apoi s-au efectuat 5-10 „trageri” ale peptidei în ambele sensuri (R către

poziţia andocată la membrană şi F către poziţia liberă a peptidei). Din acestea

s-a calculat şi lucrul mecanic necesar efectuării acestor deplasări;

e) Din valorile medii ale lucrului mecanic obţinut pe cele două direcţii s-a calculat

PMF-ul de înaltă acurateţe, conform ecuaţiei (1).


Celelalte detalii sunt similare cu cele descrise la secţiunea 3.4 şi nu vor fi

repetate aici.

Rezultate şi discuţii

Un număr mult mai mare de simulări F şi R au fost folosite pentru obţinerea

mediilor de profile de lucru mecanic (F şi R) de înaltă calitate. Din acestea au fost

obţinute profilele de energie liberă de adeziune, atât pentru modelul membranar

bacterian, cât şi pentru cel de mamifer (Fig. 4). Valorile energiilor de adeziune la

fiecare membrană pentru candidaţii peptidici 4290 şi 3853 sunt listate în Tab. 7.

Fig.4. Profilele de afinitate a doi candidaţi peptidici (4290 – roşu, 3853 –

albastru) pentru două modele membranare (bacterian – sus, mamifer – jos). Coordonatele PMF-ului au fost schimbate relativ la poziţia suprafeţei

membranare (marcată cu linie punctată, în dreptul poziţiei medii a atomilor de fosfor din modelele membranare).

Afinitate membranară [kcal / mol]

Peptidă / membrană DOPC:DOPG 85:15 POPC

3853–FLGKIWPSNRGROGNF -8.0 -8.2

4290–GLLKRIKTLL -4.9 -1.4

Tabel 7. Energiile de adeziune calculate din PMF prin FR method.


Figura 4 indică faptul că monomerii candidatului peptidic 4290 au afinitate foarte

slabă la modelul membranar, în contrast cu afinitatea relativ mare la membrana

bacteriană. Peptida 3853, pe de altă parte, nu pare să discrimineze între cele

două membrane (nici măcar locul minimului membranar nu se schimbă prea

mult).

Concluzii

Diferenţa de afinitate monomerică a candidatului peptidic 4290 pare să îl indice

ca pe cel mai promiţător candidat. Afinitatea similară şi mare pentru cele două

modele membranare sugerează peptida 3853 cum că ar putea diferenţia între

cele două membrane doar prin autoasociere (observată la secţiunea 3.5). Mai

mult, acesta pare să fie contra-exemplul / candidatul neeficient dintre cei doi.


3.7. Listă candidaţi peptidici

Următorul pas a constat în analizarea datelor de andocare (unele vizualizate în

Tabelul 8), PMF şi simulări coarse-grained (CG) pentru a evidenţia anumite

secvenţe/fragmente de aminoacizi care pot fi corelate cu activitatea acestora. Pe

baza identificării acestor criterii vom face în continuare design de noi peptide

candidate pentru validare antimicrobiană.

– puţină specificitate pentru modelele bacteriene, neadecvat Candidat PepBank1

puţin specifică nespecifică foarte specifică puţin specifică

Candidat PepBank2 – specific pentru BS, dar la fel şi pentru modelele de mamifer, neideal

foarte specifică nespecifică foarte specifică specifică

– modificări aduse candidatului PepBank2 limitează specificitatea pentru Candidat Design

modelele de mamifer şi o îmbunătăţeşte pentru modelele bacteriene specifică puţin specifică puţin specifică puţin specifică

Modele membranare BS BC MS MC

Tabel 8. Reprezentare grafică a modului de legare a diferitelor candidaţi peptidici la cele patru modele membranare folosite. Fiecare membrană este colorată diferit, la fel şi cei trei candidaţi peptidici

(roşu şi galben candidaţi din PepBank şi verde un candidat obţinut prin design)


Analiza de andocare a acestora a rezultat în identificarea secvenţei LLTKIKKTLL ca

având un potenţial antimicrobial ridicat. Propunerea acesteia pentru analize

suplimentare prin metode de dinamică moleculară CG a coroborat acest fapt,

evidenţiind inserţia semnificativă / modestă a acesteia în model membranar

bacterian / de mamifer.

Tabelul 9 indică o listă de modificări a candidatului peptidic 4290 propusă spre

testare prin docking şi simulări de dinamică moleculară CG (secţiunea 3.5). Dintre

acestea, d3 şi d4 sunt cele mai promiţătoare (din energiile de andocare şi adeziunea

mare/mică la membrana bacteriană/de mamifer din simulările CG), d7 şi d9 sunt

doar parţial testate, urmând a se stabili dacă vor fi trimise spre validare

experimentală sau nu.

pep. ID Secvenţă L [#aa] Energie de andocare [kcal/mol] BS BC MS MC

4290 GLLKRIKTLL 10 -6.5 -4.8 -5.5 -5.7

d1 GLLKKKKLLG 10 -5.5 -4.4 -6.0 -4.8

d2 LLTKKIKKTLL 11 -5.8 -4.9 -4.8 -5.5

d3 LLTKIKKTLL 10 -5.8 -5.1 -5.9 -4.9

d4 LLTKIKKLL 9 -6.0 -5.0 -5.3 -5.0

d5 LLTKIKKPGNF 11 -6.3 -5.5 -6.6 -5.9

d6 LLTKIRPRLL 10 -6.5 -5.5 -6.2 -6.1

d7 LLTKIKKTLG 10 -5.8 -5.3 -5.5 -5.5

d8 LLTKIRPRLG 10 -6.6 -6.1 -6.5 -6.1

d9 LLTKIKKLLG 10 - - - -

Tabel 9. Energiile de andocare pentru peptidele propuse prin design

Astfel lista parţială de peptide trimise spre validare este în Tabelul 10.

pep. ID Secvenţă L [#aa] tip candidat 3853 FLGKIWPSNRGRPGNF 16 PepBank 4290 GLLKRIKTLL 10 PepBank d3 LLTKIKKTLL 10 Design d4 LLTKIKKLL 9 Design d7 LLTKIKKTLG 10 Design d9 LLTKIKKLLG 10 Design

Tabel 10. Listă candidaţi peptidici trimişi pentru validare experimentală. Candidaţii marcaţi cu verde sunt imparţial testaţi din punct de vedere teoretic.

Această listă cuprinde cei doi candidaţi peptidici din PepBank: 3853 (probabil inactiv

datorită autoasocierii puternice evidenţiate prin dinamica moleculară CG) şi 4290

(cel mai probabil cu activitate antimicrobiană şi toxicitate redusă, după cum reiese

din calculele de PMF monomerice şi lipsa de autoasociere).


În final am testat diferite modificări ale candidatului peptidic 4290, pentru a vedea

care din aceştia sunt cei mai fiabili. Astfel, doi candidaţi au ieşit în evidenţă, d3 şi d4.

Aceştia au scos în evidenţă importanţa asimetriei aranjării sarcinii de la mijlocul

peptidei, precum şi importanţa cel puţin a unui aminoacid polar alături de sarcina

pozitivă. La lista de design au mai fost adăugaţi doi candidaţi similari: d7, care are

schimbată arginina din 4290 cu o lizină, şi d9, căruia păstrează motivul KLLG de la

capătul lui 4290.


3.8. Experimente MIC/MBC şi viabilitate celulară

3.8.1. Experimente MIC / MBC

Tulpinile bacteriene testate

În vederea testării candidaţilor peptidici descrişi anterior, s-au utilizat următoarele

tulpini bacteriene: Staphylococcus aureus ATCC 25923 (numită în continuare S.

aureus, bacterie Gram-pozitivă), Escherichia coli BL21DE3 şi E. coli TOP 10 (E. coli

BL21, şi E. coli TOP 10, bacterii Gram-negative).

Activarea tulpinilor bacteriene

Alicotele având tulpinile bacteriene de interes, păstrate în congelator la -80°C (Fryka

Kaltetechnik GmbH, Esslingen am Neckar, Germania, Model B-35-85) au fost

dezgheţate la temperatura camerei. După dezgheţarea completă a suspensiilor,

acestea au fost omogenizate prin pipetare şi 50 µL suspensie bacteriană s-a

transferat peste 5 mL mediu lichid Luria-Bertani (LB) de la Liofilchem (Piane

Vamano, Italia), autoclavat în prealabil. Culturile astfel obţinute au fost incubate la

37°C timp de 20 de ore.

Realizarea diluţiilor seriale

În vederea obţinerii coloniilor bacteriene pure pentru analizele ulterioare s-au realizat

diluţii seriale din utilizând culturile bacteriene obţinute anterior. Astfel, din preculturile

anterioare se transferă 1 mL suspensie bacteriană peste 9 mL tampon salin 0,9%

(NaCl) se omogenizează bine prin agitare, obţinând astfel o diluţie de 10-1. Acest

procedeu se repetă până obţinem concentraţia de 10-6. Obţinerea coloniilor pure s-a

realizat prin inocularea pe mediu de cultură LB cu agar a diluţiilor 10-5 și 10-6. După

inocularea plăcilor cu diluţiile seriale menţionate mai sus, acestea au fost incubate la

37°C timp de 20 de ore.

Sinteza peptidelor

Candidaţii peptidici obţinuţi în urma simulărilor in silico au fost sintetizaţi de către

Eurogentec (Liège, Belgia), puritatea acestora fiind > de 90%.


Determinarea MIC

Pentru determinarea MIC a candidaţilor peptidici, s-a utilizat metoda microdiluţiilor în

plăci cu 96 godeuri (fiecare concentraţie testată a fost realizată în triplicat) după

protocolul de mai jos:

a) Reconstituirea peptidelor. Cantitatea de peptidă utilizată pentru fiecare testare

a fost proaspăt dizolvată în 50 µL DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, SUA) şi

450 µL tampon salin, urmată de o agitare 30 secunde prin vortexare (Stoc A).

b) Din soluţia stoc A de peptidă s-au realizat diluţii pentru a obţine concentraţiile

6,4 mM, 3,2 mM, 1,6 mM, 0,8 mM, 0,4 mM, 0,2 mM şi 0,1 mM de peptidă.

Pentru concentraţii mai mari s-a utilizat soluţie stoc A integrală.

c) Concentraţiile finale de peptidă testate au fost: 1 µM, 2 µM, 4 µM, 8 µM, 16

µM, 32 µM, 64 µM, 128 µM, 256 µM şi 512 µM.

d) Prepararea standardului 0,5 McFarland s-a realizat prin amestecarea a 50 µl

clorură de bariu dihidrat (BaCl2 x 2H2O) 1% cu 9,95 ml acid sulfuric (H2SO4)

1%, se agită bine prin vortexare pentru obţinerea unei soluţii transparent

lăptoase. Standardul 0,5 McFarland corespunde unei concentraţii relative de

bacterii de 1,5 x 108 CFU mL-1.

e) Prepararea inoculului bacterian: Câte o colonie crescută în plăcile Petri se

transferă în tampon salin 0,9% cu ajutorul unei anse şi se omogenizează

foarte bine suspensia bacteriană apoi se compară cu standardul McFarland.

Dacă suspensia bacteriană nu are aceeaşi culoare şi turbiditate se vor

transfera colonii până la obţinerea turbidităţii dorite. Inoculul astfel obţinut se

diluează până la 4,5 x 106 CFU mL-1 din care se folosesc cate 10 µL (4,5 x

104 CFU mL-1) pentru fiecare probă.

f) Inhibitorii de proteaze (PI). Inhibitorii de proteaze au fost folosiţi pentru a

proteja candidatul peptidic de acţiunea catalitică a proteazelor până la

adăugarea suspensiei bacteriene. În acest sens o tabletă de PI oComplete

(Roche, Mannheim, Germania) a fost dizolvată în 10 mL H2O ultrapură.


Pentru fiecare probă au fost utilizaţi 10 µL inhibitori diluaţi 1:100 cu H2O

ultrapură.

g) Conţinutul fiecărei probe (Fig. 5): i) 10 µL inhibitori proteaze; ii) volumul de

peptide necesar pentru a atinge concentraţia finală dorită; iii) se completează

cu tampon salin până la 40 µL; iv) 50 µL mediu de cultură Müeller-Hinton

(Oxoid, Hants, UK) 2X; v) 10 µL inocul bacterian. Probele au fost amestecate

prin pipetare şi incubate la 37°C timp de 20 de ore. Citirea plăcilor s-a realizat

la 600nm folosind un cititor de placi Biotek Epoch.

Fig. 5. Distribuţia probelor pe placa de 96 de godeuri (MHB – Mediu de cultură Müeller-Hinton).

Determinarea MBC

Pentru determinarea MBC a candidaților peptidici, din godeurile care nu prezentau o

creştere sesizabilă vizibil a tulpinilor bacteriene s-a transferat cu ansa 1 µL

suspensie peste 5 mL mediu proaspăt LB, urmate de o incubare la 37°C timp de 20

de ore. Prin urmare MBC a fost considerată concentraţia la care în mediul de cultură

LB nu s-a dezvoltat nicio bacterie, acesta rămânând limpede comparativ cu martorul.

Rezultate

Activitatea antimicrobiană a celor două peptide, 3853 (P1–FLGKIWPSNRGROGNF)

şi 4290 (P2–GLLKRIKTLL) a fost testată prin determinarea MIC, înainte de

realizarea celorlalte studii precum MBC sau testarea peptidelor pe linii celulare. În


acest caz au fost folosite trei tulpini bacteriene, două tulpini bacteriene Gram-

negative de E. coli (BL21DE3 şi TOP10) şi o tulpină de S. aureus ATCC 25923

(Gram-pozitivă).

După cum se poate observa din tabelul 11, peptida P1 nu prezintă activitate

antimicrobiană la concentraţiile testate pe nici una din tulpinile folosite în prezentul

studiu. Pe de altă parte, P2 prezintă activitate antimicrobiană la concentraţii de 256

µM asupra tulpinilor de E. coli, însă nu prezintă nici un efect asupra tulpinii de S.

aureus.

Tabel 11. Rezultatele MIC şi MBC ale peptidelor testate.

Candidat peptidic

S. aureus ATCC 25923

E. coli BL21 E. coli TOP10

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

3853 – P1 FLGKIWPSNRGROGNF >512 µM - >512 µM - >512 µM -

4290 – P2 GLLKRIKTLL >512 µM - 256 µM 512 µM 256 µM 512 µM

Pentru confirmarea rezultatelor privind MIC, s-a decis determinarea zonei de inhibiţie

a celor două peptide comparativ cu două antibiotice de referinţă: Ampicilină (AMP) –

10 µg/disc, Ciprofloxacină (CIP) – 5 µg/disc.

Fig. 6. Determinarea zonei de inhibițțțție a peptidei P2 (4290) folosind mediu de cultură

Müeller-Hinton Agar cu antibiotice CIP șșșși AMP (A) șșșși peptidul P2 (B), pe tulpina E. coli TOP10


Analizând mediile de cultură conţinând discurile cu antibiotic şi cele cu peptide (1

mg/ml) (Fig. 6 A–B) s-a putut observa că peptidele nu posedă proprietăţi

antimicrobiene sau acestea nu sunt sesizabile la concentraţia testată, zona de

inhibiţie nu este vizibilă şi lipseşte la toate speciile testate. Comparativ cu

antibiograma realizată cu ajutorul discurilor impregnate cu antibiotice unde zona de

inhibiţie variază în funcţie de antibiotic fiind uneori foarte bine conturată.

În ceea ce priveşte concentraţia minimă bactericidă (Tabel 11), în urma testării

suspensiei bacteriene din godeurile corespunzătoare concentraţiilor 256 µM şi 512

µM s-a observat că P2 a determinat omorârea tuturor celulelor de E. coli la

concentraţia de 512 µM în mediul de cultură testat.

Având in vedere compoziţia celor două peptide, presupunem că mecanismul de

acţiune al acestora se bazează pe interacţii de tip electrostatic dintre resturile de

aminoacizi încărcate pozitiv din structura peptidelor şi membrana celulară externă

(încărcată negativ). Penetrarea membranei celulare de către aceste peptide ar

rezulta în perturbarea homeostaziei celulare asociată cu o scurgere a conţinutului

citoplasmatic şi în final moartea celulelor bacteriene, cel puţin la nivel teoretic.

Studiile publicate în literatură au evidenţiat prezenţa la diferite tulpini de

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis sau

enterococci a unui mecanism de apărare care se activează în prezenţa peptidelor

antimicrobiene. În acest sens au fost descrise mai multe gene implicate în acest

mecanism de răspuns, precum: (i) gena codificată de operonul dlt implicată în D-

alanilarea acizilor teicoici de la E. faecalis [39], L. Monocytogenes [40] sau

Streptococcus sp. [41]; (ii) gena care codifică subunitatea IIAB de la fosfotransferaza

specifică manozei [40]; (iii) gene implicate în metabolismul fosfolipidelor

membranare precum: mprF la L. monocytogenes [42], S. aureus [43], M.

tuberculosis [44], B. anthracis [45]; cardiolipin sintaza de la S. aureus [46] sau alţi

enterococci [47]; pgsA de la S. aureus [46] sau B. subtilis [48]. Pe lângă genele

amintite mai sus anumite tulpini de Enterococcus faecalis sau Listeria

monocytogenes ar reuşi prin lizinilarea cardiolipinei şi fosfatidilglicerolului să

schimbe sarcina electrică a membranei celulare externe, devenind astfel încărcată

electric pozitiv [49].


3.8.2. Vialbilitate celulară

Obiectivul activităţii

Evaluarea morfologică şi funcţională a keratinocitelor normale umane HaCaT şi

celulelor de melanom uman A375 tratete cu candidatul peptidic 4290 (P2) la diferite

concentraţii, prin microscopie optică şi biochimie.

Materiale șșșși metode

Creşterea celulelor

Celulele au ca sursă ATCC (American Type Cell Culture Collection) şi au fost

crescute in vitro conform cerinţelor producătorului, în Laboratorul de Culturi de

Celule şi Microbiologie din cadrul INCDTIM, în condiţii BSL2 (BioSafety Level 2).

Celulele se menţin în azot lichid în soluție care permite congelarea fără distrugerea

acestora (nu se formează cristale care pot sparge celula). Mediul de congelare este

constituit din: mediul de bază, 10% DMSO și 40% ser fetal. Acest mediu este capabil

să criogenizeze aproape toate tipurile de celule. Stocurile de celule au fost

dezgheţate şi aduse la 37°C cu mediu de cultură complet, apoi au fost centrifugate

la 1200 rpm (500 ġ) și resuspendate în mediu complet.

Mediul de cultură complet conţine: 10% ser fetal, 1% L-glutamină, 1% penicilină-

streptomicină, 88% mediu de bază DMEM. L-Glutamina este un aminoacid

semiesenţial, care poate fi sintetizat de organism, dar în anumite perioade (stres,

traume, efort fizic şi intelectual) este necesar aportul din exterior. Penicilina-

streptomicina este un amestesc de substanţe care este adăugat în mediu în principal

pentru a inhiba sau împiedica dezvoltarea bacteriilor care ar putea compromite

celulele. DMEM este mediul de bază care are la bază 4,5 g /L glucoză.

Celulele au fost menţinute în incubator, la 37ºC și o atmosferă cu 5% CO2. Pentru a

putea utiliza celulele in experimente acestea trebuie sa treacă prin minim 2 pasări.

La fiecare pasare se realizează urmatoarele etape: îndepărtarea mediului de pe

placă, adăugarea de PBS (soluţie de apă şi săruri, asemănătoare serului fiziologic,

cu rol în menținerea osmozei, dar fără Ca și Mg), adăugarea soluţiei de tripsină

(concetraţie egală cu 0,5%, conţine EDTA – date producător: 200 mg/L EDTA şi


170.000 U Tripsină/L) – aproximativ 3 mL tripsină/placă T75, la temperatura de

37ºC. Apoi placa se pune înapoi în incubator, la temperatură constantă şi se lasă un

timp pentru a se desprinde celulele de suprafaţă şi pentru a putea fi vizibile în

suspensie. Urmează blocarea tripsinei cu mediu complet care conţine ser fetal, în

proporţie volumetrică de 1:2, pe urmă, celulele care sunt în suspenie se mută într-un

tub şi se centrifughează la 1200 rpm timp de 3 minute. Se îndepărtează mediul, iar

celulele se resuspendă în mediu proaspăt într-un volum cunoscut (aproximativ 5

mL).

Testarea viabilităţii celulare

Pentru a determina domeniul de concentraţie optim la care celulele nu sunt complet

moarte, dar nu sunt nici indiferente de prezenţa peptidei P2 (candidatul peptidic

4290), am realizat o analiză a viabilităţii prin metoda MTT.

MTT este o metodă colorimetrică prin care se observă activitatea metabolică a

celulei. Se bazează pe conversia substanţei MTT în cristale de formazan de către

celulele vii, ceea ce indică activitate mitocondrială. Deoarece pentru majoritatea

populaţiilor de celule activitatea mitocondrială totală este legată de numărul de celule

viabile, această analiză este utilizată în general pentru măsurarea efectelor

citotoxice in vitro ale medicamentelor pe liniile celulare sau pe celulele primare ale

pacienţilor [50].

Pentru realizarea acestei analize este nevoie să creştem celule în plăci de cultură cu

96 de godeuri. Celulele au fost însămânţate la o densitate de 12x103 celule/godeu

(HaCaT) și 104 celule/godeu (A375) în 100 µL mediu complet.

Celulele au fost lăsate în incubator 24 de ore pentru a intra în faza de creştere

exponenţială, apoi a doua zi am aplicat peptidul P2 de test în concentraţii

crescătoare de la 1 µM până la 512 µM în 6 exemplare de test şi a fost lăsat să

acţioneze 24 de ore. După acest timp, peste celule s-a aplicat soluţia MTT în

concentraţie de 0.5 mg/L şi s-a lăsat la incubat pentru încă 1.5 ore. Ulterior celulele

au fost lizate în 100 µL soluţie de izopropanol şi soluţia de liză a fost citită la

spectrofotometrul Biotech Epoch, la 490 nm. În urma rezultatelor spectrofotometrice

s-au realizat calculele de viabilitate raportând toate citirile la citirea de referinţă a

celulelor netratate, care au fost considerate 100% viabile.


Analiza morfologică

Celulele tratate cu peptida P2 în concentraţie de 512 µM au fost analizate imagistic

folosind microscopul optic inversat, iar rezultatele au fost raportate la controlul

netratat şi controlul negativ (celule tratate cu Tween 20 în concentrație 2%/godeu).

Rezultate

În Figura 7 este prezentat graficul de viabilitate celulară înregistrat pentru

keratinocitele normale tratate cu candidatul peptidic 4290 (P2). Din grafic se poate

observa că la toate concentraţiile celulele au avut viabilitate peste controlul pozitiv,

aspect ce sugerează fie o activitate mitocondrială intensă, fie proliferare celulară.

Viabilitatea a scăzut la 512 µM la 156%, comparativ cu restul concentraţiilor folosite,

iar cea mai mare valoare s-a înregistrat la concentraţia de 128 µM (277%).

Fig.7.Keratinocite tratate cu peptide 4290 (P2); domeniu de concentraţii: 1-512µM

În Figura 8 este prezentat graficul de viabilitate celulară înregistrat pentru A365

tratate cu peptida P2. Din grafic se poate observa o creştere a viabilităţii celulare


bruscă de la controlul netratat, la concentraţia de 1 µM şi la fel de bruscă de la 1 µM

la 2 µM, de unde începe să scadă gradual până la 512 µM, care înregistrează

valoarea minimă de 165%. Maximul de viabilitate celulară a fost atins la concentraţia

de 2 µM (246%).

Fig. 8. Melanom A375 tratat cu peptida P2; domeniu de concentraţii: 1-512 µM

MTT este considerat o analiză a viabilităţii, dar este una indirectă, deoarece se

bazează pe activitatea mitocondrială. Se consideră că o activitate mitocondrială sub

50% apare în situaţia unei concentraţii puternic iritante pentru celule, iar o activitate

mitocondrială sub 20% reprezintă o mortalitate suficient de mare încât populaţia de

celule să nu îşi mai revină [51].

Din punct de vedere morfologic nu s-au observat diferenţe între celulele tratate şi

controale. Atât pentru HaCaT (Fig. 9), cât şi pentru A375 (Fig. 10) se poate observa

un număr semnificativ mai mare de celule ataşate pe placă la concentraţia de 512

µM.


HaCaT - control

HaCaT+Tween 20

HaCaT+peptida P2(512 µM)

Fig. 9. Imagini de microscopie optică (20X) care arată diferenţele dintre celulele

HaCaT tratate șșșși netratate cu peptida P2 (4290).

A375 - control

A375+Tween 20

A375+peptid P2 (512 µM)

Fig. 10. Imagini de microscopie optică (20X) care arată diferențțțțele dintre

celulele A375 tratate șșșși netratate cu peptida P2.

Concluzii

Pe baza testelor MIC, MBC şi a antibiogramei folosind cele 2 peptide construite şi

testate in silico nu s-a putut evidenţia un puternic efect antimicrobian al acestora.

Totuşi, candidatul peptidic 4290 (P2) a prezentat un efect antimicrobian puternic, la

concentraţii relativ crescute ale acestuia de 256 µM, respectiv 512 µM. În ceea ce

priveşte îmbunătăţirea activităţii antimicrobiene a acestor peptide ar trebui avut în

vedere următoarele aspecte în momentul construirii lor: (i) modul de adaptare al

bacteriilor în prezenţa peptidelor; (ii) lungimea şi numărul sarcinilor electrice; (iii)

existenşa structurilor secundare de tipul α-helix care să faciliteze penetrarea şi

dezorganizarea membranei celulare externe.


În privinţa expunerii linilor celulare la diferite concentraţii de peptide, testele au

relevat faptul că candidatul activ 4290 (cel activ) testat nu prezintă un efect inhibitor,

din contră pare să stimuleze dezvoltarea celulelor comparativ cu probele martor.


3.9. Spectroscopie SERS

În ultimii ani, metodele spectroscopice clasice, cum ar fi spectroscopia în infraroşu

(IR), spectroscopia Raman şi în particular, spectroscopia Raman amplificată de

suprafaţă (SERS), în combinaţie cu metode statistice (cum ar fi Analiza

Componentelor Principale – ACP) au cunoscut o creştere a popularităţii pentru

aplicarea lor ca metode noninvazive în detecţia, discriminarea şi identificarea de

microorganisme patogene sau nonpatogene. Un real avânt în această direcţie a

avut-o tehnica SERS, datorită posibilităţii de a mări cu câteva ordine de magnitudine

semnalul slab Raman. Amplificarea semnalului Raman este generată de intensitatea

optică puternic localizată la o distanţă mică (≈ 10 nm) de suprafaţa nanostructurilor

metalice [52]. Spectroscopia SERS va oferi informaţii legate de compoziţia chimică a

probelor studiate, chiar la nivel de singură bacterie, datorită concentraţiilor şi a

volumelor mici de probă care pot fi studiate.

Nanosuprafeţele metalice folosite în cadrul experimentelor SERS (substraturi

SERS) pot fi sintetizate din aur, argint sau alte metale (cupru, platină). Dintre aceste

metale, cel mai mare factor de amplificare este furnizat de nanoparticulele de argint

(AgNPs), datorită proprietăţilor acestora de absorbţie optică.

Recent, s-a demonstrat că implicarea biomasei microbiene în protocolul clasic de

sinteză a AgNPs duce la o îmbunătăţire a amplificării semnalului SERS [21–24].

Astfel, primul pas constă în tratarea biomasei microbiene cu azotat de Ag (AgNO3)

de aceeaşi concentraţie ca şi cea din reţeta clasică [25], iar al doilea în aplicarea

agentului reducător, hidroxilamină hidrocloridă (hya), în mixtură cu hidroxid de sodiu

(NaOH), agentul stabilizator. Astfel, se formează un strat de AgNPs la suprafaţa

membranei bacteriene, (Bacteria@AgNPs) [21–24], asigurând amplificarea

semnalului SERS a componentelor acesteia, specifice fiecărui tip de microorganism.

Pe langă obţinerea unui efect SERS îmbunătăţit, alte avantaje privind aplicarea

acestui protocol sunt uşurinţa de preparare, la temperatura camerei; utilizarea lui

imediat după procesul de sinteză; realizarea unui contact intim dintre membrana

bacteriană şi stratul de AgNPs, dar şi o îmbunătăţire semnificativă a reproductibilităţii

spectrelor SERS.


3.9.1 Preparare probe

Probele vizate în cadrul acestei Etape au constat în:

(i) o tulpină de bacterie Gram-Negativă, compatibilă cu peptidele achiziţionate. În

acest sens, s-a ales tulpina TOP10 a bacteriei Escherichia coli (E. coli) care a fost

crescută conform specificaţiilor existente în Secţiunea 3.8. 2 ml de suspensie

bacteriană a fost centrifugată la 5000 rpm, timp de 10 minute. Supernatantul rezultat

a fost aruncat, pelletul spălat în 2 ml de buffer salin 0,9% şi s-au repetat aceiaşi paşi

de 3 ori. În final, pelletul bacterian a fost resuspendat în 500 µl de buffer salin 0,9%.

Din acest amestec, un volum de 5 µl a fost adăugat la 100 µl AgNO3, iar peste acest

amestec s-au adăugat 900 µl hya.

(ii) peptida 4290 (P2), dizolvată în DMSO şi apă, rezultând o soluţie de concentraţie

1 mg/ml, respectiv 0,866 mM. Dintr-un volum de 1 ml, 10 µl de P2 a fost adăugat la

1 ml de coloid de Ag in situ.

(iii) centrifugarea unui volum de 4 ml de E. coli TOP10@P2 la 5000 rpm, timp de 10

minute. Supernatantul rezultat a fost aruncat, pelletul a fost spălat în 2 ml de buffer

salin 0,9% şi s-au repetat aceiaşi paşi de 3 ori. În final, pelletul bacterian a fost

resuspendat în 200 µl de buffer salin 0,9%. Din acest amestec, un volum de 5 µl a

fost adăugat la 100 µl AgNO3, iar peste acest amestec s-au adăugat 900 µl hya.

Cele trei seturi de probe rezultate, împreună cu proba martor de coloid de Ag in situ

sunt prezentate în Fig. 11.

(a)

(b)

Fig. 11. (a) Proba de coloid de Ag preparat in situ (stânga) şi proba SERS cu E. coli TOP10 (dreapta); (b) Probele SERS cu P2 (stânga) şi E. coli TOP10@P2 (dreapta)


Din cele 3 probe conţinând bacterie şi peptidă s-a luat un volum de 10 µl şi s-a

pipetat pe un slide de microscop tratat chimic cu poli-L-lizină de către producător

(PolysineTM Microscope Adhesion slides, Erie Scientific). Acest tip de substrat

posedă o sarcină permanentă pozitivă la suprafaţă, care facilitează şi asigură

adeziunea eficientă a celulelor, în special a celor încărcate negativ la nivelul

membranei acestora (de exemplu, a microorganismelor Gram-negative), pe baza

interacţiunii pur electrostatice de atracţie. Am optat pentru aceste lamele datorită

costului lor redus (0.31 EUR/lamă) şi pentru a minimiza timpul de preparare a

probei biologice de investigat. Distanţa de timp între prepararea probelor şi ataşarea

lor pe substrat a durat ≈20 minute, pentru a permite aderarea/incubarea AgNPs la/în

probele cu biomasă bacteriană şi/sau peptida P2.

3.9.2 Instrumentaţie. Prelucrarea

spectrelor

Experimentele SERS s-au realizat

folosind platforma NTEGRA

Spectra, amplasată pe o masă

optică NEWPORT RS4000 cu un

sistem de izolare a vibraţiilor şi

dotată cu un spectrometru Raman

confocal SOLAR TII cuplat cu un

microscop Olympus IX71 în două

configuraţii diferite (Fig.12).Sistemul este echipat cu trei laseri cu lungimi de undă de

532 nm, 632.8 nm, şi de 785 nm, un filtru Rayleigh 90 cm-1, 4 reţele de difracţie: 150,

600, 1800 ls/mm. Rezoluţia spectrală este <0.22 cm-1 (532 nm), < 0.1 cm-1 (785 nm)

şi cea spaţială < 200 nm (XY), 500 nm (Z). Detecţia se realizează cu o cameră CCD.

Măsurătorile SERS pe cele 3 seturi de probe (E. coli TOP10, peptida 4290 (P2) şi E.

coli TOP10@P2) au fost realizate folosind laserul cu lungimea de undă 532 nm

(reşea de difracţie de 600 ls/mm), obiectivul 100×, putere maximă de iradiere de 100

mW, iar timpul de acumulare a fost de 5 secunde şi 5 acumulări. Puterea laserului a

fost variată cu ajutorul filtrului ND pentru a reduce zgomotul, a maximiza semnalul

SERS al probelor investigate şi a minimiza degradarea acestora. Achiziţia datelor a

fost realizată cu softul dedicat NOVA.

Fig. 12. Platforma NTEGRA Spectra.


Prelucrarea datelor experimentale s-a făcut în softul OriginPro. Spectrele SERS

obţinute au fost normalizate la cea mai mare valoare a intensităţii, pentru fiecare

spectru în parte. Menţionăm faptul că nici unul din spectrele reprezentate în figurile

ce vor fi discutate în subsecţiunea următoare nu au fost supuse la corecţii privind

semnalul de fond.

3.9.3 Măsurători SERS. Interpretarea rezultatelor

Pentru a putea face o distincţie clară între fingerprint-ul spectral caracteristic

bacteriei analizate, a peptidei P2 testate, cât şi a bacteriei supuse tratamentului cu

peptida P2, au fost analizate separat cele 3 sisteme SERS, iar spectrele

reprezentative obţinute sunt prezentate în Figurile13-15. Din perspectiva tehnicii de

caracterizare SERS, bacteriile sunt sisteme complexe, cu un spectru SERS

complicat, rezultat în urma contribuţiilor mediate ale componentelor intra-

membranare şi intracelulare aflate în vecinătatea AgNPs şi a modului în care

bacteriile interacţionează cu substratul amplificator. Luând în considerare aceste

premise, pentru a evalua reproductibilitatea spectrelor SERS, în fiecare tablou

spectral ce urmează a fi discutat sunt reprezentate mai multe spectre înregistrate în

diferite puncte de pe proba uscată sau lichidă.

Figura 13 prezintă spectrele SERS obţinute pe bacteria E. coli TOP10. Benzile

specifice clasei de bacterii Gram-negative şi a speciei E. coli sunt prezente în toate

spectrele SERS înregistrate. Tabelul 12 cuprinde tentativa de atribuire a acestor

benzi SERS, în conformitate cu literatura de specialitate. Banda existentă la

lungimile de undă 547/561/572/566 cm-1 a fost atribuită ca provenind de la vibraţiile

de întindere din carbohidraţi sau a inelelor glicozidice [53]. Benzile SERS din

intervalul 632–688 cm-1 provin de la deformările COO- ale guaninei [54, 55]. Banda

SERS prezentă în regiunea 721-749 cm-1 a fost atribuită vibraţiilor de întindere din

adenină sau din inelele glicozidice [56–58]. O bandă SERS de intensiatte medie este

cea de la 1053 cm-1 care este localizată în zona vibraţiilor provenite de la

carbohidraţi [59, 60]. Alte benzi SERS de intensităţi medii/mari sunt localizate în

intervalul 1200-1300 cm-1, la 1358 cm-1, 1405 cm-1 şi 1620 cm-1. Aceste benzi provin

de la componentele amida II/amida III [60, 54], de la deformarea (CH) din proteine

[57], lipide saturate [58] şi amida I/vibraţia de întindere din ADN [60, 58].


Fig. 13. Spectre SERS reprezentative ale bacteriei E. coli TOP10.

Tab. 12 cu atribuirile numerelor de undă indicate în spectrele SERS din Fig. 13.

Număr de undă (cm-1) Atribuire Referinţă bibliografică

500-586 ν(carbohidraţi), ν(inel glicozidic)

[53]

632-688 δ(COO−) din guanină [54, 55] 721-749 ν(inel glicozidic), ν(adenină) [56–58] 801-819 ν(CN) din tirozină [55, 58] 867-889 ν(C–C) din scheletul proteic [54] 921-957 vibraţie de tip “respirație” în

nuclee aromatice [61]

1000-1134 δ(CC, CO, –COH) în carbohidraţi

[59]

1149-1209 =C–C=lipide [57] 1242-1245 amidă III [54] 1266-1287 δ(CH) din proteine [54] 1323-1368 δ(CH) din proteine,

ν(COO−) simetrică [57, 62, 63]

1422-1483 δ(CH2) în lipidele saturate [58] 1523-1543 vibraţie de întindere în

nuclee aromatice [61]

1589-1668 ν(ADN) [58] 1690-1702 ν(C=C) [61]


În Figura W sunt prezentate 2 spectre SERS reprezentative ale peptidei 4290 (P2),

care are în structura sa 6 aminoacizi: glicina (G), arginina (R), lizina (K), leucina (L),

isoleucina (I) şi treonina (T), fiecare având o amprentă spectrală SERS, în directă

relaţie cu modul de interacţiune al acestuia cu AgNPs. Aminoacidul G are cea mai

simplă structură, iar vibraţiile de deformare NH3+ (regăsit de obicei la 1165 cm-1) [64]

contribuie la peak-ul existent la 1157 cm-1, vibraţiile de tip ”wagging” CH2 (regăsit de

obicei la 1135 cm-1) [65] contribuie la peak-ul de la 1265 cm-1 şi vibraţiile de întindere

CN se regăsesc în codul de vibraţie de la 1058 cm-1 [65].

Aminoacidul L contribuie la următoarele benzi SERS observate experimental: banda

de la 853 cm-1 (întindere CC) [66], la banda de la 957 cm-1 (vibraţie de tip ”wagging”

CH3) [66], la banda de la 1099 cm-1 (deformare CH) [64], la banda de la 1157 cm-1

(deformare NH3+) [66, 64], banda de la 1463 cm-1 [66] şi banda de la 1497 cm-1

(vibraţie de întindere în gruparea COO-) [64].

Prezenţa contribuţiei aminoacidului K la amprenta SERS a P2 se regăseşte într-un

număr mare de benzi: banda de la 668 cm-1 [Aliaga et al., 2009], 795 cm-1

(deformare în gruparea COO-) [66],la banda de la 1157 cm-1 (vibraţie de tip

”wagging” NH, întindere CC) [64, 67], 1265 cm-1 (vibraţie de tip ”wagging” CH2,

deformare în gruparea NH2/NH3+) [64, 67], 1347 cm-1 (vibraţie de tip ”wagging” CH2)

[67] şi 1497 cm-1 (întindere COO-, deformare simetrică în gruparea NH3+) [67].

Fig. 14. Spectre SERS reprezentative ale peptidei P2.


Aminoacidul R se identifică în spectrul SERS prin contribuția la 6 benzi: banda de la

487 cm-1 (vibraţie de tip ”rocking” COO-) [68], banda de la 668 cm-1 (deformare în

gruparea COO-) [68], banda de la 853 cm-1 (întindere CC) [68], banda de la 1099 cm-

1 (deformare NH a guanidinei) [68], banda de la 1157 cm-1 (vibraţie de tip ”wagging”

NH) [64] şi banda de la 1347 cm-1 (vibraţie de tip ”wagging” CH2) [68].

Aminoacidul I contribuie la benzile SERS prezente la: 957 cm-1 (vibraţie de tip

”wagging” CH3) [66] 1099 cm-1 (deformare CH) [64], 1463 cm-1 [67] şi 1497 cm-1

(întindere COO-) [64]. O bandă caracteristică aminoacidului I este cea de la 1629

cm-1 şi atribuită întinderii în gruparea COO- [64].

În final, aminoacidul T contribuie la apariţia următoarelor 4 benzi SERS: 737 cm-1

(deformare CH2) [66], 795 cm-1 [66], 1157 cm-1 (deformare gruparea NH3+) [64] şi

1463 cm-1 (deformare asimetrică în gruparea CH3) [66].

Tabel 13 cu atribuirile numerelor de undă ale peptidei P2.

Bandă SERS / cm-1 Tentativă de atribuire

487 ρ(COO-) Arg (R) [68]

668 δ (COO-) Arg (R) [68]

Lys (K) [67] 737 ρ(CH2)Thr (T) [66]

795 δ (COO-) Lys (K),

Thr (T) [66]

853 ν(CC) Arg (R) [68]

Leu (L) [66] 957 ω(CH3) Leu (L) şi Ile (I) [66] 1058 ν(CN) Gly (G) [65]

1099 δ(CH) Leu (L) [64] δ(CH) Ile (I) [64]

δ(NH) (guanidină) Arg (R) [68]

1157

δ(NH3+) Thr (T) [64]

δ(NH3+) Leu (L) [64, 66]

ω(NH) Lys (K), ν(CC) Lys (K) [64, 67] ω(NH) Arg (R) [64] δ(NH3

+) Gly (G) [64]

1265 ω(CH2) Lys (K) [64]

ρ(NH2 ), δs(NH3+ )Lys (K) [67]

1347 ω(CH2) Gly (G) [65]

Arg (R) [68] Lys (K) [67]

1463 δ as(CH3) Thr (T) [66]

Leu (L) [66] Ile (I) [67]


1497 ν(COO−), Ile (I), Leu (L) [64]

ν(COO−), δs(NH3+) Lys (K) [67]

1629 ν(COO−) Ile (I) [64]

Figura 15 prezintă 4 spectre SERS reprezentative ale complexului TOP10@P2, şi

un spectru SERS (cu culoare mov) mediat peste cele 4 spectre singulare, obţinute

cu aceiaşi parametrii de înregistrare.

Fig. 15. Spectre SERS reprezentative pe TOP10@P2

În comparaţie cu spectrele SERS obţinute pe biomasa bacteriană există diferenţe în

poziţiile benzilor existente şi altele noi apărute, care ar putea sugera apariţia unui

efect la nivelul membranei bacteriene, la contactul cu peptida P2. Există câteva

benzi SERS existente care au suferit o deplasare, în urma interacţiunii cu P2:

561/572/566 cm-1 apare la 563 cm-1; 727 cm-1 apare la 729 cm-1; benzile de la

786/817 cm-1 apar la 806 cm-1. Banda care prezintă modificări minime atât în

intensitate, cât şi în poziţie este cea de la 1619/1620 cm-1, şi care poate proveni atât

de la bacterie (vibraţia de întindere ADN) [58], cât şi de la P2 (atribuită întinderii în

gruparea COO- ) [64]. Benzile SERS noi apărute în spectrul vibraţional al bacteriei

tratate sunt localizate la 1175 cm-1, 1372 cm-1 şi la 1584 cm-1. Aceste benzi pot fi

corelate cu modificări apărute la nivelul membranei în încercarea bacteriei de a se

apăra împotriva efectului peptidei, modificări induse la nivelul peretelui celular, a

sarcinii peretelui celular sau a sintezei de proteine.


Concluzii

• Spectrele SERS obţinute pe bacteria Gram-negativă E. coli TOP10 folosind

coloid de Ag preparat in situ au fost reproductibile în ceea ce priveşte prezenţa

benzilor marker, iar atribuirea lor s-a făcut pe baza literaturii de specialitate.

• Au fost analizate spectrele SERS reprezentative al peptidei P2 şi s-a făcut

atribuirea benzilor existente pe baza literaturii de specialitate pe fiecare aminoacid

component.

• Diferenţele în spectrele SERS obținute pe biomasa bacteriană, în comparaţie

cu spectrele SERS ale bacteriei netratate sugera apariţia unui efect la nivelul

membranei bacteriene, la contactul cu peptida 4290 (P2), cum ar fi: modificări induse

la nivelul peretelui celular, a sarcinii peretelui celular sau a sintezei de proteine.


� 4. Concluzii etapă

Secţiunea corespunzătoare raportului ştiinţific (3) a atins toate activităţile ştiinţifice

propuse în cadrul etapei 2, ajungând la următoarele concluzii:

• Am pus la punct un protocol de căutare şi extragere de potenţiali candidaţi

peptidici antimicrobieni din baza de date PepBank; astfel am obţinut 372

candidaţi iniţiali din cei peste 21.000 disponibili. Am folosit Autodock Vina

pentru determinarea situsurilor optime de legare şi a energiilor acestora la

modelele membranare propuse în prima etapă.

• Această primă listă a fost apoi filtrată folosind simulări de dinamică moleculară

coarse-grained, care au pus în evidenţă (i) existenţa / modul de legare a 49

peptide de acelaşi fel la modelele membranare, şi (ii) influenţa asupra

conformaţiei acestora (care influenţează direct această (ne)legare) a sarcinii,

hidrofobicităţii, asimetriei. Nu s-a obţinut penetrare / deformare membranară /

formare de pori pentru nici unul din cei 15 potenţiali candidaţi.

• Simulările CG au remarcat două clase de comportamente importante inter-

peptidice, cele care au puţină autoasociere (peptida 4290 – GLLKRIKTLL) şi cu

autoasociere puternică (3853 – FLGKIWPSNRGRPGNF). Aceşti doi candidaţi

peptidici au fost folosiţi drept modele pentru obţinerea profilelor de energie

liberă monomerice şi design-ul ulterior de candidaţi peptidici antimicrobieni.

• Am efectuat calculul preliminar al profilelor de energie liberă transmembranară

pentru ierarhizarea celor două peptide relativ la o peptidă antimicrobiană

cunoscută (P6). Rezultatul sugerează o ataşare mai puternică a peptidei 3853

decât 4290, dar mai slabă decât a peptidei antimicrobiene. Rezultatul, aparent

contrar celor date de simulările CG, subiniază importanţa autoasicierii

peptidelor în deteminarea afinităţii reale a acesteia la un model membranar.

• Profilele de energie liberă de adeziune de înaltă rezoluţie au fost obţinute

ulterior. Diferenţele de profil pe această porţiune sunt însă nesemnificative.

• Astfel, candidaţii peptidici trimişi spre validare experimentală sunt următorii: (i)

din lista PepBank: 4290 (GLLKRIKTLL) şi 3853 (FLGKIWPSNRGRPGNF), şi

(ii) candidaţi designed bazaţi de 4290: LLTKIKKTLL, LLTKIKKLL,

LLTKIKKTLG, LLTKIKKLLG.


• Pe baza testelor MIC, MBC şi a antibiogramei, folosind candidaţii peptidici 4290

şi 3853, testaţi in silico nu s-a putut evidenţia un puternic efect antimicrobian

(adică la concentraţii mici). Doar 4290 a arătat un efect puternic antimicrobian

împotriva E.coli , însă la concentraţii relativ mari: peste 256µM. Acesta nu a

prezentat nici un efect inhibitor asupa celulelor umane testate, din contră pare

să stimuleze dezvoltarea, comparativ cu probele martor.

• În aceste sens, spectrele SERS, pe bacteria gram-negativă E.coli TOP10,

folosind coloid de Ag preparat in situ au fost reproductibile în privinţa benzilor

marker. Atribuirea benzilor spectrelor SERS obţinute atât pe candidatul peptidic

4290, cât şi pe bacteria menţionată, s-a făcut pe baza literaturii de specialitate.

• Diferenţele în spectrele SERS obţinute pe biomasa bacteriană, în comparaţie

cu spectrele SERS ale bacteriei netratate sugera apariţia unui efect la nivelul

membranei bacteriene, la contactul cu peptida 4290, cum ar fi: modificări

induse la nivelul peretelui celular, a sarcinii acestuia sau a sintezei de proteine.

Rezultatele favorabile obţinute în prima etapă permit proiectul să avanseze la

activităţile din etapele următoare.


� 5. Diseminări etapă

Articole

1. G. Necula, L. Janosi, M. Bacalum, M. Radu, Updating RoNBio molecular

modelling system to support in silico investigation of AMP activity on

membrane models, 2018 CONFERENCE GRID, CLOUD & HIGH

PERFORMANCE COMPUTING IN SCIENCE (ROLCG) (2018)

(proceedings paper)

Conferinţe internaţionale

1. L. Buimaga-Iarinca, A. Farcas, C. Floare, L. Janosi, Design of novel

antimicrobial peptides in a three-stage in silico approach, 12th International

Conference Processes in Isotopes and Molecules, 25-27 September 2019, Cluj-Napoca, Romania

(prezentare poster)

2. A. Farcas, L. Janosi, Simple models that mimic the lipid composition in the

mammalian and bacterial membranes, 12th International Conference

Processes in Isotopes and Molecules, 25-27 September 2019, Cluj-Napoca, Romania

(prezentare poster)

3. A. Colnita, N. Dina, N. Leopold, D. Vodnar, D. Bogdan, S. Porav, L. David, Label-free bacteria detection and discrimination using Raman and

ultrasensitive surface-enhanced Raman spectroscopy, The 4th International

Turkish Congress on Molecular Spectroscopy, 4-9 August 2019, Kusadasi, Turcia

(prezentare poster)

4. L. Buimaga-Iarinca, A. Farcas, L. Janosi, Combining molecular docking and

molecular dynamics simulations to propose novel antimicrobial peptides, 12th

EBSA European Biophysics Congress / 10th IUPAP International

Conference on Biological Physics (ICBP), 20-24 July 2019, Madrid, Spania

(prezentare poster)

5. A. Farcas, I. Turcu, L. Janosi, Simple vs. complex lipid bilayers: Balancing

compositional simplicity and behavioral complexity of mammalian and

bacterial membrane models, 12th EBSA European Biophysics Congress /


10th IUPAP International Conference on Biological Physics (ICBP), 20-24 July 2019, Madrid, Spania

(prezentare poster)

6. L. Janosi, B. Zorila, G. Necula, M. Bacalum, M. Radu, I. Turcu, Investigation

of binding energies of histidine-modulated arginine and tryptophan-based

peptides in membrane models: In silico and spectroscopic studies, 12th

EBSA European Biophysics Congress / 10th IUPAP International

Conference on Biological Physics (ICBP), 20-24 July 2019, Madrid, Spania

(prezentare poster)


� 6. Bibliografie

[1] WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, WHO Lib.Cat.-in-Pub.Data (2014).

[2] L.L. Silver, Clin. Microbiol. Rev., Challenges of antibacterial discovery, 24 (2011), 71.

[3] R.E. Hancock, H.G. Sahl, Nat. Biotechnol., Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies, 24 (2006), 1551.

[4] K. Fosgerau, T. Hoffmann, Drug Discov. Today, Peptide therapeutics: current status and future directions, 20 (2015), 122.

[5] C.D. Fjell, J.A. Hiss, R.E. Hancock, G. Schneider, Nat. Rev. Drug Discov., Designing antimicrobial peptides: form follows function, 11 (2012), 37.

[6] J.C. Phillips, R. Braun, W. Wang, J. Gumbart, E. Tajkhorshid, E. Villa, C. Chipot, R.D. Skeel, L. Kale, K. Schulten, J. Comput. Chem., Scalable molecular dynamics with NAMD, 26 (2005), 1781.

[7] H.J.C. Berendsen, D. van der Spoel, R. van Drunen, Comput. Phys. Commun., GROMACS: A Message-Passing Parallel Molecular Dynamics Implementation, 91 (1995), 43.

[8] W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten, J. Molec. Graphics, VMD: Visual molecular dynamics,14 (1996), 33.

[9] J.B. Klauda, R.M. Venable, J.A. Freites, J.W. O’Connor, D.J. Tobias, C. Mondragon-Ramirez, I. Vorobyov, A.D. MacKerell, Jr., R.W. Pastor, Update of the CHARMM all-atom additive force field for lipids: validation on six lipid types, J. Phys. Chem. B, 114 (2010), 7830.

[10] R.M. Venable, A.J. Sodt, B. Rogaski, H. Rui, E. Hatcher, A.D. MacKerell, Jr., R. W. Pastor, J.B. Klauda., Biophys J., CHARMM All-Atom Additive Force Field for Sphingomyelin: Elucidation of Hydrogen Bonding and of Positive Curvature, 107(1) (2014), 134.

[11] S.J. Marrink, H.J. Risselada, S. Yefimov, D.P. Tieleman, A.H. de Vries, J. Phys. Chem. B, The MARTINI Force Field: Coarse Grained Model for Biomolecular Simulations, 111 (2007), 7812.

[12] S.O. Yesylevskyy, L.V. Schäfer, D. Sengupta, S.J. Marrink, PLoS Comp. Biol., Polarizable Water Model for the Coarse-Grained MARTINI Force Field, 6(6) (2010), e1000810.

[13] S.J. Marrink, A.H. de Vries, T.A. Harroun, J. Katsaras, S.R. Wassall, J. Am. Chem. Soc., Cholesterol shows preference for the interior of polyunsaturated lipid membranes, 130(1) (2008),10.


[14] H.J. Risselada, S.J. Marrink, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., The molecular face of lipid rafts in model membranes, 105(45) (2008), 17367.

[15] C.A. Lopez, Z. Sovova, F.J. van Eerden, A.H. de Vries, S.J. Marrink, J. Chem. Theory Comput., Martini force field parameters for glycolipids, 9(3) (2013), 1694.

[16] H.I. Ingólfsson, M.N. Melo, F.J. van Eerden, C. Arnarez, C.A. López, T.A. Wassenaar, X. Periole, A.H. De Vries, D.P. Tieleman, S.J. Marrink, J. Am. Chem. Soc., Lipid organization of the plasma membrane, 136(41) (2014), 14554.

[17] G. van Rossum, J. de Boer, CWI Quarterly, Interactively Testing Remote Servers Using the Python Programming Language, 4 (1991), 283.

[18] O. Trott, A.J. Olson, J. Comput. Chem., AutoDock Vina: Improving the Speed and Accuracy of Docking with aNew Scoring Function, Efficient Optimization and Multithreading, 31 (2010), 455.

[18] G.M. Morris, R. Huey, W. Lindstrom, M.F. Sanner, R.K. Belew, D.S. Goodsell, A.J. Olson, J. Comput. Chem., Autodock4 and AutoDockTools4: Automated Docking with Selective Receptor Flexiblity, 16 (2009), 2785.

[20] E.F. Pettersen, T.D. Goddard, C.C. Huang, G.S. Couch, D.M. Greenblatt, E.C. Meng, T.E. Ferrin, J. Comput. Chem., UCSF Chimera – A Visualization System for Exploratory Research and Analysis, 25 (2004), 1605.

[21] N. Mircescu, H. Zhou, N. Leopold, V. Chiş, N. Ivleva, R. Niessner, A. Wieser, C. Haisch, Anal. Bioanal. Chem., SERS Detection of Bacteria in Water by in Situ Coating with Ag Nanoparticles, 406 (2014), 3051.

[22] H. Zhou, D. Yang, N. P. Ivleva, N. E. Mircescu, R. Niessner, C. Haisch, Anal. Chem., SERS detection of bacteria in water by in situ coating with Ag nanoparticles, 86 (2014), 1525.

[23] H. Zhou, D. Yang, N. Mircescu, N. Ivleva, K. Schwarzmeier, A. Wieser, S. Schubert, R. Niessner, C. Haisch, Microchim Acta, Surface-enhanced Raman scattering detection of bacteria on microarrays at single cell levels using silver nanoparticles, 182 (2015), 2259.

[24] H. Zhou, D. Yang, N. P. Ivleva, N. E. Mircescu, S. Schubert, R. Niessner, A. Wieser, C. Haisch, Anal. Chem., Label-Free in Situ Discrimination of Live and Dead Bacteria by Surface-Enhanced Raman Scattering, 87 (2015), 6553.

[25] N. Leopold, B. Lendl, J. Phys. Chem. B, A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride, 107 (2003), 5723.

[26] T. Shtatland, D. Guettler, M. Kossodo, M. Pivovarov, R. Weissleder, BMC Bioinformatics, PepBank - A Database of Peptides Based on Sequence Text Mining and Public Peptide Data Sources, 8 (2007), 280.


[27] T. Duchrow, T. Shtatland, D. Guettler, M. Kossodo, M. Pivovarov, R. Weissleder, BMC Bioinformatics, Enhancing Navigation in Biomedical Databases by Community Voting and Database-Driven Text Classification, 10 (2009), 317.

[28] D.A. Case , T.A. Darden, T.E. Cheatham, C.L. Simmerling, J. Wang, R.E. Duke,..., P.A. Kollman, AMBER 12, (2012) University of California, San Francisco.

[29] G. van Rossum, J. de Boer, CWI Quarterly, Interactively Testing Remote Servers Using the Python Programming Language, 4 (1991), 283.

[30] E. Darve, D. Rodríguez-Gómez, A. Pohorille, J. Chem. Phys., Adaptive Biasing Force Method for Scalar and Vector Free Energy Calculations, 128 (2008), 144120.

[31] J. Comer, J.C. Gumbart, J. Hénin, T. Lelièvre, A. Pohorille, C. Chipot, J. Phys. Chem. B, The Adaptive Biasing Force Method: Everything You Always Wanted to Know but Were Afraid to Ask, 119 (2014), 1129.

[32] I. Kosztin, B. Barz, L. Janosi, J. Chem. Phys., Calculating Potentials of Mean Force and Diffusion Coefficients from Nonequilibrium Processes without Jarzynski’s Equality, 124 (2006), 064106.

[33] M.W. Forney, L. Janosi, I. Kosztin, Phys. Rev. E, Calculating Free-Energy Profiles in Biomolecular Systems from Fast Nonequilibrium Processes, 78 (2008), 051913.

[34] J. Kästner, Wiley Interdisc. Rev.: Comput. Molec. Sci., Umbrella Sampling, 1 (2011), 932.

[35] J. Huang, A.D. MacKerell Jr., J Comput Chem., CHARMM36 all-atom additive protein force field: validation based on comparison to NMR data, 34(2013), 2135.

[36] M. Bacalum, L. Janosi, F. Zorila, A.-M. Tepes, C. Ionescu, E. Bogdan, N. Hadade, L. Craciun, I. Grosu, I. Turcu, M. Radu, BBA – Gen. Subj., Modulating short tryptophan- and arginine-rich peptides activity by substitution with histidine, 1861 (2017), 1844.

[37] http://www.cgmartini.nl/index.php/tools2/proteins-and-bilayers/204-martinize

[38] J. Michalowsky, J. Zeman, C. Holm, J. Smiatek, J. Chem. Phys., A polarizable MARTINI model for monovalent ions in aqueous solution, 149 (2018), 163319.

[39] F. Fabretti, C. Theilacker, L. Baldassarri, Z. Kaczynski, A. Kropec, O. Holst, J., Infect. Immun., Alanine esters of enterococcal lipoteichoic acid play a role in biofilm formation and resistance to antimicrobial peptides, 74 (2006), 4164.

[40] V. Vadyvaloo, S. Arous, A. Gravesen, Y. Héchard, R. Chauhan-Haubrock, J.W. Hastings1, M. Rautenbach, Microbiol., Cell-surface alterations in class IIa bacteriocin-resistant Listeria monocytogenes strains, 150 (2004), 3025.

[41] R. Saar-Dover, A. Bitler, R. Nezer, L. Shmuel-Galia, A. Firon, E. Shimoni, P. Trieu-Cuot, Y. Shai, Plos Path., D-Alanylation of Lipoteichoic Acids Confers


Resistance to Cationic Peptides in Group B Streptococcus by Increasing the Cell Wall Density, 8 (2012), e1002891.

[42] K. Thedieck, T. Hain, W. Mohamed, B.J. Tindall, M. Nimtz, T. Chakraborty, J. Wehland, L. Jänsch, Mol. Microbiol., The MprF protein is required for lysinylation of phospholipids in listerial membranes and confers resistance to cationic antimicrobial peptides (CAMPs) on Listeria monocytogenes, 62 (2006), 1325.

[43] C.M. Ernst, P. Staubitz, N.N. Mishra, S.-J. Yang, G. Hornig, H. Kalbacher, A.S. Bayer, D. Kraus, A. Peschel, Plos Path., The Bacterial Defensin Resistance Protein MprF Consists of Separable Domains for Lipid Lysinylation and Antimicrobial Peptide Repulsion, 5 (2009), e1000660.

[44] E. Maloney, D. Stankowska, J. Zhang, M. Fol, Q.-J. Cheng, S. Lun, W.R. Bishai, M. Rajagopalan, D. Chatterjee, M.V. Madiraju, Plos Path., The Two-Domain LysX Protein of Mycobacterium tuberculosis Is Required for Production of Lysinylated Phosphatidylglycerol and Resistance to Cationic Antimicrobial Peptides, 5 (2009), e1000534.

[45] S. Samant, F.-F. Hsu, A.A. Neyfakh, H. Lee, J. Bacter., The Bacillus anthracis Protein MprF Is Required for Synthesis of Lysylphosphatidylglycerols and for Resistance to Cationic Antimicrobial Peptides, 191 (2009), 1311.

[46] A.Y. Peleg, S. Miyakis, D.V. Ward, A.M. Earl, A. Rubio, D.R. Cameron, S. Pillai, R.C. Moellering Jr., G.M. Eliopoulos, Plos One, Whole Genome Characterization of the Mechanisms of Daptomycin Resistance in Clinical and Laboratory Derived Isolates of Staphylococcus aureus, 7 (2012), e28316.

[47] C.A. Arias, D. Panesso, D.M. McGrath, X. Qin, M.F. Mojica, C. Miller, L. Diaz, T.T. Tran, S. Rincon, E.M. Barbu, J. Reyes, J.H. Roh, E. Lobos, E. Sodergren, R. Pasqualini, W. Arap, J.P. Quinn, Y. Shamoo, B.E. Murray, G.M. Weinstock, N. Engl. J. Med., Genetic Basis for In Vivo Daptomycin Resistance in Enterococci, 365 (2011), 892.

[48] A.-B. Hachmann, E. Sevim, A. Gaballa, D.L. Popham, H. Antelmann, J.D. Helmann, Antimicrob. Ag. Chemoth., Reduction in Membrane Phosphatidylglycerol Content Leads toDaptomycin Resistance inBacillus subtilis, 55 (2011), 4326.

[49] A. Peschel, M. Otto, R.W. Jack, H. Kalbacher, G. Jung, F. Götz, J. Biol. Chem., Inactivation of the dlt Operon inStaphylococcus aureus Confers Sensitivity to Defensins, Protegrins, and Other Antimicrobial Peptides, 274 (1999), 8405.

[50] J. Meerloo, G.J. Kaspers, J. Cloos, Methods Mol. Biol., Cell sensitivity assays: the MTT assay, 731 (2011), 45.

[51] ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices —Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity (2009)

[52] B.J.S.S. Kennedy, M. Dickey, K.T. Carron, J. Phys. Chem. B, Determination of the distance dependence and experimental effects for modified SERS substrates based on self-assembled monolayers fourmed using alkanethiols, 103 (1999), 3640.


[53] M. Çulha, A. Adigüzel, M. M. Yazici, M. Kahraman, F. Ahin, M. Güllüce, Appl. Spectrosc., Characterization of thermophilic bacteria using surface-enhanced Raman scattering, 62 (2008), 1226.

[A8] M. Kahraman, M. M. Yazıcı, F. Sahin, M. Çulha, Langmuir, Convective assembly of bacteria for surface-enhanced Raman scattering, 24 (2008), 894.

[55] M. Knauer, N. P. Ivleva, X. Liu, R. Niessner, C. Haisch, Anal. Chem., Surface-enhanced Raman scattering-based label-free microarray readout for the detection of microorganism, 82 (2010), 2766.

[56] M. Kahraman, K. Keseroğlu, M. Çulha, Appl. Spectrosc., On Sample Preparation for Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) of Bacteria and the Source of Spectral Features of the Spectra, 65 (2011), 500.

[57] N.P. Ivleva, M. Wagner, A. Szkola, H. Horn, R. Niessner, C. Haisch, J. Phys. Chem. B, Label-free in situ SERS imaging of biofilms, 114 (2010), 10184.

[58] A. Walter, A. Marz, W. Schumacher, P. Rosch, J. Popp, Lab. Chip, Towards a fast, high specific and reliable discrimination of bacteria on strain level by means of SERS in a microfluidic device, 11 (2011), 1013.

[59] K.C. Schuster, I. Reese, E. Urlaub, J.R. Gapes, B. Lendl, Anal. Chem., Multidimensional information on the chemical composition of single bacterial cells by confocal Raman microspectroscopy, 72 (2000), 5529.

[60] P.A. Mosier-Boss, Biosensors, Review on SERS of Bacteria, 7 (2017), 51.

[61] D. Lin-Vein, N.B. Colthup, W.G. Fately, J.G. Grasselli, The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequecies of Organic Molecules (Academic Press Limited, 1991).

[62] A. Sengupta, M.L. Laucks, N. Dildine, E. Drapala, E.J. Davis, Aerosol Sci., Bioaerosol characterization by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), 36 (2005), 651.

[63] K. Maquelin, L.-P. i. Choo-Smith, T. van Vreeswijk, H.P. Endtz, B. Smith, R. Bennett, H.A. Bruining, G.J. Puppels, Anal. Chem., Raman spectroscopic method for identification of clinically relevant microorganisms growing on solid culture medium, 72 (2000), 12.

[64] P. Negri, Z.D. Schultz, Analyst., Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic L-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis, 139 (2014), 5989.

[65] A. Parameswari, A. Milton F. Benial, AIP Conference Proceedings, Orientation of glycine on silver nanoparticles: SERS studies, 1728 (2016), 020374.

[66] G.-M. Zhou, D.-N. Yu, S. Li, D.-C. Yang, Acta Phys.-Chim. Sin., Adsorption of Leucine and Isoleucine on Core-Shell Au/Ag nanoparticles, 23(2007) 1478.


[67] A.E. Aliaga, I. Osorio-Roman, C. Garrido, P. Leyton, J. Carcamo, E. Clavijo, J.S. Gomez-Jeria, G. Dıaz F., M.M. Campos-Vallette, Vibrational Spectroscopy, Surface enhanced Raman scattering study of L-lysine, 50 (2009), 131.

[68] C. Garrido, T. Aguayo, E. Clavijo, J.S. Gómez-Jeria, M.M. Campos-Vallette, J. Raman Spectrosc., The effect of the pH on the interaction of L-arginine with colloidal silver nanoparticles. A Raman and SERS study, 44 (2013), 1105.

Director de proiect Data: 03.12.2019

Dr. Lorant JANOSI

Raport HEALinSiDE Etapa 2 FINAL...Activitate 2.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului Obiectiv...

Documents

Transcript of Raport HEALinSiDE Etapa 2 FINAL...Activitate 2.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului Obiectiv...