PROVOCĂRI ÎN DIAGNOSTICUL PRECOCE IVN...REZUMAT Conducător ştiinţific: CS I Dr. Gabriela ANTON...

1

ȘCOALA DE STUDII AVANSATE A

ACADEMIEI ROMÂNE

PROVOCĂRI ÎN DIAGNOSTICUL PRECOCE

AL BOLILOR MAJORE PRIN ABORDAREA

TEHNOLOGIILOR PROTEOMICE

REZUMAT

Conducător ştiinţific:

CS I Dr. Gabriela ANTON

Student-Doctorand:

Simona MIHAI

Bucureşti

2020

Provocări în diagnosticul precoce al bolilor majore prin abordarea tehnologiilor proteomice

2

Cuprins

Introducere ............................................................................................................. 3

CONTRIBUȚII PERSONALE ............................................................................. 6

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI .................................................................... 6

I. Screening proteomic, bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS,

pentru identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie diferențiată

la pacienții cu BRC versus control ........................................................................ 7

II. Profil proteomic al BRC bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler și

Luminex xMAP array, diferențiat în funcție de gradul de severitate al bolii

renale ................................................................................................................... 14

III. Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în studiu

și markerii paraclinici convenționali, la pacientul renal. Selectarea unui panel de

biomarkeri cu potențială relevanță clinică în diagnosticul precoce, stratificarea și

gradul de severitate al BRC ................................................................................. 21

CONCLUZII FINALE ........................................................................................ 26

Bibliografie selectivă ........................................................................................... 29

LISTA DE LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE PUBLICATE .......................................... 30


3

Introducere

Boala renală cronică (BRC) reprezintă o boală majoră la nivel mondial, care acoperă

toate gradele de insuficiență a funcției renale, cu incidență și prevalență în creștere, fiind una

dintre cele mai costisitoare dintre bolile cronice. Potrivit ghidurilor clinice internaționale -

KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) 2017 - Clinical Practice Guideline

Update for the Diagnosis, Evaluation, Prevention, and Treatment of Chronic Kidney

Disease: Mineral and Bone Disorder, această boală este definită drept „anomalii în structura

sau funcția rinichilor, prezente mai mult de 3 luni, cu implicații asupra sănătății pacientului”.

Caracteristicile de bază ale BRC sunt reprezentate de pierderea progresivă și ireversibilă a

funcției renale, cu afectare renală extinsă, conducând necondiționat la boala renală în stadiul

final și complicații cardiovasculare, cu excepția cazurilor în care se va administra tratamentul

afecțiunii de bază, se va realiza diagnosticarea precoce și tratarea manifestărilor patologice,

precum și planificarea în timp util a terapiei de substituție renală pe termen lung (Isakova et

al., 2017).

Povara economică a acestei boli este studiată predominant în țările cu venituri mari, în

principal în ceea ce privește prevalența, calitatea vieții, mortalitatea și complicațiile renale și

cardiovasculare. Chiar și în cazul în care sunt disponibile rezultatele programelor naționale de

depistare a BRC la scară largă, multe surse de date raportează doar estimări ale BRC și doar

pentru populațiile selectate (limitate în funcție de grupe de vârstă, geografie, ocupație etc.), iar

pentru multe țări nu există date pentru epidemiologia BRC. Deosebit de important, BRC a

continuat să se impună printre principalele cauze de mortalitate în ultimii ~30 de ani, având

drept cauze îmbătrânirea populației și principalii factori de risc, care includ diabetul zaharat și

hipertensiunea arterială care, împreună, au contribuit la mai mult de jumătate dintre decesele

cauzate de BRC în anul 2017 (2020).

Deși îmbunătățiri substanțiale au fost aduse în sistemele de sănătate, BRC rămâne în

continuare o povară majoră pentru sănătatea publică, iar prevalența acesteia este în continuă

creștere. Datorită naturii sale insidioase, BRC este rareori diagnosticată în stadiile incipiente

și, odată dezvoltată, progresia bolii este, din păcate, ireversibilă, conducând la terapie de

substituție a funcției renale (dializă și transplant renal) (Mihai et al., 2018).

Bolile cronice sunt însoțite de un status inflamator persistent, de intensitate scăzută

sau moderată, asociat de regulă bolilor coronariene, sindromului metabolic, diabetului zaharat

sau vârstei înaintate. Având în vedere că nu numai patologiile populației vârstnice au fost


4

asociate cu prezența inflamației sistemice scăzute, acest status fiind raportat și la copiii și

adolescenții cu variate probleme de sănătate (obezitate, infecții enterale, stres etc.), studiile au

relevat că BRC și mecanismele moleculare care o declanșează trebuie luate în considerare în

tandem cu procesul inflamator cronic care însoțește boala. Principalele surse de citokine

inflamatorii sunt monocitele circulante și celulele endoteliale, a căror distribuție ubiquitară ar

putea fi responsabilă pentru impactul larg răspândit al inflamației în aproape toate organele,

incluzând rinichiul. Deși rinichii primesc 25% din întregul volum de sânge al organismului,

fără a beneficia de mecanisme de apărare antioxidante, detoxifiante și anti-inflamatorii,

dezvoltate de alte țesuturi intens vascularizate (cum ar fi țesutul hepatic), aceste organe se

constituie ca o țintă vulnerabilă în fața diverselor agresiuni persistente (Dregan et al., 2014,

Guarner and Rubio-Ruiz, 2015, Pawelec et al., 2014). Conform studiilor clinice, 50% dintre

pacienții diagnosticați cu BRC prezintă un prognostic nefast datorat complicațiilor

cardiovasculare, respectiv calcificările vasculare avansate arteriale și valvulare; cu toate

acestea, procesele care stau la baza calcificărilor accelerate în BRC nu sunt pe deplin

descifrate, reprezentând subiectul mai multor studii de cercetare științifică în sfera

nefrologică. Astfel, screening-ul pentru prezența calcificărilor vasculare este sugerat în

ghidurile clinice actuale, întrucât calcificarea vasculară este considerată a fi un marker de risc

cardiovascular și este asociată cu o creștere substanțială a morbidității și mortalității, atât în

populația generală, cât și în BRC (Aikawa et al., 2009).

Pe măsura pierderii funcției renale, metabolismul mineral perturbat agravează

microstructura și remodelarea osoasă, scenariu patologic care implică axa os-rinichi-sistem

cardiovascular și care este recunoscut sub denumirea de BRC – boală minerală și osoasă

(BRC-BMO), în orchestrarea căreia participă variate molecule care mediază procesele de

mineralizare în BRC. Ghidurile clinice internaționale KDIGO definesc astfel BRC-BMO ca o

tulburare sistemică mai largă a metabolismului mineral și osos ca urmare a BRC, caracterizată

printr-un metabolism anormal al calciului, fosforului, hormonului paratiroidian (PTH) sau

vitaminei D, anomalii ale turn-over-ului osos, de mineralizare și creștere osoasă, precum și

calcificări anormale ale țesuturilor moi (extra-osoase, vasculare) (Fukagawa and Komaba,

2017). În conformitate cu ghidurile de evaluare, clasificare și stratificare NKF KDOQI -

National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative, boala renală

cronică este împărţită în 5 stadii de boală, în funcţie de eGFR, contribuind astfel în mod

esențial la o definire mai facilă şi o încadrare a pacienţilor cu afecţiuni renale cronice.

Recunoscute la nivel mondial pentru îmbunătățirea diagnosticului și a tratamentului bolilor


5

renale, ghidurile KDOQI au îmbunătățit practicile clinice curente pentru numeroase

specialități și discipline și au îmbunătățit speranța de viață pentru mii de pacienți cu patologie

renală. Odată stabilit diagnosticul de BRC, următorul pas este stadializarea bolii, care se

bazează pe următoarele componente: GFR, albuminuria și componenta etiologică. Ghidurile

clinice internaționale KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) 2017, clasifică

BRC în funcție de etiologie, categoria GFR (G1-G5), care evaluează funcția renală și

albuminurie (A1-A3), parametru care evaluează lezarea renală. (Inker et al., 2014)

În contextul unor date epidemiologice îngrijorătoare, a naturii insidioase a BRC și a lipsei de

markeri de diagnostic care să surprindă boala într-un stadiu incipient, dezvoltarea platformelor

proteomice de ultimă generație ar putea avea o contribuție majoră în managementul pacientului

renal, direcționând strategia terapeutică actuală care vizează „repararea daunelor”, către strategia de

prevenire a bolii (Pejchinovski and Mischak, 2017). Descoperirea de noi biomarkeri, cu expresie

modificată în torentul circulator înainte ca boala să fie confirmată clinic, cu sensibilitate și

specificitate ridicate, reprezintă una dintre preocupările majore ale cercetărilor fundamentale și

clinice din aria nefrologică.

Toate aceste considerente au contribuit la orientarea proiectului de cercetare științifică,

care a făcut obiectul prezentei teze, către selectarea, prin tehnologii proteomice avansate, a

unui panel de noi biomarkeri, cu rol în diagnosticarea precoce, stadializarea și determinarea

severității BRC. Prin abordarea tehnologiilor proteomice, identificarea de noi biomarkeri într-

o manieră neinvazivă permite conturarea semnăturilor proteice unice pentru fiecare stadiu de

boală, utile în managementul pacientului renal.


6

CONTRIBUȚII PERSONALE

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI

BRC este caracterizată printr-un debut insidios, iar simptomele ce însoțesc boala în

stadiile inițiale nu sunt specifice, împiedicând astfel un diagnostic precoce, într-un stadiu în

care aplicarea terapiilor curente ar putea oferi o vindecare completă. În conformitate cu

ghidurile clinice actuale, diagnosticul BRC se bazează pe calculul eGFR, detectarea

albuminuriei și realizarea unei biopsii renale, însă aceste metode de diagnostic sunt adesea

utilizate într-un stadiu tardiv al bolii, când leziunile glomerulare renale sunt avansate și adesea

ireversibile, conducând invariabil la terapia de substituție renală, respectiv dializă și transplant

renal. Având în vedere că markerii paraclinici convenționali prezintă anumite limite, nefiind

utili în stadiile precoce ale bolii, sunt necesari noi biomarkeri ai funcției renale care să fie capabili

să detecteze în mod neinvaziv debutul precoce al bolii renale, să faciliteze diagnosticul diferențial,

să monitorizeze răspunsurile la terapie și progresia spre stadiile mai avansate ale bolii, precum și

spre boala renală în stadiu final. Dezvoltarea tehnologiilor proteomice a permis noi abordări vizând

bolnavul renal, prin descoperirea de noi biomarkeri și stabilirea de semnături proteice unice,

caracteristice pentru fiecare stadiu de boală.

Pornind de la aceste considerente, scopul acestei teze a constat în selectarea unui nou

panel de biomarkeri cu potențială relevanță clinică în diagnosticul precoce, stratificarea și

gradul de severitate al BRC. Utilizând tehnologii proteomice avansate, această teză a urmărit

trei obiective principale:

Screening proteomic bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS pentru

identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie diferențiată la pacienții cu

boală renală cronică versus control.

Profil proteomic al bolii renale cronice, bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler,

diferențiat în funcție de gradul de severitate al bolii renale.

Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în studiu și markerii

paraclinici convenționali, la pacientul renal.

Nota de originalitate a acestei lucrări științifice rezidă în selectarea unui panel de nouă

biomarkeri, care au dovedit un real potențial în evaluarea gradului de severitate al BRC, în

stratificarea și diagnosticarea timpurie a BRC.


7

I. Screening proteomic, bazat pe spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF

MS, pentru identificarea de potențiali biomarkeri circulatori cu expresie

diferențiată la pacienții cu BRC versus control

În vederea identificării de molecule cu expresie diferită în BRC comparativ cu lotul

control, dar și între diferite stadii de boală, urmând design-ul studiilor proteomice clasice de

tip Fishing Expedition proiectate în vederea investigării de proteine specifice, într-o primă etapă a

fost realizat un screening proteic utilizând spectrometria de masă de tip SELDI-ToF MS.

Pornind de la rezultatele screening-ului proteic, spectrul de molecule supus analizei a fost

extins, coroborând în acest sens și datele existente în literatura de specialitate care vizează

patologia nefrologică. Moleculele identificate prin spectrometrie de masă, împreună cu alte

potențiale molecule relevante pentru boala renală, au fost analizate și cuantificate utilizând

tehnologia de multiplexare Luminex xMAP array și metoda ELISA. Ulterior au fost analizate

posibilele interconexiuni funcționale între aceste molecule, atât între lotul de pacienți cu BRC

și lotul control, cât și între loturile distincte de pacienți aflați în stadii diferite de boală.

Obiectivele studiului:

Identificarea de molecule cu rol potențial în fiziopatologia BRC, în diferite stadii,

bazat pe analiză spectrometrică de masă de tip SELD-ToF MS;

Evaluarea profilului inflamator și de demineralizare osoasă în BRC, bazat pe

tehnologia de multiplexare xMAP array și metoda ELISA;

Explorarea potențialelor asocieri și covariații ale moleculelor identificate și

cuantificate, cu expresie semnificativă în BRC, în vederea selectării unui panel de

molecule reprezentativ.

Material și metodă

Lotul de pacienți. În studiu au fost incluși 106 indivizi - 86 de pacienți internați în Clinica de

Nefrologie, Institutul Clinic Fundeni, București și diagnosticați cu BRC în conformitate cu

criteriile KDIGO (28% femei și 72% bărbați, cu vârsta medie de 65 de ani), nesupuși dializei:

20 de pacienți cu BRC stadiul 4; 52 de pacienți cu BRC stadiul 3; 14 pacienți cu BRC stadiul

2; studiul a inclus și 20 de martori sănătoși. Au fost colectate datele clinice, antropometrice și

rezultatele testelor uzuale de laborator ale pacienților. Estimarea ratei de filtrare glomerulară

(eGFR) a fost calculată pe baza formulei CKD-EPI, în conformitate cu ghidurile curente


8

KDIGO. Probele de sange (ser) au fost recoltate a jeun și apoi stocate la -80°C până la

momentul analizei.

Metode utilizate:

- Tehnologia SELDI-ToF MS Proteinchip pentru screening-ul potențialilor biomarkeri serici;

- Tehnologia de multiplexare Luminex xMAP array pentru evaluarea cantitativă a

biomarkerilor-candidați serici, relevanți pentru pacientul renal și kit-urile:

- Milliplex MAP Human Bone Magnetic Bead Panel, (Merck-Millipore, Billerica,

MA, USA), cu următoarele molecule: citokine pro-inflamatorii - IL-6, TNF-α;

markeri asociați metabolismului mineral și osos - Osteoprotegerin (OPG),

Osteopontin (OPN), Osteocalcin (OCN) și Factorul de creștere a fibroblastelor-23

(FGF-23).

- kitul Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel, (Merck-

Millipore, Billerica, MA, USA), cu următoarii mediatori ai răspunsului inflamator:

IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10, MIP-1α.

- Tehnica ELISA cantitativă pentru determinarea nivelului seric al Fetuin-A.

Rezultate

Caracterizarea prin spectrometrie de masă de tip SELDI-ToF MS a profilului proteic

S-au identificat 78 de clustere (proteine) serice la pacienți cu BRC versus control

dintre care, în intervalul de masă moleculară 20.000 – 40.000 Da, s-au selectat 5 clustere cu

cea mai bună putere de clasificare între loturile de pacienți în stadiile 2-4 și lotul control

(valori ROC cuprinse între 0,83-0,89). Selecția potențialelor molecule relevante pentru

fiziopatologia BRC s-a axat pe identificarea spectrelor ale căror niveluri de expresie să difere

semnificativ de la un lot la altul și s-a utilizat analiza software Protein Chip DATA Manager,

bazată pe algoritmi capabili să grupeze pick-uri de proteine cu greutate moleculară similară,

prezente în probele aparținând aceluiași lot. Valorile p și curbele ROC au fost utilizate pentru

a dezvălui relevanța statistică pentru markerii individuali. Apelând la baze de date precum

UniProt, ExPASy, au fost identificate proteine specifice aferente maselor moleculare

determinate prin analiza spectrometrică, urmând a fi luate în analiză.

Având în vedere rezultatele obținute în urma screening-ului prin SELDI-ToF MS,

acest studiu a urmărit în continuare analiza și cuantificarea unor molecule implicate în

mecanismele care stau la baza fiziopatologiei BRC. Utilizând tehnologia de multiplexare

Luminex xMAP array, spectrul de analiză proteomică a fost extins în două direcții majore de

cercetare:


9

evaluarea unor mediatori importanți în orchestrarea răspunsului inflamator, respectiv

citokine pro-inflamatorii (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1α și TNF-α);

analiza și cuantificarea unui panel de molecule implicate în metabolismul mineral și

osos (OPG, OPN, OCN și FGF-23). Pentru cuantificarea nivelului de expresie serică a

moleculei Fetuin-A a fost utilizată metoda ELISA.

Statusul inflamator şi BRC

În urma analizei de multiplexare xMAP array, mediatorii răspunsului inflamator IL-6

și TNF-α au prezentat niveluri serice crescute, relevante din punct de vedere statistic, la

pacienții cu BRC în comparație cu lotul martor (p<0,001). IL-6 a prezentat cel mai ridicat

nivel de expresie serică la grupul de pacienți cu BRC stadiul 4 (p<0,001), concentrația medie

în acest lot de pacienți fiind de 11 ori mai mare decât media concentrațiilor din lotul control

(Figura 1 - a, b). TNF-α a prezentat, de asemenea, un nivel seric crescut, concentrația medie

fiind de 3,6 ori mai mare (p<0,001) la lotul de pacienți cu BRC stadiul 4 (Figura 1 - c, d).

a

b

c d

Figura 1. Nivelul de expresie serică pentru IL-6 (a, b) și TNF-α (c, d) în grupul pacienților

cu BRC versus control, precum și expresia diferențiată în funcție de stadiile BRC, utilizând

analiza Luminex xMAP array (Mihai et al., 2016)


10

Creșterea nivelului seric al IL-6 și TNF-α în BRC concordă cu rezultatele altor studii

recente care menționează un trend uniform în creșterea nivelului markerilor pro-inflamatori și

progresia bolii renale. Inflamaţia reprezintă o marcă reprezentativă a BRC, iar gradul în care

procesul inflamator este asociat cu stadiul bolii rămâne încă neelucidat. Studii recente au

evidentiat niveluri crescute ale citokinelor pro-inflamatorii IL-6 şi TNF-α la pacienţii cu

disfuncţii renale, fiind corelat și cu evoluţia şi complicaţiile BRC, respectiv bolile

cardiovasculare (Abraham et al., 2015, Hénaut et al., 2015). Spoto și colab. au relevat că

procesul inflamator este asociat cu insuficiența renală, cu nivele crescute ale IL-6 doar în

stadiile inițiale ale BRC; însă studiul acestora a arătat o corelație negativă între nivelul TNF-α

și eGFR, indicând diferențe în dinamica relației dintre cele două citokine (Spoto et al., 2012).

Analiza xMAP a celorlalți markeri inflamatori a indicat că nivelul seric al citokinelor

IL-8, IL-10, IL-1β și MIP-1α a prezentat un nivel de expresie serică diferit la pacienții cu

BRC versus control, dar și în funcție de stadiul bolii (Figura 2).

Expresia citokinei IL-10 în relație cu dezvoltarea și progresia BRC a fost abordată de

mai multe studii din literatură, Yilmaz M.I. și colab. raportând un nivel crescut al IL-10, IL-6

și al Proteinei C-reactive în rândul pacienților cu funcție renală scăzută (eGFR scăzut); un

nivel seric crescut al IL-10 a fost asociat cu riscul de evenimente cardiovasculare în timpul

monitorizării pacienților, speculând că nivelurile mai mari de IL-10 în acest context semnifică

un millieu pro-inflamator general (Yilmaz et al., 2014).

Pe de altă parte, eliberarea de interleukină IL-1β în contextul activării inflamazomului

este considerată un element central al multor forme de inflamație, având un potențial rol în

promovarea dezvoltării și evoluției bolii renale diabetice (Lei et al., 2019). . Nu în ultimul

rând, există studii care, la pacienții cu diverse forme de glomerulonefrită sau în boala

tubulointerstitială progresivă, au descris un nivel crescut al MIP-1α, alături de alte

citokine/chemokine, (Chung and Lan, 2011).


11

Figura 2. Raportul nivelului de expresie (fold-change) al MIP-1α, IL-8, IL-10, IL-1β în

stadiile 2-4 de BRC față de lotul control

Markeri asociați metabolismului mineral și osos în BRC

Analiza multiplex xMAP array a relevat, în BRC versus control, creșteri semificative statistic

ale expresiei serice ale osteoprotegerinei (OPG), osteopontinei (OPN), osteocalcinei (OCN) și

a factorului de creștere a fibroblastelor-23 (FGF-23) (Figura 3).

P a c i e n t i C o n t r o l

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

O P G

pg

/mL


0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

O C N

pg

/mL


0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

O P N

pg

/mL


0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

F G F - 2 3

pg

/m

L

Figura 3. Nivelul de expresie serică al OPG, OCN, OPN și FGF-23 în grupul pacientilor cu

BRC versus control

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

MIP-1a IL-8 IL-10 IL-1b

Rap

ort

niv

el e

xpre

sie

se

rică

BRC std 4/ctrl

BRC std 3/ctrl

BRC std 2/ctrl


12

Dintre moleculele implicate în procesul de calcificare vasculară, Fetuin-A are un rol inhibitor,

pacienții cu BRC având o deficiență a nivelului circulant al acestui marker, așa cum a rezultat

în urma dozării sale prin metoda ELISA.

Evaluarea markerilor asociați metabolismului mineral și osos în diferite stadii ale BRC este

prezentată în Figura 4.

Figura 4. Nivelul seric mediu al biomarkerilor evaluați în BRC stadiile 4, 3 si 2 versus

control ( Mihai et al., 2016).

Analiza corelațiilor dintre mediatorii inflamației și markerii metabolismului mineral și

osos selectați, în relație cu stadiile BRC s-a realizat pe două direcții distincte:

corelațiile dintre moleculele analizate, pentru fiecare stadiu de BRC, în vederea stabilirii

tendințelor similare de variație de expresie serică, pentru selectarea de potențiali markeri

utili în stratificarea pacienților renali;

corelațiile dintre mediatorii inflamației, markerii metabolismului mineral și osos și

gradul de alterare a funcției renale, în vederea stabilirii de potențiali markeri revevanți

în stabilirea gradului de severitate a BRC.

Evaluarea profilului inflamator și a markerilor asociați metabolismlui mineral și osos în BRC

a indicat corelații semnificative statistic între IL-6, FGF-23, TNF-α, OCN, OPN, Fetuin-A și

gradul de disfuncție renală (eGFR) în grupul de pacienți cu BRC stadiile 2-4. (Tabelul 1)

Concluzii

În urma acestui studiu au fost selectate molecule apartinand mediatorilor inflamatiei dar si

markeri ai metabolismlui mineral și osos care au prezentat un nivel de expresie semnificativ

diferențiat în cazul BRC versus control, iar acest panel de molecule a făcut obiectul studiilor

ulterioare, în vederea design-ului unei semnături proteice specifice pacientului renal, aflat în

diferite stadii de BRC.

13

Tabelul 1. Corelații (χ2-test) între citokinele pro-inflamatorii, markerii implicați în metabolismul mineral și osos și gradul de alterare a funcției renale

(eGFR) în BRC stadiile 4, 3 si 2 (nedializați)

χ2-test

IL-6

TNF-α OPN OPG OCN FGF-23 Fetuin-A

<6 ≥6 <5 ≥5 <6000 ≥6000 <400 ≥400 <12000 ≥12000 <35 ≥35 <400 ≥400

Sex M 31 31 p=0,16 χ

2=1,9

39 23 p=0.29 X2=1.1

13 49 p=0.65 X2=0.2

10 52 p=0.17 X2=1.85

21 41 p=0.75 X2=0.1

20 42 p=0.29 X2=1.09

13 49 p=0.65 X2=0.2

F 8 16 18 6 4 20 7 17 9 15 5 19 4 20

Vârstă <60 10 12 p=0,99 χ2=0,0001

12 10 p=0.18 X2=1.8

7 15 p=0.09 X2=2.7

7 15 p=0.09 X2=2.7

9 13 p=0.5 X2=0.5

4 18 p=0.19 X2=1.7

7 15 p=0.09 X2=2.7

≥60 29 35 45 19 10 54 10 54 21 43 21 43 10 54

eGFR <60 27 47 P<0,001 X2=16,8

46 28 p=0.04 X2=4.02

12 62 p=0.04 X2=4.2

14 60 p=0.6 X2=0.2

22 52 p=0.01 X2=6.2

15 59 P<0.001 X2=19.9

17 64 p=0.07 X2=3.08

≥60 12 0 11 1 5 7 3 9 8 4 10 2 0 12

IL-6 <6 32 7 p<0.005 X2=7.9

12 27 p<0.02 X2=5.4

13 26 p=0.004 X2=8.28

18 21 p=0.04 X2=4

16 23 p=0.02 X2=5

7 32 p=0.7 X2=0.2

≥6 25 22 5 42 4 43 12 35 9 38 10 37

TNF-α <5 19 38 p=0.03 X2=4.6

15 42 p=0.03 X2=4.6

22 35 p=0.3 X2=1.02

22 35 p=0.006 X2=7.4

7 50 p=0.01 X2=5.9

≥5 3 26 2 27 8 21 3 26 10 19

OPN <6000 6 11 p=0.07 X2=3.2

10 7 p=0.02 X2=5.3

6 11 p=0.52 X2=0.39

3 14 p=0.8 X2=0.06

≥6000 11 58 20 49 19 50 14 55

OPG <400 9 8 p=0.08 X2=3.04

4 13 p=0.57 X2=0.3

4 13 p=0.66 X2=0.2

≥400 21 48 21 48 13 56

OCN <12000 14 16 p=0.008 X2=6.9

6 24 p=0.96 X2=0.001

≥12000 11 45 11 45

FGF-23 <35 2 23 p=0.07 X2=3.07

≥35 15 46

Fetuin-A <400

≥400

14


II. Profil proteomic al BRC bazat pe analiza dot-blot Proteome Profiler și

Luminex xMAP array, diferențiat în funcție de gradul de severitate al

bolii renale

Pornind de la faptul că o expresie crescută a citokinelor pro-inflamatorii serice reflectă

prezența procesului inflamator, iar un nivel alterat al moleculelor implicate în metabolismul

mineral și osos reflectă posibile demineralizări osoase și calcificări extraosoase vasculare, în

acest studiu s-a urmărit evaluarea profilului circulator de citokine asociat inflamației și

metabolismului mineral și osos, pe loturi de pacienți în stadiile 2-4 de BRC, comparativ cu

lotul martor.


Stabilirea de semnături proteice unice, utilizând tehnologia proteomică multianalit de

imunodetecție semicantitativă, de tip dot-blot și compararea profilului circulant al

pacienților din loturi aparținând diferitelor stadii de BRC versus control;

Identificarea de paneluri de citokine al căror nivel de expresie serică diferă

semnificativ între loturile cu BRC și lotul control, precum și între diferite loturi care

corespund unor stadii diferite de boală renală;

Selectarea unui panel de markeri serici care prezintă potențialul de a discrimina

pacientul renal aflat într-un stadiu precoce al bolii față de control.


Lotul de pacienți. În acest studiu de tip transversal (cross-sectional) au fost incluși 56 de

pacienți (care, conform criteriilor KDIGO, au fost diagnosticați cu boală renală cronică) 20 de

controale normale. Pacienții cu BRC au fost împărțiți în trei loturi, corespunzând stadiilor 2, 3

si 4 de boală renală. Pentru a evita potențiale rezultate fals pozitive/negative care ar putea

interfera cu acuratețea determinărilor calcitriolului și a celorlalți markeri serici, din acest

studiu au fost excluși în primul rând pacienții supuși tratamentului cu analogi sintetici de

vitamina D. Lotul control a fost selectat astfel încât să prezinte aceeași distribuție a vârstei și

sexului, într-un mod similar loturilor de pacienți cu BRC. S-au colectat datele clinice și

antropometrice ale pacienților luați în studiu. eGFR a fost calculat pe baza ecuației EPI

(coroborare BRC – date epidemiologice), iar albuminuria a fost determinată din probe de

urină de 24 de ore.


15


- Screening-ul proteomic al serurilor provenite de la pacienții cu BRC (imunodetecția

semicantitivă simultană a proteinelor serice - citokine, chemokine, factori de creștere, markeri

de angiogeneză și alte proteine solubile) s-a realizat prin tehnica dot-blot cu kitul Proteome

Profiler Human XL Cytokine Array (ARY022B, R&D Systems, Inc., Abingdon, Marea

Britanie).

- Tehnologia de multiplexare xMAP array a fost utilizată pentru cuantificarea simultană,

din serurile pacienților cu BRC stadiile 2-4 și serurile control, a unui panel de molecule

(citokine și moleculele implicate în metabolismul mineral și osos) cu rol în fiziopatologia

BRC, folosind kitul multiplex MILLIPLEX MAP Human Bone Magnetic Bead Panel (Merck-

Millipore, Billerica, MA, SUA).

- Determinarea expresiei serice a Dkk-1 (Dickkopf-related protein-1) și a calcitriolului

(1,25OH2D3) s-a realizat utilizând metoda ELISA cantitativă.

Rezultate

Semnătura proteică a BRC și a diferitelor stadii ale bolii, prin screening de tip dot-blot

La evaluarea dot-blot, expresia proteică pentru fiecare dintre cele 4 pool-uri de seruri,

corespunzând celor 4 membrane de nitroceluloză, a fost testată prin analiza densitometrică,

așa cum este relevat în Figura 5, iar spot-urile marcate au prezentat diferențe de intensitate a

semnalului între membranele ce corespund loturilor diferite de pacienți cu BRC, precum și

față de lotul control.


16

Figura 5. Membranele dot-blot corespunzând diferitelor stadii ale BRC și controlului (4 pool-

uri de seruri). Moleculele care au prezentat modificări semnificative față de control și au făcut

obiectul testărilor ulterioare au fost marcate în consecință.

Dintre cele 105 molecule analizate pe kitul Proteome Profiler, pentru fiecare lot în

parte, 24 de molecule au fost relevante, prezentând un nivel de expresie semnificativ crescut

la pacienții cu BRC versus control, precum și pentru diferitele stdii de boală renală (Figura 6).

Printre proteinele care au prezentat un nivel de expresie semnificativă în comparație cu

controlul au fost identificați mediatori ai răspunsului inflamator, reflectând importanța

componentei inflamatorii în fiziopatologia BRC, precum și markeri ai metabolismului mineral

și osos, reflectând rolul axei os - rinichi - sistem cardiovascular. Dintre mediatorii inflamației,

IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-Ɣ, RANTES, RAGE, ICAM-1, IP-10, PAI-1, PDGF, Proteina

C-reactivă și alte molecule au fost identificate ca fiind importante în realizarea semnăturii

proteice a BRC. Așa cum subliniază studiile științifice din literatura de specialitate, un status

inflamator persistent, de intensitate scăzută, reprezintă o caracteristică ce însoțește BRC încă

din stadiile timpurii, iar mediatorii inflamației Proteina C-reactivă și IL-6 sunt cunoscuți ca

predictori independenți ai unui prognostic nefavorabil în BRC (Mihai et al., 2018b).


17

Figura 6. Profilul proteinelor serice în stadiile 2-4 ale BRC față de control. Moleculele au

prezentat un trend crescător de expresie, în funcție de severitatea bolii; Dkk-1 și vit. D BP au

prezentat o tendință descendentă, pe măsura progresiei bolii.

Screening-ul dot-blot din studiul efectuat în cadrul tezei a relevat ca mediatorii

consacrați ai inflamației - IL-6, IL-8, IL-12, Proteina C-reactivă și markeri ai metabolismului

mineral și osos – vitamina D (BP), Osteocalcin (OCN), Dkk-1 sunt importanți în constituirea

profilului proteic al bolnavului renal, într-un stadiu al bolii în care simptomatologia clinică nu

este manifestă; pe de alta parte, nivelul de expresie al acestor molecule este semnificativ

modulat (crescut/scăzut), în funcție de stadiul BRC. Având în vedere aceste observatii și

rezultatele analizei statistice, au fost selectate următoarele molecule pentru conturarea unui

panel de biomarkeri relevanți pentru pacientul cu BRC:

Mediatori ai inflamației: IL-6, TNF-α

Vitamina D activă – calcitriol

Mediatori ai metabolismului mineral și osos: Dkk-1 (Dickkopf-related protein-1),

Osteoprotegerin (OPG), Osteocalcin (OCN), Osteopontin (OPN), Factorul de

creștere a fibroblastului-23 (FGF-23).

Cuantificarea prin ELISA a Dkk-1 și calcitriolului si analiza în funcție de severitatea

BCR, a relevat scăderea acestor markeri proporțional cu stadiul bolii (Figura 7).


18

Figura 7. Nivelul de expresie serică a Dkk-1 (fold-change) si calcitriolului (fold-change) în BRC

stadiile 4, 3 și 2 față de control, evaluate prin tehnica ELISA.

Scăderea semnificativă înregistrată la lotul BRC stadiul 4, recomandă aceaste

molecule ca având potențial în diferențierea gradului de severitate al bolii, corelându-se cu

riscul crescut de complicații la pacientul renal aflat într-un stadiu avansat de boală.

Cuantificarea simultană, pe platforma de multiplexare Luminex 200, a moleculelor din

orchestrarea răspunsului inflamator ( IL-6 și TNFα) și a celor cu implicații în metabolismul mineral

și osos (OPG, OCN, OPN și FGF-23) a indicat că nivelul de expresie serică al acestora crește la

pacienții din diferitele stadii de BRC comparativ cu lotul control.

Corelațiile între markerii asociați inflamației și cei asociați metabolismului

mineral și osos în BRC, obținute prin aplicarea testului Chi-square test/ χ2-test (χ2, P), au

relevat următoarele:

- tendința de variație a expresiei serice a markerilor analizați cu stadiul BRC;

- asocieri statistice între Dkk-1 și calcitriol, citokinele pro-inflamatorii și funcția renală, în

diferite stadii ale BRC.

S-au obținut corelații semnificativ statistice între Dkk-1 și calcitriol (χ2 = 21.4, P < 0,001) și între

nivelul seric al Dkk-1 și mediatorii inflamației IL-6 (χ2 = 13,7, P <0,001) și TNF-α (χ2 = 10,4, P =

0,001), precum și cu markerul osos FGF-23 (χ2 = 10 , P = 0,001). Nivelul de expresie serică a

calcitriolului la pacienții cu BRC a fost corelat semnificativ statistic cu IL-6 (χ2 = 4.4, P <0.05) și

FGF-23 (χ2 = 5.5, P = 0.01). A fost observată o corelație puternică între eGFR și Dkk-1 (χ2 = 8,48,

P <0,01) și calcitriol (χ2 = 8,36, P <0,01), indicând potențialul crescut pentru aceste două molecule

în ceea ce privește evaluarea severității bolii renale.

Testele de corelatie Spearman au identificat corelațiile cu semnificație statistică între moleculele

analizate și diversele stadii de BRC. Pentru subiecții aparținând stadiului 4 BRC, în urma aplicării

testului statistic, s-au obținut corelații semnificative între TNF-α și Dkk-1 (r = 0,50, p <0,05), OPG


19

(r = 0,58, p <0,02) și OPN (r = 0,66, p = 0,01), iar pentru pacienții apartinând stadiului 3 al BRC au

fost evidențiate corelații între TNF-α și OPG (r = 0,60, p = 0,001) și FGF-23 (r = 0,57, p <0,01). Pe

de altă parte, în cazul lotului de pacienți aparținând stadiului 2 al BRC a fost observată o corelație

negativă puternică între Dkk-1 și FGF-23 (r = −0,84, p <0,001) și corelații moderate între calcitriol

și IL-6 (r = 0,53, p <0,05), TNFα (r = 0,58, p <0,05), OPG (r = 0,71, p <0,05) și FGF-23 (r = 0,52 , p

<0,05). (Tabelul 2 – a, b, c)

Tabelul 2. Teste de corelație Spearman (p-value) între moleculele analizate în BRC stadiile 2-4.

a. BRC stadiul 4

std. 4 p-value

IL-6

TNF-a

OPG

OC

OPN

FGF-23

Fetuin-A

Dkk-1

Calcitriol

eGFR

IL-6 0.78 0.13 0.28 0.28 0.49 0.14 0.73 0.33 0.85

TNF-a 0.78 0.02 0.16 0.01 0.19 0.11 0.05 0.53 0.53

OPG 0.13 0.02 0.29 0.05 0.27 0.02 0.93 0.92 0.44

OC 0.28 0.16 0.29 0.15 0.09 0.13 0.32 0.31 0.09

OPN 0.28 0.01 0.05 0.15 0.79 0.01 0.91 0.53 0.55

FGF-23 0.49 0.19 0.27 0.09 0.79 0.36 0.33 0.83 0.34

Fetuin-A 0.14 0.11 0.02 0.13 0.01 0.36 0.90 0.34 0.99

Dkk-1 0.73 0.05 0.93 0.32 0.91 0.33 0.90 0.37 0.22

Calcitriol 0.33 0.53 0.92 0.31 0.53 0.83 0.34 0.37 0.21

eGFR 0.85 0.53 0.44 0.09 0.55 0.34 0.99 0.22 0.21

b. BRC stadiul 3 std. 3

p-value

IL-6

TNF-a

OPG

OC

OPN

FGF-23

Fetuin-A

Dkk-1

Calcitriol

eGFR

IL-6 0.95 0.31 0.05 0.26 0.69 0.32 0.99 0.05 0.59

TNF-a 0.95 0.00 0.90 0.02 0.00 0.38 0.20 0.51 0.31

OPG 0.31 0.00 0.67 0.06 0.07 0.01 1.00 0.56 0.92

OC 0.05 0.90 0.67 0.94 0.66 0.98 0.91 0.42 0.35

OPN 0.26 0.02 0.06 0.94 0.43 0.25 0.84 0.91 0.23

FGF-23 0.69 0.00 0.07 0.66 0.43 0.21 0.86 0.68 0.17

Fetuin-A 0.32 0.38 0.01 0.98 0.25 0.21 0.78 0.90 0.23

Dkk-1 0.99 0.20 1.00 0.91 0.84 0.86 0.78 0.33 0.68

Calcitriol 0.05 0.51 0.56 0.42 0.91 0.68 0.90 0.33 0.14

eGFR 0.59 0.31 0.92 0.35 0.23 0.17 0.23 0.68 0.14

c. BRC stadiul 2 std. 2


20

p-value IL-6

TNF-a OPG OC OPN FGF-23 Fetuin-A Dkk-1 Calcitriol eGFR

IL-6 0.03 0.02 0.82 0.82 0.95 0.06 0.78 0.05 0.55

TNF-a 0.03 0.23 0.27 0.60 0.68 0.19 0.72 0.03 0.24

OPG 0.02 0.23 0.82 0.55 0.91 0.08 0.40 0.00 0.76

OC 0.82 0.27 0.82 0.91 0.60 0.13 0.31 0.39 0.23

OPN 0.82 0.60 0.55 0.91 0.83 0.16 0.96 0.96 0.25

FGF-23 0.95 0.68 0.91 0.60 0.83 0.59 0.00 0.05 0.58

Fetuin-A 0.06 0.19 0.08 0.13 0.16 0.59 0.24 0.04 0.37

Dkk-1 0.78 0.72 0.40 0.31 0.96 0.00 0.24 0.37 0.72

Calcitriol 0.05 0.03 0.00 0.39 0.96 0.05 0.04 0.37 0.93

eGFR 0.55 0.24 0.76 0.23 0.25 0.58 0.37 0.72 0.93

Aplicarea testului de analiză unidirecțională a varianței Kruskal-Wallis (Kruskal–Wallis one-

way analysis of variance) pentru evaluarea variației în nivelul de expresie serică pentru fiecare

moleculă în relație cu fiecare dintre stadiile 4, 3 si 2 de BRC a condus la următoarele rezultate:

- diferențe semnificative de variație în expresia circulantă a Dkk-1, calcitriol și eGFR la

pacienții cu BRC (P <0,0001);

- diferențe semnificative ale nivelurilor Dkk-1, calcitriol și eGFR între BRC stadiul 4 și

stadiul 3, între stadiile 4 și 2 și, respectiv, între stadiile 3 și 2 (P <0,0001), evidențiind

potențialul acestor doi markeri în evaluarea severității bolii;

- diferențe semnificative de variație în expresia IL-6 (P <0,0001) în functie de stadiul bolii.

Concluzii

- existența unei interacțiuni funcționale între markerii inflamației și markerii de mineralizare

osoasă în BRC, în funcție de severitatea bolii.

- moleculele Dkk-1 și calcitriol se corelează statistic semnificativ cu gradul de severitate al BRC,

având un trend circulator descendent pe măsura agravării bolii renale.

- existența unor corelații semnificative între Dkk-1, calcitriol și citokinele pro-inflamatorii,

începând cu stadiile incipiente ale BRC.


21

III. Corelații între markerii inflamatori și de demineralizare osoasă luați în

studiu și markerii paraclinici convenționali, la pacientul renal.

Selectarea unui panel de biomarkeri cu potențială relevanță clinică în

diagnosticul precoce, stratificarea și gradul de severitate al BRC

Investigarea corelațiilor între markerii evaluați, care prezintă o potențială relevanță în

BRC, și markerii convenționali de diagnostic și prognostic utilizați în mod current în clinică

reprezintă un pas important în extinderea spectrului de biomarkeri utilizați în screening-ul și

diagnosticul precoce al BRC. În cazul acestui studiu, am evaluat corelațiile dintre molecule

pentru fiecare stadiu de boală, în vederea identificării markerilor care se corelează cu

severitatea BRC și pentru a stabili pattern-uri de expresie specifice în funcție de stadiul bolii.


Analiza corelațiilor dintre markerii selectați și markerii convenționali inflamatori de

fază acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici

efectuați de rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid

uric seric și albuminurie).

Evaluarea interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei

de date STRING și selectarea unui panel de biomarkeri relevanți, util în diagnosticarea

precoce, stadializarea și severitatea BRC.


Lotul de pacienți. Pentru realizarea acestui studiu, a fost luat în calcul lotul de pacienți cu

BRC care a fost descris la capitolul II, iar acest lot a fost constituit din 56 de pacienți,

diagnosticați cu boală renală cronică, conform criteriilor KDIGO; acești pacienți au fost

împărțiți în trei loturi, corespunzând stadiilor 2, 3 si 4 de boală renală, respectiv 28,6% stadiul

2 BRC, 46,4% stadiul 3 BRC, 25% stadiul 4 BRC.

Metode statistice pentru analiza corelațiilor dintre markerii selectați

- Analiza statistică și graficele aferente pentru acest studiu au fost realizate cu ajutorul

software-ului GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA).

- Evaluarea distribuției valorilor analiților luați în studiu, în cadrul celor 3 loturi de

pacienți cu BRC stadiile 2, 3 si 4, a fost realizată utilizând testul Kolmogorov-Smirnov.

- Coeficientul de corelație Spearman a fost aplicat în vederea evaluării corelației a două

variabile cantitative, cu distribuție non-normală, în cadrul aceluiași lot de pacienți, pentru

fiecare dintre cele 3 loturi de boală renală.


22

- Investigarea posibilelor interacțiuni dintre moleculele analizate și markerii convenționali

utilizați în mod curent în practica clinică pentru diagnosticul BRC, a fost realizată prin abordarea

bazei de date STRING.

Rezultate

Analiza corelațiilor dintre markerii selectați și cei convenționali inflamatori de fază

acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de

rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric și

albuminurie)

În cadrul studiului s-au evaluat corelațiile dintre molecule pentru fiecare stadiu de

boală, în vederea identificării markerilor care se aociază cu severitatea BRC și pentru a stabili

pattern-uri de expresie specifice în funcție de stadiul bolii. Corelațiile Spearman (p-value)

între moleculele analizate si stadiile BRC sunt prezentate în Tabelul 3 – a, b, c.

Tabelul 3. Corelații Spearman (p-value) între moleculele analizate pentru lotul de pacienți

aferent BRC stadiilor 2-4 (abrevieri: CAL – calcitriol, Fbg – fibrinogen, CRE – creatinină,

ALB – albuminurie, AU – acid uric, FA- Fetuin-A)

a. BRC stadiul 2 p-value

Spearman

BRC std. 2

IL-6

TNFa

OPG

OC

OPN

FGF23

Dkk

CAL

FA

eGFR

PCR

Fbg

CRE

ALB

AU

IL-6

(pg/mL)

0.03 0.02 0.82 0.07 0.95 0.78 0.05 0.06 0.14 0.16 0.00 0.00 0.27 0.26

TNFa (pg/mL) 0.03 0.23 0.27 0.14 0.68 0.72 0.03 0.19 0.42 0.83 0.07 0.03 0.19 0.21

OPG (pg/mL) 0.02 0.23 0.82 0.88 0.92 0.39 0.01 0.08 0.67 0.16 0.08 0.15 0.18 0.90

OC

(pg/mL)

0.82 0.27 0.82 0.45 0.61 0.31 0.39 0.13 0.82 0.67 0.68 0.82 0.19 0.04

OPN (pg/mL) 0.07 0.14 0.88 0.45 0.59 0.89 0.62 0.96 0.54 0.33 0.09 0.01 0.33 0.08

FGF23 (pg/mL) 0.95 0.68 0.92 0.61 0.59 0.00 0.06 0.59 0.63 1.00 0.92 0.75 0.75 0.69

Dkk-1 (pg/mL) 0.78 0.72 0.39 0.31 0.89 0.00 0.37 0.24 1.00 0.83 0.90 0.96 0.77 0.99

Calcitriol (pg/mL) 0.05 0.03 0.01 0.39 0.62 0.06 0.37 0.04 0.31 0.33 0.12 0.18 0.95 0.47

Fetuin-A (pg/mL) 0.06 0.19 0.08 0.13 0.96 0.59 0.24 0.04 0.51 0.50 0.02 0.16 0.85 0.36

eGFR 0.14 0.42 0.67 0.82 0.54 0.63 1.00 0.31 0.51 0.16 0.25 0.08 0.45 0.97

PCR (mg/dL) 0.16 0.83 0.16 0.67 0.33 1.00 0.83 0.33 0.50 0.16 0.16 0.16 0.66 0,66

Fbg (mg/dL) 0.00 0.07 0.08 0.68 0.09 0.92 0.90 0.12 0.02 0.25 0.16 0.00 0.45 0.15

CRE

(mg/dL)

0.00 0.03 0.15 0.82 0.01 0.75 0.96 0.18 0.16 0.08 0.16 0.00 0.58 0.21

ALB (mg/mmol) 0.27 0.19 0.18 0.19 0.33 0.75 0.77 0.95 0.85 0.45 0.66 0.45 0.58 0.02

AU

(mg/dL)

0.26 0.21 0.90 0.04 0.08 0.69 0.99 0.47 0.36 0.97 0.66 0.15 0.21 0.02


23

b. BRC stadiul 3 p-value

Spearman

BRC std. 3

IL-6

TNFa

OPG

OC

OPN

FGF23

Dkk

CAL

FA

eGFR

PCR

Fbg

CRE

ALB

AU

Il-6

(pg/mL)

0.94 0.31 0.05 0.26 0.69 0.99 0.05 0.32 0.59 0.08 0.78 0.93 0.86 0.30

TNFa

(pg/mL)

0.94 0.00 0.89 0.02 0.00 0.20 0.52 0.38 0.29 0.76 0.27 0.51 0.95 0.76

OPG

(pg/mL)

0.31 0.00 0.67 0.06 0.07 1.00 0.56 0.01 0.92 0.77 0.67 0.02 0.12 0.58

OC

(pg/mL)

0.05 0.89 0.67 0.94 0.66 0.91 0.42 0.98 0.35 0.79 0.13 0.23 0.92 0.04

OPN

(pg/mL)

0.26 0.02 0.06 0.94 0.43 0.84 0.91 0.25 0.23 1.00 0.06 0.53 0.71 0.54

FGF-23

(pg/mL)

0.69 0.00 0.07 0.66 0.43 0.86 0.68 0.21 0.17 0.53 0.60 0.79 0.53 0.64

Dkk-1

(pg/mL)

0.99 0.20 1.00 0.91 0.84 0.86 0.33 0.78 0.68 0.42 0.77 0.50 0.02 0.38

Calcitriol

(pg/mL)

0.05 0.52 0.56 0.42 0.91 0.68 0.33 0.90 0.14 0.23 0.23 0.96 0.85 0.64

Fetuina-A

(pg/mL)

0.32 0.38 0.01 0.98 0.25 0.21 0.78 0.90 0.23 0.15 0.61 0.76 0.48 0.26

eGFR 0.59 0.29 0.92 0.35 0.23 0.17 0.68 0.14 0.23 0.67 0.72 0.69 0.60 0.74

PCR

(mg/dL)

0.08 0.76 0.77 0.79 1.00 0.53 0.42 0.23 0.15 0.67 0.64 0.39 0.50 0.36

Fbg

(mg/dL)

0.78 0.27 0.67 0.13 0.06 0.60 0.77 0.23 0.61 0.72 0.64 0.93 0.74 0.28

CRE

(mg/dL)

0.93 0.51 0.02 0.23 0.53 0.79 0.50 0.96 0.76 0.69 0.39 0.93 0.34 0.01

ALB

(mg/mmol)

0.86 0.95 0.12 0.92 0.71 0.53 0.02 0.85 0.48 0.60 0.50 0.74 0.34 0.34

AU

(mg/dL)

0.30 0.76 0.58 0.04 0.54 0.64 0.38 0.64 0.26 0.74 0.36 0.28 0.01 0.34

c. BRC stadiul 4 p-value

Spearman

BRC std. 4

IL-6

TNFa

OPG

OC

OPN

FGF23

Dkk

CAL

FA

eGFR

PCR

Fbg

CRE

ALB

AU

IL-6

(pg/mL)

0.78 0.13 0.28 0.28 0.49 0.73 0.33 0.15 0.59 0.00 0.86 0.00 0.30 0.35

TNFa

(pg/mL)

0.78 0.02 0.16 0.01 0.19 0.06 0.53 0.11 0.19 0.20 0.14 0.24 0.74 0.21

OPG

(pg/mL)

0.13 0.02 0.29 0.05 0.26 0.93 0.93 0.03 0.53 0.05 0.86 0.30 0.50 0.97

OC

(pg/mL)

0.28 0.16 0.29 0.15 0.09 0.32 0.31 0.13 0.04 0.02 0.38 0.78 0.42 0.51

OPN

(pg/mL)

0.28 0.01 0.05 0.15 0.80 0.91 0.53 0.02 0.21 0.02 0.70 0.58 0.84 0.20

FGF23

(pg/mL)

0.49 0.19 0.26 0.09 0.80 0.33 0.83 0.36 0.11 0.42 0.01 0.43 0.88 0.46

Dkk-1

(pg/mL)

0.73 0.06 0.93 0.32 0.91 0.33 0.37 0.90 0.66 0.71 0.13 0.47 0.18 0.69

Calcitriol

(pg/mL)

0.33 0.53 0.93 0.31 0.53 0.83 0.37 0.34 0.87 0.99 0.88 0.20 1.00 0.34

Fetuina-A

(pg/mL)

0.15 0.11 0.03 0.13 0.02 0.36 0.90 0.34 0.86 0.04 0.66 0.33 0.49 0.67

eGFR 0.59 0.19 0.53 0.04 0.21 0.11 0.66 0.87 0.86 0.60 0.98 0.20 0.95 0.52

PCR

(mg/dL)

0.00 0.20 0.05 0.02 0.02 0.42 0.71 0.99 0.04 0.60 0.85 0.01 0.79 0.78

Fbg

(mg/dL)

0.86 0.14 0.86 0.38 0.70 0.01 0.13 0.88 0.66 0.98 0.85 0.78 0.46 0.69

CRE

(mg/dL)

0.00 0.24 0.30 0.78 0.58 0.43 0.47 0.20 0.33 0.20 0.01 0.78 0.55 0.34

ALB

(mg/mmol)

0.30 0.74 0.50 0.42 0.84 0.88 0.18 1.00 0.49 0.95 0.79 0.46 0.55 0.52

AU

(mg/dL)

0.35 0.21 0.97 0.51 0.20 0.46 0.69 0.34 0.67 0.52 0.78 0.69 0.34 0.52

Evaluarea interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei

de date STRING și selectarea unui panel de biomarkeri relevanți, utili în diagnosticarea

precoce, stadializarea și severitatea BRC

Având în vedere rezultatele obținute, pentru investigarea posibilelor interacțiuni dintre

moleculele analizate și markerii convenționali utilizați în mod curent în practica clinică pentru


24

diagnosticul BRC, a fost abordată baza de date STRING, care oferă analiza complexă a moleculelor

implicate în fiziopatologia BRC, printr-o abordare sistemică, prin integrarea tuturor informațiilor

existente; această bază oferă posibilitatea de a descoperi și de a obține o înțelegere aprofundată a

evenimentelor moleculare cheie care modulează patogeneza BRC. Existența corelațiilor

semnificative între markerii selectați și cei convenționali inflamatori de fază acută (Proteina C-

reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de rutină în clinică pentru

diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric și albuminurie), sugerează un potențial

ridicat al noilor biomarkeri în managementul pacientului renal.

Figura 8. Interacțiuni funcționale între moleculele selectate - mediatori inflamatori, markeri de

demineralizare osoasă, markeri convenționali, precum și alte molecule cu potențiale implicații în

fiziopatologia BRC. Legenda figurii: Nodurile colorate sunt reprezentate de proteine cu potențial

de a fi biomarker-candidat și primul „shell”/prima linie de interacțiuni. Liniile dintre proteine

reprezintă asocieri funcționale proteină-proteină, atribuite cu coduri diferite de culoare, astfel: linia

albastră indică interacțiunile cunoscute din bazele de date explorate, linia roz indică interacțiuni

cunoscute, care au fost determinate prin studii experimentale, linia verde indică interacțiuni asociate

alterărilor genetice, linia roșie indică interacțiuni previzionate pentru fuziunile genice, linia indigo

indică interacțiuni previzionate pentru coexpresii genice, linia verde deschis indică alte interacțiuni

derivate din documentări din literatura de specialitate, iar linia neagră indică coexpresia genică,

derivată din alte baze de date.

Abrevieri: CYP24A1 – calcitriol, 1,25-dihydroxyvitam D3, 1,25OH2D3; SPP1 – osteopontin, OPN;

TNFRSF11B – osteoprotegerin, OPG; BGLAP – osteocalcin, OC; CXCL8 – IL-8, interleukin-8; GC

– vitamin D binding protein, DBP; VDR – vitamin D receptor, ITGA2B – fibrinogen, CRP –

Proteina C-reactivă.


25

Concluzii

- Asocierea între intensitatea variației nivelulului de expresie a mediatorilor inflamației,

a moleculelor implicate în metabolismul mineral și osos și gradul de afectare a funcției renale

sugerează o interrelație funcțională complexă între aceste molecule.

- În urma rezultatelor obținute în cadrul acestor studii, precum și pe baza studiilor

menționate în literatura de specialitate, se poate concluziona că un panel de

biomarkeri/biomarker multiplu, nu doar un singur biomarker, este necesar pentru a

diagnostica BRC, cu o sensibilitate și o specificitate ridicate, cât și pentru a identifica

pacienții cu un risc ridicat de progresie a bolii.

- Evaluarea nivelului de expresie a biomarkerilor și a corelațiilor dintre aceștia în

diferite stadii ale BRC sugerează existența unor pattern-uri de expresie diferențiate în funcție

de gradul de severitate al bolii renale.

Biomarkerii semnificativi pot fi configurați astfel într-un panel mai larg, care să cuprindă

markeri asociați inflamatiei – IL-6, TNF-α și markeri asociați metabolismului mineral și osos

– calcitriol, Dkk-1, OPG, OPN, OC, FGF-23 și Fetuin-A


26

CONCLUZII FINALE

Datele obținute în cadrul acestei teze de doctorat au condus la următoarele concluzii:

- Screening-ul proteic pentru identificarea unor molecule cu expresie diferită în BRC

comparativ cu lotul control și realizat prin spectrometrie de masă de tip SELDI-TOF

MS, a identificat 78 de clustere (proteine) serice din care, pe baza puterii de clasificare

pentru pacienții în stadiile 2-4 de boală, s-au selectat 5 clustere semnificative

(intervalul de masă moleculară 20.000 – 40.000 Da, valori ROC cuprinse între 0,83-

0,89). Prin coroborarea datelor obținute prin SELDI-ToF MS cu bazele de date

UniProt, ExPASy și cu literatura de specialitate, s-au selectat molecule implicate în

procesul inflamator și în metabolismul mineral și osos, procese care stau la baza

fiziopatologiei BRC.

- Evaluarea profilului inflamator și a markerilor asociați metabolismlui mineral și osos

în BRC (tehnologia Luminex xMAP array și metoda ELISA) a indicat corelații

pozitive, semnificative statistic, între IL-6, FGF-23, TNF-α, OCN, OPN, Fetuin-A și

gradul de disfuncție renală (eGFR) în grupul de pacienți cu BRC stadiile 2-4, aceste

molecule având un potențial important în stabilirea gradului de severitate a bolii -

corelații între eGFR și IL-6 (χ2= 16,8; P< 0.01), precum și între eGFR și FGF-23

(χ2=19,9; P<0,001; între eGFR și TNF-α (χ2=4,02; P=0,04), OPN (χ

2=4,2; P=0,04),

OCN (χ2=6,2; P=0,01) și Fetuin-A (χ

2=3,08; P=0,07).

- Screening-ul proteomic de tip dot-blot Proteome Profiler pentru 105 molecule

(citokine, chemokine, alte proteine solubile) pe pool-uri de seruri corespunzând

stadiilor 2, 3 și 4 de BRC, respectiv control, a identificat IL-6, IL-8, IL-12, IL-18,

IFN-Ɣ, RANTES, RAGE, ICAM-1, IP-10, PAI-1, PDGF și Proteina-C reactivă, ca

mediatori ai răspunsului inflamator în BRC.

- Dkk-1 și vitamina D (BP – binding protein) au prezentat, la screening-ul proteomic de

tip dot-blot Proteome Profiler, cel mai mare potențial de diferențiere la pacienții cu

BRC stadiul 4 versus control, având cea mai semnificativă scădere a nivelului seric (de

~1,5 ori, p <0,05), cu potențial în stabilirea gradului de severitate al bolii.

- Cuantificarea prin metoda ELISA a moleculelor Dkk-1 și calcitriol, a relevat o scădere

semnificativă a nivelului seric al acestora, pe măsura agravării BRC. Astfel, în BRC

stadiul 4 s-a înregistrat o scădere de 2,36 ori față de control (p<0,05) pentru Dkk-1,

respectiv 2,24 ori (p<0,05) pentru calcitriol.


27

- Aplicarea testului de analiză unidirecțională a varianței Kruskal-Wallis (Kruskal–Wallis one-

way analysis of variance) pentru evaluarea nivelului de expresie serică a moleculelor

analizate în functie de stadiile 2, 3 si 4 de BRC, a relevat diferențe semnificative în expresia

circulantă a Dkk-1, calcitriol și eGFR la pacienții cu BRC (P <0,0001); nivelul Dkk-1,

calcitriol și eGFR au fost semnificativ diferite între stadiile 2, 3 și 4 ale BRC (P <0,0001),

evidențiind potențialul acestor doi markeri în stadializarea și evaluarea severității bolii.

- Cuantificarea prin Luminex xMAP a moleculelor relevante pentru BRC (IL-6, TNF-α,

OPG, OPN, OCN, FGF-23) a indicat o creștere progresivă a nivelului seric a acestora,

începând cu stadiile incipiente ale bolii; astfel, în lotul de pacienți cu BRC stadiul 4, nivelul

circulator al acestor 6 molecule au prezentat cele mai semnificative diferențe în comparație

cu lotul control analizat (p<0,05).

- Analiza tendinței de variație a expresiei serice a markerilor analizați, prin aplicarea testelor

Chi-square test for trends și Chi-square/ χ2-test, a relevat corelații semnificative în funcție

de stadiul BRC, astfel:

- în BRC stadiul 4, a fost observată o corelație pozitivă puternică între Dkk-1 și

calcitriol, precum și o corelație semnificativ statistică negativă între Dkk-1 și

moleculele IL-6, OPG, OC, OPN și FGF-23 (P <0,001). În ceea ce privește gradul de

alterare a funcției renale, eGFR a fost corelat pozitiv cu Dkk-1 (P <0,001). Nivelul seric

al calcitriolului a fost corelat în mod semnificativ cu TNF-α (P <0,01, Chi-square test),

precum și cu markerii metabolismului mineral și osos - OC, OPN și FGF-23(P <0,01,

Chi-square test).

- în BRC stadiile 2 și 3, au fost obținute corelații semnificative, după cum urmează:

Dkk-1 și calcitriol în BRC stadiile 3 și 2 (P <0,001, Chi-square test for trends); Dkk-1 și

OPG, OPN și FGF-23 (P <0,001, Chi-square test for trends) în BRC stadiile 3 și 2;

calcitriol și TNF-α (P <0,01, Chi-square test for trends) în BRC stadiul 3; Dkk-1 și

OPG, FGF-23 în BRC stadiul 2 (P <0,001, Chi-square test for trends).

- Aplicarea testelor de corelație Spearman (r, p-value), pentru identificarea de potențiale

corelații cu semnificație statistică între moleculele analizate, pentru loturile de pacienți aflați

în diversele stadii de BRC, a relevat:

- în BRC stadiul 4, corelații semnificative au fost obținute între TNF-α și Dkk-1 (r =

0,50, p <0,05), OPG (r = 0,58, p <0,02) și OPN (r = 0,66, p = 0,01), precum și între

OPG și OPN (r = 0,51, p <0,05).

- în BRC stadiul 3, au fost evidențiate corelații între TNF-α și OPG (r = 0,6, p = 0,001),

FGF-23 (r = 0,57, p <0,01).


28

- în BRC stadiul 2, a fost stabilită o corelație negativă puternică între Dkk-1 și FGF-23

(r = −0,84, p <0,001), corelații moderate între calcitriol și IL-6 (r = 0,53, p <0,05),

TNFα (r = 0,58, p <0,05), OPG (r = 0,71, p <0,05) și FGF-23 (r = 0,52 , p <0,05), o

corelație moderată între IL-6 și OPG (r = 0,61, p = 0,01).

- Investigarea corelațiilor dintre moleculele analizate și markerii convenționali inflamatori de

fază acută (Proteina C-reactivă și fibrinogen), precum și parametrii biochimici efectuați de

rutină în clinică pentru diagnosticarea BRC (creatinină serică, eGFR, acid uric seric,

albuminurie), prin aplicarea testelor de corelație Spearman (r, p-value) a relevat:

- în BRC stadiul 4, corelații puternice au fost stabilite între IL-6 și PCR (r=0,74,

p=0,001), precum și între IL-6 și creatinina serică (r=0,87, p<0,001). Corelații

moderate au fost stabilite între OPN și PCR (r=0,60, p=0,02), precum și între PCR

și creatinină (r=0,47, p=0,01).

- în BRC stadiul 3, a fost stabilit un grad de asociere acceptabil între IL-6 și PCR

(r=0,55, p=0,08), între OPG și creatinină (r=0,43, p=0,02), între OC și acidul uric

(r=0,44, p=0,04), între OPN și fibrinogen (r=0,37, p=0,06).

- în BRC stadiul 2, corelații puternice au fost stabilite între IL-6 și fibrinogen

(r=0,97, p<0,01), IL-6 și creatinină (r=0,94, p<0,01), PCR și fibrinogen (r=0,94,

p=0,16), creatinină (r=0,94, p=0,16), albuminurie (r=0,86, p=0,66) și acidul uric

seric (r=0,86, p=0,66). O corelație puternică a fost stabilită între fibrinogen și

creatinină (r=0,90, p<0,01). De asemenea, un grad de asociere foarte bun a fost

stabilit între IL-6 și PCR (r=0,94, p=0,16), între OPG și PCR (r=0,94, p=0,16),

precum și între eGFR și PCR (r=-0,94, p=0,16). Aceste corelații sugerează

potențiale modulări reciproce, cu impact în progresia și gradul de severitate al

bolii renale.

- Analiza interrelațiilor funcționale dintre moleculele analizate, prin abordarea bazei de date

STRING, a indicat o interconexiune complexă între markerii selectați, cei convenționali de

fază acută și parametrii biochimici efectuați în clinica curentă, sugerând implicarea acestora

în fiziopatologia complexă a BRC și un potențial ridicat al acestor biomarkeri în conturarea

de pattern-uri de expresie diferențiată în funcție de gradul de severitate al bolii renale.

- Biomarkerii care au prezentat diferențe semnificative statistic, atât în lotul de pacienți cu

BRC versus control, cât și între loturile aparținând stadiilor diferite de boală renală, pot fi

configurați într-un panel care cuprinde mediatori ai inflamației – IL-6, TNF-α și biomarkeri

asociați metabolismului mineral și osos – calcitriol, Dkk-1, OPG, OPN, OC, FGF-23 și

Fetuin-A.


29

Bibliografie selectivă

2020. Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for

the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet, 395, 709-733.

Abraham, A. G., Darilay, A., Mckay, H., Margolick, J. B., Estrella, M. M., Palella, F. J., Jr., Bolan, R.,

Rinaldo, C. R. & Jacobson, L. P. (2015) Kidney Dysfunction and Markers of Inflammation in the

Multicenter AIDS Cohort Study. J Infect Dis, 212, 1100-10.

Aikawa, E., Aikawa, M., Libby, P., Figueiredo, J. L., Rusanescu, G., Iwamoto, Y., Fukuda, D., Kohler, R. H.,

Shi, G. P., Jaffer, F. A. & Weissleder, R. (2009) Arterial and aortic valve calcification abolished by

elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation, 119, 1785-94.

Chung, A. C. K. & Lan, H. Y. (2011) Chemokines in Renal Injury. Journal of the American Society of

Nephrology, 22, 802-809.

Dregan, A., Charlton, J., Chowienczyk, P. & Gulliford, M. C. (2014) Chronic inflammatory disorders and risk

of type 2 diabetes mellitus, coronary heart disease, and stroke: a population-based cohort study.

Circulation, 130, 837-44.

Fukagawa, M. & Komaba, H. (2017) Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder in Asia. Kidney

Dis (Basel), 3, 1-7.

Gounden, V., Bhatt, H. & Jialal, I. (2020) Renal Function Tests. StatPearls. Treasure Island (FL).

Guarner, V. & Rubio-Ruiz, M. E. (2015) Low-grade systemic inflammation connects aging, metabolic

syndrome and cardiovascular disease. Interdiscip Top Gerontol, 40, 99-106.

Hénaut, L., Sanchez-Nino, M. D., Aldamiz-Echevarría Castillo, G., Sanz, A. B. & Ortiz, A. (2015) Targeting

local vascular and systemic consequences of inflammation on vascular and cardiac valve

calcification. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 20, 89-105.

Inker, L. A., Astor, B. C., Fox, C. H., Isakova, T., Lash, J. P., Peralta, C. A., Kurella Tamura, M. & Feldman,

H. I. (2014) KDOQI US Commentary on the 2012 KDIGO Clinical Practice Guideline for the

Evaluation and Management of CKD. American Journal of Kidney Diseases, 63, 713-735.

Isakova, T., Nickolas, T. L., Denburg, M., Yarlagadda, S., Weiner, D. E., Gutierrez, O. M., Bansal, V., Rosas,

S. E., Nigwekar, S., Yee, J. & Kramer, H. (2017) KDOQI US Commentary on the 2017 KDIGO

Clinical Practice Guideline Update for the Diagnosis, Evaluation, Prevention, and Treatment of

Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD). Am J Kidney Dis, 70, 737-751.

Lei, Y., Devarapu, S. K., Motrapu, M., Cohen, C. D., Lindenmeyer, M. T., Moll, S., Kumar, S. V. & Anders,

H.-J. (2019) Interleukin-1β Inhibition for Chronic Kidney Disease in Obese Mice With Type 2

Diabetes. Frontiers in Immunology, 10.

Mihai, S., Codrici, E., Popescu, I. D., Enciu, A. M., Albulescu, L., Necula, L. G., Mambet, C., Anton, G. &

Tanase, C. (2018) Inflammation-Related Mechanisms in Chronic Kidney Disease Prediction,

Progression, and Outcome. J Immunol Res, 2018, 2180373.

Mihai, S., Codrici, E., Popescu, I. D., Enciu, A. M., Rusu, E., Zilisteanu, D., Albulescu, R., Anton, G. &

Tanase, C. (2016) Proteomic Biomarkers Panel: New Insights in Chronic Kidney Disease. Dis

Markers, 2016, 3185232.

Pawelec, G., Goldeck, D. & Derhovanessian, E. (2014) Inflammation, ageing and chronic disease. Curr Opin

Immunol, 29, 23-8.

Pejchinovski, M. & Mischak, H. (2017) Clinical Proteomics in Kidney Disease: From Discovery to Clinical

Application. Prilozi, 38, 39-54.

Spoto, B., Leonardis, D., Parlongo, R. M., Pizzini, P., Pisano, A., Cutrupi, S., Testa, A., Tripepi, G., Zoccali, C.

& Mallamaci, F. (2012) Plasma cytokines, glomerular filtration rate and adipose tissue cytokines

gene expression in chronic kidney disease (CKD) patients. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 22, 981-8.

Yilmaz, M. I., Solak, Y., Saglam, M., Cayci, T., Acikel, C., Unal, H. U., Eyileten, T., Oguz, Y., Sari, S.,

Carrero, J. J., Stenvinkel, P., Covic, A. & Kanbay, M. (2014) The relationship between IL-10 levels

and cardiovascular events in patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol, 9, 1207-16.


30

LISTA DE LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE PUBLICATE

(selecție)

LUCRĂRI PUBLICATE PE TEMATICA TEZEI

Articole publicate în jurnale ISI:

1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Rusu E, Zilisteanu D, Necula LG, Anton

G, Tanase C, Inflammation-Related Patterns in the Clinical Staging and Severity

Assessment of Chronic Kidney Disease, Disease Markers; Article ID:1814304, 2019,

doi: 10.1155/2019/1814304, IF=2,738 (Research Article).

- Articol premiat UEFISCDI - Premierea rezultatelor cercetării PN-III-P1-1.1-

PRECISI-2019- 39736.

2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM , Rusu E, Zilisteanu D, Albulescu R,

Anton G, Tanase C, Proteomic Biomarkers Panel: New Insights in Chronic Kidney

Disease, Disease Markers, Article ID 3185232, 2016, doi.org/10.1155/2016/3185232,

IF=2,738 (Research Article).


PRECISI-2016-12780.

3. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Necula LG, Mambet C,

Anton G, and Tanase C, Inflammation-Related Mechanisms in Chronic Kidney

Disease Prediction, Progression, and Outcome, Journal of Immunology Research, ID

2180373, 2018, doi: 10.1155/2018/2180373, IF= 3,327 (Review Article).


PRECISI-2018- 27561.

Capitol de carte:

1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Necula LG, Anton G, and Tanase

C, Inflammation and Chronic Kidney Disease: Current Approaches and Recent

Advances, Chronic Kidney Disease - from Pathophysiology to Clinical

Improvements, IntechOpen, Chapter 6131-151, ISBN 978-953-51-3844-0, 2018

(Book Chapter).

Studii/rezumate în jurnale ISI:

1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Albulescu R, Anton G, Adi

Lupu M, Tanase C, Cytokine Patterns in Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone

Disorders, FEBS Open Bio, Volume: 9, Pages: 407-40, Supplement: 1 Meeting

Abstract: P-39-016, Published: JUL 2019.

2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Codorean E, Rusu E,

Zilisteanu D, Anton G, Tanase C, Protein profiling in chronic kidney disease assessed

https://doi.org/10.1155/2016/3185232

http://apps.webofknowledge.com.ezproxy.umf.ro/full_record.do?product=WOS&search_mode=AuthorFinder&qid=5&SID=C2ewJ4UWCBSmYCY8YWQ&page=1&doc=1

http://apps.webofknowledge.com.ezproxy.umf.ro/full_record.do?product=WOS&search_mode=AuthorFinder&qid=5&SID=C2ewJ4UWCBSmYCY8YWQ&page=1&doc=1

javascript:;


31

by high-throughput technologies, The FEBS Journal 284 (Suppl. 1) 135,

doi:10.1111/febs.14174, 2017.

3. Rusu EE, Rosca M, Calin A, Mihai S, Atasie T, Balanica S, Neatu A, Zilisteanu D,

Serum fetuin-A and osteoprotegerin are correlated with left atrial size and function

in patients with chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation,

2016/5/1, IF=4.085, Vol 31, suppl 1, i436-i436, Oxford University Press.

4. Rusu EE, Zilisteanu DS, Atasie T, Rosca M, Calin A, Mihai S, Balanica S,

Voiculescu M, Correlates of osteoprotegerin and association with cardiovascular

status in patients with chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation

2015/5/1, IF=4.085, Vol 30, suppl. 3, iii489-iii489.

5. Mihai S, Rusu E, Zilisteanu D, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R,

Voiculescu M, Anton G, Tanase C, Proteomics and metabolomics in early diagnosis

and monitoring of patients with chronic kidney disease, FEBS Journal,

IF=4,001, 2015, 282 (Suppl.1): 56–408: 196.

6. Mihai S, Rusu E, Codrici E, Popescu ID, Nita AI, Voiculescu M, Tanase C,

Circulating biomarkers assessment for early diagnosis of vascular calcification in

chronic kidney disease, FEBS Journal, IF=4,001; 2014, 281 (Suppl.1): 65–783: 107.

7. Rusu E, Zilisteanu D, Atasie T, Circiumaru A, Carstea F, Ecobici M, Rosca M,

Tanase C, Mihai S, Voiculescu M, Serum osteoprotegerin is a predictor of diastolic

dysfunction and vascular stiffness in chronic kidney disease patients, Oxford Univ

Press, IF=4.085,117-117, vol. 29, 2014.

8. Zilisteanu D, Rusu E, Atasie T, Ecobici M, Circiumaru A, Carstea F, Rosca M,

Tanase C, Mihai S, Voiculescu M, Fibroblast growth factor 23 correlates with aortic

valve calcifications and non-dipper status in chronic kidney disease patients, Oxford

Univ Press, IF=4.085, 119-119, vol. 19, 2014.

Studii/rezumate în jurnale ISSN/ ISBN:

1. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Luntraru CM, Anton G, Tanase

C, Inflammation-related patterns in chronic kidney disease assessment, A 48-a Conferință

Anuală de Imunologie, pg 60, 2019.

2. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Anton G, Tanase C, Advances

in CKD Early Detection Using Proteomic Technologies, 13 edition – Academician

Nicolae Cajal Symposium of the Romanian Medical Sciences Academy, Romania, 2018.

3. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu L, Albulescu R, Codorean E,

Tanase C, Gut microbiota-renal axis: exploration of novel therapeutic avenues in renal

diseases, The 11th National Pathology Symposium, Annual Scientific Meeting of Victor

Babes Institute, 22-24 noiembrie 2018, ISSN 2601-0771.

4. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Rusu E, Zilisteanu D, Albulescu R,

Voiculescu M, Radu I, Anton G, Tanase C, Proteomic study - a useful tool in chronic

kidney disease treatment, Journal of Translational Medicine and Research, Vol 21

(Supplement I), ISSN, 2392-7232, S67, 2016.


32

5. Mihai S, Zilisteanu D, Codrici E, Popescu ID, Enciu AM, Albulescu R, Voiculescu M,

Anton G, Tanase C, Lopazan N, Abordări proteomice în managementul bolii renale

cronice, Sesiunea anuală a Institutului “Victor Babeş”, Al 8-lea Simpozion Naţional de

Patologie Medicina de Precizie – de la modele experimentale la biomarkeri, 2015, pg. 91

ISBN 978-973-708-862-8.

6. Mihai S, Codrici E, Popescu ID, Tanase C, Albulescu R, Nita A, Rusu E, Voiculescu

M, Vascular calcification in chronic kidney disease - proteomic challenges, New Trends

on Sensing - Monitoring- Telediagnosis for Life Sciences, Brasov, 2014, pg. 124, ISBN

978-973-131-280-4.

PROVOCĂRI ÎN DIAGNOSTICUL PRECOCE IVN...REZUMAT Conducător ştiinţific: CS I Dr. Gabriela ANTON...

Documents

Transcript of PROVOCĂRI ÎN DIAGNOSTICUL PRECOCE IVN...REZUMAT Conducător ştiinţific: CS I Dr. Gabriela ANTON...