Proiect stiinţific de cercetare

Titlul proiectului: “Contribuţii în sinteza şi caracterizarea de noi vectori coloidali ce au în componenţă Bifosfonaţi”

1

Expunerea problemei Bifosfonaţii sunt analogi sintetici ai pirofosfatului folosiţi în

tratamentul osteoporozei datorită capacităţii lor de a inhiba resorbţia osoasă .

Datorită proprietăţilor fizico-chimice (solubilitate mărită în apă, sarcină puternic negativă), acest grup de compuşi are aplicabilitate preponderent intravenoasă.

Tratamentul pe calea orală nu este foarte eficient,

bifosfonaţii având o biodisponibilite scăzută caracterizată prin absorbţie scăzută şi eliminare renală rapidă.

Se pune problema cum se poate produce o îmbunătăţire a proprietăţilor farmacocinetice şi implicit a eficacităţii administrării orale.

2

Prezentarea generală a proiectului

Scopul lucrării - formularea şi caracterizarea de noi vectori

coloidali care să încorporeze bifosfonaţi în vederea creşterii biodisponibilităţii orale a substanţei active.

S-au formulat in acest sens 2 tipuri de lipozomi, folosind ca material pentru stratul lipidic fie numai fosfatidilcolină , fie amestec fosfatidilcolină- colesterol într-un raport bine definit.

Lipozomii preparaţi au fost caracterizaţi dpdv al stabilităţii în timp, al conţinutului în substanţă activă înglobată , pentru a li se putea evalua apoi computaţional eficacitatea teoretică a noilor compuşi.

3

Principalele aspecte analizate în timpul cercetării :

1. Formularea a 2 tipuri de lipozomi conţinând Alendronat şi

Clodronat (bifosfonaţii luaţi în studiu) folosind ca materiale pentru stratul lipidic fosfatidilcolina şi colesterolul

2. Examinarea microscopică a noilor formulări 3. Evaluarea capacităţii de încapsulare a substanţei active în

lipozomi şi stabilirea eficacităţii formulărilor prin compararea cantităţii înglobate din fiecare substanţă activă din cele două tipuri de lipozomi

4. Modelarea moleculară a celor 2 substanţe active şi predicţii teoretice privind comportamentul in vitro comparativ cu restul membrilor clasei de bifosfonaţi

5. Studiul stabilităţii şi rezistenţei compuşilor activi imediat după preparare şi pe parcursul a 3 luni de stocare

4

Variabile

Variabile controlate: temperatură, umiditate, lumină, solvenţii şi

reactivii utilizaţi, aparatura de laborator Variabile independente: raportul masic de fosfatidilcolină –

colesterol, gradul de rigiditate (prin cantitatea de colesterol adăugată), gradul de mărime al particulelor de lipozomi (prin durata de sonicare)

Variabile dependente: determinarea spectrofotometrică a

conţinutului în substanţă activă; stabilitatea formulărilor prin DLS; capacitatea de încapsulare prin compararea graficelor obţinute

5

Ipoteza de lucru

Categoria de medicamente a Bifosfonaţilor are o eficacitate terapeutică mai bună la administrare orală dacă substanţa activă este înglobată în Lipozomi.

6

Materiale şi metode

Alendronat şi Clodronat Apă distilată Fosfatidilcolină (PC) Colesterol (Ch) Cloroform Soluţie 1.5mmol/L de Cu (II) (NO3)2 *3 H2O/HNO3

folosită ca agent complexant Pipete, flacoane de 10-15ml Coloane de separare Supelclean, filtre de ultracentrifugare Agitator, microscop, spectrofotometru, centrifugă, aparat

Zeta sizer, calculator

7

Materiale şi metode

a. Formularea lipozomilor: Am preparat 5ml de lipozomi care conţin substanţă activă şi

lipid PC sau amestec PC-Ch în raport molar de 1:4. Pentru tipul de lipozomi cu amestec de lipide, raportul folosit a

fost PC-Ch de 19:1. Am folosit 2ml de cloroform pentru dizolvarea lipidului şi 5ml

de apă distilată încălzită la aprox. 60 grade pentru a desprinde filmul lipidic de pe pereţii flaconului şi a se forma particulele de lipozomi.

8

Materiale şi metode b.Evaluarea stabilităţii şi rigidităţii moleculelor de lipozomi

sintetizate prin tehnica DLS Probele, pregătite anterior pentru test, au fost analizate cu

aparatul ZetaSizer. Iniţial, monodispersia lipozomală s-a prezentat sub forma unei

singure populaţii, aparatul înregistrând o dimensiune medie a lipozomilor.

S-au făcut determinări pe parcursul celor 3 luni de stocare, ultimele date furnizând o mică diferenţă a distribuţiei dimensiunilor, ca urmare a aglomerării particulelor sub forma a 2 populaţii.

9

Materiale şi metode c. Analiza capacităţii de încapsulare a noilor formulări cu

bifosfonaţi determinarea spectrofotometrică indirectă a

substanţei active, după separarea prealabilă a lipozomilor cu ajutorul coloanelor Supelclean şi a filtrelor de ultracentrifugare Millipore.

Materiale folosite: soluţie de lipozomi separaţi, apă distilată, agent complexant sol. 1,5 mmol/L de Cu (II) (NO3)2 *3 H2O/HNO3

Principiul metodei: Capacitatea bifosfonaţilor de a forma complecşi cu Cu(II) ce determină o absorbanţă specifică în UV/Viz la lungimea de undă λ=234nm (alendronat) şi λ=235nm (clodronat).

10

Rezultate şi discuţii Noii compuşi sintetizaţi au o dimensiune bună, putând fi observaţi

cu ajutorul microscopului optic la gradul de mărime100x.

Lipozomi cu Alendronat Lipozomi cu Clodronat

11

Înregistrarea aparatului imediat după preparare, prezenţa unei singure populaţii

Înregistrarea aparatului după 3 luni de stocare, prezenţa a două populaţii

Studiul stabilităţii şi al rigidităţii particulelor lipozomale

12

Studiul stabilităţii şi al rigidităţii particulelor lipozomale

Aparatul a detectat mici schimbări în distribuţia dimensiunilor şi s-a dovedit că starea iniţială de monodispersie a particulelor poate fi inversată prin simplă sonicare.

Particulele nu pierd substanţa activă din cauza rigidităţii dată de componentele straturilor lipidice (mai ales din cauza colesterolului).

Cu asemenea proprietăţi, aceşti transportori de medicamente pot circula o lungă perioadă de timp în sânge până când vor găsi organ ţintă.

13

Determinarea capacităţii de încapsulare a Clodronatului în lipozomi

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

200 250 300 350 400

Blank Cu(II)

Blank sample Lip PC

Blank sample Lip PC-Ch

Clodr-Cu(II) complex Lip PC

Clodr - Cu(II) complex Lip PC-Ch Blank Lip PC difference

Blank Lip PC-Ch difference

Clod-Cu(II) complx Lip PC difference Clod-Cu(II) compl Lip PC-Ch difference

Quantitative determination of the Clodronate incorporated in colloidal vectors

14

Determinarea capacităţii de încapsulare a Alendronatului în lipozomi

y = 3.4887x + 0.1628R2 = 0.9964

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Alendronate concentration (mg/ml)

Abso

rban

ce

15

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

Encapsulation capacity (%) of the 2 types of liposomes

Clodronatul s-a dovedit a fi o substanţă mai eficientă decât Alendronatul în ceea ce priveste capacitatea de a fi încorporat în lipozomi.

16

Modelare moleculară

Au fost calculate predicţii despre comportamentul in vivo: pH-ul, solubilitatea, coeficientul de distribuţie,

permeabilitatea , biodisponibilitatea şi concentraţia plasmatică.

Conform informaţiilor furnizate şi pe baza sistemelor de clasificare biofarmaceutică, Bifosfonaţii fac parte din clasa a III-a de medicamente cu permeabilitate scăzută şi solubilitate mare.

Predicţiile teoretice ne-au ajutat să înţelegem necesitatea de a crea o formulă nouă, rigidă şi stabilă, următorul pas fiind obţinerea unui produs cu eficacitate terapeutică superioară.

17

Concluzii

Formulările obţinute au dimensiuni de ordinul nano, sunt rigide şi stabile în timp.

Alendronatul şi Clodronatul înglobaţi în lipozomi s-au dovedit a avea o absorbţie teoretică mai mare decât produsele existente.

Lipozomii sunt sisteme de transport al substanţelor active , care eliberează substanţa activă la locul ţintă prin interacţiunea lor cu membranele biologice. Din acest motiv, nu a fost posibilă determinea profilului de cedare in vitro.

Folosind programe de simulare, se doreşte corelarea rezultatelor

experimentale cu cele teoretice şi îmbunătăţirea formulărlor existente.

18

Bibliografie selectivă

Application of UV-derivative spectrophotometry for determination of some bisphosphonates drugs in pharmaceutical formulations, Koba Marcin, Koba Katarzyna and Przyborowski Lech, Acta Poloniae Pharmaceutica - Drug Research, Vol. 65 No. 3, Pages 289-294 (2008)

www.avantilipids.com- Liposome preparation

Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes), Szoka Jr.F., Papahadjopoulos D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 , Pages 467-508 (1980)

Dynamic Light Scattering, Berne B.J.; Pecora R. , Wiley: New York, (1976)

Liposomes as drug carrier systems. Preparation, classification and therapeutic advantages of liposomes, Budai M., Szogyi M. (2001)

Management of osteoporosis in postmenopausal women: 2010 position statement of The North American Menopause Society. Menopause, Volume 17, Issue 1, Pages 25-54 (Jan.- Febr. 2010)

The relationship between the chemistry and biological activity of the bisphosphonates, Frank H. Ebetino, Anne-Marie L. Hogan , Shuting Sun, Volume 49, Issue 1, Pages 20–33 (July 2011)

19