Proiect 41-013/2007: · Web viewJonctiunile stranse, formate din complexe proteice ale caror...

Proiect 41-013/2007:EXPRESIA SI FUNCTIA PROTEINELOR JONCTIUNILOR STRANSE - STUDIU IN MODELE EXPERIMENTALE SI LA PACIENTII CU DEMENTA (DEMENTJUNCTION)

Program: Parteneriate in Domeniile Prioritare

Domeniul: 4 – Sanatate

Autoritatea contractanta: Centrul National de Management Programe (CNMP)

Durata: 2007-2010

Bugetul proiectului: 1.045.359 lei (de la Bugetul de stat)

Coordonator: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in Domeniul Patologiei si Stiintelor Biomedicale “Victor Babes”

Splaiul Independentei 99-101, Sector 5,050096 Bucuresti, ROMANIATel. +40-21-319.27.32; 319.45.28; 319.45.30; 319.27.34; Fax.: +40-21-319.45.28; 319.27.34; E-mail: [email protected]

Director de Proiect: Dr. Bogdan Ovidiu POPESCU, CS I, Sectia Biologie, Laboratorul de Medicina Moleculara, INCD Victor BabesTel.: 021-319.4528, e-mail: [email protected] ; [email protected]

Parteneri:P1 - Centrul International de Biodinamica - Dr. Dana Cucu, CS IIP2 - Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti - Prof. Dr. Ovidiu Alexandru Bajenaru

Rezumatul proiectului:

Dementele se afla printre cele mai frecvente afectiuni ale populatiei varstnice si se caracterizeaza

printr-un declin general cognitiv si biologic, insotit de scaderea calitatii vietii pacientilor si familiilor

acestora. Dementele nu beneficiaza in prezent decat de un tratament simptomatic, avand un curs evolutiv

inexorabil si ducand in final la deces. Proiectul de fata isi propune sa aduca date noi relevante pentru

mecanismele patogenice ale dementelor (degenerative si vasculare), care ar putea constitui baza

MINISTERUL SANATATII

INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE IN DOMENIUL PATOLOGIEI

SI STIINTELOR BIOMEDICALE

“VICTOR BABES”

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

dezvoltarii unor noi strategii terapeutice. Bariera hemato-encefalica este o structura unica la nivelul

organismului uman, cu inalta selectivitate si cu o reglare speciala si care sufera alterari semnificative atat

in boala Alzheimer cat si in dementa vasculara. Jonctiunile stranse, formate din complexe proteice ale

caror functii nu sunt decat partial cunoscute, reprezinta cheia integritatii barierei hemato-encefalice, de

care depinde functionarea normala a sistemului nervos central. In acest proiect ne propunem descrierea

expresiei proteinelor constitutive ale jonctiunilor stranse la nivelul sistemului nervos central comparativ cu

alte tesuturi si studiul functiei acestora in modele adecvate experimentale, in conditii fiziologice si

patologice.

Pentru atingerea acestor scopuri, in proiect propunem un parteneriat care asigura atat accesul la

pacienti cat si crearea de modele experimentale si analiza produselor biologice umane in laboratoare cu

experienta in domeniul neurostiintelor si respectiv in studii morfologice si functionale la nivel celular si

molecular. Producerea acestor date stiintifice poate genera un impact atat asupra cunoasterii

fiziopatologiei dementei cat si asupra modului in care medicamentele pot traversa bariera

hematoencefalica pentru a ajunge in sistemul nervos central.

Obiectivele generale si specifice ale proiectului:Obiectivele generale ale proiectului sunt: studiul expresiei proteinelor jonctiunilor stranse in

creierul pacientilor cu dementa Alzheimer si dementa vasculara, explorarea prezentei acestor proteine in

serul si lichidul cefalorahidian la pacienti diagnosticati cu dementa, elaborarea de modele experimentale

adecvate pentru studiul reglarii expresiei acestor proteine si elaborarea de modele experimentale adecvate

pentru impactul expresiei acestor proteine asupra transportului paracelular al solutilor.

Obiectivele s tiintifice specifice ale proiectului sunt:

- in 2007-2008:

1. Examinarea expresiei proteinelor specifice jonctiunilor stranse (ocludina, claudine, ZO 1-3) in neuroni.

Prin acest obiectiv am urmarit evaluarea expresiei ocludinei si claudinelor in tesutul cerebral al pacientilor

cu boala Alzheimer si dementa vasculara.

2. Dezvoltarea si adaptarea de culturi celulare pentru studiul proteinelor specifice jonctiunilor stranse

Prin acest obiectiv ne-am propus investigarea expresiei claudinelor si ocludinei in celule MDCK I, II-C7,-

C11, SH SY5Y si caracterizarea din punct de vedere al localizarii/colocalizarii acestor proteine, precum si

studiul permeabilitatii paracelulare prin metoda TINS.

- in 2009:

3. Examinarea efectului peptidului beta-amiloid asupra jonctiunilor stranse. Acest obiectiv a presupus

obtinerea de date prin studiul modificarilor permeabilitatii paracelulare sub actiunea peptidului beta-

amiloid, prin studiul clinic privind incidenta hipercolesterolemiei in demente, precum si prin investigarea

expresiei claudinelor si ocludinei in culturi celulare tratate cu beta-amiloid prin metode moleculare.

Beta amiloidul (A beta) este o peptida alcatuita din 39-43 de aminoacizi, cu mare potential de

agregare, si este principalul constitutent al placilor amiloide existente in creierul pacientilor cu boala

Alzheimer. A beta deriva prin proteoliza seriata din proteina precursoare a amiloidului (APP), care este o

proteina integrala a carei functie nu este clar cunoscuta (Popescu and Ankarcrona, 2004). Studii anterioare

(Marco and Skaper, 2006) au dovedit ca beta-amiloidul altereaza distributia proteinelor din jonctiunile

stranse de la nivelul celulelor endoteliale din capilarele cortexului cerebral. Aceste date sugereaza

disfunctia barierei hemato-encefalice in boala Alzheimer.

4. Investigarea factorilor de risc vasculari si a dislipidemiei la pacienti cu dementa. Prin acest obiectiv

ne-am propus studiul modificarii parametrilor electrici/rezistenta transepiteliala sub actiunea beta-

amiloidului, studiul clinic privind incidenta hipercolesterolemiei in demente, precum si evaluarea

rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii.

- in 2010:

5. Identificarea de proteine ale jonctiunilor stranse in probe biologice ale pacientilor cu dementa si

investigarea efectelor beta-amiloidului asupra fluiditatii membranare; rolul colesterolului. Prin acest

obiectiv ne-am propus sa efectuam un studiu al fluiditatii membranare prin microscopie de fluorescenta

(TIRF), sa obtinem date privind parametrii electrici in celule cu continutul de colesterol modificat, sa

recoltam probe biologice de la pacienti cu dementa si de la lotul de control pentru analiza expresiei de

proteine ale jonctiunilor stranse.

Protocolul de lucru (vezi extrasul din Planul de activitati)

Extras din PLANUL DE REALIZARE A PROIECTULUIEXPRESIA SI FUNCTIA PROTEINELOR JONCTIUNILOR STRANSE - STUDIU IN MODELE EXPERIMENTALE SI LA

PACIENTII CU DEMENTA

Anul Etape/ Activitati Organizatia executanta

Termene Rezultate/Documente de prezentare a

rezultatelor

2008

Etapa IExaminarea expresiei proteinelor specifice jonctiunilor stranse in creier

CO. 18.04.2008 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.I.1Evaluarea expresiei claudinelor in tesutul cerebral al pacientilor cu boala Alzheimer si dementa vasculara

CO. Determinarea tipurilor de celule care exprima claudine in niveluri decelabile/ Raportde cercetare (etapa)

Etapa IIDezvoltarea si adaptarea de culturi celulare pentru studiul proteinelor specifice jonctiunilor stranse

CO, P1 18.10.2008 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.II.1Investigarea expresiei claudinelor si ocludinei in celule MDCK I, II-C7,-C11, SH SY5Y si caracterizarea din punct de vedere al localizarii/colocalizarii proteinelor

CO, P1 Date despre expresia ocludinelor /claudinelor in liniile celulare investigate. Rezultate privind proprietatile electrice ale tesuturilor selectate

A.II.2Studiul permeabilitatii paracelulare prinmetoda TINS

P1 Definirea protocoalelor experimentale de punere in evidenta a transportului paracelular

2009

Etapa IIIExaminarea efectului peptidului beta-amiloid asupra jonctiunilor stranse

CO, P1, P2 20.05. 2009 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.III.1Studiul modificarilor permeabilitatii paracelulare sub actiunea peptidului beta-amiloid

P1. Date experimentale privind permeabilitatea celulara studiata prin metoda fluxurilor sau transport de fluorofori sub actiunea peptidului beta-amiloid

A. III.2Studiu clinic privind incidenta hipercolesterolemiei in demente

P2. Studiu retrospectiv privind incidenta factorilor de risc vascular si in special a hipercolesterolemiei la pacienti diagnosticati cu dementa (Alzheimer, vasculara, mixta)

A. III.3Investigarea expresiei claudinelor si ocludinei in culturi celulare tratate cu beta-amiloid

CO. Date experimentale privind reglarea expresiei de proteine ale jonctiunilor stranse sub influenta peptidului beta-amiloid.

Etapa IVInvestigarea factorilor de risc vasculari si a dislipidemiei la pacienti cu dementa

CO, P1, P2. 18.10.2009 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.IV.1.Studiul modificarii parametrilor electrici/rezistenta transepiteliala sub actiunea beta-amiloidului

P1Date experimentale privind modificarile parametrilor electrici sub actiunea peptiduluibeta-amiloid.

A.IV.2.Studiu clinic privind incidenta hipercolesterolemiei in demente

P2. Rezultatele studiului retrospec tiv privind incidenta factorilor de risc vascular si in special a hipercolesterolemiei la pacienti diagnosticati cu dementa (Alzheimer, vasculara, mixta)

A.IV.3.Evaluarea rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii.

CO Studiu privind evaluarea rezultatelor partiale; aplicarea corectiilor daca este cauzul.

A.IV.4.Diseminarea rezultatelor intre parteneri

CO, P1, P2. Intalniri intre membrii echipelor de cercetare ale parteneri lor pentru discutarea, interpre tarea si corelarea rezultatelor

2010

Etapa VIdentificarea de proteine ale jonctiunilor stranse in probe biologice ale pacientilor cu dementa si investigarea efectelor beta-amiloidului asupra fluiditatii embranare; rolul colesterolului.

CO, P1, P2 15.10.2010 Raport final de cercetare si documentatie economico financiara

A.V.1.Studiul fluiditatii membranare prin microscopie de fluorescenta (TIRF)

P1 Rezultate preliminare obtinute cu microscopie de fluorescenta privind modificarile fluiditatii membranare sub actiunea beta-amiloidului.

A.V.2.Studiul parametrilor electrici in celule cu continutul de colesterol modificat

P1 Rezultate privind modificarile parametrilor electrici prin extragerea/imbogatirea cu colesterol a membranelor.

A.V.3.Recoltarea de probe biologice de la pacienti cu dementa si de la lotul de control

P2 Recoltarea de plasma si lichid cefalorahidian de la pacienti cu dementa (Alzheimer, vasculara sau mixta)

A.V.4.Analiza expresiei de proteine ale jonctiunilor stranse in produse biologice.

CO Analiza expresiei de ocludina si claudina in plasma si lichid cefalorahidian la pacienti cudementa si lot control.

A.V.5.Elaborarea raportului final de cercetare

CO, P1, P2 Elaborarea unui model al functiei proteinelor jonctionale.

A.V.6.Diseminarea rezultatelor intre parteneri

CO, P1, P2 Intalniri intre membrii echipelor de cercetare ale partenerilor pentru discutarea, interpretarea si corelarea rezultatelor.

Diseminarea rezultatelor proiectului:LUCRARI PUBLICATE:

1. B.O. Popescu, Still debating a cause and diagnostic criteria for Alzheimer’s disease, Journal of Cellular and Molecular Medicine, 11:1225-6, 2007.

2. D.F. Muresanu, X.A. Alvarez, H. Moessler, M. Buia, A. Stan, D. Pintea, F. Moldovan, B.O. Popescu, A pilot study to evaluate the effects of Cerebrolysin on cognition and qEEG in vascular dementia: Cognitive improvement correlates with qEEG acceleration, Journal of Neurological Sciences, 267:112-119, 2008

3. Popescu BO, Toescu EC, Popescu LM, Bajenaru O, Muresanu DF, Schultzberg M, Bogdanovic N., Blood-brain barrier alterations in ageing and dementia, J Neurol Sci. 2009 Aug 15;283(1-2):99-106 (ISI, impact factor = 2,2) 4. Popescu BO, Bajenaru O, Ene A, Mindruta I, Manga G, Muresanu DF, Romanian O, Evaluation of cognition and mood in post-stroke mixed dementia patients – a pilot trial, Journal of Neurology, 2008, 7:153-156 (CNCSIS B+)

5. Romanitan O, Popescu BO, Spulber S, Popescu LM, Bajenaru O, Winblad B, Bogdanovic N., Altered expression of claudin family proteins in Alzheimer's disease and vascular dementia brains, Journal of Cellular and Molecular Medicine – in press (ISI, impact factor 5,1)

COMUNICARI LA MANIFESTARI STIINTIFICE NATIONALE SI INTERNATIONALE

1. B.O. Popescu, Pathological changes of the blood-brain barrier in dementias, Fifth International Congress on Vascular Dementia, WFN, Budapesta, Ungaria, noiembrie 2007 (prezentare orala)

2. B.O. Popescu, Patologia moleculara a bolii Alzheimer – perspective noi de terapie, Simpozionul „Prezentul si viitorul imediat al medicinei celulare si moleculare” organizat de catre Sectia de Stiinte Medicale a Academiei Romane, Bucuresti, Romania, noiembrie 2007 (prezentare orala)

3. B.O. Popescu, The contribution of the blood-brain barrier to neurodegeneration in dementia, 40th International Danube Symposium in conjunction with the 6th Congress of Romanian Society of Neurology, Sinaia, Romania, mai 2008 (prezentare orala)

4. B.O. Popescu, Mechanisms of cell death and neuroprotection in Alzheimer’s disease, 40th International Danube Symposium in conjunction with the 6th Congress of Romanian Society of Neurology, Sinaia, Romania, mai 2008 (prezentare orala)

5. B.O. Popescu, Alzheimer’s disease treatment – symptomatic benefits and beyond, 40th International Danube Symposium in conjunction with the 6th Congress of Romanian Society of Neurology, Sinaia, Romania, mai 2008 (prezentare orala)

6. B. Popescu, Calcium dysregulation and altered neuronal signaling in Alzheimer’s disease, Conferinta Diaspora in Cercetarea Stiintifica Romaneasca, Bucuresti, Romania, septembrie 2008 (prezentare orala)

7. B.O. Popescu, The development and survival of the nervous system – a long battle for trophic factors, Cony – 2nd World Congress on Controversies in Neurology, Atena, Grecia, octombrie 2008 (prezentare orala) 8. B.O. Popescu, The dementia of Parkinson’s disease is mainly due to cholinergic deficiency, Cony – 2nd World Congress on Controversies in Neurology, Atena, Grecia, octombrie 2008 (prezentare orala)

9. B.O. Popescu, Presenilin-mediated signal transduction – relevance to Alzheimer’s disease pathogenesis, Second Joint Congress of GCNN and SSNN, Viena, Austria, martie 2009 (comunicare orala)

10. Romanitan MO, Winblad B, Bajenaru O, Popescu BO, Bogdanovic N, The role of occludin and claudins in vascular dementia, 18th European Stroke Conference, Stockholm, Suedia, mai 2009 – (rezumat ISI publicat in Cerebrovascular Diseases, 2009; 27, suppl.6: 110) (poster)

11. B.O. Popescu, Is there any neuroregeneration in Alzheimer’s disease?, 3rd World Congress on Controversies in Neurology (CONy), Praga, Republica Ceha, octombrie 2009 (comunicare orala)

12. Popescu BO, Alterations of blood-brain barrier triggered by neurodegeneration, 6th International Congress on Vascular Dementia, Barcelona, Spania, noiembrie 2009 (comunicare orala)

13. B.O. Popescu, Neurobiology of vascular cognitive impairment, 6th International Congress on Vascular Dementia, Barcelona, Spania, noiembrie 2009 (comunicare orala)

Rezumatul Rapoartelor de cercetare

Rezumatul Etapei 1 de executieDENUMIREA PROIECTULUI:EXPRESIA SI FUNCTIA PROTEINELOR JONCTIUNILOR STRANSE - STUDIU IN MODELE EXPERIMENTALE SI LA PACIENTII CU DEMENTA

Acronim: DEMENTJUNCTION

Director de proiect (INCD ‘Victor Babes’): CS I, Dr. Bogdan O. Popescu Responsabil de proiect Centrul International de biodinamica (CIB): CS II, Dr. Dana CucuResponsabil de proiect Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti (SUUB): Prof. Dr. Ovidiu A. Bajenaru

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 1, APRILIE 2008Examinarea expresiei proteinelor specifice jonctiunilor stranse in creier

OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUIDementele se afla printre cele mai frecvente afectiuni ale populatiei vârstnice si se caracterizeaza

printr-un declin general cognitiv si biologic, însotit de scaderea calitatii vietii pacientilor si familiilor

acestora. Dementele nu beneficiaza în prezent decât de un tratament simptomatic, având un curs evolutiv

inexorabil si ducând în final la deces. Proiectul de fata îsi propune sa aduca date noi relevante pentru

mecanismele patogenice ale dementelor (degenerative si vasculare), care ar putea constitui baza

dezvoltarii unor noi strategii terapeutice. Bariera hemato-encefalica este o structura unica la nivelul

organismului uman, cu înalta selectivitate si cu o reglare speciala si care sufera alterari semnificative atât

în boala Alzheimer cât si în dementa vasculara. Jonctiunile strânse, formate din complexe proteice ale

caror functii nu sunt decât partial cunoscute, reprezinta cheia integritatii barierei hemato-encefalice, de

care depinde functionarea normala a sistemului nervos central. În acest proiect ne propunem descrierea

expresiei proteinelor constitutive ale jonctiunilor strânse la nivelul sistemului nervos central comparativ cu

alte tesuturi si studiul functiei acestora în modele adecvate experimentale, în conditii fiziologice si

patologice.

Jonctiunile strânse (JS) sunt componente ale complexului jonctional situate în partea extrema

apicala a spatiului intercelular (Farquhar and Palade, 1963) si au rolul de a forma bariere permeabile

selective de-a lungul caii paracelulare a celulelor epiteliale si endoteliale (Gumbiner, 1987). Jonctiunile

strânse restrictioneaza difuzia lipidelor si proteinelor între domeniile membranare apicale si cele laterale

mentinând astfel polarizarea membranara. Sub actiunea a diversi stimuli externi, ca de exemplu factori de

crestere, medicamente, toxice, fenomene inflamatorii, jonctiunile strânse îsi modifica rapid

permeabilitatea, permitând fluxul dinamic de ioni si soluti ca si trecerea unor molecule mari (Madara,

1989). Jonctiunile strânse sunt formate dintr-o serie de situsuri de contact reprezentate de fibrile

intermembranare. Acestea contin cel putin patru tipuri de proteine si anume ocludina, claudinele (1-13),

molecule de adeziune jonctionala si proteine citoplasmatice periferice.

În acest proiect propunem investigarea efectului unor factori externi modulatori ai jonctiunilor

strânse din bariera hemato-encefalica, cu relevanta pentru patogenia dementelor, si anume beta amiloidul

si colesterolul. Implicarea acestor compusi în dementa Alzheimer si dementa vasculara este demonstrate

de numeroase studii (Marco and Skaper, 2006; Kalaria, 2003). Mai mult, printr-un studiu recent, la care au

participat si doi dintre partenerii consortiului nostru, s-a demonstrat pentru prima oara modificarea

nivelului expresiei ocludinei în boala Alzheimer si dementa vasculara (Romanitan et al., 2007).

OBIECTIVELE FAZEI 1 DE EXECUTIE

In prima faza a acestui proiect ne-am propus examinarea expresiei proteinelor specifice

jonctiunilor stranse in creier. Principalele obiective ale acestei faze au fost optimizarea reactiilor de

imunohistochimie pentru claudinele 2 si 5 si optimizarea cuantificarii neuronale prin tehnica disectorului

optic (West et al., 1991). Astfel, in aceasta faza am studiat expresia claudinelor 2 si 5 în creierele unor

pacienti decedati cu boala Alzheimer, dementa vasculara sau cu alte patologii (cazuri control) si am

realizat comparatii statistice ale datelor obtinute pentru aceste loturi. Accesul la acest material biologic a

fost asigurat de colaborarea cu banca de creiere a Institutului Karolinska din Stockholm, Suedia.

Pe langa podocitele astrocitare si pericite, bariera hemato-encefalica contine celule endoteliale

capilare care alcatuiesc un perete compact datorita JS, care impiedica pasajul paracellular al

macromoleculelor si celulelor dinspre torentul sangvin catre versantul tisular cerebral (Brightman si

Reese, 1969). JS reprezinta domenii membranare specializate situate la nivelul regiunii apicale a celulelor

epiteliale si endoteliale, care sunt specializate atat in prevenirea pasajului de solute si apa (functie de

bariera) cat si in mentinerea polaritatii celulare (Schneeberger et al, 2004). In creierul verterbatelor sunt

cunoscute doua tipuri de celule care prezinta JS: celulele endoteliale vasculare si oligodendrocitele

(Rubin, 1991). Retelele de JS sunt formate din protein membranare integrale, si anume proteina

membranara ascoiata jonctiunilor 1 (JAM 1, junctional associated membrane protein 1, Martin-Padura et

al., 1998), ocludina (Furuse et al., 1993) si familia claudinelor (Sonoda et al., 1999). Ocludina si

claudinele se leaga de protein membranare periferice cum sunt ZO-1, ZO-2 sau ZO-3, care la randul lor

sunt conectate la reteaua perijonctionala de filamente de actina a citoscheletului (Itoh et al., 1999). Avand

in vedere ca intr-un studiu anterior am aratat ca in creierul pacientilor cu boala Alzheimer si dementa

vasculara, ocludina este exprimata la niveluri semnificativ mai crescute comparative cu controlul

(Romanitan et al., 2007), in aceasta faza a proiectului de fata ne-am propus evaluarea expresiei claudinelor

in creierul pacientilor cu dementa.

CONCLUZII

Studiul nostru este primul care identifica expresia claudinelor la nivel neuronal si al altor tipuri de

celule gliale cu exceptia oligodendrocitelor. De asemenea, aratam pentru prima oara cresterea

semnificativa a nivelului claudinelor 2 si 5 in creierele bolnavilor cu boala Alzheimer si dementa

vasculara comparative cu creierele cazurilor cu varsta similara, fara dementa.




RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 2, OCTOMBRIE 2008Dezvoltarea si adaptarea de culturi celulare pentru studiul proteinelor specifice jonctiunilor strânse


In aceasta etapa a proiectului ne-am propus selectia liniile celulare potrivite pentru studiul

functiei proteinelor din jonctiunile strânse. La aceasta faza au participat doi parteneri ai consortiului:

INCD „Victor Babes” (CO) si CIB (P1). Ca modele celulare de investigare INCDVB va folosi o linie de

neuroblastom utilizata curent ca model in experimentele de neurobiologie (SH-SY5Y) cat si culturi de

neuroni granulari cerebelosi de sobolan (CGC) in timp ce CIB va face experimentele pe o linie

imortalizata bine stabilita, si anume celulele renale MDCK, utilizate extensiv in analiza unor procese

celulare ca transportul transpitelial, modularea barierei epiteliale si functia jonctiunilor intercelulare.

Expresia de ocludina a fost verificata in linia SH-SY5Y si CGC (vezi capitolul de rezultate). Expresia

proteinelor din jonctiunile stranse este diferita in clone celulare ale liniei MDCK: MDCK-I respectiv –II.

Astfel, cele doua clone prezinta caracteristici diferite In rezistenta transepiteliala (RT) si in expresia

proteinelor jonctionale. Furuse & col. (2001) demonstreaza faptul ca epiteliile cu RT mai mare (MDCK I)

nu exprima claudina-2, iar aceasta proteina scade RT. Studii recente demonstreaza si ca selectivitatile

ionice paracelulare variaza in diferite epitelii si datorita expresiei combinate a mai multor tipuri de

claudine. Alterarile fiziologice sau patologice ale claudinelor pot avea impact asupra proprietatilor barierei

epiteliale. Acest lucru se poate repercuta in modificari ale transportului, contaminarea cu agenti patogeni

sau posibile modificari morfologice ale tesutului. Intelegerea functiei si selectivitatii jonctiunilor stranse

poate avea aplicatii terapeutice pentru transportul selectiv si controlat al medicamentelor.

Ocludina este de asemeni localizata la nivelul complexului jonctiunilor stranse iar supraexprimarea

acesteia determina cresterea RT in celulele epiteliale. Cu toate acestea, lipsa expresiei ambelor alele ale

ocludinei prin recombinare homologa a dus in celulele stem la formarea de epitelii polarizate cu jonctiuni

strânse normale. Din acest studiu s-a concluzionat ca ocludinele nu sunt necesare in formarea jonctiunilor

stranse, ci au un rol mult mai complex si insuficient studiat.

In CIB se lucreaza curent cu celulele epitelial MDCK I, care exprima claudina de tip 2 si ocludina.

Ne propunem testarea si a altor clone ale celulelor MDCK (II, -C7 si C11). Intr-o prima faza prin

imunofluorescenta (sau real –time PCR) vom determina localizarea si /sau colocalizarea diferitelor tipuri

de ocludine si claudine.

Când celulele epiteliale sunt crescute pe filtre semipermeabile, se dezvolta ca epitelii polarizate cu

o membrana apicala si o membrana bazolaterala similar epiteliului din care provin. Pentru studiul functiei

proteinelor de la nivelul jonctiunilor stranse ne propunem utilizarea unor tehnici folosite curent in CIB si

anume tehnica spectroscopiei de impedanta si analiza de zgomot (TINS), recent implementata. Cu ajutorul

aceste tehnici se poate masura transportul celular si paracelular si se poate studia cinetica porilor

transmembranari si RT simultan. Ca protocol de lucru pentru modularea RT se poate folosi variatia

concentratiei externe de Ca2+.

Personalul CIB are o vasta experienta in utilizarea acestor tehnici pe tesuturi epiteliale renale. Mai

mult, in literatura de specialitate au fost raportate proprietatile de transport cation-selectiv ale claudinelor-

2 prin metode indirecte (permeabilitati bionice) dar metodele electrofiziologice, ca de exemplu analiza de

zgomot, pot aduce informatii precise despre eventualele caracteristici de por ale acestor proteine.

Permeabilitatea paracelulara va fi studiata prin masurarea transportului dinspre partea apicala in

cea bazolaterala a unor fluorofori specifici (FITC-dextran, sodium-fluoresceina etc.) si cuantificarea

spectrofotometrica. Variatiile permeabilitatii paracelululare pot fi realizate prin protocolul modularii

concentratiei Ca2+ extern.

Ne propunem si studiul expresiei de ocludina, claudine si ZO 1-3 intr-o linie celulara stabilizata

pe care laboratorul parter de la Institutul Victor Babes o detine (neuroblastom SH-SY5Y), care este foarte

bine caracterizata, este folosita frecvent ca model neuronal si cu care laboratorul din INCDVB are

experienta. Pentru acest scop vom folosi tehnici de Western blot si imunocitofluorescenta, eventual real-

time PCR.

Obiectivul principal al acestei faze este dezvoltarea si adaptarea de culturi celulare pentru

studiul proteinelor specifice jonctiunilor strânse.

CONCLUZII

Studiul nostru este primul care identifica expresia ocludinei si claudinelor la nivel neuronal si al

altor tipuri de celule gliale (pe langa oligodendrocite). De asemenea, aratam pentru prima oara, ca celulele

granulare cerebeloase, liniile SH-SY5Y si MDCK pot fi folosite ca modele experimentale de studiu al

expresiei proteinelor de jonctiuni stranse. Aceste date sugereaza, alaturi de cele comunicate anterior

(Romanitan et al., 2007), ca proteinele din compozitia JS pot avea alte roluri biologice, posibil in relatie

cu apoptoza, ciclul cellular sau apararea anti-stress.




RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 3, MAI 2009Examinarea efectului peptidului beta-amiloid asupra jonctiunilor stranse


In aceasta etapa a proiectului ne-am propus sa studiem efectele peptidului beta-amiloid asupra

jonctiunilor stranse. La aceasta faza au participat toti cei trei parteneri ai consortiului: INCD „Victor

Babes” (CO), CIB (P1)si SUUB (P2). Ca modele celulare de investigare INCDVB a folosit o linie de

neuroblastom utilizata curent ca model in experimentele de neurobiologie (SH-SY5Y) cat si culturi de

neuroni granulari cerebelosi de sobolan (CGC), CIB a folosit mai multe clone ale unei linii imortalizate

bine stabilita, si anume celulele renale MDCK, utilizate extensiv in analiza unor procese celulare ca

transportul transpitelial, modularea barierei epiteliale si functia jonctiunilor intercelulare. Clonele diferite

de MDCK exprima si niveluri diferite de ocludina. Astfel, cele doua clone prezinta caracteristici diferite

In rezistenta transepiteliala (RT) si in expresia proteinelor jonctionale. Furuse & col. (2001) demonstreaza

faptul ca epiteliile cu RT mai mare (MDCK I) nu exprima claudina-2, iar aceasta proteina scade RT.

Astfel, INCDVB a avut ca obiectiv specific in aceasta faza obtinerea de date experimentale

privind reglarea expresiei de proteine ale jonctiunilor stranse sub influenta peptidului beta-amiloid.

CIB in aceasta faza a avut ca obiectiv specific obtinerea de date experimentale privind

permeabilitatea celulara studiata prin metoda fluxurilor sau transport de fluorofori sub actiunea

peptidului beta amiloid.

In SUUB – Clinica de Neurologie s-a realizat un studiu retrospectiv privind incidenta factorilor de

risc vascular si in special a hipercolesterolemiei la pacienti diagnosticati cu dementa (Alzheimer,

vasculara, mixta), conform planului de activitate al proiectului, care a avut rolul de a stabili frecventa

dislipidemiei (in principal a hipercolesterolemiei) in populatia de pacienti accesibila studiului nostru (vezi

capitolul rezultate), urmand ca in etapele urmatoare sa se preleveze sange si lichid cefalorahidian de la

pacienti cu dementa, probe in care laboratorul de la INCDVB sa incerce detectarea de proteine sau

fragmente de proteine de jonctiune stranse.

Obiectivul principal al acestei faze este examinarea efectului peptidului beta-amiloid asupra

jonctiunilor stranse.

CONCLUZII

Concluzii ale studiilor din modelele experimentale. In studiul nostru aratam pentru prima oara ca liniile

celulare folosite (SH-SY5Y, MDCK, CGC) sunt fezabile ca modele experimentale de studiu al reglarii

expresiei proteinelor de jonctiuni stranse in conditiile prezentei unor factori patogenici caracteristici

dementelor (diferite forme de peptid beta-amiloid, diferite izoforme ald apolipoproteinei E). Am aratat in

aceasta faza pentru prima oara ca in modelele noastre experimentale atat varianta fibriloidogenica de beta-

amiloid (1-42) cat si varianta E4 a apolipoproteinei E sunt capabile sa creasca expresia de ocludina.

Aceste date sugereaza ca proteinele din compozitia jonctiunilor stranse pot avea alte roluri biologice,

posibil in relatie cu apoptoza, ciclul cellular sau apararea anti-stres.

Obiectivul principal al acestei faze a fost examinarea efectului peptidului beta-amiloid asupra

jonctiunilor stranse prin studii de permeabilitate paracelulara. Metoda propusa este estimarea

transportului paracelular prin masuratori de fluorescenta a FITC-dextranului. FITC-dextranul este o

molecula impermeabila epiteliului celular, singura cale de transport fiind calea paracelulara prin jonctiuni

stranse. Masurarea cu lumninometru a probelor aplicate in flux reprezinta o metoda inovativa, in conditiile

in care datele din literatura prezinta masuratori statice dupa ce peptidul si-a exercitat actiunea. De

asemeni masurarea concomitenta a impedantei, curentului si conductantei, estimarea cineticii canelelor

ionice este o noua maniera de abordare in studiul transportului epitelial. In faza urmatoare propunem

imbunatatirea metodei prin aplciarea unei concentratiii mai mari de FITC-dextran pentru evaluari la nivel

de concentratie data fiind cantitatea mica care poate trece prin jonctiunile tight. De asemeni intentionam

sa efectuam experimente pe epitelii expuse un timp mai lung la Aβ1–42.

Concluzii ale studiului clinic retrospectiv. Printre pacientii admisi in Clinica de Neurologie a SUUB –

Camera de Garda, pentru simptomatologie neurologica acuta, un procent mic dar semnificativ a fost

diagnosticat cu dementa. La acesti pacienti atat factorii de risc vascular cat si comorbiditatile au avut o

incidenta crescuta. In mod interesant, doar o minoritate a pacientilor a fost diagnosticata cu dementa

inaintea spitalizarii in clinica noastra pentru simptomatologia neurologica. Concluzia care reiese din datele

obtinute pana acum este ca la pacientii cu patologie cerebrovasculara, tulburarea cognitiva este cel mai

adesea incadrata in diagnosticul de dementa mixta, mecanismele implicate fiind complexe si asociind si

mecanismul neurodegenerativ. In ceea ce priveste factorii de risc, incidenta crescuta a

hipercolesterolemiei, hipertensiunii arteriale si prezenta afectiunilor cardio-vasculare vin in sprijinul

continuarii studiului cu analiza compozitiei membranare a colesterolului pentru observarea modificarii

fluiditatii membranare (sunt studii ce demonstreaza ca o concentratie mare a colesterolului induce

cresterea rigiditatii membranare) cat si ofera bazele uneia dintre ipotezele noastre initiale, anume ca BHE

este probabil alterata in dementa si printr-o agresiune a fractiunilor serice modificate ale lipidelor.




RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 4, OCTOMBRIE 2009Investigarea factorilor de risc vasculari si a dislipidemiei la pacientii cu dementa


In aceasta etapa a proiectului ne-am propus sa studiem incidenta factorilor de risc vasculari si a

dislipidemiei la pacienti cu dementa La aceasta faza au participat toti cei trei parteneri ai consortiului:

INCD „Victor Babes” (CO), CIB (P1)si SUUB (P2). Astfel, CIB a avut ca obiectiv specific in aceasta faza

studiul modificarii parametrilor electrici/a rezistentei transepiteliale sub actiunea beta-amiloidului. Acest

studiu a adus date noi, produse in modele experimentale de bariera, privind efectele amiloidului beta

asupra reglarii jontiunilor stranse. In SUUB – Clinica de Neurologie s-a realizat un studiu retrospectiv

privind incidenta factorilor de risc vascular si in special a hipercolesterolemiei la pacienti diagnosticati

cu dementa (Alzheimer, vasculara, mixta), care il completeaza pe cel realizat in etapa anterioara a

proiectului, prin extinderea lotului de pacienti analizati. Conform planului de activitate al proiectului,

aceste studii retrospective au avut rolul de a stabili frecventa dislipidemiei (in principal a

hipercolesterolemiei) in populatia de pacienti accesibila studiului nostru (vezi capitolul rezultate), urmand

ca in etapa urmatoare sa se preleveze sange si lichid cefalorahidian de la pacienti cu dementa, probe in

care laboratorul de la INCDVB sa incerce detectarea de proteine sau fragmente de proteine de jonctiuni

stranse (ocludina, claudine). In aceasta faza, activitatea INCDVB s-a rezumat la evaluarea rezultatelor

partiale.

In aceasta etapa ne-am propus studiul permeabilitatii paracelulare prin evaluarea modificarilor

induse de beta-amiloid asupra parametrilor electrici ai celulelor: curent transepitelial (Isc), zgomot

membranar prin utilizarea analizei de zgomot, rezistenta transepiteliala prin spctroscopie de impedanta.

Obiectivul principal al acestei faze este studiul modificarii parametrilor electrici (rezistenta

transepiteliala) sub actiunea beta-amiloidului.

CONCLUZII

Obiectivul principal al primei activitati a fazei 4 a fost examinarea efectului peptidului beta-

amiloid asupra jonctiunilor stranse prin studii ale parametrilor electrici.

Masurarea concomitenta a impedantei, curentului si conductantei, (metoda TINS) este o noua

maniera de abordare in studiul transportului epitelial.

Epiteliile MDCK-I care exprima ocludine asa cum am demonstrat in faza precedenta, reprezinta un

model robust de studiu al efectului beta-amiloidului.

Beta-amiloidul creste rezistenta paracelulara. Deteminarea acestui parametru s-a facut folosind

metoda spectroscopiei de impedanta si modelarea datelor obtinute cu un model adecvat care descrie

epiteliile compacte.

A doua activitate a fazei 4 a privit studiul clinic al incidentei hipercolesterolemiei in demente.

Printre pacientii admisi in Clinica de Neurologie a SUUB – Camera de Garda, pentru

simptomatologie neurologica acuta, un mic dar semnificativ procent a fost diagnosticat cu dementa. La

acesti pacienti atat factorii de risc vascular cat si comorbiditatile au avut o incidenta crescuta. In mod

interesant, doar o minoritate a pacientilor a fost diagnosticata cu dementa inaintea spitalizarii in clinica

noastra pentru simptomatologia neurologica.

Concluzia care reiese din datele obtinute pana acum este ca la pacientii cu patologie

cerebrovasculara, tulburarea cognitiva este cel mai adesea incadrata in diagnosticul de dementa mixta,

mecanismele implicate fiind complexe si asociind si mecanismul neurodegenerativ. In ceea ce priveste

factorii de risc, incidenta crescuta a hipercolesterolemiei, a ateromatozei vaselor cervicale, prezenta

hipertensiunii arteriale precum si a afectiunilor cardio-vasculare vin in sprijinul continuarii studiului cu

analiza compozitiei membranare a colesterolului pentru observarea modificarii fluiditatii membranare.

Proiect 41-013/2007: · Web viewJonctiunile stranse, formate din complexe proteice ale caror...

Documents

Transcript of Proiect 41-013/2007: · Web viewJonctiunile stranse, formate din complexe proteice ale caror...