privind implementarea proiectului in etapele I- III ( iunie2017-15 … · 2019-10-06 · 7 noi si...
Transcript of privind implementarea proiectului in etapele I- III ( iunie2017-15 … · 2019-10-06 · 7 noi si...
1
RST - Raport stiintific si tehnic in extenso
privind implementarea proiectului in etapele I- III ( iunie2017-15 Septembrie 2019,
etapa a III-a 2019 inca in desfasurare pana la data 15 dec. 2019)
Proiectul de cercetare din cadrul PN III Programul 4 Subprogram Cercetare
fundamentală și de frontierăPN-III-P4-ID-PCE-2016-0502, inceput la data 1/06/2017 cu
titlul “Studiul translocatiilor primare induse prin recombinarea V(D)J la nivelul locus-ului
MYC ce cauzeaza degenerarea maligna a liniei limfoide implicate”, Acronim V(D)JMYC
Contract Nr. 178/2017; Director de Proiect Ciubotaru Mihai.Institutia -Spitalul Clinic
Colentina Bucuresti, Centrul de Cercetare(CDPC).
Cuprins
Rezumatul proiectului- pg 2
Definire Obiectiv1 etapa a I-a 2017 pg2
Definire Obiectiv2 etapa aII-a 2018 pg9
ActivitatiA1.1-1.4 pe 2017
A1.1 Testarea si optimizarea conditiilor de investigare a stimularii prelimfocitelor
Bv Abl cu mesylat de imatinib(STI571), crestere si viabilitate celularapg 3-4
A1.2. Testarea activitatii de recombinare la celulele vAbl pre B la concentratii
variate de imatinib(STI571) in conditii normale de crestere pg 4-6
A1.3.Testarea activitatii de recombinare la celulele vAbl pre B expuse la diverse
doze de iradiere cu raze Xpg6-7
A1.4. Testarea efectelor de reparare ADN post radiative la prelimfocitelor B v Abl
prin urmarirea focarelor de H2AX pg7-8
Activitati B1.1-1.3 pe 2018
B1.1 Modularea expresiei genei c-myc in limfocitele pre-B murine. pg 9-12
B1.2 Inductia simultana a recombinarii somatice si transcrierii genei c-myc in
limfocitele pre-B murine. pg 12-14
B1.3 Secventiera jonctiunilor Vk/jk a recombinarii somatice induse in limfocitele
pre-B murine. pg 14-16
Activitati C1.1-1.3 pe 2019
2
C1.1 Studiul leziunilor induse postradiativ in celule pre-B cu recombinare, pe
locus-ul c-myc precursoare ale translocatiilor IGL/MYC ; stabilirea regiunilor de
fragilitate ale locus-ului. pg. 17-19
C1.3 Efectul fenotipic aparut prin modularea transcrierii locusului c-myc in celule
pre-B cu recombinare; stabilirea biomarker-ilor reprezentativ afectati de leziunile
genice precursoare ale translocatiilor IGL/MYC pg. 20-21
Concluzii pg 21-22
Referinte pg22
ATASAM MANUSCRISUL PRIMULUI ARTICOL CE VA FI SUBMIS SPRE
PUBLICARE PE 15 OCT. 2019 ANEXA2
Rezumatul proiectului
La nivelul loci-lor imunoglobulinice (IG) in timpul maturarii limfocitelor B se produc fiziologic
rupturi dublu catenare de ADN(DSB). Cand aceste DSB sunt cuplate cu alte leziuni ADN
similare survenite accidental la alt nivel in genom, simultaneitatea lor poate genera translocatii
cromozomiale ce adesea reprezinta schimburi reciproce de segmente codificatoare intre doi
cromozomi neomologi. Desi demult aceste translocatii sunt in cazul celulelor B folosite
laidentificarea lor maligna nici in prezent nu se cunoaste daca ele sunt de fapt cauza
transformarii lor sau numai secundare procesului de oncogeneza limfatica. Proiectul nostrum
adreseaza experimental aceasta intrebare esentiala in oncologia limfoamelor incercand sa
"inghete in timp" momentul in care aparitia unor translocatii (MYC/IG) induse, schimba dramatic
fenotipul unei celule B purtatoare in cursul dezvoltarii sale. Experimental folosim pentru prima
data un procedeu inovativ pentru a induce prin iradiere DSB tintite la nivelul locus-uluiMYC
(Chr. 8 la om Chr. 15 la soarece). Prin el vom induce translocatii reciproce intre loci-le IG si
MYC la momente cheie peparcursul dezvoltarii limfocitelor B, atunci cand factorul de transcriere
c-MYC dirijeaza genele reglatoare ale ciclului celular(bcl2, bcl6, TCF3, NFkB). Din acest motiv
translocatiile IG/MYC sunt frecvent folosite drept biomarkeri de diagnostic ale celor mai temute
limfoame B maligne avand prognostic de evolutie negativ si neraspunzand la tratament. Din
aceasta categorie fac parte unele din leucemiile Acute Limfoblastice(B-ALL) si limfoamele B
nonhodgkiniene(NHLB), cancere ale caror celule clonale ne vor ghida in studiul nostru prin
marker-ii lor de transformare fenotipica. Vom stabili indici corelativi intre fiecare tip de
translocatie IG/MYC identificata si severitatea modificarilor fenotipice cauzate in celulele B
purtatoare. Aceste corelatii ilustreaza ca model experimental limfoamele amintite iar markerii lor
de suprafata ne vor ajuta la studiul tratamentului lor.
3
Definire Obiectiv1(activitati A1.1-A1.4 pe aceasta etapa I)
Studiul efectelor iradierii asupra celulelor B in cursul diferentierii de la celule pre-
B la limfocite naive B.(D2a pg9 formularul C&D al aplicatiei de proiect)Acest obiectiv
are drept scop principal identificarea efectelor produse de iradierea celulelor murine
vAbl preB cu doze mici de raze X in prezenta /absenta stimularii lor cu mesylat de
Imatinib(STI571) agent chimic ce induce in aceste celule recombinarea V(D)J si
diferentierea lor la stadiul de limfocite naive B.Prin aceste experimente incercam sa
intelege cum iradierea generalizata cu raze X, o conditie ce induce rupturi dublu
catenare a ADN-ului(DNA double stranded brakes DSB) genomic si mobilizarea
masinariei de reparare ADN in celulele vAbl preB, afecteaza cresterea si transformarea
maligna a acestor celule spre fenotip de tip limfom B.In acesta prima etapa s-au
definitivat cu succes 4 activitati aferente acestui obiectiv A1.1-A1.4 .
A1.1 Testarea si
optimizarea
conditiilor de
investigare a
stimularii
prelimfocitelor B v
Abl cu mesylat de
imatinib(STI571),
crestere si viabilitate
celulara.Celule pre-B
murine infectate cu
virusul leucemic
Abelson(vAbl preB)
au fost crescute in
conditii standard la 370C fie in absenta sau stimulate cu 2, 3, 5 si respectiv 7.5M
Imatinib Mesylate(IMA/STI571) timp de 48 de ore (1,2). Dupa incubare celulele au fost
colorate cu albastru de tripan pentru stabilirea concentratiei minime IMA si procentului
optim de supravietuire. Durata de 48h este aleasa corespunzatoare necesitatii de
transcriere si expresie cu translatie a RAG1 si RAG2 ce alcatuiesc recombinaza ce
4
produce recombinarea V(D)J(vezi propunerea de proiect formularul C&D sectiunea
D1.1 pg5-6). In Fig.1Asunt ilustrate rezultatele colorarii cu tripan a celulelor in functie
de tratamentul cu IMA in cultura(albastru cele cu supravietuire si rosu cele moarte). Se
observa procentul de ≈72% supravietuire la celulele tratate cuIMA fata de 98% la cele
netratate indiferent de concentratia de inductor folosita. Rezultatul este consistent cu
faptul ca IMA un inhibitor de tirozin kinaze(TK) cu mare specificitate pe abl-TK, induce
in celulele tratate pe langa efectul stimularii recombinazei RAG si stagnarea ciclului
celular la nivelul fazei G cu oprirea replicarii ADN. Am verificatapoi efectul de stagnare
metabolica(printre altele reduce si sinteza de baze azotate) indusa de IMA si oprirea
replicarii(element necesar pentru a detecta leziunile postradiative fara eventuala lor
reparare celulara).Celulele preB au fost testate +/- IMA in concentratiile precizate mai
sus la 6h, 12h, 24h si respectiv 48h post inductie prin tehnica MTS. Adaugarea fiecarei
concentratii deIMA s-a facut la initierea pasajului culturii dupa care la timpul precizat ,
ore post-inoculare, viabilitatea celulara a fost citita spectrofotometric la 490nm in
prezenta sarii de tetrazoliu MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-
carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- sare de tetrazoliu; MTS] si a reactivului
redox(fenazina metosulfat) PMS. In celulele vii metabolic active continand NAD/NAD
(P)H dehidrogenaza sarea MTS este transformata de aceasta in formazan care este un
colorant activ, solubil ce difuzeaza in afara celulelor in mediu, coloratia sa putand fi citita
ca absorbanta in domeniul 490-500nm, (indicator de viabilitate printr-o scara directa de
conversie). Rezultatele testelor de viabilitate prezentate in Fig. 1B (conversiile % de
viabilitate fata de culturile control continand mediu suplimentat doar cu solutia cu
DMSO) sunt mediile a 3 citiri independente pentru fiecare interval de timp si
concentratie IMA testata. Se observa clar ca in ciuda supravietuirii relativ bune la 48h
post tratare IMA(intre 72-75%) celulele tratate sunt oprite clar din replicare cu indicatorul
MTS aratand stagnarea lor metabolica similara la toate concentratiile testate(reducere
la 60% la 6h si numai 10% la 48h). La acest rezultat se adauga si faptul ca celulele
vAbl-preB obtinute din laboratorul Dr. Schatz sunt bcl2-/- knock-down, BCL-2 fiind un alt
factor stimulator al replicarii celulare. Asadar, rezultatele din Fig.1 sunt imbucuratoare
demonstrand fara echivoc faptul ca tratamentul chiar cu doze mici (2-3M)cu IMA la
48h este eficient in inducerea stagnarii ciclului celular in fazaG cu oprirea repararii si
5
replicarii celulare, conditii esentiale surprinderii efectelor postradiative la aceste celule
concomitent cu testarea recombinarii somatice.
A1.2. Testarea activitatii de recombinare la celulele vAbl pre B la concentratii
variate de imatinib(STI571) in conditii normale de crestere. Pentru testarea
recombinarii somatice am folosit un assay de tip nested PCR dezvoltat in doua etape
succesive folosind ca material de amplificare ADN genomic de la celulele vAbl preB fie
netratate(-IMA) fie induse cu 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 7.5 si respectiv 10M IMA timp de
48h. Acest assay de 2 etape nested PCR pune in evident rearanjarea genica ce are loc
mediata prin RAG la nivelul locusului k (cromozom 6 la soarece) codificator al regiunii
variabile a lantului usor IGL imunoglobulinic. Aceasta recombinare este pasul necesar
diferentierii celulelor preB spre limfocite imature B naive. Schematic in casuta Fig.2A
este ilustrata dispunerea segmentelor germinale dinaintea recombinarii in locusul k.
Pentru assay-ul de PCR, ADN genomic provenind de la 1.5x106 celule/ml este extras
din fiecare lot cu(48h dupa adaugare) sau fara IMA, si o dilutie de 1:100 din acesta
initiaza prima amplificare cu un primer 5' For Vk1 degenerat(din 25 nt. 4 sunt ambiguu
incorporate)care hibridizeaza nespecific in amontele locus-ului la unul din segmentele
germinale Vk in timp ce un primer Rev1 hibridizeaza specific 3' in aval de segmentele
germinale Jk(Fig.2A). Dupa 25 cicluri de amplificare in prima etapa, produsii acesteia
sunt rediluati si reamplificati in a IIa etapa cu acelasi primer For. Vk1 degenerat si cu un
alt primer Rev2 care hibridizeaza specific 3' fata de segmentele Jk1(5%) si Jk2(95%).
Produsii amplificarii (Vk-Jk1 700bp si Vk-Jk2 280bp, sagetile din Fig.2B) celei de-a IIa
6
etape a assay-ului sunt migrati pe geluri de 1.5% agaroza si evidentiati dupa migrare
prin colorare cu agent fluorescent SYBR green(3). Scan-ul unui gel reprezentativ este
ilustrat in Fig.2B. In absenta recombinarii V(D)J (-IMA ) si concentratii prea mici de
IMA(0.25, 0.5M) segmentele Vk si Jk sunt foarte distal localizate genomic pentru a
permite amplificarea si de aceea produsii sunt absenti. La concentratii semnificative 1-
10M de IMA se detecteaza produsii mai sus amintiti ai recombinarii Vk-Jk2 of
280bp(95%) and Vk-Jk1of 700bp(5%)(Fig.2B ultimele 6 godeuri din dreapta gelului).
Prin analiza densitometrica a benzilor Vk-Jk2 se pot cuantifica cat de eficiente sunt
concentratiile de IMA folosite in culturi la inducerea recombinarii, iar reprezentarea prin
histograme a cuantificarilor(media de la 3 experimente individuale cu SD drept linia de
eroare) exprima grafic efectele testate(Fig.2C). Remarcabil este faptul ca expunerea
culturilor de vAbl-preB la concentratii relativ scazute de IMA duce la o recombinare
sustinuta(efectul este maxim la 3M), concentratii ce sustin si efectele celulare dorite de
7
noi si testate la A1.1(Fig.1 paragraful anterior). In urma acestor teste am folosit drept
concentratie IMA optima de stimulare a recombinarii pe cea de 3M.
A1.3.Testarea activitatii de recombinare la celulele vAbl pre B expuse la diverse
doze de iradiere cu raze X. Folosind assay-ul optimizat descris mai sus am determinat
efectele iradierii cu raze X la 1Gy si respectiv 2Gy , doze cumulate intre 1-2min. ,
aplicate la 48 h post stimulare cu 3M IMA pe celule vAbl preB. Loturi de celule control
nestimulate cu IMA neiradiate, stimulate IMA si neiradiate si respectiv nestimulate IMA
+iradiere au fost incluse pentru analiza. Iradiere s-a facut cu un aparat medical cu
accelerator liniar (Mevatron Primus 2D, 6MV, Siemens, Germany ) cu o rata rate of 1.85
Gy/min la o distanta de 100cm de sursa intr-un container dedicat suport 30x30x30cm cu
dozimetrie descrisa. Pentru o sensibilitate crescuta la cuantificarea efectelor radiative
assay-ul de mai sus a fost facut cu 4 dilutii de ADN genomic(1:5, 1:25, 1:50 si 1:100)
provenit de la culturile celulare recoltate la 30min. dupa iradiere. In Fig. 3A este ilustrat
un gel de migrare al produsilor de amplificare Vk-Jk 1/2 rezultati dintr-un astfel de
experiment in iar Fig.3B prin histograme sunt schematic reprezentate raporturile
obtinute la iradiereX/control neiradiat similar tratat la 1Gy raporturi calculate din 3
experimente independente pe dilutii 1:5,1:25,1:50, atat pentru recombinarea Vk-Jk
1(gri) cat si pentru Vk-Jk 2(alb). Precum se vede vizual evident din Fig.3B iradierea fie
cu 1 sau 2Gy duce la o scadere semnificativa a intensitatii benzilor produsilor reactiei
Vk-Jk 2 induse de IMA(comparati intensitatile benzilor Vk-Jk2 din godeurile 2-4
neiradiate cu cele iradiate 6-9 si 11-13 Fig.3A). Prin cuantificarea efectului la 1Gy se
poate estima o reducere cu 30-40% a recombinarii, efect observabil prevalent la
produsul principal al recombinarii detectat de noi Vk-Jk2. Cea mai plauzibila explicatie
adusa fenomenului observat este aceea ca iradierea ducand la DSB reduce
semnificativ finalizarea recombinarii somatice la locus-ul IgK si de aceea estimam o
crestere a susceptibilitatii la leziuni genomice la celulele astfel tratate. Acest rezultat ar
fi consistent cu cel prevazut de noi in propunerea originala a proiectului si de aceea am
testat-o ulterior la activitatea A1.4(vezi mai jos rezultatele din Fig. 4) urmand sa
identificam la Ob.2 in etapa a IIa a proiectului astfel de leziuni induse la nivel genomic.
8
A1.4. Testarea efectelor de reparare ADN post radiative la prelimfocitelor B v Abl
prin urmarirea focarelor de H2AX.Pentru a testa daca efectele iradierii observate in
experientele descrise la A1.3 se datoreaza integritatii ADN-ului dupa iradiere sau
recombinarii am facut experimente in care celulele tratate ca la sectiunea A1.3 au fost
investigate pentru colorarea cu marker ce indica prezenta histonei fosforilate H2AX.
Acest marker citologic este asociat indisolubil de procesul intracelular al repararii
rupturilor dublu catenare de ADN (DNA double stranded breaks DSB)si prezenta
focarelor nucleare H2AX este cea mai bun indiciu al prezentei mecanismelor de
reparare a DSB de catre
ansamblul de proteine NHEJ
(non homologous end joining
DNA repair machinery) ce
repara leziunile ADN cauzate
de orice proces toxic. Celulele
au fost crescute, tratate+/- IMA
si iradiate cu 1Gy ca si in
experimentele de la sectiunea
A1.3 dar dupa recoltare in
locul extragerii ADN-ului
genomic ele au fost fixate si
dublu colorate pentru analiza
la microscopul cu fluorescenta
astfel: a)Reactivul Hoechst
33342 detecteaza nespecific
nucleul celular pe care-l
coloreaza in albastru intens si b)colorare imunofluorescenta cu o pereche de anticorpi,
intai cei primari nemarcati de sobolan antiH2AX cu specificitate pt histona fosforilata
murina urmata de a IIa incubare cu anticorpi secundari de iepure anti Ig de sobolan
marcati cu fluoroforul Cy2 -detectie verde deschis ce indica prezenta caracteristica a
focarelor de H2AX. Aceste focare sunt vizualizate pe lamele celulelor tratate prin
microscopie de fluorescenta si Nr. de focare detectate/Nr de celule din camp indica
9
intensitatea procesului de reparare DSB. In Fig.4 A-D sunt ilustrate patru astfel de
campuri vizualizate prin imunofluorescenta cu contururile albastre indicand nucleul
celular iar punctele verzi indicate de noi prin sageti arata prezenta focarelor de
H2AX(4,5). Prezenta stimularii cu IMA nu duce la o crestere sporita detectabila direct
de focare de H2AX(compara Fig.4C cu 4D) dar iradierea cu raze X induce o crestere
semnificativa a acestor focare/Nr. de celule(compara Fig.4A si B cu campurile 4C siD).
Numararea acestor focare cuantifica gradul de intensitate al leziunilor DSB induse de
iradiere cu o sporire de 5 ori in absenta IMA si respectiv 8 ori in prezenta sa(Fig. 4E).
Aceste rezultate confirma clar faptul ca iradierea cu raze X induce leziuni genomice
nediscriminative dar care in mod evident afecteaza si procesul de reparare de la nivelul
IgK consecutiv recombinarii. Aceste rezultate preliminarii vin sa intareasca evident
concluzia elaborata de noi la interpretarea rezultatelor din sectiunea A1.3(Fig.3).
Definire Obiectiv2(activitati B1.1-B1.3 etapa a II-a 2018)
Studiul efectelor inducerii expresiei oncogenei tinta c-myc pentru a genera
translocatii IGL/MYC specifice in cursul diferentierii de la celule pre-B la limfocite
naive B.(D2b pg11-12 formularul C&D al aplicatiei de proiect)Scopul acestui obiectiv
este de a modula prin agenti farmacologici expresia oncogenei c-myc in asa fel incat
inducerea ei simultana cu procesul recombinarii V/J in prelimfocitele B murine sa
favorizeze translocatii reciproce intre locusul IGK(cromozomul2-om/Cr6-murin,locul
recombinarii)si locus-ul MYC(cromozomul8-om/Cromozom15 murin).
B1.1 Modularea expresiei genei c-myc in limfocitele pre-B murine. Una din cele mai
importante probleme cu care ne-am confruntat de la inceputul acestui proiect este faptul
ca inducerea expresiei RAG in celulele v-abl pre-B A70 prin IMA-mesylat de Imatinib
(STI571) ca urmare a actiunii inhibitorii asupra Abelson kinase, conduce la stagnarea in
faza G1-(arrest) in ciclul celular,efect discutat mai sus la paragraful A1.1,Fig.1 pg.3 a
acestui raport. Acest efect al Ima duce in consecinta si la o suprimare/inhibitie a
expresiei de c-MYC ceea ce ar contracara efectele accesibilitatii locus-ului MYC cautate
de noi. De aceea am adoptat o alta alternativa de stimulare a recombinarii si expresiei
RAG prin suprimarea caii represive datorate factorului de transcrierie NF-kB care inhiba
FOXO1(forkhead box O factor activator al transcrierii ambelor gene RAG1&2).Prin
10
intermediul contracararii actiuniiNF-kBprin agentul GSK-690693 (GlaxoSmithKlein) GSK
se produce inhibitia proteinkinazei B denumita si AKT(AKTi)(6) ceea ce reduce
consecvent nivelul kinazei CDK4. CDK4 fosforileaza serina 329 a factorului FOXO-1
ceea ce-i blocheaza accesul intranuclear. GSK actionand AKTi si CDK4i blocheaza
sechestrarea intracitosolica a FOXO-1 inlesnindu-i actiunea intranucleara pe
Erag(conserved transcriptional enhancer of RAG locus)(6). Asadar am incercat sa
inducem expresia RAG prin concentratii crescatoare de GSK urmand dinamica
viabilitatii celulare fata de efectul stagnant indus de IMA(Fig.5 IMA3M in B fata de
C,D,E,F,G H 1,3,5,7.5, 10,15,20 MGSK). Se observa usor faptul ca si la 15M
GSK(Fig.5G)se observa proliferarea celulara la 72h post-tratament(efect diametral opus
fata de stagnarea diviziunii indusa de 3M IMA. Fig.5B). Panta usor ascendenta a
celulelor tratate cu GSK (similara cu a celor tratate doar cu agentul de solubilizare
11
DMSO) atesta faptul ca acest stimul spre deosebire de IMA nu opreste diviziunea
celulara si-l recomanda pentru continuare studiului nostru.
Pentru a verifica modul in care cei doi agenti farmaceutici(IMA si GSK) pot afecta
nivelul recombinarii somatice in celulele pre-B am testat pe aceste culturi in paralel la
concentratiile de 10M GSK si 3M IMA efectul asupra expresiei RAG1 prin imunoblot,
(Fig. 6A si B) cu acelasi nr de celule (2x106) sacrificate la 6, 12, 24, 36, 48 si respectiv
72h dupa adaugarea agentului de inductie. Este interesant ca ambii reactivi induc
RAG1 la nivele comparabile
dar inductia pe inhibitor de
Abl kinase(RAG1 atinge
nivel maxim la 24h )
premerge pe cel de CDK4
kinase cu 12h (RAG1
atinge nivel maxim la 36h la
stimularea cu GSK).
Aceasta observatie apropie
cumva mai mult stimulul
oferit de GSK de cel fiziologic ce are loc in timpul maturarii pre-B spre B imature in
maduva osoasa a mamiferelor si unde tranzitia presupune 2-3 zile pana la aparitia IgM
de suprafata.
12
Urmatorul pas in seria noastra de experimente a fost sa incercam sa detectam
prin western blot prezenta c-MYC in celulele pre-B fie netratate sau supuse
tratamentului medicamentos cu IMA+, GSK+ pentru inductia RAG ori, cu 5M GM-CSF
(stimuleaza expresia c-MYC) sau 10M JQ1(inhibitor de c-MYC prin reducerea
factorilor de transcriere tip bromodomain), la 48 h post-tratament. Drept control am
folosit celule T Jurkat (godeul 1) cunoscute ca exprimand c-MYC si respectiv fibroblaste
umane HEK293T (godeul 2) sau murine 3T3NIH (godeul 3 ) transfectate cu un vector
de expresie pcDNAMYC(Fig7). Precum se observa comparand intensitatea benzilor
detectiei c-MYC
din godeurile
4(netratat)
5(+IMA),
6(+GSK),
7(+GMCSF),
precum si din
cuantificarile
densitometrice
corespunzatoare
incluse ca
histograme in
inset-ul din
dreapta sus pe
Fig.7 proteina c-MYC detectabila intracelular este neafectata de aceste tratamente.
Inhibitorul JQ1 este cel ce pare sa reduca detectia proteinei la un nivel de aproape
jumatate din cel decelabil in absenta oricarui tratament (comparam godeul 4 cu 8).
Urmatorul pas al investigarii noastre a fost acela al detectiei nivelului direct de
transcriere mRNA al genei c-myc din extras nuclear al celulelor pre-B, expresie
modulata de GM-CSF sau JQ1 in prezenta sau absenta GSK-690693. Pentru aceasta
13
RNA extras dintr-un numar egal de celule pre-B (2x106) este intai supus revers
transcrierii cu Mulv-Revers transcriptaza (+/-RT) si un primer revers R1A ce
hibridizeaza complementar la capatul 3’ al primului exon1 din gena c-myc. cDNA-ul
obtinut este apoi amplificat prin PCR
folosind R1A in conjunctie cu un
primer forward F1A hibridizand 5’ fata
de R1A pe acelasi exon(amplicon
296bp). In Fig.8A sunt prezentate
gelurile de poliacrilamida cu separarea
electroforetica pentru reactiile
+RT(pozitive) iar in B cele -
RT(negative) a patru dilutii succesive
cuantificate densitometric in Fig.8C.
Remarcabil transcrierea genei c-myc nu este afectata de agentul inductor al
recombinarii si poate fi modulata pozitiv (GMCSF)sau negativ (JQ1). Aceste
experimente ne confera certitudinea ca putem modifica diferential accesibilitatea locus-
ului genei c-myc in timpul transcrierii acestei gene prin agentii farmacologici alesi.
Urmatorul pas este acela al testarii recombinarii V/J in prezenta GMCSF si JQ1 pentru
a verifica in ce masura acesti agenti influenteaza evenimentele diferentierii celulelor
pre-B la nivelul locus-ului IGL kappa.
B1.2 Inductia simultana a recombinarii somatice si transcrierii genei c-myc in
limfocitele pre-B murine.
Primul experiment testat a fost acela al compararii efectului inductor al RAG prin IMA
fata de GSK in reactiile de recombinare pe celule pre-B la 24,48 si respectiv 72h post-
stimulare. In Fig.9A sunt ilustrate gelurile de migrare electroforetica a reactiilor de
nested PCR (descrise in Fig.2 pg5 a acestui raport) cu ADN genomic provenit de la
acelasi numar de celule din fiecare din reactiile mentionate. Spre evidentiere sunt
ilustrate si reactii directe de amplificare din acelasi ADN genomic cu primeri specifici
locus-ului histonei H1f(gena exprimata constitutiv). Desi IMA induce cu aproape 12h
mai devreme decat GSK-ul expresia de RAG este demn de remarcat faptul ca
14
recombinarea are o dinamica celulara si eficienta similara prin ambele tratamente. In
Fig. 10 A,B si C sunt prezentate aceleasi tipuri de reactii obtinute cu tratament simultan
IMA + GMCSF, IMA + JQ1, GSK + GMCSF, GSK + JQ1 la 24,48 si respectiv 72h, iar in
Fig.10D sunt ilustrate histogramele normalizate (fata de reactiile unic stimulate +IMA
respectiv +GSK). Se observa efectul negativ al JQ1 care reduce considerabil eficienta
recombinarii efect foarte pronuntat mai ales la tratament simultan cu GSK(>40% din
recombinarea detectabila in absenta JQ1 la 48 si respectiv 72h).
Pentru a putea identifica
conditiile optime de producere prin
iradiere a translocatiilor IGK/MYC
in conditiile GSK + GMCSF, GSK
+ JQ1 determinate, am testat
preliminar un set de primeri ce
hibridizeaza pe locus-ul genei c-
myc din cromozomul 8 murin
ilustrat schematic in josul Fig.11.
Datele preliminare ne pun in
evidenta amplificari genomice interexonice (3.9kb interexonice1_3 cu F1A&R3A) si
respectiv (1.6kb interexonice1_2 cu F1A&R2B). Aceste reactii trebuie optimizate ca
15
reactii control pozitiv in vederea certificarii integritatii locus-ului MYC in etapa ulterioara
a proiectului.
B1.3 Secventiera jonctiunilor Vk/jk a recombinarii somatice induse in limfocitele
pre-B murine.
In urma recombinarii din celulele pre-B(IMA stimulate) si excizand din gel benzile
corespunzatoare recombinarii Vk-Jk2 am reusit sa clonam preliminar aceste jonctiuni in
8 subclone distincte. S-a constatat că în toate cazurile, fragmentul J participant a fost
întotdeauna Igkj2 >ENSMUST00000198234.1,
https://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000076605;r
=6: 70,722,916-70722958).
In ceea ce priveste segmentul V, au fost descoperite doua fragmente V participante
apartinand clusterului IgKv4-86, identificat in trei dintre inserturi (>
ENSMUST00000200454.1https://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core; g
= ENSMUSG00000076536; r = 6: 68910411-68910973), și clusterul IgKv8-27 (>
ENSMUST00000197272;https://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=
ENSMUSG00000076580;r=6:70171809-70172270), identificat in restul de cinci inserturi.
In Anexa 1 -RST etapa aII a 2018 am inclus datele exacte ale secventierii acestor clone
cu ilustrarea pe un cod de culori a secventelor primeri folosite pentru amplificare si a
secventelor detectate la nivelul jonctiunilor, precum si sit-urile de restrictie folosite la
insertie.
Secvențele coding joint-urilor relevă activitatea enzimei Tdt(Terminal
deoxinucleotidil transferaza) și a endonucleazei Artemis
In Tabelul 1 este dată secvența coding joint-urilor identificate in cadrul secvențelor de
recombinare VJ obținute anterior. După cum se poate observa in tabel, la nivelul unora
dintre secvențe s-au putut identifica secvențe palindroamice. Aceste secvențe, sunt cel
mai probabil, rezultatul activității “nefidele” a enzimei Artemis. Deschiderea hairpin-ului
format in urma clivajului realizat de RAG, este creată de către endonucleaza Artemis.
Studiile arată că deseori aceasta taie nefidel în afara axei, ceea ce dă naștere la
16
formarea unor extensii scurte, care pot duce la inserții palindromice numite și nucleotide
P. La nivelul clonelor 1, 3, 6 au fost identificate secvențe palindromice formate din 4
nucleotide, iar la nivelul clonei 4 s-a identificat o secvența palindromica alcatuită din 10
nucleotide. Mai mult decât atât, au fost observate și regiuni bogate in GC, cum este
cazul clonelor 2, 5, 6 și 7. Aceasta descoperire sugerează activitatea enzimei Tdt care
adaugă inserții scurte non-template la nivelul joncțiunii V-J. Nucleotidele insertate de
enzima Tdt sunt cunoscute ca și nucleotide N. Clona 6 este rezultatul activității atât a
enzimei TdT(poliC-urile sunt semnatura sa), cât și a activității nefidele a endonucleazei
Artemis.
Tabelul 1. Secvența coding joint-urilor identificată la nivelul secvențelor de recombinare VJ ale lanțului ușor.
Secvențele palindroamice identificate sunt marchate in culori. Bazele perechi sunt evidențiate in aceeași culoare.
Nucleotidele N sunt date in culoarea roz.
Nr.
clonă
Secvență (5’- 3’) coding joint
1 5’ GACAGGGTTACAGCTATCTTAG 3’
2 5’ GTAGTAACCCGC 3’
3 5’ TAGCAGCAAGTACA 3’
4 5’ TAGCAGCAAGTACTTG 3’
5 5’ CGTGGG 3’
6 5’ CTTTCAAGGTTCACATGTTCCCCCTC 3’
7 5’ GTAGTAACCCAC 3’
Aceste rezultate preliminare sugereaza puternic contextul mentinerii post stimulare IMA
a TdT-ului o enzima ce este detectata in celulele de leucemia B limfoblastica(B-ALL).
Acest lucru trebuie confirmat si prin identificarea directa a enzimei TdT. Importanta
acestei observatii este covarsitoare in desfasurarea experimentelor noastre ulterioare
unde dorim sa identificam translocatii care sa mimeze conditiile oncogenice detectate in
aceasta boala pe celulele A-70.
17
Definire Obiective 3 si 4(activitati C1.1-C1.3 etapa a III-a 2019 inca in desfasurare
pana la data 15 dec. 2019)
C1.1-1.2 Studiul leziunilor induse postradiativ in celule pre-B cu recombinare, pe
locus-ul c-myc precursoare ale translocatiilor IGL/MYC ; stabilirea regiunilor de
fragilitate ale locus-ului.(D2b pg11-12 formularul C&D al aplicatiei de proiect) Scopul
acestui obiectiv este de a studia efectele iradierii cu raze X asupra integritatii locus-ului
c-myc(cromozomul8-om/cromozom15-murin) la celulele pre-B sub influenta
modulatorilor farmacologici de inducere a recombinarii si expresiei oncogenei c-MYC.
Asa cum formulasem la pg. 11 a propunerii de proiect aceasta activitate are 2
subobiective: C1.1 stabilirea conditiilor de stimulare si iradiere optime ce duc la leziunile
premergatoare translocatiilor si C1.2 detectarea unor pozitii cheie ce acumuleaza
leziuni in locus-ul c-myc postradiativ (sit-uri de fragilitate) unde sunt favorizate aparitia
de translocatii reciproce intre locusul IGK (cromozomul 2-om/cr.6murin-locul
recombinarii) si locus-ul c-myc (cromozomul8-om/cromozom15-murin).
Pentru a testa aceste efecte celulele pre-B A-70 murine sunt incubate in cultura
+/-GSK pentru inductia RAG ori, +/- 5M GM-CSF (stimuleaza expresia c-MYC) sau +/-
18
10M JQ1(inhibitor de c-MYC prin reducerea factorilor de transcriere tip bromodomain),
iar la 48 h post-tratament celulele sunt supuse iradierii cu RazeX cu o doza de 1, sau
5Gy, dupa care sunt rapid recoltate(20-40 min. postiradiere) si se extrage ADN-ul lor
genomic in asa fel incat nu se permite refacerea leziunilor. Pentru a estima discriminativ
afectarea locus-ului c-myc folosim 2 amplificari complementare. In prima folosim o
pereche de primeri ce amplifica o regiune inter exon1 si 2(IEX1_2) de 2714bp(primerii
for-OAM8 care hibridizeaza in regiunea 5’UTR a exonului 1 si rev-OAM4 care
hibridizeaza ca revers complement pe secventa 3’ a exonului 2). Cea de-a doua
amplificare se extinde inter exon2 si 3(IEX2_3) de 2714bp(primerii for-OAM3 care
hibridizeaza in regiunea 5’ a exonului 2 si rev-OAM7 care hibridizeaza ca revers
complement pe secventa 3’UTR a exonului 3)(Ambii ampliconi si primerii folositi sunt
schematic reprezentati pe diagrama insotind Fig.12A) . Se observa faptul ca ambele
amplificari acopera in intregime exonul 2 central. In Fig.12B sunt ilustrate gelurile de
electroforeza cu separarea reactiilor de PCR obtinute la experimentul cu iradiere raze X
doza de 1Gy(primele 17 godeuri partea stanga si ultimele 17 partea dreapta a imaginii).
Aceste experimente au fost repetate pentru fiecare tip de iradiere de 3 ori si rezultatele
au fost exprimate sub forma
cuantificarii intensitatii benzilor
corespunzatoare ampificarii
IEX1_2 si IEX2_3 prin
densitometrie din scan-urile
gelurilor de separare precum
cele ilustrate in Fig12B. Pentru
aprecierea efectelor iradierii
rezultatele cuantificarilor au fost
exprimate sub forma raportului dintre intensitatea reactiei in prezenta iradierii raportate
la reactia in conditii identice de stimulare farmacologica obtinuta de la ADN-ul celulelor
neiradiate. In Fig.13 sunt reprezentate impreuna (IEX1_2 si IEX2_3) rezultatele obtinute
la iradierile de 1Gy. Cu regret rezultatele pe IEX2_3 de control DMSO (agentul de
control folosit la solubilizarea tuturor compusilor farmacologici) trebuiesc refacute (nu
sunt confirmate la doze de 5Gy) si reflecta doar o extragere defectuoasa de ADN
19
genomic de la un singur experiment (30mai2018), nu o diminuare a amplificarii
interexonice 2-3. Exceptand acest neajuns tehnic la 1Gy iradiere, fluctuatiile de
amplificare sunt relativ mici (rapoartele aproape de valoarea unitara +0,4) pentru
ambele reactii si toate incubarile cu mentiunea efectelor mai pronuntate in prezenta JQ1
inhibitor de factori de transcriere bromodomain. Rezultatele in cazul iradierii la doza de
5Gy sunt prezentate diferentiat in Fig.14 in 2 diagrame pentru fiecare tip de reactie si
pentru claritate. Rezultatele in prezenta modularii JQ1simple sunt similare pentru
ambele reactii cu cele de la iradierile de 1Gy indicand indirect faptul ca efectele
observate trebuie atribuite mai degraba modularii farmacologice decat efectelor
postradiative. Mult mai pronuntat si specific indus(de iradiere) sunt efectele cauzate de
iradierea la 5Gy pe reactia IEX2_3 la celulele supuse efectului concertat GSK+JQ1. In
urma iradierii se produce o reducere a amplificarii de 27,7 ori fata de cea din controlul
neiradiat(+Irad/-Irad=0,036, incadrate in dreptunghiul cu chenar linie intrerupta rosie).
Efectul poate fi fara echivoc atribuit dozei crescute de iradiere(nu se observa la 1Gy), si
avand loc fie in intronul 2 sau in exonul 3. Astfel de leziuni genice induse radiativ in
contextul recombinarii(reactie cu GSK) si a modularii simultane a transcrierii c-MYC
sunt precursorii mult cautati ai translocatiilor presupusi in ipoteza noastra de lucru a
propunerii de proiect. Remarcabil este faptul ca leziunile identificate sunt localizate
20
specific spre portiunea 3’ terminala genica induse de inhibitia actiunii factorilor
bromodomain BRd3/4 pe Myc(JQ1) ceea ce indirect poate implica interferenta cu unul
din urmatoarele trei mecanisme: capacitatea de elongare terminala a polimerazei RNA
II, cu splicing-ul dintre exonii 2 si 3 sau cu o posibila stagnare a polimerazei II RNA la
nibvelul sit-ului de poliadenilare.
C1.3 Efectul fenotipic aparut prin modularea transcrierii locusului c-myc in celule
pre-B cu recombinare; stabilirea biomarker-ilor reprezentativ afectati de leziunile
genice precursoare ale translocatiilor IGL/MYC (D2c-d pg12-13 formularul C&D al
aplicatiei de proiect) Scopul acestui obiectiv este de a studia efectele fenotipice de
expresie exercitate asupra pre-limfocitelor B v-abl A70 de agentii modulatori ai c-MYC
in prezenta sau absenta recombinarii si a leziunilor genice induse radiativ. Pentru
aceasta celulele crescute in prezenta sau absenta stimulilor GSK, GMCSF, JQ1 aplicati
fie unic sau insumati (GSK+GMCSF, GSK+JQ1)pe o perioada de 48 h dupa care sunt
recoltate si supuse analizei prin imunoblot cu anticorpi specifici reactivi fata de fiecare
din componentele celulare investigate. De prim interes pentru noi sunt factorii care
regleaza diviziunea celulara si progresia in faza G1, ce controleaza procesele
oncogenice. In Fig.15 sunt ilustrate rezultatele sumative obtinute de la cei mai
21
reprezentativi sase markeri celulari testati (TIP60 un factor de reglare transcriptionala a
transactivatorilor celulari Myc, STAT3, NF-κB, E2F1 si p53 dar si cu functie de
acetiltransferaza histonica la reziduul K4 al H2AX fosforilate in urma rupturilor dublu
catenare ADN, CDK6 o S/T protein kinaza implicata in fosforilarea ciclinelor de tip D-
G1 care controleaza ciclul celular in special progresia G1-S in celulele hematopoietice,
PIAS2 coreglator transcriptional (silencer)pe calea p53 si STAT ce functioneaza ca E3
ubicuitin ligaza a complexului SUMO, p300/CBP co-activator transcriptional implicat in
realizarea de punti intre transactivatori si masinaria polimerazei II RNA, CDk4 ca si
CDK6 o alta o S/T protein kinaza implicata in fosforilarea ciclinelor de tip D controland
ciclul celular in special progresia G1-S dar si fosforilarea proteinei retinoblatoma RB
care modificata disociaza din RB/E2F eliberand E2F factor esential in diferentierea
limfocitelor B, ciclina D2 care formeaza un complex strans asociat cu reglarea CDK 4 si
6 factor esential la tranzitia G1-S in ciclul celular). Foarte important pentru studiul nostru
sunt factorii modulati dinamic de agentii farmacologici folositi de noi. Din cuantificarile
densitometrice ale western blot-urilor se observa cum GMCSF+ GSK duce la o crestere
substantiala a CDK6(7) in timp ce JQ1+ GSK stimuleaza expresia Ciclinei D2(8)(ambele
modulari generand o crestere de aproape 5 ori expresiei factorilor implicati). Aceste
observatii ne indreptatesc sa atribuim modularilor efectuate asupra celulelor preB un rol
important mitogen esential patogenezei maligne si degenerarii de tip limfom.
Concluzii
1)Am reusit sa testam si optimizam conditiile de crestere ale celulelor vAbl-preB
necesare inductiei recombinarii V(D)J.
2) In conditiile propuse de proiectul nostru detectam cu succes si putem cuantifica
eficienta recombinarii V(D)J la nivel genomic indusa de Imatinib.
3) Am reusit sa masuram efectele iradierii cu raze X asupra celulelor vAbl-preB induse
sa produca recombinarea somatica si putem concluziona ca doze mici de 1-2Gy induc o
scadere decelabila a recombinarii Vk-Jk2, pe un fond substantial de crestere a focarelor
de H2AX consecinta a DSB generalizat induse.
22
4) Pe celulele A-70 am identificat 4 conditii de modulare simultana atat a expresiei
RAG(IMATINIB vs GSK-690693) cat si a factorului de transcriere c-MYC(GMCSF, JQ1).
5) Recombinarea la nivelul locus-ului IGK are loc cu eficienta distincta in prezenta
GMCSF(nealterata) sau a JQ1(scadere semnificativa) factori ce trebuie considerati la
inducerea translocatiilor.
6)Secventele jonctionale Vk-Jk2 detectate in reactiile induse pe celulele A-70 indica
preliminar prezenta TdT, factor ce poate creste instabilitatea genomica similar cu cea
observata in leucemia limfoblastica acuta B-ALL
7)Am identificat leziuni genice precursoare ale translocatiilor la nivelul locus-ului c-myc
induse post-radiativ la doza de 5Gy raze X in celulele pre-B si am localizat pozitia lor la
nivelul regiunii 3’ terminale ( Intron 2, Exon3). Aceste pozitii sunt extrem de importante
putand altera regiunea C terminala a proteinei cMYC cea unde este pozitionat domeniul
de legareADN HLH(helix loop helix), necesar recunoasterii secventei de activare.
8) Am testat modul cum mediatorii farmacologici folositi de noi la cresterea celulelor
preB moduleaza dinamic expresia unor markeri fenotipici esentiali in oncogeneza
precum CDK6 si ciclina D2 ambii implicati la progresia ciclului celular din faza G1/S
precursoare diviziunii celulare. Ambii acesti factori sunt esentiali in degenerarea
limfomatoasa.
9) Datele noastre obtinute in acest proiect vor face obiectul a doua publicatii. Prima
publicatie „Elena Ionita, Aurelian Marcu, Mihaela Temelie, Mihai Serbanescu and Mihai
Ciubotaru, Low dose radiofrequency electromagnetic field exposure effects on somatic
recombination during B lymphocytes development, ” manuscris aproape incheiat este
atasat ca anexa 2 alaturi de acest raport intermediar faza 3 2019.
10)Datele obtinute de noi in 2018 au fost prezentate ca prezentare orala (Ciubotaru
Mihai) la conferinta internationala „5th International Conference on MATHEMATICS and
COMPUTERS in SCIENCES and INDUSTRY (MSCI 2018)Corfu Greece 25-27 august 2018”,
Subsectiunea Electromagnetic Fields Irradiadions High Power Laser Applications (MSCI 2018)
, prezentare cu titlul „Simulation of high intensity pulsed electromagnetic fields exposure of
23
developing pre B lymphocytes undergoing V(D)J gene recombination”. Mihai Ciubotaru, Elena
Ionita si ulterior sub forma de poster la conferinta internationala de pe 10Sept. 2018
„International ‘Radiobiology’ Satellite Meeting of the 15th National Conference of Biophysics”
Magurele Romania.
Bibliografie
1 Wilson, M. K., McWhirter, S. M., Amin, R. H., Huang, D. & Schlissel, M. S. Abelson virus
transformation prevents TRAIL expression by inhibiting FoxO3a and NF-kappaB. Mol Cells29,
333-341, (2010).
2 Bredemeyer, A. L. et al. ATM stabilizes DNA double-strand-break complexes during V(D)J
recombination. Nature442, 466-470, doi:nature04866 (2006).
3 Carmona, L. M., Fugmann, S. D. & Schatz, D. G. Collaboration of RAG2 with RAG1-like
proteins during the evolution of V(D)J recombination. Genes Dev30, 909-917, (2016).
4 Helmink, B. A. et al. H2AX prevents CtIP-mediated DNA end resection and aberrant repair in
G1-phase lymphocytes. Nature469, 245-249, (2011).
5 Huang, X. & Darzynkiewicz, Z. Cytometric assessment of histone H2AX phosphorylation: a
reporter of DNA damage. Methods Mol Biol314, 73-80, (2006).
6 Ochodnicka-Mackovicova, K. et al. NF-kB and AKT signalling prevent DNA damage in
transformed pre-B cells by supressing RAG1/2 expression and activity Cytometric assessment of
histone H2AX phosphorylation: a reporter of DNA damage. Blood 126, 1324-1335, (2015).
7 Fujimoto T., Anderson K., Jacobsen S.E.W., Nishikawa S-i and C Nerlov C., Cdk6 blocks
myeloid differentiation by interfering with Runx1 DNA binding and Runx1-C/EBPa interaction.
EMBO Journal 26, 2361–2370(2007).
8 Chiles T. C., Regulation and Function of Cyclin D2 in B Lymphocyte Subsets. Journal of
Immunology 173, 2901-2907(2004).