PLASMIDELE ȘI ROLUL LOR CA VECTORI

Coordonator: SL. Dr. Biolog dr. Ing Vasilica BarbuMasteranzi: Guţan Valentina

Ţuguţchi Alexandru

PLASMIDELE: Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenar, circular covalent închis (ADNdcCCC) sau liniar

care posedă informaţie genetică proprie şi, de regulă, diferită de cea a nucleoidului . sunt structuri moleculare invizibile prin tehnici uzuale in situ, dar vizibile la microscopul

electronic, după extracţie şi purificare au calitate de repliconi, deci se replică autonom de cromozomul bacterianşsi posedă chiar unele

gene ce codifică enzime necesare propriei replicări, replicându-se prin trei mecanisme: Theta, Rolling Circle

ele se transmit pe verticală (de la o generaţie la alta) prin diviziune directă - prin partiţia echilibrată a numarului de plasmide din celula mamă în celulele fiice, dar şi pe orizontală (de la un individ la altul, într-o populaţie), prin conjugare.

plasmidele sunt exemplul tipic de clonare naturală, in vivo, fiind capabile să transfere, pe lângă informaţia genetică proprie şi unele gene cromozomale deoarece, când se desprind din cromozomul bacterian, pot prelua una sau cateva gene de pe acesta, din vecinatatea situsului de integrare şi să le transfere unei alte bacterii prin procesul de conjugare bacteriana.

pot fi naturale (ColE1) sau artificiale (create prin tehnici de inginerie genetica) şi sunt folosite ca vectori în experimentele de clonare genică

prezenta plasmidelor pare să fie un fenomen universal în lumea bacteriana (bactenii Gram pozitive sau Gram negative), dar sunt intalnite şi la unele eucariote inferioare (drojdii sau fungi) precum şi în mitocondrii sau cloroplaste.

Clasificarea plasmidelor:1. După criteriul autotransferabilităţii există trei categorii de plasmide:

Conjugative sau autotransferabile, care sunt numite şi plasmide transferabile, infecţioase, conjugoni sau transferoni.

Mobilizabile, care nu posedă operonul tra, dar posedă gene mob şi pot realiza transferul conjugativ doar în prezenţa altei plasmide conjugative care să iniţieze procesul;

Neconjugative sunt plasmide fară operonul tra şi fără gene mob, deci nu pot realiza conjugarea bacteriană.

2. Dupa criteriul integrării în cromozomul bacterian există două grupe de plasmide

o Epizomi sau plasmide integrative ce pot exista alternativ atât în stare autonomă cât şi în forma integrate reversibil în nucleoid;

o Neintegrative, plasmide care există doar în stare autonomă şi nu se pot integra în nucleoid.

3 . Dupa criteriul incompatibilităţii, prin care plasmide din aceeaşi grupă nu pot coexista în aceeaşi linie celulară bacteriană, deoarece, fiind acelaşi replicon-type, au origini de replicare similare şi intră în competiţie moleculară pentru aceleaşi enzime implicate în proces.

4. După criteriul numarului de copii plasmidiale per celulă, sunt plasmide:

High-copy, care au între 10 şi cateva sute de copii per celulă bacteriană; Low-copy, ce posedă 1-10 copii per celulă bacteriană.

5. După criteriul structurii moleculare, există două clase de plasmide:

•Circulare care sunt alcătuite din ADNdc care, cel mai adesea, este CCC şi doar temporar se

poate întâlni şi în forma CO, ce prezintă o legătură fosfodiesterică desfacută, pe o catenă.

•Liniare care sunt formate din ADNdc liniar (L) şi care pot fi:

■ Cu telomere "in ac de par" adica cele doua catene se continuă una pe cealaltă printr-o

legatură covalentă şi au palindroame terminale, bogate în perechi A=T.

■ Cu telomere invertoni, la care cele două catene nu se continuă una pe cealaltă, ci prezintă

fiecare, la capatul 5' o proteină TP ataşată covalent.

Clasificarea plasmidelor:

6. După proprietăţile majore (funcţionale) există mai multe categorii de plasmide:

Plasmide F sau factor de fertilitate, ce conţin operonul tra (alcătuit din 14-15 gene), care controleaza transferul conjugativ între bacteria donor si cea receptor prin intermediul pilului de conjugare (denumirea veche - pil de sex).

În functie de prezenţa/absenţa, localizarea şi structura plasmidului F, bacteriile pot fi:•F- - celule bacteriene care nu posedă plasmid F nici liber, nici ca epizom, (considerate “femele")•F+ - celule bacteriene (considerate "mascule") care prezintă factorul de fertilitate în forma extracromozomala( 1-2 copii/celula). Îndeplineşte rol de bacterie donor în procesul de conjugare

•Hfr - celule procariote care prezintă plasmidul F integrat ca epizom in nucleoid şi care prezintă un potenţial crescut de recombinare a genelor cromozomale;•F’ – bacterii la care excizia epizomului F din cromozomul bacterian se face incorect şi astfel plasmidul achiziţioneaza una sau cateva gene cromozomale;•F" - bacterii care rezultă în urma conjugării dintre o celula F' şi celula F-și care posedă genele achiziţionate de plasmidul F în stare diploidă;

Plasmide R conţin gene ce determină rezistenţa celulei gazdă la antibiotice, sulfamide, chimioterapice, ridică mari probleme în medicină, deoarece face imposibilă tratarea unor maladii infecţioase.

Clasificarea plasmidelor:

Ingineria genetică cuprinde tehnici efectuate in vitro cu gene, cromozomi sau celule întregi în scopul construirii unor structuri reprogramate genetic.

VECTORI UTILIZAŢI ÎN CLONAREA GENETICĂ LA ESCHERICHIA COLI

Vectorii reprezintă molecule de ADN în interiorul cărora se introduc fragmentele de ADN de studiat, ce poate fi de origine pro- sau eucariotă.

Vectorii pot fi clasificaţi în funcţie de diferite criterii:a) posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN pasager, vectorii se împart în:

vectori de clonare vectori de exprimare

b) tehnica de clonare folosită, vectorii pot fi: vectori de clonare inserţională vectori de clonare prin înlocuire (substituţie)

c) structura şi modul de funcţionare, vectorii se împart în: vectori plasmidiali vectori virali vectori hibrizi –fagimide cosmide

d) spectrul de gazde, există vectori: vectori congenerici vectori shuttle

Proprietăţile plasmidelor ca vectori de clonare1. Să nu conţină gene tra, deci să nu

genereze proces de conjugare bacteriană şi, ca atare, să nu fie autotransmisibile.

2. Să conţină situsuri unice pentru un număr cât mai mare de endonucleaze de restricţie.

3. Situsul de inserţie să nu fie localizat în genele implicate în replicarea şi partiţia plasmidului.

4. Să prezinte markeri genetici absenţi în celula receptoare.

5. Să aiba o greutate moleculară mică, pentru a fi uşor de izolat şi de manipulat.

6. Să prezinte cât mai multe copii per celulă.

Primul plasmid natural care a fost folosit în experimente de clonare genetică este plasmidul Col E1 de

la Eschehchia coli

Strategia de clonare în vectorul pBR322 şi derivaţii săi•Inserţia ADN pasager - construcţia vectorului

recombinat

ADN pasager va fi inserat într-unul din situsurile de restricţie din cele 2 gene de antibiorezistenţă (Apr, Tcr): (1) ambele molecule se supun digestiei cu o aceeaşi enzimă de restricţie, ceea ce va conduce la obţinerea de capete complementare; (2) se amestecă cele 2 tipuri de molecule astfel digerate; (3) se adaugă şi o ADN ligază ce va reface legăturile fosfodiesterice rezultând vectorul recombinat.

•Propagarea vectorului recombinat în tulpini de E.coli şi selecţia celulelor transformate

Vectorul recombinat se introduce (prin tehnici de transformare genetică in vitro) într-o tulpină bacteriană ce trebuie să prezinte sensibilitate la ambele antibiotice (Aps Tcs). Celulele transformate vor prezenta fenotip Apr Tcs sau Aps Tcr.

Vectorii pGEM (fig. 5) sunt vectori plasmidiali de

exprimare care conferă, deci, şi posibilitatea analizei

exprimării ADN heterolog. în structura lor intră

următoarele regiuni:

•regiunea ori din plasmidul Col E1, ce controlează

replicarea vectorului;

•Apr = gena de rezistenţă la ampicilina, pe baza căreia

sunt selecţionaţi transformanţii;

•regiunea PCS care conţine situsuri pentru 10

endonucleaze de restricţie + 3 enzime izoschizomere;

•doi promotori, din fagii SP6 şi T7, care flanchează

regiunea PCS şi care sunt în orientare inversă unul fată

de celălalt, permiţând transcrierea ambelor catene ale

ADN heterolog.

Fig. 5 Vectorul pGEM 3/4ori [col E1]-origine a replicării din Col E1

Ap’-gena de rezistenţă la ampicilinăPCS-situs de policlonare ce conţine situsuri pentru 10 endonucleaze de

restricţie (are orientare inversă în pGEM 3 faţă de pGEM 4)

P-SP6 – secvenţa promotor din secvenţa SP6

P-T7 – secvenţa promotor din fagul T7

Vectorii pGEM

VĂ MULŢUMIM PENTRU ATENŢIE!!!