1

PASTOREX™ CRYPTO PLUS 61747 60

DETECŢIA ANTIGENELOR SOLUBILE DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ÎN LICHIDE BIOLOGICE (SER, L.C.R., L.B.A., URINĂ)

881131 - 2014/07 1- INTERESUL CLINIC Criptococoza este o infecţie oportunistă ce apare la pacienţi imunodeprimaţi şi mai ales în cursul bolii SIDA, în care criptococoza este în prezent principala infecţie oportunistă cauzatoare de deces la bolnavii cu SIDA. Incidenţa sa în Europa occidentală şi SUA se situează între 2 şi 10%, dar depăşeşte 15% în anumite regiuni din Africa (3). La aceşti pacienţi imunodeprimaţi, infecţia diseminează rapid în sistemul nervos central (meninge) precum şi în alte organe, după faza primară pulmonară (1). Antigenele solubile sunt detectabile rapid în ser, lichidul cefalorahidian (L.C.R.), lavaj bronho-alveolar (L.B.A.) şi urină. Diagnosticul criptococozei se bazează pe detecţia microscopică a fungilor capsulaţi, pe izolarea în cultură a Cryptococcus neoformans şi pe detecţia antigenelor capsulare în fluidele biologice (2). 2- PRINCIPIUL TESTĂRII PASTOREX™ Crypto Plus este un test calitativ şi semi-cantitativ de aglutinare, pentru detecţia simplă în fluidele biologice (ser, LCR, LBA, urină) a polizaharidului capsular de Crytococcus neoformans denumit glicuronoxilomanan (GXM). Acest test utilizează particule de latex de culoare roşie, sensibilizate cu anticorpi monoclonali anti-glicuronoxilomanan, o componentă majoră a capsulei Cryptococcus neoformans (4). Aglutinarea care rezultă în urma reacţiei dintre particulele de latex şi GXM este vizibilă cu ochiul liber. Limita sensibilităţii pentru ser este de 50 ng/ml. Testul poate fi efectuat pe probe inactivate termic (30 minute la 56°C) pentru a elimina riscul contaminării cu virusul HIV. Se impune pretratarea enzimatică al tuturor probelor cu excepţia urinii, pentru a elimina interferenţele şi pentru a îmbunătăţi sensibilitatea de detecţie (5, 6, 7). Eşantioanele pozitive sunt apoi titrate prin diluţii seriale într-o soluţie tampon: Titrul antigenic indică stadiul infecţiei precum şi gradul său de diseminare. Determinarea cineticii antigenice pe parcursul evoluţiei bolii permite evaluarea eficienţei terapiei (2). 3- PREZENTARE Cutie de 60 de teste : cod 61747 conţinând: Latex Cryptococcus: 1 sticluţă picurătoare cu 1 ml de latex Cryptococcus: particule de latex sensibilizate cu anticorpi

monoclonali de şoarece anti-glicuronoxilomanan, în tampon glicină. Antigen Control Pozitiv: 1 sticluţă picurătoare cu 0,5 ml de control pozitiv: poliozid capsular purificat de Cryptococcus

neoformans. Tampon diluant : 1 sticluţă picurătoare cu 10 ml de tampon albumină glicină. Pronază: 2 flacoane de enzimă liofilizată (pronază) de reconstituit într-un (1) ml de apă distilată sau demineralizată. Soluţie de stopare: 1 sticluţă picurătoare cu 2 ml de soluţie de stopare (inhibitor enzimatic) 15 carduri de aglutinare de unică folosinţă 100 de baghete de unică folosinţă Toţi reactivii conţin 0,02% mertiolat şi < 0,1% azidă de sodiu. 4- CONDIŢII DE PĂSTRARE: Toţi reactivii sunt stabili până la data de expirare inscripţionată pe etichetă, dacă sunt păstraţi la +2-8°C, în absenţa unei contaminări microbiene (chiar după desigilarea trusei). Pronaza reconstituită poate fi păstrată timp de 4 săptămâni la +2-8°C, sau câteva luni la -20°C. Păstraţi flacoanele cu reactivii latex în poziţie verticală. REACTIVII LATEX NU TREBUIE CONGELAŢI 5- MATERIALE NECESARE NEFURNIZATE: Pipete de precizie Microtuburi cu dop etanş Agitator rotativ orizontal (160 rpm) Agitator de tip vortex

2

Baie de apă, la 56°C Baie de apă, la 100°C Rezervor pentru dezinfectare 6- MĂSURI DE PRECAUŢIE: Calitatea rezultatelor depinde de respectarea strictă a Bunelor Practici de Laborator. Toţi reactivii şi probele, se folosesc la temperatura camerei (18-30°C) Nu atingeţi suprafaţa de reacţie a cardurilor de aglutinare. Schimbaţi pipeta sau vârfurile de prelevare de unică folosinţă pentru fiecare probă testată. Agitaţi flacoanele cu latex înainte de utilizare Ştergeţi vârful sticluţei picurătoare pentru a obţine picături de reactiv corect calibrate La repartizarea picăturilor, ţineţi sticluţele cu reactiv în poziţie verticală. Schimbaţi bagheta pentru fiecare reacţie. Eliminaţi toate materialele de unnică folosinţă într-un recipient autoclavabil sau într-o baie de dezinfecţie. INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Observaţi cu atenţie tehnicile şi precauţiile curente privind protecţia faţă de materialele cu risc microbiologic. Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă

rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

7- INSTRUCŢIUNI DE UTILIZARE 1) PREGĂTIREA ENZIMEI PRONAZA Reconstituiţi 1 flacon de pronază cu 1ml de apă distilată sau demineralizată. Evitaţi formarea spumei în timpul reconstituirii şi asiguraţi-vă că liofilizatul s-a dizolvat complet. Dacă lunar se efectuează 30-40 de teste, păstraţi pronaza la +2-8°C (rămâne stabilă timp de 4 săptămâni). Pentru serii de lucru mai mici, preparaţi porţii (alicote) de câte 20 μl în eprubete separate şi păstraţi-le la -20°C. 2) PREGĂTIREA PROBELOR Stocarea Se recomandă prelucrarea probelor imediat după recoltarea acestora, în caz contrar le puteţi păstra una-două ore la +2-8°C. ATENTIE! Folosiţi pentru probele de ser numai eprubete uscate (fără aditivi). Interferenţele datorate excesului de albumină, lipide, hemoglobină şi bilirubină, nu au fost testate. Prelucrarea a) Ser, lavaj bronho-alveolar Pipetaţi 120 μl din proba de testat într-o eprubetă cu dop etanş, apoi adăugaţi 20 μl de pronază. Amestecaţi energic şi încălziţi la 56°C, timp de 30 minute Scoateţi tubul din baia de apă şi adăugaţi 1 picătură de soluţie de stopare (inhibitor enzimatic). Omogenizaţi foarte bine. ATENŢIE! Atunci când folosiţi baia de apă, evitaţi pătrunderea apei în eprubete deoarece acest lucru poate duce la rezultate false. b) Lichid cefalo-rahidian In cazul în care LCR este foarte tulbure sau conţine hematii, centrifugaţi timp de 5 minute la 350 g (2000 rpm) şi colectaţi

supernatantul. Introduceţi 120 μl din proba de testat într-o eprubetă cu dop etanş, apoi adăugaţi 20 μl de pronază. Amestecaţi energic şi încălziţi la 56°C, timp de 30 minute. Scoateţi eprubeta din baia de apă de 56°C. Opriţi activitatea enzimatică a pronazei prin încălzirea acesteia în baie de apă la 100°C, timp de 5 minute. Omogenizaţi perfect. Lăsaţi să se răcească timp de 3-4 minute înainte de a începe reacţia de aglutinare. ATENŢIE! Atunci când folosiţi baia de apă, evitaţi pătrunderea apei în tuburi, deoarece acest lucru poate genera rezultate false. c) Urină Diluaţi urina în proporţie de 1:2 în tampon glicină.

3

3) REACŢIA DE AGLUTINARE Aplicaţi 40 μl de probă prelucrată într-un cerc de pe suprafaţa cardului de aglutinare. Adăugaţi alături o picătură de latex Cryptococcus Folosiţi o baghetă pentru omogenizare perfectă. Efectuaţi un control negativ amestecând 40 μl de tampon diluant cu o picătură de latex. Aşezaţi cardul de aglutinare pe agitator timp de 5 minute (160 rpm), la temperatura camerei (+18-30°C). 8- INTERPRETAREA REZULTATELOR Citirea rezultatelor: O reacţie pozitivă este indicată de aglutinarea particulelor de latex cu proba de testat, dar nu şi cu controlul negativ (alcătuit din latex + tamponul diluant). Titrarea: Diluţiile în tamponul glicină pot fi realizate după cum urmează:

O titrare precisă este apoi realizată prin diluţii binare încăpând cu ultima eprubetă pozitivă: 50 μl + 50 μl de tampon. NOTĂ: Interpretarea reacţiei de aglutinare obţinută la diluţii mari poate varia în funcţie de persoana care efectuează testul; atunci când se titrează o probă nouă de la acelaşi bolnav, se recomandă confirmarea titrul probei anterioare. 9- CONTROLUL DE CALITATE AL TESTULUI Sensibilitatea latexului se poate verifica periodic, folosind controlul pozitiv din trusă, furnizat la concentraţia de GXM de 200 ng/ml. 10- CONTROLUL DE CALITATE AL PRODUCĂTORULUI Toţi reactivii produşi şi comercializaţi se află sub sistemul complet al calităţii începând de la recepţia materiilor prime şi până la punerea pe piaţă a produsului finit. Fiecare lot este supus controlului de calitate şi este eliberat la vânzare numai atunci când îndeplineşte criteriile de admitere. Toate înregistrările referitoare la producţia şi controlul fiecărui lot sunt în proprietatea companiei noastre. 11- CARACTERISTICI DE PERFORMANŢĂ Anticorpii monoclonali E1 utilizati în acest test de aglutinare au fost descrişi de către Dromer & colaboratorii (4). Studiile anterioare efectuate cu un test de aglutinare cu particule albe au demonstrat buna performanţă a acestor anticorpi. Unul dintre aceste studii (8) s-a realizat pe 84 seruri prelevate de la pacienţi cu criptococoză şi 47 seruri de control. S-a constatat că tratarea cu pronaz, a dus la îmbunătăţirea sensibilităţii şi specificităţii detecţiei GXM. O alta evaluare (9) a demonstrat că titrurile antigenelor obţinute cu diferiţi reactivi nu au fost identice şi că revenirea la rezultate negative cu Pastorex™Crypto Plus pentru antigenele solubile poate reflecta eficienţa tratamentului. Utilizarea particulelor de latex de culoare roşie în locul celor albe îmbunătăţeşte vizualizarea agregatelor. In cursul unei evaluări clinice efectuate într-un laborator de spital s-au obţinut următoarele rezultate: SENSIBILITATE Probe recoltate de la 38 de pacienţi cu criptococoză.

Probe Număr pacienţi Pastorex™ Crypto Plus

Tip Număr total + -SER 28 21 26 2

L.C.R. 13 11 11 2 L.B.A. 1 1 1 0 URINĂ 9 5 9 0 TOTAL 51 38 47 4*

Sensibilitatea globală a testului Pastorex™Crypto Plus evaluată pe aceste 51 de probe a fost estimată la 92% . * Cele patru probe nedetectate de testul Pastorex™Crypto Plus au fost de asemenea negative în urma testării cu un alt test de aglutinare, bazat pe un antigen policlonal.

Diluţia 1:10 1:100 1:1000 1:10000Probă de testat tratată 50 μl 50 μl 50 μl 50 μlSoluţie tampon 450 μl 450 μl 450 μl 450 μl

4

SPECIFICITATE Probe recoltate de la 92 pacienţi martor, fără criptococoză.

Probe Număr pacienţi Pastorex™ Crypto Plus

Tip Număr total + -SER 62 62 2 60

L.C.R. 7 7 0 7 L.B.A. 21 19 0 21 URINĂ 6 4 0 6 TOTAL 96 92 2 94

Specificitatea testului Pastorex™Crypto Plus evaluată prin testarea acestor 96 de probe a fost estimată la 98%. Complementar, s-au efectuat evaluări interne folosind 59 seruri, incluzând 18 seruri recoltate de la pacienţi cunoscuţi cu aspergiloză sau candidoză, evidenţiind o specificitate de 100%. Limita detecţiei GMX în ser a fost estimată la 50 ng/ml. 12- LIMITELE TESTULUI Reacţia de aglutinare poate fi inhibată de concentraţii foarte mari de GXM (efectul disproporţiei dintre doză-răspuns, sau de cârlig). Dacă există un dubiu cât de mic legat de interpretarea reacţiei, repetaţi testarea folosind o probă diluată 1/100. Prin urmare, rezultatele trebuie interpretate în contextul clinic al pacientului. O probă cu o concentraţie a antigenului situată sub limita inferioară de detecţie a trusei Pastorex™ Crypto Plus poate conduce la un rezultat fals negativ: în acest caz, este util să se repete testarea după o vreme. Tehnicile de detecţie a antigenelor solubile prin aglutinarea particulelor latex sunt de ajutor în diagnosticul mult mai rapid faţă de metodele convenţionale de cultură. Datele clinice şi bibliografice referitoare la detecţia antigenului GXM în L.B.A. şi urină utilizând reactivi latex sunt limitate în prezent. Asemănările antigenice dintre capsula de Cryptococcus şi peretele Trichosporum beigelii pot duce la reacţii fals pozitive la pacienţii cu tricosporoză (4). Posibilitatea apariţiei unor reacţii încrucişate, valabilă pentru toate tehnicile imunologice, trebuie întotdeauna luată în considerare. Diagnosticul criptococozei se bazează pe detecţia microscopică a fungilor capsulaţi, pe creşterea Cryptococcus neoformans în cultură (coloraţie cu tuş de China) şi pe detecţia antigenelor capsulare din fluidele biologice (2). Metoda detecţiei antigenelor solubile prin aglutinarea particulelor de latex reprezintă un real ajutor în stabilirea diagnosticului. Diagnosticarea criptococozei poate fi făcută numai după o evaluare completă a tuturor aspectelor clinice, radiologice şi biologice (microbiologice, histologice, serologice), fiecare element luat separat trebuind interpretat cu prudenţă. 13- BIBLIOGRAFIE 1. CAMERON M.L, BARTLETT J.A., GALLIS H.A., WASKIN H.A, Manifestations of pulmonary Cryptococcocis in Patients

with Acquired Immunodeficiency Syndrome, R.I.D., 1991, 13, p. 64-67 2. STAIB F., Cryptococcocis in Aids - Mycological-diagnostic and epidemiological observations, Aids-Forshung (AIFO), 1987,

p. 363-382 3. DROMER F., MATHOULIN S., DUPONT B , LAPORTE A., and the French Cryptococcosis Study Group. Epidemiology of

Cryptococcosis in France : A 9-Year Survey (1985-1993). Clin. Inf. Dis.1996, 23, p. 82-90 4. DROMER F., SALAMERO J., CONTREPOIS A., CARBON C., YENI P. Production, Characterization and Antibody

Specificity of a Mouse Monoclonal Antibody Reactive with Cryptococcus neoformans Capsular Polysaccharide. Infect. and Immun., 1987, 55, p. 742-748

5. GRAY L.D., ROBERTS G.D. Experience with the Use of Pronase to eliminate Interference Factors in the Latex Agglutination Test for Cryptococcal Antigen. J. Clin. Microbiol., 1988, 26, p. 2450-2451

6. HEELAN J.S., CORPUS L , KESSIMIAN N. False-positive reaction in the Latex Agglutination Test for Cryptococcus neoformans Antigen. J.Clin. MIcrobiol. 1991, 29, p. 1260-1261

7. HAMILTON J.R., NOBLE A., DENNING D.W., STEVENS D.A. Performance of Cryptococcus Antigen Latex Agglutination Kits on Serum and Cerebrospinal Fluid Specimens of Aids patients before and after Pronase treatment. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, p. 333-339

8. TEMSTET A., ROUX P., POIROT J.L., RONIN O., DROMER F. Evaluation of monoclonal antibody based latex test for the diagnosis of Cryptococcosis : Comparison with two tests Using Polyclonal Antibodies J. Clin. Microbiol. 1992, 30, p. 2544-2550.

9. SWINNE D., MEULEMANS L., DE VROEY Ch. Detection of Cryptococcus antigen with a mononucleal antibody based latex test (abstract) Trends in the management of systemic fungal infections, Nijmegen, The Netherlands, 5-7 Sept. 1991

5

6

7

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France

Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/07 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881131 www.bio-rad.com