I

UNIVERSITATEA DE ŞTIIN łE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă VETERINAR Ă

CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

ŞCOALA DE STUDII DOCTORALE Domeniul : BIOTEHNOLOGII

Chim. SONIA ANCUłA SPINEAN (SOCACI)

TEZĂ DE DOCTORAT

OPTIMIZAREA SISTEMELOR GC-MS PENTRU DETERMINAREA AMPRENTEI ULEIURILOR

VOLATILE DIN PLANTE AROMATICE ŞI MEDICINALE

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conducător ştiin Ńific: Prof. univ. dr. Carmen Socaciu

CLUJ-NAPOCA 2009

I

INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE

Uleiurile volatile sunt cunoscute încă din cele mai vechi timpuri datorită efectelor

lor terapeutice. Ele au fost utilizate de egipteni, greci, romani, arabi atât în tratarea

diferitelor afecŃiuni (arsuri, răni, etc.) cât şi în practicile religioase (ex. îmbalsămări), dar

şi în viaŃa de zi cu zi (aromatizante pentru diferite băuturi, uleiuri pentru masaj sau băi).

ProprietăŃile antioxidante, anti-microbiene, anti-fungice, anti-cancerigenne, anti-

mutagene, imunostimulatoare, sedative, aromatizante, etc. demonstrate de multitudinea

de studii efectuate asupra compoziŃiei lor în ultimii ani, fac ca ale uleiurilor volatile să

joace un rol important în domenii precum : industria alimentară, farmaceutică, chimică,

în parfumerie, agricultură şi nu în ultimul rând în medicină.

ProprietăŃile uleiurilor volatile sunt direct corelate cu compoziŃia lor, atât din punct

de vedere calitativ cât şi cantitativ. PrezenŃa unor falsuri conduce adesea la modificarea

proprietăŃilor uleiurilor volatile, în special ale celor terapeutice, care rezultă prin acŃiunea

sinergetică a tuturor componenŃilor. Mai mult, uleiurile volatile, diferitele extracte de

plante sunt utilizate în suplimentele alimentare sau în scopuri medicinale, şi prin urmare

este crucial să se asigure autenticitatea şi calitatea produsului respectiv, existând riscul ca

falsificarea lor să inducă efecte negative severe asupra sănătăŃii consumatorului.

Luând în considerare toate aceste aspecte este uşor de înŃeles amploarea pe care au

luat-o în ultimii ani cercetările privind compoziŃia uleiurilor volatile. Studiile actuale se

axează pe dezvoltarea şi optimizarea unor metode de analiză capabile fie să determine

compoziŃia acestor uleiuri (amprenta cromatografică/metabolomică), fie să identifice

anumiŃi compuşi “markeri” care să ateste calitatea şi autenticitatea produsului respectiv.

Având în vedere complexitatea compoziŃiei (zeci sau chiar sute de compuşi), cele

mai des utilizate metode pentru studiul uleiurilor volatile sunt: gaz-cromatografia cuplată

cu spectrometria de masă (GC-MS), headspace-gaz-cromatografia (HS-GC),

microextracŃia în fază solidă – gaz-cromatografia (SPME-GC), “in-tube extraction”-gaz-

cromatografia (ITEX-GC), spectroscopia vibraŃională (NIR, IR, ATR-IR, Raman),

electroforeza capilară (CE), etc.

Scopul acestei lucrări este optimizarea sistemelor GC-MS pentru determinarea

amprentei uleiurilor volatile din plante aromatice şi medicinale.

II

Principalele obiective ale studiului de faŃă sunt:

� Evaluarea metodelor gaz-cromatografice de separare şi identificare a

componentelor uleiurilor volatile şi a compuşilor volatili din matrici vegetale;

� Optimizarea unor metode GC-MS, HS/GC-MS, şi HS/ITEX/GC-MS de separare

şi identificare a componentelor uleiurilor volatile;

� Determinarea amprentei gaz-cromatografice a rozmarinului şi uleiului volatil de

rozmarin, prin folosirea comparativă a tehnicilor de analiză optimizate (GC-MS,

HS/GC-MS, şi HS/ITEX/GC-MS);

� Determinarea amprentei gaz-cromatografice a hameiului, peleŃilor şi uleiului

volatil de hamei, prin folosirea comparativă a tehnicilor de analiză optimizate

(GC-MS, HS/GC-MS, şi HS/ITEX/GC-MS);

� EvidenŃierea diferenŃelor compoziŃionale în cadrul uleiurilor volatile analizate,

expresie a influenŃei unor factori intrinseci şi extrinseci asupra biochimismului

plantei;

� EvidenŃierea unor compuşi volatili specifici plantelor / uleiurilor analizate şi

posibilitatea folosirii lor ca “markeri” în autentificare;

� Discriminarea soiurilor de hamei pe baza compoziŃiei uleiurilor volatile, folosind

metode de analiză statistică a datelor (analiza cluster).

STRUCTURA TEZEI

Teza este structurată în două părŃi principale, prima parte incluzând studiul de

literatură, iar cea de a doua parte cercetări proprii, rezultate, discuŃii, concluzii şi

perspective.

PARTEA ÎNTÂI: STUDIU DE LITERATUR Ă, cuprinde 2 capitole:

Capitolul 1. Evaluarea metodelor gaz-cromatografice de separare si

identificare a componentelor uleiurilor volatile, cuprinde 5 subcapitole în care sunt

prezentate tehnici de analiză utilizate în determinarea/identificarea compuşilor volatili şi

semi-volatili.

Capitolul 2. Compozitia uleiurilor volatile expresie a variabilitatii genetice şi

originii geografice a plantelor, descrie în 2 subcapitole principalele noŃiuni de biologie

III

ale plantei de rozmarin şi hamei, precum şi compoziŃia şi variabilitatea compoziŃională a

uleiurilor volatile extrase din cele două plante.

PARTEA A DOUA: CERCET ĂRI PROPRII , cuprinde 3 capitole:

Capitolul 3. Evaluarea compoziŃiei uleiului volatil de rozmarin prin

optimizarea unor tehnici de tip GC, cuprinde 3 subcapitole referitoare la cele trei

tehnici folosite pentru determinarea amprentei cromatografice a uleiului volatil de

rozmarin, fiecare la rândul lor fiind structurate în sub-subcapitole care prezintă modul de

optimizare al diferiŃilor parametrii ai metodelor de analiză, precum şi evaluarea

compoziŃiei volatile a rozmarinului în funcŃie de vârstă.

Capitolul 4. Evaluarea compoziŃiei uleiului volatil de hamei prin optimizarea

unor tehnici de tip GC, are aceeaşi structură ca şi capitolul 3, evaluarea compoziŃiei

volatile a hameiului realizându-se în funcŃie de soi, dar şi în funcŃie de modalitatea de

prelucrare a conului.

Capitolul 5. Analiza chemometrică a datelor, cuprinde 2 subcapitole, referitoare

la folosirea unor metode de analiză statistică pentru predicŃia evoluŃiei compoziŃiei

chimice a uleiului volatil în timp, respectiv pentru clasificarea/discriminarea diferitelor

soiuri pe baza compoziŃiei uleiul volatil.

Elementele de originalitate ale tezei sunt:

1) Optimizarea unor metode moderne pentru caracterizarea compoziŃiei volatile a

unor plante aromatice şi medicinale indigene;

2) Folosirea uneia dintre cele mai performante tehnici actuale - HS/ITEX - in

evidentierea unor compusi volatili prezenti in urme;

3) Evidentierea unor compuşi “marker” ce pot fi utilizaŃi în autentificarea plantelor

studiate;

4) Evidentierea variabilitatii compozitionale a uleiurilor volatile expresie a

influentei unor factori intrinseci si extrinseci;

5) Clasificarea/discriminarea unor soiuri de hamei cultivate în România pe baza

compoziŃie lor volatile.

IV

CERCETĂRI PROPRII

Uleiurile volatile mai sunt cunoscute şi sub denumirea de „uleiuri eterice” sau

„uleiuri esenŃiale” fiind produse în protoplasma celulară a plantelor ca metaboliŃi

secundari. Sub aspect chimic, uleiurile volatile nu sunt compuşi unitari, ci reprezintă

amestecuri de zeci sau chiar sute de substanŃe organice (aldehide, cetone, alcooli, esteri,

etc.) cunoscute sub denumirea de terpene şi terpenoide. ImportanŃa acordată în ultimii ani

uleiurilor volatile, se datorează şi proprietăŃilor pe care monoterpenele constituente le au.

Pentru optimizarea unor sisteme GC-MS pentru determinarea amprentei

cromatografice a uleiulurilor volatile s-au ales două plante aromatice şi medicinale

indigene, şi anume rozmarinul şi hameiul.

Rozmarinul, este o plantă aromatică şi medicinală, cunoscută încă din antichitate,

care poate fi folosită atât în stare proaspătă cât şi uscată. Rozmarinul conŃine o cantitate

mare de ulei volatil care are proprietăŃi tonice, colagoge, poate fi folosit ca antiseptic

pulmonar, coleric, are proprietăŃi stomahice, antidiuretice şi antireumatice. De asemenea

uleiul volatil de rozmarin este folosit în parfumerie, fitocosmetică, medicină, industria

alimentară, a băuturilor alcoolice (lichior), agricultura, etc.

Hameiul este o plantă perenă, cu durata de viaŃă cuprinsă între 30-50 de ani, fiind

însă productive numai planŃiile de 20-25 de ani. Hameiul se numără printre puŃinele

plante cultivate la nivel mondial, datorită multiplelor sale utilizări, o importanŃă deosebită

având însă pentru industria berii, pentru care inflorescenŃele female (conurile) reprezintă

materia primă indispensabilă pentru producerea acestei băuturi. Hameiul mai poate fi

folosit atât ca legumă, cât şi în scop furajer sau medicinal, având proprietăŃile bactericide,

antiseptice, antimicrobiane, antispasmice, astringente, diuretice, emoliente, estrogenice,

hipnotice, sedative, etc.

V

I. EVALUAREA COMPOZI łEI ULEIULUI VOLATIL DE ROZMARIN PRIN

OPTIMIZAREA UNOR TEHNICI DE TIP GC

I.1. MATERIAL ŞI METODE

I.1.1. Probele de rozmarin

Pentru evaluarea variabilităŃii compoziŃionale a uleiurilor volatile in funcŃie de

stadiul vegetativ, s-au recoltat, la un interval de timp de şase luni, probe de rozmarin de

vârste diferite, cultivate în sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj.

Probele au fost codificate după cum urmează:

- R2004-aug07 - rozmarin plantat în anul 2004 şi recoltat în august 2007;

- R2004-mar08 - rozmarin plantat în anul 2004 şi recoltat în martie 2008;

- R2004-oct08 - rozmarin plantat în anul 2004 şi recoltat în octombrie 2008;

- R2005-aug07 - rozmarin plantat în anul 2005 şi recoltat în august 2007;

- R2005- mar08 - rozmarin plantat în anul 2005 şi recoltat în martie 2008;

- R2005-oct08 - rozmarin plantat în anul 2005 şi recoltat în octombrie 2008;

- R2006-aug07 - rozmarin plantat în anul 2006 şi recoltat în august 2007;

- R2006-mar08 - rozmarin plantat în anul 2006 şi recoltat în martie 2008;

- R2006-oct08 - rozmarin plantat în anul 2006 şi recoltat în octombrie 2008;

- R2007-aug07 - rozmarin plantat în anul 2007 şi recoltat în august 2007;

- R2007-mar08 - rozmarin plantat în anul 2007 şi recoltat în martie 2008;

- R2007-oct08 - rozmarin plantat în anul 2007 şi recoltat în octombrie 2008.

I.1.2. Metode de analiză

I.1.2.1. ExtracŃia uleiului volatil

ExtracŃia uleiului volatil s-a realizat prin hidrodistilare, după cum urmează: o

cantitate de 50 g de frunze verzi de rozmarin, respectiv uscate şi măcinate au fost

introduse împreună cu 750 ml apă distilată în balonul de distilare al instalaŃiei de dozare a

uleiurilor volatile din produse vegetale. În balonul de distilare au fost adăugate şi câteva

bile de sticlă în vederea omogenizării fierberii. Materialul vegetal a fost supus distilării

VI

timp de 3h. La sfârşitul distilării, uleiul volatil de rozmarin a fost colectat şi măsurat

volumul obŃinut. Probele de ulei volatil au fost păstrate la frigider, în fiole bine închise,

până în momentul analizei. Pentru îndepărtarea eventualelor urme de apă, în fiolele de

păstrare a fost adăugat sulfat de sodiu anhidru. Pentru determinarea compoziŃiei uleiurilor

volatile prin diferite metode gaz-cromatografice a fost preparată o soluŃie de 2% ulei

volatil în hexan.

I.1.2.2. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile de rozmarin

Analiza probelor de rozmarin şi de ulei esenŃial de rozmarin prin cele trei tehnici

utilizate (GC-MS; HS/GC-MS şi ITEX/GC-MS) s-a realizat cu ajutorul unui aparat GC-

MS QP-2010 Schimadzu, echipat cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL). Coloana

utilizată pentru separarea constituenŃilor uleiurilor volatile a fost o coloană capilară

Alltech, USA, AT-5 de 30m cu diametrul intern de 0,25mm şi grosimea filmului de

0,25µm.

Pentru o separare şi o identificare cât mai bună a constituenŃilor uleiurilor volatile,

s-a recurs la optimizarea metodei de analiză. Principalul parametru de care depinde

separarea compuşilor din uleiurile volatile este programul de temperatură al coloanei

cromatografice. Prin urmare, au fost testate 5 programe de temperatură:

PROGRAMUL DE TEMPERATUR Ă AL COLOANEI

CROMATOGRAFICE

CODIFICARE

METODĂ

a) 50.0oC (2 min) la 250.0oC (10 min) cu 3oC/min MEOR

b) 60oC (5 min) la 160oC cu 4oC/min la 240oC (1min) cu 15oC/min MEOR1

c) 60oC (1 min) la 180oC (15 min) cu 3oC/min MEOR2

d) 40oC (1 min) la 250oC (5 min) cu 4oC/min MEOR3

e) 60oC (10 min) la 220oC (10 min) cu 4oC/min la 240oC cu 1oC/min MEOR4

CeilalŃi parametrii ai metodei GC-MS au fost: temperatura injectorului 250.0oC;

volumul de injectare 1.0µL; presiunea 37,1 kPa; viteza liniară 32.4 cm/s; raportul de

splitare 1:200; gaz purtător – heliu; detector MS; temperatura sursei ionice 250.0oC;

temperatura de interfaŃă 250.0oC; MS mode EI, intervalul de scanare 40-400u; viteza de

scanare 769u/s. Datele au fost achiziŃionate cu ajutorul softului aparatului, iar

VII

identificarea compuşilor s-a realizat prin comparaea spectrelor de masă obŃinute cu cele

din bibliotecile de date a softului (NIST147 şi NIST27).

I.1.2.3. Analiza HS/GC-MS a rozmarinului şi uleiurilor volatile de rozmarin

Tehnica headspace este utilizată pentru extracŃia compuşilor volatili din diferite

matrici biologice. Pentru o extracŃie cât mai eficientă a compuşilor de aromă/volatili din

rozmarin a fost necesară optimizarea următorilor parametrii:

Metoda

Masa probă (g)

Temperatura de incubare (oC)

Timpul de incubare (min)

HSrT30t40m1 (HS1) 1,00 30 40 HSrT40t40m1 (HS2) 1,00 40 40 HSrT60t40m1 (HS3) 1,00 60 40 HSrT60t30m1 (HS4) 1,00 60 30 HSrT75t15m1 (HS5) 1,00 75 15 HSrT75t15m0.5 (HS6) 0,50 75 15 HSrT80t15m0.5 (HS7) 0,50 80 15 HSrT85t15m0.25 (HS8) 0,25 85 15 HSrT95t15m0.15 (HS9) 0,15 95 15

După incubare, 250 µL din faza de headspace a fiolei cu probă au fost introduşi în

injectorul gaz-cromatografului şi analizaŃi folosind metoda MEOR1.

I.1.2.4. Analiza ITEX/GC-MS a compuşilor volatili din rozmarin

Parametrii variaŃi în vederea optimizării acestei metode au fost: temperatura de

incubare, timpul de incubare, numărul de pompări din faza de headspace, precum şi masa

probei luată în analiză. Codificarea metodelor ITEX/GC-MS testate în funcŃie de

parametrii variaŃi, s-a făcut după cum urmează:

a) T = 30oC t = 40min. pompări = 20 m = 1g ITEXT30t40s20m1

b) T = 40oC t = 40min. pompări = 20 m = 1g ITEXT40t40s20m1

c) T = 60oC t = 30min. pompări = 20 m = 1g ITEXT60t30s20m1

d) T = 60oC t = 30min. pompări = 20 m = 0,50g ITEXT60t30s20m0.5

e) T = 60oC t = 10min. pompări = 20 m = 0,50g ITEXT60t10s20m0.5

f) T = 60oC t = 10min. pompări = 30 m = 0,50g ITEXT60t10s30m0.5

g) T = 60oC t = 5min. pompări = 20 m = 0,15g ITEXT60t5s20m0.15

VIII

h) T = 75oC t = 15min. pompări = 20 m = 0,50g ITEXT75t15s20m0.5

i) T = 85oC t = 15min. pompări = 20 m = 0,25g ITEXT85t15s20m0.25

j) T = 95oC t = 15min. pompări = 20 m = 0,15g ITEXT95t15s20m0.15

CeilalŃia parametrii ai metodelor de extracŃie ITEX au fost : temperatura siringii:

60oC; viteza de agitare 500 rpm; volumul extras 1000 µL; viteza de extracŃie 100 µL/s;

temperatura de desorbŃie 200oC; temperatura de curăŃare a trapei 250oC; timpul de

curăŃare a trapei 2 min.

Fibra ITEX utilizată pentru extracŃia compuşilor volatili a fost o fibră ITEX-II

Trap (G23)-SilicoNert 2000, Tenax TA 80/100 mesh, ea. După incubare, 250 µL din faza

de headspace a fiolei cu probă au fost introduşi în injectorul gaz-cromatografului şi

analizaŃi folosind metoda MEOR1.

I.2. REZULTATE ŞI DISCUłII

I.2.1. Rezultate şi discuŃii privind analiza GC-MS a uleiului volatil de rozmarin

Dintre cele cinci programe de temperatură a coloanei descrise la capitolul I.1.2.2.,

cele mai bune rezultate, în ceea ce priveşte numărul de compuşi separaŃi, separarea şi

rezoluŃia picurilor, precum şi timpul de analaiză (35 de minute), s-au obŃinut cu metoda

MEOR1.

Principalii constituenŃi ai uleiului volatil de rozmarin din probele R2004-aug07,

R2004-mar08 şi R2004-oct08 sunt: α-pinenul (31,71-33,67%), camforul (15,68-17,12%),

eucaliptolul (8,39-9,35%), camfenul (6,15-6,77%), borneolul (5,89-7,74%), 3-octanona

(3,80–4,37%), β-mircenul (3,28–3,53%), limonenul (4,00-4,26%), o-cimen (2,52-3,62%).

Aceiaşi compuşi majoritari şi în aproximativ aceeaşi concentraŃie au fost identificaŃi şi în

celelalte probe supuse analizei: R2005, R2006 şi R2007. Printre compuşii secundari

identificaŃi în probele analizate se numără: trans-verbenolul, 3-octanolul, α-felandrenul,

α-terpineolul, verbenona, acetatul de bornil, α-terpinen, cariofilenul şi α-cariofilenul.

Luând în considerare ariile picurilor corespunzătoare celor trei compuşi principali

ai uleiului de rozmarin, se obŃine următorul raport: α-pinen:camfor:eucaliptol – 2:1:0,6,

acest raport putând fi utilizat ca “marker” în autentificarea uleiului volatil de rozmarin

IX

provenit din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca. Alte

două rapoarte care se păstrează aproximativ constante în cazul tuturor probelor analizate,

sunt cel dintre 3-octanonă şi 3-octanol, a cărui valoare este de cuprinsă între 18 -21, şi cel

dintre eucaliptol şi limonen care este cuprins între 1,7 -2,7.

Comparativ cu datele de literatură referitoare la compoziŃia uleiului volatil de

rozmarin din diferite regiuni geografice, în probele provenite din sera Departamentului de

Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca se pot evidenŃia câŃiva compuşi care ar putea

fi consideraŃi ca “markeri” specifici ai acestora precum 3-octanona, prezentă într-o

concentraŃie relativ ridicată în probele analizate (3,80-6,30%), sau alŃi compuşi minoritari

precum 3-octanolul sau trans-verbenonul. 3-octanona şi 3-octanolul nu sunt prezenŃi nici

în compoziŃia uleiului volatil de rozmarin din: regiunea Sardiniei, Italia, Algeria, Turcia,

Grecia, Spania, Japonia – seră, FranŃa, Portugalia, Tunisia. În schimb, 3-octanona a fost

identificată în uleiul volatil de rozmarin din Iran, însă într-o concentraŃie mult mai mică.

În figura 1 este prezentat conŃinutul mediu în principalii compuşi ai uleiului volatil

de rozmarin din sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca (α-

pinen, camfor şi eucaliptol), în raport cu cel regăsit în uleiuri volatile de rozmarin

provenite din alte regiuni geografice. După cum se poate observa, raportul acestor

compuşi este caracteristic uleiului volatil de rozmarin provenit din sera Departamentului

de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca. Totodată, în datele de literatură studiate,

nici un alt ulei volatil de rozmarin nu are concentraŃia de α-pinen cuprinsă între 30-40%.

X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

10

20

30

40

50

60

Co

nce

trat

ia, %

Co

nce

ntr

atio

n, %

Regiunea geograficaGeographic region

Legenda: 1-România (Cluj); 2- Brazilia; 3-FranŃa (regiunea sudică); 4- Italia (Sardinia); 5-Portugalia; 6-

Spania (Aragon); 7-Algeria; 8-Iran; 9-Tunisia; 10-Grecia (Atena); 11-Grecia (Creta); 12-Turcia (Izmir);

13-Turcia (Mersin); 14-Turcia (Cannakkale)

Figura 1. VariaŃia concentraŃiei de α-pinen (■), camfor (●)şi eucaliptol (▲) în funcŃie de

regiunea geografică

I.2.2. Rezultate şi discuŃii privind analiza HS/GC-MS a compuşilor volatili din

rozmarin

I.2.2.1. Optimizarea metodei de analiză HS/GC-MS

În vedera optimizării extracŃiei compuşilor volatili din rozmarin s-au variat diferiŃi

parametrii, conform metodelor descrise la capitolul I.1.2.3. Numărul de compuşi separaŃi,

respectiv identificaŃi din proba de frunze uscate de rozmarin (R2007-oct08) variază în

funcŃie de metoda de headspace utilizată.

Prin compararea rezultatelor obŃinute cu metoda HS3, în care timpul de incubare a

fost de 40 de minute şi metoda HS4 în care timpul de incubare a fost de 30 de minute, se

poate constata că mărirea timpului de incubare nu duce la o creştere a numărului de

compuşi separaŃi, în ambele cazuri fiind separat acelaşi număr de compuşi volatili, şi în

aproximativ aceeaşi concentraŃie (figura 2).

XI

Figura 2. Cromatograma HS/GC-MS pentru proba de frunze uscate de rozmarin incubate

la 60oC timp de 40 de minute (HS3), respectiv 30 de minute (HS4)

Un alt parametru variat a fost masa de probă supusă incubării. S-a constatat că

pentru acelaşi timp şi temperatură de incubare, se separă un număr mai mare de compuşi

dacă masa de probă este mai mică. Astfel, folosind metoda HS5, în care s-a analizat o

probă de 1g, au fost separaŃi 18 compuşi, în timp ce pentru o probă de 0,5g (metoda HS6)

au fost separaŃi 19 compuşi. Prin urmare, micşorând masa de probă incubată, scade

concentraŃia de α-pinen din faza de headspace a fiolei, putând fi astfel detectaŃi compuşi

minoritari precum β-linaloolul.

Cea mai mare influenŃă asupra numărului de compuşi volatili separaŃi o are însă

temperatura de incubare (figura 3). Din proba de rozmarin incubată la 30oC au fost

separaŃi şi identificaŃi 4 compuşi, şi anume: α-pinenul, camfenul, 3-octanona şi

eucaliptolul, ceea ce sugerează faptul că aceşti compuşi sunt constituenŃii cei mai volatili

ai rozmarinului fiind responsabili de aroma şi mirosul caracteristic perceput de om. La

temperatura de incubare de 40oC încep să se extragă în faza gazoasă noi compuşi volatili,

precum: β-pinenul, β-mircenul, o-cimenul şi limonenul. Dacă incubarea probelor de

rozmarin se face la 60oC sunt extraşi şi α-felandrenul, α-terpinenul, γ-terpinen şi

camforul. In cazul incubării probelor de frunze uscate de rozmarin la temperaturi de 95oC

(HS9), 7 noi compuşi au fost separaŃi faŃă de cazul în care probele au fost incubate la

temperatura de 80oC, şi anume: 1-octen-3-ol, alfa-terpineol, ylangen, cariofilen, alfa-

cariofilen şi doi compuşi neidentificaŃi. Prin urmare, mărind temperatura de incubare, atât

XII

timpul de incubare cât şi masa de probă supusă incubării pot fi reduse considerabil

(metoda HS4 şi HS5, respectiv HS4 şi HS6).

30 40 50 60 70 80 90 100

5

10

15

20

25

30

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

ompu

nds

Temperatura de incubare, o

C (Incubation temperature,oC )

Figura 3. InfluenŃa temperaturii de incubare asupra numărului de compuşi separaŃi

I.2.2.2. EvidenŃierea compuşilor uşor volatili din frunze şi ulei volatil de rozmarin prin

incubare la 40oC

Compuşii volatili majoritari ai probelor de frunze uscate de rozmarin incubate la

40oC sunt: α-pinenul (65,64 - 67,27%), camfenul (12,72 – 14,44%) şi β-pinenul (3,48 –

4,41%). În concentraŃii considerabile se regăsesc şi o-cimenul (2,94 – 4,12%) şi β-

mircenul (3,12 – 3,84%). Faptul că la temperatura de incubare de 40oC, atât în probele de

frunze uscate cât şi în cele de frunze verzi, a fost separată şi identificată 3-octanona, într-

o concentraŃie de ~1,2 -3%, demonstrează faptul că 3-octanona este un compus volatil

caracteristic rozmarinului cultivat în sera Departamentului de Fitotehnie a USAMV Cluj,

şi prin urmare poate fi utilizat în autentificarea acestuia.

In urma incubării probelor de ulei volatil de rozmarin la aceiaşi temperatură ca

probele de frunze uscate de rozmarin (40oC), dar pentru un timp mai scurt (15 minute), s-

au separat şi identificat 22 de compuşi. Compuşii majoritari identificaŃi pentru probele de

ulei volatile sunt: α-pinenul (60,32 - 62,18%), camfenul (9,25 – 11,08%) şi eucaliptolul

(5,83 – 7,06%), urmaŃi de 3-octanona (2,62 – 4,15%), camfor (3,10 – 3,91%), β-mircen

(2,73 – 3,13%) şi β-pinen (2,10 – 2,90%).

Analizând comparativ compoziŃia celor două categorii de probe (frunze uscate şi

ulei volatil), incubate la 40oC, se poate constata o uşoară scădere a contribuŃiei α-

XIII

pinenului, camfenului şi β-pinenului şi o creştere a contribuŃiei eucaliptolului, camforului

şi 3-octanonei la mirosul caracterisc al uleiului volatil de rozmarin (figura 4).

10.8%

0.54%2.65%

1.75%4.11%

13.9%

66.3%

a)

12.5%

3.61%

6.48%

3.29%2.55%

10.3%

61.3%

b)

Figura 4. ContribuŃia compuşilor volatili separaŃi la mirosul caracteristic frunzelor uscate

de rozmarin (a), respectiv uleiului volatil de rozmarin (b): ■ – α-pinen; ■ – camfen; ■ –

β-pinen; ■ –3-octanona; ■ – eucaliptol; ■ – camfor; ■ –alŃi compuşi.

I.2.2.3. EvidenŃierea compuşilor uşor volatili din frunze şi ulei volatil de rozmarin prin

incubare la 85oC

ConstituenŃii volatili majoritari extraşi din probele de frunze uscate de rozmarin

incubate la 85oC, sunt: α-pinenul (50,22 – 54,68%), camfenul (7,83-9,38%) şi β-mircenul

(5,67-7,16%), urmaŃi de 3-octanona (3,76-6,17%), , limonenul (4,87-5,27%), eucaliptolul

(4,49-6,10%), o-cimen (3,44 – 4,52%). Se poate observa că odată cu creşterea

temperaturii de incubare de la 40oC la 85oC se modifică şi compuşii majoritari ai probelor

de frunze uscate de rozmarin, β-pinenul fiind acum cuantificat ca şi compus minoritar.

Totuşi în compoziŃia frunzelor uscate de rozmarin a fost identificată atât 3-octana cât şi

3-octanolul, consideraŃi de noi ca fiind compuşi “marker” pentru rozmarinul provenit din

sera Departamentului de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj-Napoca.

Analizând prin aceeaşi metodă probele de ulei volatil de rozmarin, au fost separaŃi

35-40 de compuşi, comparativ cu cei 26-29 de compuşi extraşi şi separaŃi din frunzele

uscate de rozmarin. Principalii constituenŃi ai celor patru probe de ulei volatil de

rozmarin analizate sunt: α-pinenul (31,70–34,70%), camforul (16,22–17,12%) şi

eucaliptolul (9,00–11,36 %) urmaŃi de camfen (5,47–6,98 %), 3-octanona (4,01-6,56%),

borneol (4,17–5,18%), limonen (4,47–4,83%) şi β-mircen (3,44–3,95%). Cantitatea cea

XIV

mai mare de 3-octanonă la fel ca în cazul analizei GC-MS a fost regăsită în proba cea mai

tânără, R2007-oct08. Împreună cu 3-octanona a fost identificat şi 3-octanolul, raportul

dintre aceşti doi compuşi “marker” fiind însă mai mare decât cel regăsit în analiza GC-

MS a probelor de ulei volatile de rozmarin. Totodată trebuie remarcat faptul că utilizând

tehnica HS/GC-MS, raportul dintre cei trei compuşi majoritari α-pinen:camfor:eucaliptol

rămâne de aproximativ 2:1:0,6, la fel ca şi în cazul analizei GC-MS a probelor de ulei

volatil. De asemenea, raportul dintre eucaliptol şi limonen se încadrează şi el între

valorile obŃinute la analiza GC-MS (1,7-2,7).

I.2.3. Rezultate şi discuŃii privind analiza ITEX/GC-MS a compu şilor volatili din

rozmarin

Primul parametru, a cărui influenŃă, asupra extracŃiei compuşilor volatili din

rozmarin, a fost studiată, este masa de probă supusă analizei. Astfel, utilizând metodele

ITEXT60t30s20m0.5 şi ITEXT60t30s20m1, a fost analizată în aceleaşi condiŃii o probă

de frunze uscate de rozmarin R2007-oct08 cu masa de 0,5g şi o probă cu masa de 1g.

Pentru proba cu masa de 0,5g au fost separaŃi 9 compuşi în timp ce pentru proba cu masa

de 1g au fost separaŃi 12 compuşi. Prin urmare, dublarea masei de probă nu are ca

rezultat o creştere considerabilă a numărului de compuşi separaŃi. Totodată, în cazul

probei de 1g concentraŃia α-pinenului (49,97%) este aproape dublă faŃă de cazul probei

de 0,5g. O concentraŃie ridicată de α-pinen în faza de headspace poate duce la o

acumulare a acestuia în fibra adsorbantă care să conducă fie la saturarea detectorului, fie

la mascarea unor constituenŃi minoritari prezenŃi în rozmarin.

InfluenŃa timpului de incubare asupra extracŃiei compuşilor volatili din proba

R2007-oct08 se poate observa prin compararea rezultatelor obŃinute cu metodele

ITEXT60t5s20m0.5, ITEXT60t10s20m0.5 şi ITEXT60t30s20m0.5. Astfel, se poate

constata că la o creştere semnificativă a timpului de incubare, de la 5 la 30 de minute,

numărul de compuşi separaŃi creşte doar de la 7 la 9. Mai mult, între metoda cu timpul de

incubare de 10 minute şi cea cu timpul de incubare de 30 de minute nu există nici o

diferenŃă în ceea ce priveşte numărul de compuşi separaŃi (figura 5).

XV

5 10 15 20 25 30

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

Num

ar c

om

pu

si s

epar

ati

Num

ber

of s

epar

ated

com

poun

dsTimp (min.)Time (min.)

Figura 5. InfluenŃa timpului de incubare asupra numărului de compuşi separaŃi

Un alt parametru, cu un rol important în optimizarea metodei ITEX/GC-MS a fost

numărul de pompări din faza de headspace. În acest sens, temperatura de incubare (60oC),

timpul de incubare (10 min) şi masa de probă (0,5g) au fost păstrate constante, variindu-

se numărul de pompări efectuate de fibra adsorbantă (metodele ITEXT60t10s20m0.5 şi

ITEXT60t10s30m0.5). Dacă în cazul metodei în care s-au efectuat 20 de pompări din

faza de headspace au fost separaŃi 9 compuşi, pentru metoda în care s-au realizat 30 de

pompări din faza de headspace au fost separaŃi 14 constituenŃi. Prin urmare, realizându-se

un număr mai mare de pompării, sunt concentraŃi, în materialul adsorbant al fibrei,

compuşi a căror concentraŃie în faza de headspace este mai mică, precum cei patru noi

compuşi identificaŃi în cazul în care proba a fost analizată cu metoda

ITEXT60t10s30m0.5: β-pinenul, α-felandrenul, α-terpinenul şi γ-terpinenul.

În ceea ce priveşte influenŃa temperaturii de incubare asupra extracŃiei compuşilor

volatili din rozmarin, după cum se poate observa din figura 6 odată cu creşterea

temperaturii de incubare se volatilizează un număr tot mai mare de compuşi din rozmarin

care sunt adsorbiŃi în materialul adsorbant al fibrei. Astfel, chiar dacă masa şi timpul de

incubare scad, o creştere a temperaturi de incubare duce la o creştere a numărului de

compuşi separaŃi. De exemplu, utilizând metoda ITEXT40t40s20m1 au fost separaŃi 11

compuşi, în timp ce utilizând metoda ITEXT75t15s20m0.5 sau ITEXT95t15ms200.15 au

fost separaŃi 15 respectiv 24 de compuşi. Totuşi, se constată, că peste un anumit prag al

temperaturii de incubare, creşterea numărului de compuşi separaŃi nu mai este atât de

mare.

XVI

30 40 50 60 70 80 90 100

5

10

15

20

25

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

om

pou

nds

Temperatura , oC (Temperature, oC)

Figura 6. InfluenŃa temperaturii de incubare asupra numărului de compuşi separaŃi

VariaŃia numărului de compuşi separaŃi în funcŃie de metoda şi tehnica de analiză

este prezentată în figura 7. După cum se poate observa, pentru temperaturi mici de

incubare, 30-40oC, tehnica ITEX oferă posibilitatea identificării unui număr mai mare de

compuşi volatili decât tehnica HS. Acest lucru se datorează tocmai posibilităŃii de

îmbogăŃire a fibrei adsorbante în compuşi care se găsesc în concentraŃie redusă în faza de

headspace a fiolei. Pe măsură ce temperatura de incubare creşte, 60-95oC, numărul de

compuşi separaŃi cu tehnica ITEX este mai mic decât cel obŃinut folosind tehnica HS.

Totuşi, trebuie Ńinut cont de faptul că numărul de pompări pentru metodele ITEX este de

20. Mărindu-se numărul de pompări, aşa cum s-a menŃionat anterior, se pot evindeŃia noi

constituenŃi volatili ai rozmarinului. Prin urmare, este necesară în continuare optimizarea

tehnicii ITEX în vederea găsirii raportului optim între temperatura de incubare şi numărul

de pompări, pentru obŃinerea unei metode cât mai eficiente pentru determinarea

constituenŃilor volatili ai rozmarinului.

XVII

30405060708090100

0

5

10

15

20

25

30

HS ITEX

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

ompo

unds

Temperatura de incubare, oC

Incubation temperature, oC

4

8

13

19

2828

8

1112

15

2324

Figura 7. InluenŃa metodei şi tehnicii de analiză utilizate asupra numărului de compuşi

volatili separaŃi

II. EVALUAREA COMPOZI łIEI ULEIULUI VOLATIL DE HAMEI PRIN

OPTIMIZAREA UNOR TEHNICI DE TIP GC

II.1. MATERIAL ŞI METODE

II.1.1. Probele de hamei

Pentru determinarea variabilităŃii compoziŃionale a uleiului volatil de hamei în

funcŃie de soi şi de modulul de procesare a conului de hamei, s-au ales patru soiuri de

hamei, două aromate (Huller Bitterer şi Perle) şi două amare (Magnum şi Brewers Gold),

cultivate în arealul pedo-climatic al Sighişoarei, o zonă cu tradiŃie în cultura hameiului, în

fermele Saschiz şi Seleuş, judeŃul Mureş. Din fiecare din aceste patru soiuri de hamei au

fost prelevate trei tipuri de probe: hamei floare (conuri de hamei ajunse la maturitatea

tehnologică care după recoltare au fost uscate timp de 48 de ore la temperatura camerei),

hamei uscat (hamei floare uscat în instalaŃiile fermelor Saschiz şi Seleuş) şi hamei peleŃi

tip 90, obŃinuŃi în instalaŃia de peletizare de la ferma Seleuş.

XVIII

II.1.2. Metode de analiză

II.1.2.1. ExtracŃia uleiului volatil

ExtracŃia uleiului volatil din probele de hamei s-a realizat prin hidrodistilare, după

cum urmează: o cantitate de aproximativ 50 g conuri, respectiv peleŃi de hamei măcinaŃi

au fost introduse împreună cu 700 ml apă distilată în balonul de distilare al instalaŃiei de

dozare a uleiurilor volatile din produse vegetale. În balonul de distilare au fost adăugate

şi câteva bile de sticlă în vederea omogenizării fierberii. Materialul vegetal a fost supus

distilării timp de 3h. La sfârşitul distilării, uleiul volatil de hamei a fost colectat şi

măsurat volumul obŃinut. Codificarea probelor de ulei volatil de hamei s-a făcut în

modul următor:

- BG-Feo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Brewers Gold;

- BG-Ueo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri uscate de hamei, soiul Brewers Gold;

-BG-Peo - ulei volatil de hamei obŃinut din peleŃi de hamei, soiul Brewers Gold;

- MG-Feo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Magnum;

- MG-Ueo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri uscate de hamei, soiul Magnum;

- MG-Peo - ulei volatil de hamei obŃinut din peleŃi de hamei, soiul Magnum;

- PR-Feo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Perle;

- PR-Ueo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Perle;

- PR-Peo - ulei volatil de hamei obŃinut din peleŃi de hamei, soiul Perle;

- HB-Feo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Huller Bitterer;

- HB-Ueo - ulei volatil de hamei obŃinut din conuri de hamei floare, soiul Huller Bitterer;

- HB-Peo - ulei volatil de hamei obŃinut din peleŃi de hamei, soiul Huller Bitterer.

II.1.2.2. Analiza GC-MS a uleiurilor volatile de hamei

Analiza probelor de hamei şi de ulei esenŃial de hamei prin cele trei tehnici

utilizate (GC-MS; HS/GC-MS şi ITEX/GC-MS) s-a făcut cu ajutorul unui aparat GC-MS

QP-2010 Schimadzu, echipat cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL). Coloana

utilizată pentru separarea constituenŃilor uleiurilor volatile a fost o coloană capilară

Alltech, USA, AT-5 de 30m cu diametrul intern de 0,25mm şi grosimea filmului de

0,25µm. Datele au fost achiziŃionate cu ajutorul softului aparatului, iar identificarea

XIX

compuşilor s-a realizat prin comparaea spectrelor de masă obŃinute cu cele din

bibliotecile de date a softului (NIST147 şi NIST27).

Programele de temperatură testate pe coloana cromatografică în vederea obŃinerii

unei separări cât mai bune a compuşilor uleiului volatil de hamei, au fost următoarele:

a) 60oC (3min) cu 1,5º/min la 150oC (5min) meoh2split100

b) 60oC (3min) cu 3º/min la 150oC (10min) meoh3split100

c) 60oC (3min) cu 2º/min la 100oC; cu 5º/min la 130oC; cu 3º/min la 200oC (5min)

meoh4split100

d) 60oC (3min) cu 3º/min la 100oC; cu 2º/min la 160oC (5min) meoh5split100

e) 60oC (3min) cu 4º/min la 100oC; cu 1º/min la 150oC (5min) meoh6split100

f) 60oC (3min) cu 4º/min la 100oC; cu 0,5º/min la 150oC (5min) meoh7split100

g) 60oC (3min) cu 2º/min la 100oC; cu 1º/min la 150oC (5min) meoh8split200

h) 60oC (3min) cu 3º/min la 100oC; cu 0,2º/min la 120oC (10min) meoh9split100

i) 60oC (3min) cu 10º/min la 100oC; cu 0,2º/min la 120oC (10min) meoh11split100

CeilalŃi parametrii ai metodelor de analiză a fost: temperatura injectorului

250.0oC; presiunea 93,1 kPa; debit coloană 1,5ml/min; viteza liniară 44,7 cm/s; detector

MS; temperatura sursei ionice 250.0oC; temperatura de interfaŃă 250.0oC; MS mode EI,

intervalul de scanare 50-400u; viteza de scanare 769u/s.

II.1.2.3. Analiza HS/GC-MS a hameiului şi uleiurilor volatile de hamei

În ceea ce priveşte optimizarea metodei de extracŃie a compuşilor volatili din

peleŃii de hamei prin tehnica headspace, aceasta s-a realizat prin variaŃia masei de probă

incubate, a temperaturii şi timpului de incubare, după cum urmează:

a) m = 1g T = 60oC t = 30 min HShT60t30m1 (HSh1)

b) m = 0,25g T = 80oC t = 15 min HShT80t15m0.25 (HSh2)

c) m = 0,15g T = 80oC t = 15 min HShT80t15m0.15 (HSh3)

d) m = 0,15g T = 80oC t = 30 min HShT80t30m0.15 (HSh4)

e) m = 0,15g T = 80oC t = 45 min HShT80t45m0.15 (HSh5)

f) m = 0,15g T = 95oC t = 30 min HShT95t30m0.15 (HSh6)

g) m = 0,15g T = 95oC t = 15 min HShT95t15m0.15 (HSh7)

h) m = 0,15g T = 110oC t = 15 min HShT110t15m0.15 (HSh8)

XX

i) m = 0,15g T = 150oC t = 15 min HShT150t15m0.15 (HSh9)

Din probele incubate s-a prelevat un volum de 250µL care a fost injectat in

injectorul gaz-cromatografului şi supus analizei GC-MS.

II.1.2.4. Analiza ITEX/GC-MS a hameiului

Utilizarea tehnicii ITEX a avut ca scop evidenŃierea unor compuşi volatili

minoritari din hamei care n-au putut fi puşi în evidenŃă cu tehnica GC-MS sau HS/GC-

MS. Datorită posibilităŃii de a realiza mai multe pompări din faza de headspace a propbei

incubate, tehnica ITEX oferă posibilitatea determinării de compuşi care se află în

concentraŃii foarte mici în matricea de analizat, prin concentrarea acestora în materialul

adsorbant al fibrei şi apoi desorbŃia lor în injectorul gaz-cromatografului.

Pentru optimizarea metodei de extracŃie ITEX a compuşilor volatili din hamei s-au

luat în studiu probele de peleŃi a probei PR-Pn dar şi a celorlalte trei soiuri de hamei de

analizate şi prin tehnica HS/GC-MS. Masa probei de analiză luată în studiu a fost păstrată

constantă, variindu-se temperatura de incubare, timpul de incubare şi numărul de pompări

din faza de headspace a fiolei cu probă. Parametrii metodelor testate şi codificarea

acestora a fost următoarea:

a) T = 60oC t = 5 min. pompări = 20 ITEXhT60t5s20

b) T = 60oC t = 10 min. pompări = 20 ITEXhT60t10s20

c) T = 60oC t = 15 min. pompări = 30 ITEXhT60t15s30

d) T = 80oC t = 15 min. pompări = 30 ITEXhT80t15s30

e) T = 95oC t = 15 min. pompări = 30 ITEXhT95t15s30

f) T = 110oC t = 15 min. pompări = 30 ITEXhT110t15s30

Fibra ITEX şi ceilalŃi parametrii ai metodelor de extracŃie ITEX au fost aceiaşi cu

cei menŃionaŃi în capitolul I.1.2.4. După incubare, 250 µL din faza de headspace a fiolei

cu probă au fost introduşi în injectorul gaz-cromatografului şi analizaŃi folosind metoda

meoh3split100MS.

XXI

II.2. REZULTATE ŞI DISCUłII

II.2.1. Rezultate şi discuŃii privind analiza GC-MS a uleiului volatil de hamei

Separarea compuşilor prezenŃi în uleiului volatil de hamei se realizează cel mai

bine în cazul utilizării metodei meoh3split100. De asemenea, timpul de analiză pentru

metoda meoh3split100 este de 43 de minute (cel mai scurt timp de analiză), faŃă de 128

de minute în cazul meoh8split100, 68 de minute pentru meoh6split100 sau 57 pentru

meoh4split100. Acest lucru este foarte important în economia unei analize, în zilele

noastre tendinŃa fiind de a se obŃine rezultate cât mai exacte într-un timp cât mai scurt şi

cu o prelucrare minimă a probei de analizat. Metoda meoh3split100 a fost în continuare

optimizată modificându-se şi intervalul de scanare de la 0,50 secunde la 0,20 secunde,

viteza de scanare modificându-se corespunzător de la 769 la 2000.

Principalii constituenŃi ai uleiului volatil de hamei provenit de la soiurile aromate

sunt: β-mircenul (48,03–69,23%), urmat de α-cariofilen (12,05-35,10%), β-cariofilen

(5,59-9,52%). În concentraŃii apreciabile se regăsesc şi compuşi precum α-selinenul, α-

guaienul, alloaromadendrenul, β-cadinenul sau β-panasinenul.

Pentru probele de ulei volatil extrase din soiurile amare de hamei, compuşii

majoritari au fost aceiaşi ca în cazul soiurilor aromate, concentraŃiile acestora variind

după cum urmează: β-mircenul (42,95-67,99%), α-cariofilenul (18,41–41,89%),

cariofilenul (6,87–11,61%). În schimb concentraŃiile α-selinenului, α-guaienului, β-

cadinenului, γ-muurolenului sunt mult mai mici faŃă de cele prezente în soiurile aromate,

iar compuşi precum alloaromadendrenul, β-panasinenul sau γ-elemenul nu au putut fi

evidenŃiaŃi în soiurile amare. Prin urmare, aceşti compuşi pot fi utilizaŃi ca şi compuşi

“marker” în discriminarea soiurilor aromate de cele amare. În soiurile amare, şi în special

în soiul BG, a fost separat şi identificat cu ajutorul librăriilor de spectre, un nou compus,

şi anume β-cis-ocimenul. De asemenea, în ceea ce priveşte compuşii minoritari, soiurile

amare sunt caracterizate de un conŃinut mai ridicat în β-pinen şi metil nerolat faŃă de

soiurile aromate.

În toate cazurile concentraŃia cea mai mică de mircen a fost regăsită în probele de

ulei volatil extrase din peleŃi, iar cea mai mare (cu excepŃia soiului HB) în probele de ulei

XXII

volatil extrase din conurile de hamei floare. Această variaŃie poate fi uşor explicată în

funcŃie de modul de prelucrare al conurilor de hamei. Astfel, datorită uscării conurilor în

instalaŃia de uscare sau peletizării lor, are loc volatilizarea mircenului din conurile de

hamei, în timp ce în cazul conurilor de hamei floare, uscrea lor s-a făcut la temperatura

camerei timp de 48 de ore, şi prin urmare volatilizarea mircenului nu are loc într-o aşa de

mare măsură. Pierderea cea mai mare de mircen, în urma prelucrării conului de hamei, a

fost observată în cazul soiului Perle, când de la o concentraŃie de 68,72% în uleiul volatil

extras din conurile floare s-a ajuns la o concentraŃie de 48,03% pentru uleiul volatil extras

din peleŃi. Cel mai puŃin afectat soi, în ceea ce priveşte conŃinutul de β-mircen, este soiul

Brewers Gold, pentru care concentraŃia acestui compus scade de la 67,99% în uleiul

volatil extras din conurile floare la doar 62,11% pentru uleiul volatil extras din peleŃi.

II.2.2. Rezultate şi discuŃii privind analiza HS/GC-MS a compuşilor volatili din

hamei

II.2.2.1. Optimizarea metodei de analiză HS/GC-MS

Având în vedere că principalul component al uleiului volatil de hamei, β-mircenul,

se află într-o concentraŃie foarte mare (40-70%) în probele analizate prin tehnica GC-MS,

pentru a putea vizualiza şi ceilalŃi compuşi volatili din proba de peleŃi de hamei, s-a

recurs la variaŃia voltajului detectorului pe parcursul analizei. Astfel, în intervalul de timp

7,50 – 8,00 în care apare picul corespunzător β-mircenului s-a micşorat sensibilitatea

detectorului şi s-a mărit în afara acestui interval. Metoda meoh3split100 astfel modificată

a fost codificată ca meoh3split100MS. Prin urmare, concentraŃia de β-mircen rezultată nu

este cea reală, însă având în vedere că pentru toate metodele de extracŃie, cu excepŃia

metodei HSh1 şi HSh2, analiza GC-MS s-a realizat folosind aceeaşi metodă (deci aceeaşi

variaŃie a sensibilităŃii detectorului), datele obŃinute pot fi comparate unele cu altele.

Pentru extracŃia compuşilor volatili din peleŃii de hamei cu HSh1, respectiv HSh2, proba

s-a analizat cu metoda meoh3split100, fără a varia sensibilitatea detectorului pe parcursul

analizei.

Dacă se compară rezultatele obŃinute pentru aceeaşi masă de probă şi temperatură

de incubare, se constată că mărind timpul de incubare nu are loc o extracŃie mai bună.

XXIII

Mai mult, pe măsură ce creşte perioada de incubare, numărul de compuşi separaŃi scade.

De exemplu, în cazul în care incubarea s-a făcut folosind metoda HSh3 (15 minute de

incubare) sau HSh4 (proba incubată 30 de minute) s-au separat 20 de compuşi, în timp ce

folosind metoda HSh5 în care proba a fost incubată timp de 45 de minute s-au separat

doar 18 compuşi (figura 8). Acest lucru se poate datora faptului că mărind timpul de

incubare peste un anumit prag în faza de headspace se acumulează compuşi care se

găsesc într-o concentraŃie mai ridicată în hamei şi a căror temperatură de volatilizare este

mai apropiată de temperatura de incubare, picurile lor “mascând” în acest fel picurile

corespunzătoare unor compuşi minoritari precum beta-cis-ocimen sau copaen.

15 20 25 30 35 40 45

18.0

18.5

19.0

19.5

20.0

Timpul de incubare (min.) Incubation time (min.)

N

um

ar c

om

pu

si s

epar

ati

Num

ber

of s

epar

ated

com

poun

ds

Figura 8. InfluenŃa timpului de incubare asupra numărului de compuşi separaŃi

Dintre cei trei parametrii variaŃi (masa de probă, temperatura de incubare şi timpul

de incubare) cea mai mare influenŃă asupra extracŃiei compuşilor volatili din hamei o are

temperatura de incubare (figura 9). Astfel, comparând rezultatele obŃinute pentru cele

nouă metode de HS testate, cei mai mulŃi compuşi sunt extraşi din proba incubată la

temperaturi ridicate (110oC, respectiv 150oC). În cazul în care 1g de proba de peleŃi este

incubată la 60oC timp de 30 de minute sunt extraşi şi identificaŃi 8 compuşi, în timp ce

pentru o probă cu masă mai mică (0,25g), incubată un timp mai scurt (15min), dar la o

temperatură mai mare (80oC) au fost identificaŃi 12 compuşi. Pe măsură ce incubarea se

realizează la temperaturi mai ridicate, creşte şi numărul de compuşi separaŃi. Astfel, la

incubarea probei la 110oC s-au separat 33 de compuşi, în timp ce pentru probele incubate

la 150oC numărul de compuşi separaŃi creşte considerabil ajungând la 64. Nu este exclus

XXIV

însă faptul ca la temperaturi ridicate de incubare, cum este cea de 150oC, pe lângă

compuşii volatili caracteristici hameiului să apară şi compuşi de oxidare ai acestora.

Figura 9. Cromatograma HS/GC-MS pentru o probă de 0,15g PR-P, incubată timp de 15

minute la diferite temperaturi

II.2.2.2. Evaluarea comparativă a variabilităŃii aromei peletilor cu cea a uleiului volatil

utilizând tehnica HS/GC-MS

Utilizând metoda de extracŃie HShT110t15m0.15 (HSh8), s-au analizat

comparativ probele de peleŃi (din ambalaj care a fost desfăcut –P – şi din amabalaj care a

fost desfăcut numai înainte de efectuarea analizei – Pn ) şi de ulei volatil extras din peleŃi

(Peo), provenite de la cele patru soiuri de hamei: Perle, Huller Biterer, Brewers Gold şi

Magnum.

În ceea ce priveşte conŃinutul de mircen din soiurile analizate, variaŃia acestuia în

funcŃie de soi şi de modalitatea de prelucrare a probei (peleŃi sau ulei volatil) este

prezentată în figura 10. După cum se poate observa, cea mai mare concentraŃie de β-

mircen s-a regăsit în probele de peleŃi nedesfăcuŃi, urmată de probele de peleŃi şi de cele

de ulei volatil extras din peleŃi. Dacă se analizează variaŃia concentraŃiei de β-mircen în

funcŃie de soi, cea mai mare concentraŃie a fost regăsită la soiul Brewers Gold (BG),

urmat de Perle, Huller Bitterer şi Magnum, în aceeaşi ordine ca în cazul analizei GC-MS

a uleiurilor volatile extrase din conuri de hamei floare, uscate şi peleŃi.

XXV

Figura 10. VariaŃia conŃinutului de β-mircen în funcŃie de soi în probele de peleŃi şi ulei

volatil de hamei analizate prin HS/GC-MS cu metoda meoh3split100

În urma analizei HS/GC-MS, utilzând metoda meoh3split100MS, a probelor de

hamei de tip Pn au fost separaŃi 42 de compuşi volatili pentru proba aparŃinând soiului

Perle, 44 pentru soiul Huller Bitterer, 53 pentru soiul Brewers Gold şi 38 pentru soiul

Magnum. În cazul probelor de peleŃi desfăcuŃi (P) au fost separaŃi 34 de compuşi volatili

pentru soiul Perle, 50 pentru soiul Huller Bitterer, 43 pentru soiul Brewers Gold şi 40

pentru soiul Magnum.

ConstituenŃii majoritari, pe lângă mircen, identificaŃi în ambele tipuri de probe de

peleŃi, pentru toate cele patru soiuri analizate, au fost: α- şi β-cariofilenul, β-pinenul,

limonenul, 2-metilbutilisobutirat şi linaloolul. Alături de aceştia, în soiurile aromate s-au

regăsit într-o concentraŃie mai mare decât în cele amare copaenul, γ-muurolenul,

selinenul, α-guaienul, δ- şi β-cadinenul, germacren D. De remarcat este faptul că pentru

soiurile aromate au fost separaŃi şi identificaŃi, la fel ca şi în cazul analizei GC-MS,

compuşi care nu apar în cele amare. Astfel, aromadendrenul, β-panasinenul, γ-elemenul

au fost regăsiŃi doar în soiul Perle şi Huller Bitterer, în timp ce alloaromadendrenul apare

şi în proba de Pn provenită de la soiul Brewers Gold. În schimb, conŃinutul în β-cis-

ocimen este mai ridicat la soiurile amare decât la cele aromate. Soiul Brewers Gold, spre

deosebire de celelalte soiuri conŃine o cantitate mult mai mare de de metil nerolat

(2,43%). În soiurile amare, apare în plus faŃă de cele aromate, la timpul de retenŃie 6,279,

camfenul, într-o concentraŃie mai mare în probele de peleŃi desfăcuŃi decât în cele de

XXVI

peleŃi nedesfăcuŃi (0,09-0,014% la Brewers Gold şi 0,06-0,08% la Magnum). Pentru

probele de peleŃi desfăcuŃi provenite de la soiul Huller Bitterer şi Magnum, a fost

evidenŃiat isoamil-propionatul (1-butanol-3-metil-propionatul), un compus de oxidare.

Tot din categoria compuşilor de oxidare, fac parte şi izobutil izobutiratul, 2-metil-butil-

isobutiratul, 2-pentanol propanoatul, acid propanoic 2-meti-3metil-butil ester, acid

propanoic 2-metil heptil ester, 2-metil-butil-2-metil butanoatul, metil heptanoatul, acid

octanoic metil ester, etc., compuşi care au fost separaŃi şi identificaŃi în ambele tipuri de

probe de peleŃi.

Uleiurile volatile extrase din probele de peleŃi au fost analizate prin tehnica

HS/GC-MS, folosind aceeaşi metodă de analiză ca în cazul probelor de peleŃi. Pentru

uleiul volatil extras din peleŃii din soiul Perle au fost identificaŃi 67 de constituenŃi, 76

pentru soiul Huller Bitterer, 50 pentru soiul Brewers Gold şi 53 pentru soiul Magnum.

Principalii constituenŃi ai uleiurilor volatile, pe lângă mircen sunt: cariofilenul,

humulenul, limonenul, linaloolul, δ- şi β- cadinenul, γ-muurolenul, α-guaienul, α-

selinenul, β-pinenul, copaenul, aceiaşi compuşi majoritari fiind indentificaŃi şi în probele

de peleŃi, pe lângă aceştia în cantităŃi considerabile regăsindu-se oxidul de cariofilen şi

compusul neidentificat de la timpul de retenŃie 34,520. La fel ca şi în cazul probelor de

peleŃi analizate, în soiurile aromate au fost identificaŃi compuşi care nu se regăsesc în

compoziŃia uleiurilor volatile provenite de la soiurile amare, şi anume: β-panasinenul, γ-

elemenul şi aromadendrenul. ConcentraŃiile γ-muurolenului, germacren D, copaenului, α-

guaienului, α-selinenului, δ- şi β- cadinenului sunt de asemenea mai mari pentru uleiurile

volatile provenite de la soiurile aromate decât pentru cele provenite din soiurile amare.

Atât în cazul probelor de peleŃi cât şi în cazul probelor de ulei volatil, pentru soiul

Brewers Gold cantitatea de metil nerolat este de 3 pâna la 11 ori mai mare faŃă de probele

provenite de la celelalte soiuri luate în studiu. Cea mai mare cantitate de metil nerolat

(4,42%) a fost regăsită în proba de BG-Pn, urmată de proba de ulei volatil, BG-Peo

(3,89%) şi proba BG-P (2,43%).

XXVII

II.2.3. Rezultate şi discuŃii privind analiza ITEX/GC-MS a compu şilor volatili din

hamei

În ceea ce priveşte influenŃa timpului de incubare asupra extracŃiei compuşilor

volatili, din datele obŃinute se poate observa că o creştere a timpului de incubare de la 5

la 10 şi apoi la 15 minute nu are ca rezultat şi creşterea numărului de compuşi volatili

separaŃi. Astfel, utilizând metoda ITEXhT60t5s20, din proba PR-Pn, au fost separaŃi 22

de compuşi, în timp ce utilizând metoda ITEXhT60t10s20, au fost separaŃi 20 de

compuşi, iar pentru metoda ITEXhT60t15s30 au fost separaŃi doar 17 compuşi volatili

(figura 11). Acest lucru poate fi explicat prin faptul că mărindu-se timpul de incubare,

cantitatea de mircen şi a altor compuşi uşor volatili, extrasă în faza de headspace a fiolei

de analiză, creşte, în fibră fiind, prin urmare, adsorbită o cantitate mai mare din aceşti

compuşi, în timp ce compuşii care se volatilizează mai greu la temperatura de 60oC nu

mai pot fi detectaŃi.

4 6 8 10 12 14 16

17

18

19

20

21

22

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

ompo

unds

Timp incubare (min.)Incubation time (min.)

Figura 11. InfluenŃa timpului de incubare asupra numărului de compuşi volatili separaŃi

În cazul temperaturii de incubare, datele obŃinute arată că pe măsură ce

temperatura de incubare creşte, creşte şi numărul de compuşi volatili separaŃi. Dacă în

cazul utilizării metodei ITEXhT60t15s30 a fost separaŃi 17 compuşi, în cazul incubării

probelor incubate la 80oC şi 95oC au fost separaŃi 31, respectiv 52 (figura 12).

Temperatura de incubare a fost ridicată şi la 110oC, fiind separaŃi 78 de compuşi volatili,

dar la această temperatură detectorul aparatului s-a saturat, datorită cantităŃii mari de α-

cariofilen acumulată în faza de headspace şi care apoi a fost adsorbită în fibră.

XXVIII

60 70 80 90 100 11010

20

30

40

50

60

70

80

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

ompo

unds

Temperatura de incubare (oC)Incubation temperature (oC)

Figura 12. InfluenŃa temperaturii de incubare asupra numărului de compuşi volatili

separaŃi

Dacă se compară datele obŃinute prin tehnica HS cu cele obŃinute prin tehnica

ITEX, se poate observa foarte clar că tehnica ITEX oferă o extracŃie mult mai eficientă a

compuşilor volatili (figura 13).

60708090100110

0

10

20

30

40

50

60

70

80

HS ITEX

Nu

mar

co

mp

usi

sep

arat

iN

umbe

r of

sep

arat

ed c

ompo

unds

Temperatura de incubare (oC)

Incubation temperature (oC)

8

20

2933

17

31

52

78

Figura 13. InluenŃa metodei şi tehnicii de analiză utilizate asupra numărului de compuşi

volatili separaŃi

Prin urmare, comparativ cu tehnica HS, tehnica ITEX oferă rezultate mai bune în

ceea ce priveşte determinarea compoziŃiei volatile a hameiului. Este totuşi necesară

optimizarea în continuare a metodei ITEX având în vedere că pe lângă timpul şi

XXIX

temperatura de incubare pot fi optimizaŃi şi alŃi parametrii care joacă un rol important în

extracŃia şi separarea compuşilor volatili, şi anume: numărul de pompări, viteza de

adsorbŃie şi viteza de desorbŃie a compuşilor din fibră, temperatura de desorbŃie, etc.

III. ANALIZA CHEMOMETRIC Ă A DATELOR

III.1. EVALUAREA STATISTICĂ A DATELOR LA ANALIZA COMPUŞILOR

VOLATILI DIN ROZMARIN

Datele obŃinute în urma determinării, cu ajutorul tehnicii GC-MS şi HS/GC-MS, a

compoziŃiei uleiurilor volatile de rozmarin, au fost analizate folosind metode de statistică

multivariantă, metode numerice de interpolare, sau analiza corespondenŃelor.

În figura 14 este reprezentată grafic variaŃia compoziŃiei uleiului volatil de

rozmarin în funcŃie de vârstă şi de perioada de recoltare. După cum se poate observa,

majoritatea compuşilor separaŃi au concentraŃia cuprinsă în intervalul 0-5%. De

asemenea, concentraŃiile principalilor componenŃi ai uleiului volatil de rozmarin se

păstrează în aceleaşi intervale: α-pinen (30-35%), camfor (13-18%) şi eucaliptol (7-11%),

indiferent de vârsta de plantei sau de perioada de recoltare a acesteia. Unele diferenŃe în

compoziŃia uleiului volatil de rozmarin apar însă la nivelul compuşilor minoritari.

Având în vedere că recoltarea probelor de frunze de rozmarin, folosite pentru

extracŃia uleiului volatil, s-a făcut la un interval de 6 luni (august 2007, martie 2008 şi

octombrie 2008), utilizând metode numerice de interpolare şi analiza corespondenŃelor s-

a estimat compoziŃia chimică a uleiului volatil de rozmarin în lunile intermediare celor în

care s-a făcut recoltarea, Ńinându-se cont de compoziŃia globală a celor 12 probe de ulei

volatil de rozmarin (figura 15).

XXX

Figura 14. VariaŃia numărului de compuşi separaŃi şi a concentraŃiei acestora pentru

probele de ulei volatil de rozmarin analizate

Figura 15. EvoluŃia în timp a compoziŃie chimice a uleiului volatil de rozmarin extras din

proba R2004

Astfel, în ceea ce priveşte compuşii majoritari, pentru α-pinen şi camfor s-a

constat o creştere a concentraŃiei odată cu vârsta, în timp ce pentru concentraŃia de

eucaliptol a înregistrat o scădere. În decursul unui an, cantitatea cea mai mare de camfor

XXXI

s-a estimat a fi în lunile de primăvară, martie-aprilie. 3-octanona, compusul “marker” al

uleiului volatil de rozmarin studiat, prezintă concentraŃia cea mai ridicată în planta tânără,

scăzând apoi treptat pe parcursul unui an.

III.2. EVALUAREA STATISTICĂ A DATELOR LA ANALIZA COMPUŞILOR

VOLATILI DIN HAMEI

Unul din obiectivele tezei de doctorat a constat în determinarea compoziŃiei

volatile a hameiului şi utilizarea acesteia pentru discriminarea diferitelor soiuri de hamei.

Pentru realizarea acestui obiectiv s-a recurs la analiza statistică a datelor obŃinute în urma

determinării compoziŃiei volatile a hameiului şi uleiului volatil de hamei, prin statistica

multivariată care conŃine tehnici dedicate analizării seturilor complexe de date, obŃinute

în urma studiilor experimentale în care sunt urmărite, evaluate, măsurate mai multe

variabile. Complexitatea cercetărilor de acest tip este datorată nu atât numărului mare de

variabile, cât necesităŃii de a studia relaŃii simultane între mai multe variabile.

Dendograma generală pentru cele 12 tipuri de probe de ulei volatil, câte 3 din

fiecare soi, este prezentată în figura 16, obŃinându-se trei clustere. Primul cluster cuprinde

probele de ulei volatil de hamei provenite de la cele două soiuri aromate, şi anume: PR-

Feo, PR-Ueo, PR-Peo, HB-Feo, HB-Ueo şi HB-Peo. Al doilea cluster cuprinde probele

provenite de la soiul Brewers Gold (BG-Feo, BG-Ueo şi BG-Peo) şi proba MG-Feo de la

soiul Magnum, iar cel de al treilea cluster cuprinde probele de ulei volatil extrase din

conurile uscate şi din peleŃi din soiul Magnum. O diferenŃă semnificativă se observă între

probele de hamei floare sau uscat şi cele de hamei peletizat, prin creşterea distanŃei

euclidiene dintre soiuri, ceea ce presupune modificarea markerilor de calitate în timpul

prelucrării.

XXXII

Figura 16. Dendograma obŃinută prin Cluster Analysis pentru uleiurile volatile de hamei

analizate prin tehnica GC-MS

Datele obŃinute prin tehnica HS/GC-MS a probelor de peleŃi (Pn şi P) şi ulei volatil

(Peo) incubate la 110oC au fost de asemenea supuse analizei statistice. Metoda păstrează

clasificarea făcută pentru probele de ulei volatil analizate prin GC-MS, obŃinându-se şi în

acest caz un grup de similitudine format din soiurile aromate Perle şi Huller Bitterer. Un

aspect foarte important care trebuie menŃionat este faptul că atât în cazul în care s-a luat

pentru analiza statistică compoziŃia uleiului volatil extras din din peleŃi cât şi în cazul în

care s-a folosit compoziŃia volatilă a probelor ca atare de peleŃi incubate, s-a obŃinut

aceeaşi clasificare.

CONCLUZII

În raport cu obiectivele studiului de faŃă se pot evidenŃia următoarele concluzii

generale:

• In analiza compuşilor volatili din rozmarin:

1. S-au optimizat trei metode de analiză a compoziŃiei uleiurilor volatile din

rozmarin, bazate pe tehnicile GC-MS, HS/GC-MS şi ITEX/GC-MS;

2. ComponenŃii principali ai probelor de ulei volatil de rozmarin analizate cu metoda

GC-MS optimizată sunt: α-pinenul, camforul şi eucaliptolul, urmaŃi de camfen, 3-

octanona, β-mircen, limonen, borneol, o-cimen;

XXXIII

3. În urma analizei uleiului volatil de rozmarin, s-au identificat patru « markeri » ce

pot fi utilizaŃi în autentificarea uleiului volatil de rozmarin provenit din sera

Departamentului de Fitotehnie a USAMV Cluj :

a. Raportul dintre cei trei compuşi principali ai uleiului de rozmarin: α-pinen,

camfor, eucaliptol este de aproximativ 2:1:0,6

b. PrezenŃa 3-octanonei împreună cu cea a 3-octanolului

c. O concentraŃie de 3-octanonă cuprinsă între 3-7%

d. Un conŃinut ridicat în α-pinen, cuprins între 30-35%

4. Prin incubarea probelor de frunze uscate şi verzi de rozmarin şi ulei volatil de

rozmarin la 40oC s-au determinat principalii compuşi volatili responsabili de

mirosul caracteristic rozmarinului perceput de om, şi anume: α-pinenul, camfenul,

β-pinenul, β-mircenul, eucaliptolul, 3-octanona şi camforul;

5. 3-octanona, compusul „marker” al rozmarinului cultivat în sera Departamentului

de Fitotehnie din cadrul USAMV Cluj, a fost identificată în toate probele de

frunze uscate de rozmarin analizate prin tehnicile HS şi ITEX;

6. Comparativ cu tehnica HS, la temperaturi mici de incubare (30-40oC), tehnica

ITEX oferă posibilitatea identificării/evidenŃierii unui număr mai mare de compuşi

volatili minoritari. La temperaturi mai mari de incubare (60-95oC), cu ajutorul

tehnicii HS a fost separat un număr de compuşi volatili mai mare decât cel separat

utilizând tehnica ITEX. Însă prin mărirea numărului de pompări din faza de

headspace, numărul de compuşi separaŃi/identificaŃi prin tehnica ITEX îl depăşeşte

pe cel obŃinut cu tehnica HS. Prin urmare, tehnica ITEX oferă posibilitatea unei

determinări mai exacte a compoziŃiei volatile a rozmarinului.

7. Utilizând metode statistice avansate, s-a realizat o predicŃie a evoluŃiei chimice a

uleiului volatil de rozmarin în funcŃie de vârstă şi perioada de recoltare.

• In analiza compuşilor volatili din hamei:

1. S-a realizat optimizarea unor metode GC-MS, HS/GC-MS şi ITEX/GC-MS de

analiză a hameiului şi uleiurilor volatile de hamei.

2. În urma analizei HS/GC-MS a probelor de peleŃi şi de ulei volatil provenite de la

patru soiuri de hamei cultivate în România, principalii constituenŃi volatili

XXXIV

identificaŃi, atât în probele provenite de la soiurile amare cât şi în cele provenite de

la soiurile aromate au fost: mircenul, cariofilenul, humulenul, limonenul,

linaloolul, δ- şi β- cadinenul, γ-muurolenul, α-guaienul, α-selinenul, β-pinenul,

copaenul. În cazul uleiurilor volatile de hamei, pe lângă aceşti compuşi mai apare

şi oxidul de cariofilen.

3. În probele provenite de la soiurile aromate (peleŃi, respectiv ulei volatil) au fost

identificaŃi compuşi care nu se regăsesc în probele provenite de la soiurile amare,

şi anume: β-panasinenul, γ-elemenul şi aromadendrenul care pot fi utilizaŃi ca şi

compuşi “marker” în dicriminarea soiurilor aromate de cele amare.

4. Compuşi precum γ-muurolenul, germacren D, copaenul, α-guaienul, α-selinenul,

δ- şi β- cadinenul se află îtr-o concentraŃie mai mare în probele (peleŃi respectiv

ulei volatil) provenite de la soiurile aromate decât în cele provenite de la soiurile

amare.

5. În schimb, β-cis-ocimenul se regăseşte într-o concentraŃie mai mare în soiurile

amare decât în cele aromate.

6. Toate probele de Brewers Gold au fost caracterizate de o concentraŃie ridicată de

metil nerolat, de trei ori sau chiar mult mai mare faŃă de cantitatea regăsită în

celelalte soiuri.

7. S-a constat o variaŃie a conŃinutului de β-mircen în funcŃie de modul de prelucrare

a conului. Asfel, cea mai mare concentraŃie a fost regăsită în probele de ulei volatil

extras din conuri floare, urmat de cele extrase din conuri uscate şi cele extrase din

peleŃi.

8. Comparativ cu tehnica HS, tehnica ITEX oferă rezultate mai bune în ceea ce

priveşte determinarea compoziŃiei volatile a hameiului, este totuşi necesară

optimizarea în continuare a metodei ITEX

9. Folosind analiza clusterelor s-a realizat o clasificare a soiurilor pe baza

compoziŃiei volatile a hameiului şi uleiului volatil de hamei. Metoda propusă

poate fi utilizată în autentificarea soiurilor de hamei.

XXXV

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Atti-Santos, Ana Cristina, M. Rossato, G. Fernandez Pauletti, Luciana

Duarte Rota, J. C. Rech, Marcia Regina Pansera, Fabiana Agostini, Luciana

Atti-Serafini, P. Moyna, 2005, Physico-chemical evaluation of Rosmarinus

officinalis L. essential oil, Brazilian Archives Biology Technol., 48 (6), 1035-1039

2. Bernotiene, G., O. Nivinskiene, R. Butkiene, D. Mockute, 2004, Chemical

composion of essential oils of hop (Humulus lupulus L.) growing wild in

Ausktaitjia, Chemjia, 2, 31-36

3. Bicchi, C., Chiara Cordero, Erica Liberto, Barbara Sgorbini, Patrizia

Rubiolo, 2008, Headspace sampling of volatile fraction of vegetable matrices, J.

Chromatogr. A, 1184, 220-233

4. Jorge, Katia, L. C. Trugo, 2003, Discrimination of different hop varieties using

headspace gas-chromatographic data, J. Braz. Chem. Soc., 14 (3), 411- 415

5. Kovacevic, M., Milica Kac, 2002, Determination and verification of hop varieties

by analysis of essential oils, Food Chem., 77, 489-494

6. Lo Presti, Maria, S. Ragusa, Alessandra Trozzi, Paola Dugo, F. Visinoni,

Alessia Fazio, G. Dugo, L. Mondello, 2005, A comparison between different

techniques for the isolation of rosemary essential oil, J. Sep. Sci., 28, 273-280

7. Oprean, R., M. Tamas, R. Sandulescu, L. Roman, 1998, Essential oils analysis.

I. Evaluation of essential oils composition using both GC and MS fingerprint, J.

Pharmaceutical Biomed. Anal., 18, 651-657

8. Pintore, G., Marianna Usai, P. Bradesi, Claudia Juliano, G. Boatto, F. Tomi,

M. Chessa, R. Cerri, J. Casanova, 2002, Chemical composition and

antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L. Oils from Sardinia and Corsica,

Flavour Fragr. J., 17, 15-19

9. Radoias, G., A. Bosilcov, I. Bâtiu, 2005, Odorante naturale în parfumeria

modernă, Ed. Casa CărŃii de ŞtiinŃă, Cluj-Napoca

10. Roberts, M. T., J.-P. Dufour, A. C. Lewis, 2004, Application of comprehensive

multidimensional gas-chromatography combined with time-of-flight mass

spectrometry (GC x GC-TOFMS) for high resolution analysis of hop essential oil,

J. Sep. Sci., 27, 473-478