NOTIUNI GENERALE DE BIOTEHNOLOGIEBiotehnologie

Bios viata - biologie

Tehnologie studiul tehnic al utilajelor, masinilor, materialelor

Federatia Europeana de Biologie (1978)

Utilizarea integrata a biochimiei, microbiologiei si ingineriei in scopul obtinerii unei aplicatii tehnologice (industriale)cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule si a partilor componente ale acestora.

Orice manipulare a viului in folosul societatii inseamna biotehnologie

Evolutia

Biotehnologii primare, de generatia I

procedee clasice

extractiile

fermentatiile

biotehnologii de generatia II

utilizeaza metabolismul normal al unor microorganiosme nemodificate pentru obtinerea unor compusiantibioticele

biotehnologii de generatia III, genetice

inginerie genetica

Se poate dezvolta la nivel delaborator - caracter de cercetare fundamentala

industrial - caracter aplicativ

clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii in functie detipul de celule cu care se lucreaza - biotehnologii

microbiene

vegetale

animale

domeniul in care isi gasesc aplicatii produsele

biotehnologii industriale

farmaceutice

producerea de biomasa proteica

biosinteza antibioticelor

productia de acizi organici

aminoacizi

probiotice

polizaharide

hormoni

vitamine

alimentare

procedee industriale de prelucrare

legume

fructe

lapte

produse lactate

carne

aspecte fermentative ale acestora

depoluante

epurarea biologica a

apelor uzate (poluate)

aerului

solurilor degradate

extractia minereurilor cu ajutorul microorganismelor

biotehnologii agricole

vegetale

rezistenta plantelor la atacul factorilor patogenitoleranta fata de factorii de mediu defavorabilimultiplicarea speciilor horticole

obtinerea de noi hibrizi sexuati

animale

in zootehnie

nutritia animala

cresterea rezistentei animalelor la atacul factorilor patogenireproductia artificiala

predeterminarea sexului la animale

conservarea resurselor genetice animale

medical-veterinare

crearea unor sisteme de diagnostic rapid almaladiilor

dereglarilor functionale

sisteme biologice de combatere a boliloranticorpi monoclonali

vaccinuri

bacterii antagoniste

Produsul biotehnologicTipul de organism utilizat

Solventi organiciEtanol (nu pentru bautura)

acetona

Sacharomices cerevisiaeClostridium acetobutylicum

BiomasaCulturi starter si drojdii pentru industria alimentara si agriculturaBacterii lactice

Drojdii de panificatie

Acizi organiciAcid citric

Acid gluconic

Acid lactic

AspergillusnigerAspergillusnigerLactobacillus delbrueki

Aminoacizi

Transformari microbieneSteroizi

D-Sorbito L-sorboza

Polizaharide extracelulare

Nucleotide

EnzimeProteaze

Amilaze

Renina

VitamineB12

Riboflavina

Alcaloizidin ErgotCleviceps paspali

Pigmentib-carotene

Vaccinuriimpotriva

difteriei

tetanosului

pertussisului

poliomielitei

rubeolei

hepatitei B

Corinebacterium diphteriaeClostridium tetaniBordetella pertussisVirusi activi atenuati

Virusi activi atenuati

Antigen de suprafata evidentiat in drojdia recombinata

Proteine terapeuticeInsulilna

Hormonul de crestere

Eritropietina

Interferonul 2

Escherichia colirecombinata

Escherichia colirecombinata

Celule de mamifere recombinate

Escherichia colirecombinata

Insecticide

AntibioticePeniciline

Cefalosporine

Tetracicline

Antibiotice macrolide (eritromicina)

Antibiotice polipeptide (gramicidina)

Antibiotice aminoglicozide (streptomicina)

Antibiotice aromatice (griseofulvina)

Penicillinum chrysogenumCephalosporinum acremoniumStreptomyces aureofaciensStreptomyces erytreusBacillus brevisStreptomyces griseusPenicillinum griseofulvum

Anticorpi monoclonali

Cultivarea microorganismelor in instalatii industriale specializate, performantedetermina

Asigurarea de conditii optime de

Crestere

Dezvoltare

Biosinteza a metabolitilor doriti

Acumularea preferentiala a unui anumit metabolit necesitaCresterea si dezvoltarea microorganismelor

Condusa

Reglata

Etapele elaborarii tehnologiilor de biosinteza--cuprinde mai multe faze

--Laborator

--Micropilot

--Statii pilot

--Productie industriala

--Faza de laboratorcuprinde 2 etape

--Etapa I

--Izolarea, selectarea si testareamicroorganismului producator--Tehnici specifice pentru fiecare microorganism

--Metode folosite pentru izolarea si testarea microorganismului

--Tehnica dilutiilor

--Microorganismele

--preluate din diferite habitate

--cultivate pe medii

--solide

--lichide

--initial se urmareste realizarea unei culturi pure--tehnici microbiologice specifice

--epuizarea ansei

--dilutii succesive

--apoi se stabileste o metoda de triere (screening)--microorganismul cultivat pe placi Petri pe medii de agar-agar

--se fac teste de identificare

--calitative

--cantitative

--De ex. - Enzime

--includerea substratului specific pentru enzima dorita

--amidon/amilaze

--cazeina/proteaze

--celuloza/celulaza

--enzimele difuzeaza in gelul de agar-agar

--daca nu se poate aplica un test calitativ

--coloniile izolate se cultiva pe medii specifice

--extractul(lichidul) de biosinteza

--prelevat

--prelucrat

--dozarea compusului

--spectrofotometric

--fluorimetric

--tritrimetric

--polarimetric

--se retin numai cateva tulpini care au dat cele mai bune rezultate--Intretinerea culturilor producatoare--lucrari de caracterizare a microorganismului dupa criterii

--morfologice

--biochimice

--fiziologice

--imunologice

--toxicologice

--inregistrarea tulpinii

--intr-o colectie de microorganisme

--sub un numar de identificare

--Selectia unui mutant inalt producator

--Lucrari de selectie

--Naturala

--Artificiala (mutageneza)

--Conservarea

--Tulpini parentale

--Tulpini mutante

--Prin

--metode speciale

--la temperaturi scazute

--Liofilizarea

--Conservarea in azot lichid

--Cultura stoc--Cultura de la care se porneste procesul de biosinteza--Tulpinile din colectie utilizate in lucrarile de biosinteza--Metodele de intretinere a culturilor sunt specifice fiecarui microorganism

--Conditii de pastrare

--La frigider

--Pe geloza nutritiva

--In tub inclinat

--punctul de plecare pentru prepararea unei culturi inocul de laborator--cultura inocul--constituie

--cultura microbiana in curs de multiplicare--materialul de insamantare a mediului de biosinteza in etapa urmatoare

--conditii de dezvoltare

--format pe un substrat nutritiv corespunzator--pH

--Temperatura

--Agitare

--Aerare

--Transvazarea inoculului

--In mediul de biosinteza

--Conditii aseptice

--Dupa o perioada de dezvoltare bine stabilita si definita prin--Varsta

--Cantitate

--Aspect microscopic

--Aparatura

--Placi Petri

--Tuburi test

--Flacoane Ehrlenmeyer

--Faza de laborator--Etapa a II-a

--Stabilirea parametrilor optimi de cultivare--Mediul de cultura

--pH

--Temperatura

--Agitare

--Aerare

--Aparatura

--Flacoane Ehrlenmeyer

--Agitatoare rotative

--Faza de micropilot--stabilirea conditiilor de cultivare

--pH

--temperatura

--consum de O dizolvat

--turatie

--debit de aer

--aparatura

--bioreactor de laborator - 10 L

--Faza de statie pilot--A - stabilirea parametrilor

--de cultura

--biosinteza

--aparatura

--instalatii de capacitate medie

--bioreactoare 100 1000 L

--B - stabilirea conditiilor de lucru la nivel semiindustrial--aparatura

--bioreactoare 5000 10.000 L

--sterilizarea

--precede operatiile de insamantare vitamina C--aparaturii

--mediului

--mediul de cultura

--sterilizat

--racit la temperatura optima de cultivare--cultura intermediara

--treapta intermediara de cultivare

--apare atunci cand raportul de inoculare--cantitatea de inocul/cantitatea de mediu de fermentatie

--nu permite pregatirea culturii inocul in laborator--moduri de cultivare

--A - culturi de suprafata

--B - submers

--mediu lichid

--agitat

--aerat

--adoptat

--in functie de fiziologia producatorului

--rentabilitate

--Productia industriala--initial -faza experimentala industriala

--apoi obtinerea industriala a medicamentelor

--bioreactoare 10.000 100.000 L

PROCEDEE DE BIOSINTEZA--conditiile proceselor de biosinteza pot fi--oxibiotice (aerobe)

--anoxibiotice (anaerobe) fermentative

--termenul de fermentatie s-a extins si la procesele oxibiotice

--procesele de biosinteza bioproces

--criterii de clasificare a bioproceselor

--felul culturii

--de suprafata

--submers

--tipul de operare

--omogen/ heterogen

--discontinuu/continuu

--modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului--simple

--simultane

--consecutive

Bioprocese in culturi de suprafata--suport

--solid

--semisolid

--culturi solide

--microorganismele se dezvolta

--pe suprafata

--in interiorul mediului

--culturi semisolide

--microorganismele se dezvolta in toata masa mediuluiBioprocese in culturi submerse--instalatii pentru asigurarea

--amestecarii perfecte a componentelor mediului de biosinteza--solide

--lichide

--gazoase

--alimentarea adecvata cu aer

--aparatura de masura si control

--utilaje speciale bioreactoare

--avantaje

--se preteaza la automatizari

--economie de spatiu

--o buna amestecare si aerare a mediului--conditii optime pentru microorganisme

--randamente ridicate

--cel mai utilizat pentru

--aminoacizi

--proteine

--enzime

--sisteme industriale

--discontinui (sarje)

--continui

--productivitate mare

--aparte de capacitati mici pastreaza mai bine parametrii optimitipul de operare--sistemeleomogene--compozitia mediului este uniforma pe tot parcursul bioprocesului

--sistem este monofazic

--microorganismele sistemului au aceeasi stare fiziologica (stadiu de dezvoltare)--sistemeleheterogene--compozitia mediului de fermentatie are gradiente de celule sau de substrat--sisteme

--monofazice

--multifazice

--lichid/lichid

--lichid/gaz

--microorganismele

--expuse la diferite conditii de mediu--diferite stari fiziologice (diferite stadii de dezvoltare)tipul de operare--bioproceseinchise--celulele microbiene mentinute in totalitate in sistem--nu pot atinge o stare stationara

--bioprocesedeschise--celulele trec continuu in efluent

--celulele parasesc sistemul in rata in care se formeaza

--rezulta ca se gasesc in stare stationara

tipul de operare--sistem continuu de operare

--deschis

--omogen

--cu un stadiu

--cu mai multe stadii

--heterogen

--cu un stadiu

--cu mai multe stadii

--mixt

--inchis

--omogen

--heterogen

--mixt

modulde transformare al componentelor nutritive ale mediului--procese simple

--componentele nutritive se transforma stoechiometric in produse de reactie

--fara acumulare de intermediari in mediu--procese simultane

--componentele nutritive se transforma in diferite proportii stoechiometrice

--fara acumulare de intermediari in mediu--procese consecutive

--componentele nutritive se transforma cu acumulare de intermediari--procese desfasurate in etape

--componentele nutritive se transforma in intermediari si apoi in produsi de reactie

Microorganisme utilizate in biotehnologie--microorganismele

--diversitate

--morfologica

--activitate biologica

--pozitie sistematica

--caractere comune

--dimensiuni microscopice

--organizare micelara (in general)

--structura interna relativ simpla

--grup format din

--bacterii--drojdii--fungi--alge microscopice

--protozoare

Bacteriile--organizare celulara

--de tip procariot

--unicelular

--perete celular rigid

--ac. Mureinic

--ac. Teichoic

--ac. Diaminopimelic

--multiplicare prin diviziune directa

--mare variabilitate explicata prin

--fenomene

--de recombinari genetice

--mutatii

Levurile(drojdiile)--fungi microscopici

--unicelulari

--organizare celulara de tip eucariot

--dimensiuni mari

--aspect

--monoforme

--sferice

--ovale

--alungite

--dimorfe

--polimorfe

--perete celular

--gros

--format din

--polizaharide

--glucani

--manani

--nucleu

--bine definit

--inconjurat de o membrana nucleara tipica--reproducerea

--asexuata

--inmugurire

--diviziune

--sexuata

--prin conjugarea a doua celule sexuale

--putine ca numar (350 de specii)

--importante datorita numeroaselor utilizari practice, industriale

Fungii filamentosi--microorganisme eucariote

--metabolism de tip chimiorganotrof

--corp hife - miceliu

--filamente

--tubulare

--microscopice

--lungi

--subtiri

--perete celular

--semirigid

--chitina asociata cu celuloza

--reproducerea

--spori asexuati

--formati prin derivare din celule vegetative

--sporangiospori

--conidiospori

--spori sexuati

--rezultati din incrucisarea intre 2 celule polarizate sexual

--ascospori

Metabolismul microbian--totalitatea reactiilor biologice implicate in activitatea biologica prin intermediul carora energia, elementele de mediu nutritiv sunt utilizate pentru biosinteze, crestere si alte activitati celulare;

--cai metabolice

--catabolism

--reactii exergonice (elibereaza energie)

--furnizeaza energie- ATP

--anabolism

--reactii endergonice (consum de energie)--sinteza de noi constituenti prin folosirea energiei stocate din primul proces

--bioelemente

--majore

--conc. mari

--104M

--C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca

--Minore

--Cantitati foarte mici

--Zn, Mn, Mo, Co, Cu, W

--Tipuri de metabolism dupa natura sursei de energie--Microorganisme fototrofe energia radianta

--Microorganismechimiotrofe energia din reactii chimice oxidative la intuneric

--Capacitatea de a biosintetiza metaboliti esentiali--Autotrofe

--Au capacitatea de a sintetiza toti constituentii celulari--pornind de la surse anorganice simple

--de C CO2,

--de azot - NH3--Heterotrofe

--incapabile de a sintetiza metabolitii esentiali--necesara adaugarea lor in mediu ca--substante organice

--anorganice

--necesara

--o sursa de C

--hidrati de C

--acizi organici

--o sursa de N

--aminoacizi

--proteine

--saruri anorganice de amoniu

--biotehnologie heterotrofe

--factori de crestere

--Andr Lwoff

--Substante necesare pentru dezvoltarea microorganismelor

--substante pe care un organism este incapabil sa le sintetizeze

--in absenta carora multiplicarea este imposibila--aminoacizi naturali care intra in compozitia proteinelor

--bazele purinice

--bazele pirimidinice

--vitaminele hidrosolubile - B

METABOLISMUL ENERGETIC LA MICROORGANISME--Energia obtinuta din reactiile metabolismului energetic este necesara activitatii biologice

--Transport prin membrane

--Respiratie

--Biosinteza

--Energia microorganismelor heterotrofe provine din degradarea unor substante organice adaugate in mediul de cultura ca sursa de carbon

--3 faze de eliberare a energiei in procesul de catabolism--macromoleculele organice sunt descompuse la unitatile lor cu eliberarea a 1% din energia inglobata--proteinele aminoacizi

--grasimile glicerol si ac. grasi

--glucidele- monozaharide

--moleculele rezultate din prima faza sunt degradate pana la produsi mai mici + CO2+ H2O cu eliberarea a 1/3 din energia lor totala--intermediari ai cailor metabolice

--a 3-a faza este diferita pentru diferitele tipuri de microorganisme--microorganisme care pot descompune integral substantele nutritive pana la CO2si H2O pe calea acizilor tricarboxilici--microorganisme care realizeaza numai o descompunere partiala a substratului nutritiv cu formare de produsi intermediari servind ca acceptori, donori de electroni--se obtin astfel diversi produsi (fermentatie)

--compusii glucidici reprezinta sursa cea mai cunoscuta de energie

--degradare pe calea Ebden-Meyerhof-Parnas cu--formarea a 2 molecule de ac. piruvic

--eliberarea a 2 molecule de ATP

--ac. piruvic

--transformat in acetil-coenzima care intra in ciclul lui Krebs

--se elibereaza 4 perechi de electroni care pot intra in lantul respirator

Bacterii lantul respirator este asociat cumembrana plasmatica

mezozomi

eucariote sediul respiratiei in mitocondrii

energia

inmagazinata in ATP

folosita la nevoie

in functie de acceptorul final de electronirespiratia aeroba (oxibiotica) Oxigenul

respiratia anaeroba (anoxibiotica) - compus organic

fermentatia compusii organici functioneaza ca donor si acceptor ein functie de comportarea fata de Oxigenul molecularmicroorganisme strict (obligatoriu) aerobe

oxigenul este acceptor final de Hau nevoie permanent de oxigenul atmosfericdispun de citocromi

enzime

peroxidaze

catalaza

superoxid dismuataza

microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe

nu se pot dezvolta in prezenta oxigenului molecular

nu au echipamentul enzimatic al celor aerobemicroorganisme aerobe facultativ anaerobe

cele mai numeroase

isi orienteaza metabolismul spre respiratie (fermentatie) in functie de prezenta (absenta) Oxigenului

microorganisme microaerofile

au nevoie de o cantitate de Oxigen mai mica decat din aerul atmosfericmetabolitii formati produsii obtinuti prin biosintezametaboliti primari

formati in faza de crestere exponentialarezultat al metabolismului oxidativ (fermentativ)

alcooli primari (simpli)

acizi

aldehide

CO2H

CH4Metaboliti secundari

Substante chimice complexe

La inceputul fazei stationare de crestere

Uneori produse in cantitati foarte mariNu au functie metabolica evidenta

Antibiotice

Enzime

Vitamine

Sintetizati

pe seama constituentilor cu masa moleculara micapentru a indeparta din mediu compusii mici care le-ar periclita viataDatorati

existentei unor inductori

epuizarii unor represori

Medii de culturaSuporturi nutritive sterilizate

Permit dezvoltarea unui microorganism in afara nisei sale ecologice naturale

Importante pentru

Reproductibilitate

Eficienta

Criterii de clasificare

Consistenta

Lichide

Solide

Semisolide

Compozitie

Naturale

Elemente nutritive

Vegetale

Animale

Pot contine

Subproduse agroalimentare

--Srot de floarea soarelui

--Faina de porumb

--Tarate de grau

--Extract de porumb

Completate cu mici cantitati de saruri mineraleAvantaje

Mai ieftine

Dezavantaje

Nu permite

Standardizarea

Reproducerea procesului cu un randament constantSintetice

Reproductibile la scara industriala

Numai compusi

cu structura chimica cunoscuta

care pot fi dozati

Tipul de respiratie al microorganismelor

aerobe

anaerobe

Scopul si frecventa

de uz curent

medii speciale pentru studiile de izolare la nivel de laboratorelective

selective

de imbogatire

de conservare

de identificare

Faza de biosinteza la care este folositlaborator

pilot

industrial

Destinatia finala

pentru cultura inocul

cultura de regim (medii de fermentatie, de biosinteza)

trebuie sa contina

sursa de carbon - carbohidrati

sursa principala de energie

regleaza necesarul de O si Hglucoza

amidon

fructoza

zaharoza

sursa de azot

organic

aminoacizi

proteine

uree

anorganic

amoniac

sulfat de amoniu

sursa de fosfor

acid fosforic

fosfat de amoniu

fosfat acid de potasiu

oligoelemente

potasiu

clorura de potasiu

fosfat acid de potasiu

magneziu

sulfat de magneziu

fier

clorura ferica

factori de crestere

aminoacizi

proteine

vitamine

coenzime

precursori

portiuni structurale ale moleculei produsului biosintetizat

sursa de carbon

exista o valoare a concentratiei elementelor necesare dezvoltarii nerestrictivedefinita de Peppler, Harrison, 1970

CINETICA PROCESELOR DE BIOSINTEZACresterea si multiplicarea microorganismelorProcesul de crestere

se desfasoara

prin sinteza specifica echilibrata a constituentilor celulari

pornind de la substante nutritive simple aflate in mediu

controlat genetic

depinde de

substante nutritive

natura

concentratia

asigurarea cu energie

marirea volumului celular prin

sinteza de substante organice

marirea continutului in apa

cresterea se intrerupe la momentul producerii diviziunii celulare

raport intre volumul celulei/suprafata celuleisuprafata creste cu o ratie patraticavolumul creste cu o ratie cubicaraportul atinge un punct critic diviziunea celulara

multiplicarea celulelor

pluricelulare marirea taliei individului

unicelulare cresterea numarului de indivizi

viteza de multiplicare

durata unei generatii 2030 min.

tipica pentru fiecare specie

variaza in functie de conditiile de mediuDINAMICA MULTIPLICARII BACTERIILORprocesul multiplicarii populatiei bacteriene cuprinde mai multe faze

faza de latenta (lag)intre

momentul introducerii germenului in mediul de cultura (inoculare)

momentul in care celulele acestuia incep sa se multiplice

nr. bacteriilor din inocul

raman neschimbate

scad temporar

cultura nu este vizibila la microscopbacteriile acumuleaza in celula

metaboliti esentiali

sisteme enzimatice necesare cresterii

perioada de adaptare la noile conditii de cultivare (de viata)

mediu nutritiv

temperatura

pH

aeratie

timp

cateva ore

mai scurt cu cat noul mediu este mai apropiat de cel vechitransvazarea inoculului

prima situatie

inoculul provine dintr-o cultura aflata in curs de multiplicaremediu nutritiv cu aceeasi compozitie

isi pastreaza ritmul rapid de dezvoltarecazul

transvazarii inoculului in intermediar

pentru obtinerea unor cantitati mai mari de inocula doua situatie

inoculul provine dintr-o cultura aflata in curs de multiplicaremediu nutritiv cu alta compozitie

perioada de adaptare

crestere neevidenta de la inceput

fazade multiplicare exponentiala (crestere logaritmica)precedata de o perioada scurta (cca. 2h)accelerare a ritmului de crestere

multiplicarea se produce cu o viteza progresiva maritadiviziunile sunt sincronizate

nr. celulelor

se dubleaza brusc

la intervale de timp regulate

progresie geometrica

crestere exponentiala

scurt timp 2-3 ore

tendinta de multiplicare rapida scade progresiv

epuizarea substantelor nutritive

acumularea de produse de catabolism cu efect inhibitorcelulele de tip embrionar

dimensiuni mai mari

citoplasma

mai omogena

nu contine materiale de rezerva

afinitate pentru colorantii bazici

continut ridicat de ARN

cele mai potrivite pentru lucrari de geneticaperioada de post-lag

spre sfarsitul fazei de multiplicare logaritmica

incetinirea

desincronizarea cresterii populatiei

acum sunt amorsate biosintezele in culturi continui

faza stationara maximanumarul celulelor viabile

maxim

ramane constant

ore cateva zile

insotita de

epuizarea substantelor nutritive

acumularea unor produsi toxici

celulele nu se mai multiplica

faza de declinscaderea progresiva a numarului celulelor viabile

celule

batrane

cu fenomene de involutie

in unele cazuri fenomene de autoliza

metode de apreciere a cresterii unui microorganismdeterminarea substantelor uscate a masei celulare

determinarea conc. sursei de carbon din mediu

determinarea nr. total de celule, cu ajutorul celulelor de numaratdeterminarea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene in functie de timpDINAMICA PROCESULUI DE CRESTERE LA FUNGIcresc sub forma de colonii

miceliu 10-15 m

se poate pleca de la

inocul de spori

fragment micelian

mai multe faze

faza initiala de lagcateva ore

germinarea sporilor (inoculare cu suspensie de spori)

regenerarea hifelor rupte si lezate (inocul vegetativ)faza de crestere liniarape suprafata mediului apare o coloniecirculara

creste liniar cu timpul

forma unei retele fine de hifefaza de invechireincetinirea vitezei de crestere

efectul daunator al produsilor de metabolismmai repede in cazul mediilor mai bogate in substante nutritive

VARIATIA CONCENTRATIEI COMPONENTELORMEDIULUI DE BIOSINTEZAau fost elaborate modele matematice in scopul reprezentarii cat mai apropiate de realitate a cineticii de desfasurare a unui proces de biosinteza

Mono, Komo, Verhoft

Descriu ecuatia variatiei in timp a concentratiei de celule in mediul de biosinteza

Variatia vitezei specifice de dezvoltare respecta in acest caz cinetica Michaelis-Menten

Viteza specifica de dezvoltare depinde de concentratia unui component din mediul de cultura cu rol limitativ

Elementul limitativ

Sursa de carbon (glucoza)

Sursa de azot (aminoacidul esential)Pe baza ecuatiei variatia vitezei specifice de dezvoltare se poate calcula timpul necesar dublarii concentratiei de celule microbieneViteza specifica de dezvoltare calculata este mai mare decat cea reala

Variatia in timp a concentratiei de microorganisme este supusa efectelor

inhibitorii

ale substratului

ale produsului finit

efecte exercitate de mai multe substantede inductie

de represie

modelarea proceselor metabolice

urmareste obtinerea de

biomasa celulara

metaboliti

prin

viteza de dezvoltare a microorganismelor

concentratia de microorganisme

stadiul culturii de microorganisme

folosirea particularitatilor proprii ale culturii

INFLUENTA FACTORILOR DE MEDIUASUPRA CRESTERII MICROORGANISMELORfactori de mediu

conc. substratului

calitatea si cantitatea inoculului

temperatura

pH-ul mediului de biosinteza

agitarea

concentratia oxigenului dizolvat

INFLUENTA CONCENTRATIEI SUBSTRATULUIASUPRA CINETICII DEZVOLTARII MICROBIENEMarirea conc. de substrat din mediu determina cresterea nr. celule microbiene pana la o limita

Fenomen subordonat actiunii inhibitorilor

Inhibitorii actioneaza prin

Modificarea potentialului chimic al

Substratului

Intermediarilor metabolici

Produsului finit

Modificarea permeabilitatii peretelui celular cu reducerea transportului substantelor nutritive

Modificarea activitatii enzimelor metabolice

Disocierea agregatelor metabolice

Modificarea parametrilor functionali

Capacitatea de reproducere

Mobilitatea

Biosinteza unor metaboliti

Mecanismele inhibitiei

Reactie chimica cu una sau mai multe componente celulare

Adsorbtia (complexarea) de enzime (coenzime)Interventia in secvente ale reactiilor biochimice

Interventia in disocierea complexelor enzimatice

Modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintezapH

tarie ionica

constanta dielectrica

capacitatea de solvatare

interventia in functiile celulare de control

concentratia optima de substrat in momentul initial si pe parcurs

conc. inhibitoare a glucozei10-15%, dulceata, siropuri

INFLUENTA DIMENSIUNILOR INOCULULUIASUPRA PROCESELOR BIOTEHNOLOGICEcalitatea si cantitatea inoculului

cantitate mare

declansarea unei rapide dezvoltari

reducerea riscului de contaminare

3-10% din volumul total al culturii

raport optim de inoculare

definirea starii fiziologice

varsta

aspect microscopic

efectele marimii si varstei inoculului

bacteriiMarimea inocului influenteaza stadiile ulterioare ale culturii

inocul mare se micsoreaza faza de lagdatorita formarii si acumularii unor metaboliti intermediari esentiali - difuzeaza rapidcantitate prea mare

autoinhibitie

datorat sensibilitatii celulelor bacteriene fata de unii produsi metabolici intermediari

cantitate prea mica

faza de lag poate fi prelungita la infinit

dezvoltare anormala a microorganismului

initierea dezvoltarii unui inocul

concentratie critica de metale grele

Bacillus subtilis Mn

levurimarimea inocului influenteaza faza de lag si stadiile ulterioare ale culturii

fungiinecesara standardizarea inoculului vegetativ pentru acest grup de microorganismeinocul sub forma de suspensie de spori ritm rapid de dezvoltare

autoinhibitie (autostimulare) a germinarii sporilor substante produse in

timpul germinarii

fazele ulterioare

cantitatea inoculului influenteaza

miceliul

marime

forma

randamentul in metaboliti

raportul de inoculare judicios

dezvoltarea masei miceliene

consum mare de carbohidrati

cultura ineficienta

EFECTELE TEMPERATURII ASUPRA CRESTERIIMICROORGANISMELORdiferenta intre temperatura mediului inconjurator si din interiorul celulei nulavariatiile temperaturii

randamentul de transformare a substratului

cerintele nutritive

compozitia biomasei

viteza de crestere microbiana

domeniul de temperatura in care ating viteza maxima de crestere

criofile (10C)

mezofile

microorganisme industriale

25 30C

termofile

mecanismul de actiune afecteaza

procesele metabolice

compozitia biomasei in

proteine

lipide

ARN

EFECTELE PH-ULUI ASUPRA CRESTERIIMICROORGANISMELORCateva directii de influentare

Domeniul optim de pH

Drojdii 4-5 ---- 2; 8.

Valori mici ale pH (3-4) risc scazut de contaminareEfectul pH asupra randamentului de conversie a substratului

Domeniu foarte strict de pH

Ac. Citric

1,7-2

< ------ ac. citric

> ------ ac. oxalic, gluconic

deviatii ale pH de la valoarea optima

efecte nedorite

datorate

consumarea unui nutrient

producerea unui acid de catre microorganism

corectarea abaterii

adaugarea unor substante chimice

pH sub cel optim

NaOH

KOH

Amoniac gazos

Amoniac solutie

Ioni de Na, K

pH peste cel optim

HCl

Ac. sulfuric

Ac. azotic

ion Clorura

saruri greu solubile

corectia poate determina coroziune

pH-ul determina efecte de disociere a acizilor si bazeloractioneaza la nivelul suprafetelor celulei

modifica proprietatile

de aderare la diverse materiale

de floculare

CONCENTRATIADE OXIGEN DIZOLVATculturile aerobe

oxigenul necesar

oarecare exces

transferul de oxigen din faza gazoasa in faza lichida are loc cu viteze mari

in biosinteza in laborator (baloane agitate) aeratia depinde deviteza de rotatie (translatie) a agitatorului

marimea baloanelor

volumul de mediu de cultura din balon

cresterea turbulentei prin sicane

eficienta aerarii concentratia de oxigen dizolvat determinata prinmetode sulfit

masurarea vitezei maxime de transfer a oxigenului din aer in mediu

metoda polarografica

determinarea concentratiei oxigenului dizolvat in mediuutilizarea electrodului cu membrana

masurarea oxigenului dizolvat

determinarea ratiei consumului de oxigen

folosirea analizorului paramagnetice de oxigen

analizeaza si compara compozitia aerului

ce iese din bioreactor

ce intra in bioreactor

conducerea unui proces

cunoasterea

modului de variatie in timp a necesarului de oxigen

rata consumului de oxigen

sporeste rapid la o valoare maxima din primele stadiieste momentul atingerii concentratiilor ridicate de celule

apoi scade

necesarul de oxigen mediul de biosinteza utilizatPenicillium oxigen dublu glucoza(zaharoza simplu)Factori care influenteaza transferul de oxigen

Agentii tensioactivi micsoreaza coeficientul de transfer

Concentratia de microorganisme

Conc. mari vascozit. creste eficienta sistemului de aerare scade

Sistemul de agitare agitare eficienta dispersie buna a bulelorEchipament de aerare conducte perforate bioreactoare de volum mare

Suprapresiunea favorizeaza marirea conc. de oxigen 0,5 1 atm.Micsoreaza riscul de infectie

PRELUCRAREA MEDIILORDE BIOSINTEZAPrelucrarea primara

Filtrarea

Centrifugarea

Decantarea

Concentrarea fazei lichide

Dezagregarea celulelor

Extractia

Uscarea

Atomizarea

Precipitarea

cu solventi organici

cu saruri anorganice

ultrafiltrare pentru

purificari

concentrari

echipamente complexe si specifice

dificultati ale separarii produselor din lichid

produse termolabile

dificultati eliminate prin cunoasterea proprietatilor fizico-chimice ale produselor

solubilitatea in

apa (solutii diluate de saruri)

solventi polari (metanol, etanol, acetona)solventi slab polari (cloroform, hidrocarburi)

stabilitatea in solutie in functie de efectul

pH

temperatura

solutii tampon

solventilor organici

stabilitatea in stare solida in functie de temperatura si efectul umiditatii

proprietati fizice

gradul de dializa

adsorbtia pe substante solide

migrarea in camp electric

sedimentarea in ultracentrifuge

proprietati chimice

stabilitatea fata de enzime

stabilitatea la actiunea unor agenti chimicimetode de separare din biomasa

extractia cu solventi organici

separarea pe schimbatori de ioni

cromatografie

adsorbtie

operatiile cele mai utilizate in biotehnologia medicamentelorfiltrarea

concentrarea

dezagregarea celulara

atomizarea

Filtrarea mediilor de biosintezaprobleme datorate

compozitia chimica a mediului

materialul biologic

adjuvanti de filtrare

formeaza paturi microscopice cu micsorarea dimensiunilor porilormaresc vitezei de filtrare

reduc consumul de materiale

mai multe scheme

aplicarea pe materialul filtrant (panza, hartie) a unui strat subtire de material adjuvant

amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtratraclarea permanenta a stratului adjuvant cu ajutorul unor cutite pentru mentinerea stratului la o valoare constanta (cazul filtrelor rotative)se foloseste foarte mult filtrarea sterilizantaprefiltrare grosiera

apoi filtrarea sterilizanta

filtre din

acetat de celuloza

azbest

polimeri sintetici

Dezagregarea celulelor de microorganismenecesara pentru cazul in care substantele biologicactive sunt intracelulare

diverse procedee

fizice mecanicemori coloidale

mori vibratoare

agent de racire pentru mentinerea sistemului la o anumita temperaturafizice nemecaniceinghetare lenta

soc osmotic

vibratii ultrasonice 20.000 Hz

chimicepentru distrugerea componentelor lipoproteice din membrane se folosesc

detergenti cationici

detergenti aminici

solventi organici

preparate enzimatice

E. coli bacteriofagi

Tesut muscular enzime proteolitice

Drojdia de bere autoliza la 30C, 2-3 zile

Concentrarea mediilor de biosintezaSe are in vedere termolabilitatea produselorEvaporarea in vacuum la temperaturi scazute (25-50C) liofilizareProcedee de concentrare atermica

Ultrafiltrarea

Separarea pe baza diferentei de volum molecular cu ajutorul unei membraneAvantaje

Concentrarea la temperaturi scazute

Micsoreaza

fenomenele de autodigerare

pierderile in activitate prin denaturare termica

nunecesita modificari de faza (evaporari, condensari)nu utilizeaza substante chimice

purifica solutiile biologice prin indepartarea unor componente cu volum molecular inferiorOsmoza inversa

AtomizareaUscarea prin atomizare

Utila pentru materialele care in faza initiala sunt lichide

Solutii

Suspensii

Paste subtiri

Se realizeaza o ceata de lichid din particule de 2 200mUscare rapida incat materialul nu se incalzeste

Se obtine o pulbere nu este necesara maruntireaIntr-o prima concluzie biotehnologiile farmaceutice industriale sunt alese si optimizate in functie de acesti doi mari factori, raportati la criteriul economic (pretul de cost):medii

solide

lichide

culturi

de suprafata

submerse

procesele biotehnologice industriale

determina o dezvoltare

abundenta

egala

agitare mecanica

aerare corespunzatoare