ACADEMIA ROMÂNĂ

INSTITUTUL DE CHIMIE MACROMOLECULARĂ ”PETRU PONI”, IAŞI

NOI BIOMATERIALE RECEPTIVE LA STIMULI EXTERNI CONŢINÂND

PROTEINE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducători ştiinţifici: CS. I Dr. Cornelia VASILE

CS. I Dr. Maria CAZACU

Doctorand: Bioing. Daniela PAMFIL

< IAŞI, 2016 >

Mulţumiri

Datorez mulţumiri speciale Academiei Române şi conducerii Institutului

de Chimie Macromoleculară ”Petru Poni” pentru suportul financiar, sprijinul ştiinţific, încrederea şi înţelegerea acordată pe parcursul stagiului de pregătire a tezei de doctorat.

Această teză reprezintă rezultatul a 4 ani de cercetare şi s-a concretizat sub atenta îndrumare a domnişoarei Prof. Dr. CS. I Cornelia Vasile, căreia doresc să îi adresez pe această cale profunda mea recunoştinţă şi sincere mulţumiri pentru sugestiile sale indispensabile, sprijinul total şi constant, pentru răbdare şi pentru coordonarea ştiinţifică acordată pe toată perioada elaborării tezei de doctorat.

Un gând deosebit şi alese mulţumiri doamnei Dr. CS. I Maria Cazacu pentru sprijinul, sugestiile, timpul şi răbdarea acordate de-a lungul perioadei doctorale şi pentru oportunitatea oferită de a o avea ca îndrumător de doctorat.

Mulţumesc membrilor comisiei de doctotat, domnului Prof. Univ. Dr. Marcel Ionel Popa, doamnei Dr. CS. II Loredana Elena Niţă şi doamnei Prof. Univ. Dr. Liliana Vereştiuc pentru atenţia acordată analizei acestei lucrări şi pentru sugestiile formulate.

Îi rămân îndatorată doamnei Prof. Univ. Dr. Liliana Vereştiuc pentru încrederea necondiţionată şi ghidarea, încă din studenţie, a drumului spre o formare profesională cu baze solide.

Mulţumesc domnului Prof. Dr. Christoph Schick, specialist în analiza termică pentru disponibilitate şi pentru ajutorul acordat în realizarea studiilor de calorimetrie în cadrul Institutului de Fizică al Universităţii din Rostock, Germania şi doamnei Prof. Dr. Lidija Fras Zemljič pentru testele de titrare potenţiometrică ce au fost realizate în cadrul Laboratorului de Caracterizare şi Prelucrare a Polimerilor a Universităţii din Maribor, Slovenia.

Cele mai calde mulţumiri tuturor colegilor din cadrul Departamentului

Chimia Fizică a Polimerilor pentru, amiciţia unică, sfaturile preţioase, sprijinul şi încrederea lor neîncetată şi pentru că mi-au fost pur şi simplu alături când am avut nevoie de ajutor şi mi-au arătat ce înseamnă implicarea şi lucrul în echipă.

Adresez mulţumiri colegilor din cadrul Institutului de Chimie

Macromoleculară pentru generozitatea şi amabilitatea de a realiza diferite caracterizări ale sistemelor polimerice investigate în această teză.

În încheiere, le mulţumesc şi le datorez mai multă recunoştinţă decât aş fi în stare să exprim dragilor mei părinţi care au crezut în mine.

Cu deosebită stimă şi consideraţie, Bioing. Daniela Pamfil

CUPRINS

Pg.

teză/

rezumat

MOTIVAŢIA ŞI STRUCTURAREA TEZEI 1/1

PARTEA I. Stadiul actual privind obţinerea de biomateriale / hidrogeluri receptive la

stimuli externi cu aplicaţii în domeniul biomedical şi farmaceutic

Cap. I: BIOMATERIALE RECEPTIVE LA STIMULI EXTERNI

I.1. Introducere. Definiţii, clasificare, comportare generală 6

I.2. Polimeri sensibili la temperatură, un stimul extern uşor de aplicat 9

I.2.1. Polimeri termosensibili naturali 10

I.2.1.1. Proteine cu proprietăţi receptive la temperatură 11

I.2.1.1.1. Materiale termosensibile pe bază de colagen 11

I.2.1.1.2. Gelatina 12

I.2.1.2. Chitosanul 14

I.2.2. Polimeri termosensibili sintetici 17

I.2.3. Aplicaţii ale polimerilor cu caracter termosensibil 18

I.2.3.1. Eliberarea de principii active cu efecte terapeutice 18

I.2.3.2. Inginerie tisulară 19

I.3. Polimeri sensibili la pH 22

I.3.1. Clasificarea polimerilor sensibili la pH 23

I.3.2. Materiale sensibile la pH pe bază de colagen 25

I.3.3. Aplicaţii biomedicale ale polimerilor sensibili la pH 27

I.3.3.1. Sisteme de eliberare ale compuşilor activi 27

I.3.3.2. Transportori de gene 30

I.3.3.3. Biosenzori 32

I.4. Polimeri sensibili la stimuli biologici 33

I.4.1. Sensibilitatea la enzime 33

I.4.1.1. Aplicaţii biomedicale 33

I.4.1.2. Sensibilitatea colagenului la enzime cu aplicaţii în

ingineria tisulară

35

I.5. Materiale receptive la mai mulţi stimuli externi 37

Cap. II: COLAGENUL: CARACTERISTICI ŞI APLICAŢII ÎN DOMENIUL BIOMEDICAL

II.1. Introducere generală şi clasificare 38

II.2. Structura şi compoziţia chimică a colagenului 40

II.3. Proprietăţile colagenului 42

II.4. Implicarea colagenului în reacţii chimice şi fizice 46

II.4.1. Metode de modificare a colagenului 46

II.4.1.1. Modificarea chimică a colagenului 46

II.4.1.2. II.4.1.2.1. Modificarea colagenului prin intermediul

grupelor amino

47

II.4.1.2.2. Modificarea colagenului prin intermediul

grupelor carboxil

49

II.4.2. Reticularea colagenului 50

II.4.2.1. Reticularea chimică 51

II.4.2.2. Reticularea fizică 54

II.4.2.3. Reticularea enzimatică 55

II.5. Aplicaţii biomedicale ale colagenului 55

II.5.1. Pansamente pe bază de colagen pentru tratarea rănilor 55

II.5.1.1. Funcţia colagenului în refacerea rănilor 56

II.5.1.2. Pansamente pe bază de colagen ca potenţiale sisteme de

eliberare a agenţilor terapeutici

57

II.5.2. Utilizarea materialelor pe bază de colagen ca sisteme de eliberare a

principiilor active

59

Cap. III: BIOMATERIALE PE BAZĂ DE HIDROGELURI

III.1 Biocompatibilitatea polimerilor 62

III.2. Hidrogeluri ca biomateriale biocompatibile 64

III.3. Hidrogeluri obţinute prin combinarea polimerilor sintetici cu cei naturali 67

III.3.1. Compatibilitatea polimerilor 67

III.3.2. Metode de îmbunătăţire a compatibilităţii între polimeri 69

III.3.3. Hidrogeluri multicomponente 70

III.4. Aplicaţii biomedicale ale hidrogelurilor 70

III.4.1. Hidrogeluri pentru regenerarea pielii 71

III.4.2. Hidrogeluri injectabile pentru regenerarea şi refacerea ţesuturilor vii 72

III.4.3. Hidrogeluri utilizate ca sisteme de eliberare controlată 73

III.4.4. Hidrogeluri utilizate ca lentile de conctact 75

CONCLUZII PARTEA I 76

PARTEA A II-A. Contribuţii privind sinteza şi caracterizarea unor noi materiale

polimerice pe bază de proteine sensibile la stimuli externi

Cap. IV: MATERIALE ŞI METODOLOGIA DE INVESTIGARE

IV.1. Materiale 78

IV.2. Sinteza colagenului funcţionalizat cu anhidride ciclice 83

IV.3. Sinteza hidrogelurilor pe bază de colagen modificat şi 2-hidroxietil metacrilat–

CM/HEMA

84

IV.4. Sinteza hidrogelurilor pe bază de poli (alcool vinilic) şi chitosan – PVA/CHT 85

IV.5. Sinteza hidrogelurilor hibride pe bază de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen 86

IV.6. Metode de investigare a materialelor de colagen nativ şi a celor modificate cu

anhidride

86

IV.6.1. Analiza prin spectroscopie FT-IR 86

IV.6.2. Analiza prin spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară 1H-

RMN

87

IV.6.3. Determinarea grupelor amino din structura colagenului înainte şi

după modificare prin reacţia cu TNBS

87

IV.6.4. Titrarea potenţiometrică 89

IV.6.5. Determinarea conţinutului de Carbon Organic Total şi Azot Total

(TOC/TN)

90

IV.6.6. Difuzia dinamică şi statică a luminii 90

IV.6.7. Măsurători vâscozimetrice 91

IV.6.8. Analiza termică prin TG/DTG/DTA/FT-IR/MS 93

IV.6.9. Teste de adeziune 93

IV.7. Metode de investigare a hidrogelurilor 95

IV.7.1. Spectroscopia în infraroşu cu transformată Fourier (FT-IR) 95

IV.7.2. Microscopia electronică de baleiaj (SEM) 95

IV.7.3. Randamentul reacţiei de sinteză 95

IV.7.4. Determinarea gradului de umflare 96

IV.7.5. Analiza prin calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) 97

IV.7.6. Determinarea unghiului de contact cu apa 100

IV.7.7. Testarea in vitro a biodegradabilităţii enzimatice 101

IV.7.8. Teste in vitro de încărcare şi eliberare a principiilor active din

hidrogelurile CM/HEMA şi PVA/CHT

104

IV.7.9. Teste de toxicitate acută in vivo 107

IV.7.10. Teste de biocompatibilitate in vivo prin implantare intraperitoneală la

şobolani

108

Cap. V: MODIFICAREA COLAGENULUI CU ANHIDRIDE ŞI OPTIMIZAREA CONDIŢIILOR DE REACŢIE

V.1. Introducere 114

V.2. Stabilirea structurii chimice a colagenului modificat prin metodele

spectroscopice

114/5

V.2.1. Caracterizarea prin spectroscopie FT-IR 116

V.2.2. Caracterizarea prin spectroscopie 1H RMN 117/5

V.3. Determinarea gradului de substituţie utilizând reacţia cu TNBS 118/6

V.4. Rezultatele obţinute în urma titrării potenţiometrice şi a analizei TOC / TN 119/6

V.5. Rezultatele DLS/SLS 122/7

V.6. Efectul concentraţiei şi temperaturii asupra comportamentului reologic al

soluţiilor de colagen nemodificat şi al celor modificate cu anhidride

124/7

V.7. Rezultatele analizelor termice 128

V.7.1. Date termogravimetrice 128/8

V.7.1. Analiza compuşilor volatili în urma descompunerii termice 130

V.8. Rezultatele testelor de adeziune in vitro 137/9

V.9. Concluzii 139

Cap. VI: OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT

VI.1. Introducere 140

VI.2. Sinteza hidrogelurilor pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat

cu anhidride (HEMA/CM)

141/9

VI.3. Analiza structurală a hidrogelurilor prin spectroscopie FT-IR 145

VI.4. Examinarea morfologică a hidrogelurilor prin microscopie electronică de baleiaj

(SEM)

149

VI.5. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor 150/10

VI.6. Rezultate analizei calorimetrice DSC 152/11

VI.6.1. Analiza în stare uscată a materialelor de colagen modificate cu

anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen

152/11

VI.6.2. Analiza în stare hidratată a materialelor de colagen modificate cu

anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen

155/12

VI.7. Concluzii 160/56

Cap. VII: OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND CONŢINUTUL DE COLAGEN MODIFICAT ŞI AL AGENTULUI DE INIŢIERE

VII.1. Introducere 162

VII.2. Sisteme investigate 163/13

VII.3. Analiza spectrală FT-IR 165/14

VII.4. Randamentul reacţiei de sinteză a hidrogelurilor 166/15

VII.5. Testele de solubilitate 167

VII.6. Analiza morfologică şi determinarea gradului de umflare în condiţii similare 168/15

mediului fiziologic

VII.7. Dependenţa de pH a comportamentului la umflare al hidrogelurilor 172/17

VII.8. Degradarea enzimatică in vitro a hidrogelurilor 176/17

VII.9. Studiul de eliberare a ciprofloxacinei în condiţii care simulează pe cele ale

mediului fiziologic

182/19

VII.10. Dependenţa de pH a eliberarii ciprofloxacinei din hidrogeluri 187/20

VII.11. Determinarea toxicităţii acute in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA 191/20

VII.12. Rezultatele testelor de biocompatibilitate in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA 192/21

VII.13. Studii de eliberare a bisoprolului fumarat (BF) din hidrogelurile pe bază de

colagen modificat şi HEMA

200

VII.14. Concluzii 201

Cap VIII: TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA PH A UNOR HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)

VIII.1. Introducere 203

VIII.2. Sensibilitatea la pH a comportării la umflare a hidrogelurilor PVA/CHT 205/21

VIII.3. Caracterizarea hidrogelurilor PVA/CHT încărcate cu CF prin spectroscopie FT-

IR

211

VIII.4. Studii de eliberare in vitro a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate (CF)

din matricile hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT

215/22

VIII.5. Studii de eliberare in vitro a bisoprololului fumarat (BF) din matricile

hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT

221

VIII.6. Concluzii 224

Cap. IX: HIDROGELURI HIBRIDE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL ACRILAMIDĂ

IX.1. Introducere 226

IX.2. Materiale folosite 228

IX.3. Analiza de calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) a hidrogelurilor în stare

hidratată

229/24

IX.4. Determinarea unghiului de contact 239/26

IX.5. Concluzii 241

Cap. X: CONCLUZII GENERALE ŞI PERSPECTIVE 242/26

BIBLIOGRAFIE 251/33

ACTIVITATEA ŞTIINŢIFICĂ ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT 285/34

1

MOTIVAŢIA TEZEI

Colagenul este principala proteină din matricea extracelulară. Mai mult de

90 % din proteinele extracelulare de la nivelul tendonului şi mai mult de 50 % din

cele de la nivelul pielii este reprezentat de colagen. Datorită biocompatibilităţii şi

biodegradabilităţii excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice şi

modului în care interacţionează cu organismul, proteinele reprezintă unele dintre

cele mai utilizate biomateriale.

Una dintre cele mai importante funcţii ale colagenului este aceea de a

conferi rezistenţă şi integritate structurală a ţesuturilor. Totuşi, în urma procesului

de extracţie rezistenţa mecanică a acestuia scade. Viteza mare a biodegradării,

proprietăţile mecanice şi termice scăzute limitează utilizǎrile ulterioare ale

colagenului în domeniul biomedical. Pentru a îmbunătăţi toate aceste proprietăţi

într-un mod controlabil şi pentru a conferi noi poziţii active de legare la nivelul

catenei macromoleculare, colagenul a fost supus unei reacţii de funcţionalizare cu

anhidride şi s-au variat condiţiile de reacţie şi agentul de modificare pentru

optimizarea lor. Anhidrida citraconică şi 2,3-dimetil maleică folosite ca agenţi de

funcţionalizare sunt două anhidride cu reactivitate crescută. Materialele de colagen

modificate cu anhiride au fost ulterior caracterizate comparativ cu materialul nativ

şi s-au testat pentru potenţialele lor aplicaţii biomedicale.

Teza de doctorat are ca scop principal obţinerea de noi hidrogeluri

polimerice poroase, sensibile la modificări ale stimulilor externi, în particular pH,

pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride fără

implicarea agenţilor chimici de reticulare.

Testarea aplicabilităţii acestor materiale a început cu testarea toxicităţii,

biocompatibilităţii, biodegradabilităţii şi a capacităţii de a funcţiona ca transportori

pentru principii active şi eliberarea controlată a acestora. Rezultatele pozitive

obţinute au indicat potenţialele utilizării ale acestora în domeniile biomedical şi

farmaceutic, în particular ca pansamente în refacerea şi regenerarea ţesuturilor,

colagenul fiind deja cunoscut pentru calităţile lui în acest domeniu. Suplimentar, s-

a avut în vedere compararea sistemelor sintetizate pe bază de proteine sensibile la

pH cu alte sisteme deja cunoscute pentru sensibilitatea lor la stimuli externi,

acestea fiind hidrogelurile pe bază de poli (alcool vinilic) şi chitosan şi cele pe bază

de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen.

2

STRUCTURAREA TEZEI

Teza abordează subiectul obţinerii, caracterizării şi utilizǎrii hidrogelurilor

sensibile la pH în domeniul interdisciplinar al ingineriei ţesuturilor, domeniu ce

aplicǎ principii ale ştiinţelor vieţii şi ale ingineriei pentru realizarea de sisteme care

refac, menţin sau îmbunǎtǎţesc funcţia ţesuturilor. Utilizarea biomaterialelor în

aceste scopuri dateazǎ încǎ din antichitate. În prezent, odatǎ cu dezvoltarea

procedurilor şi materialelor de refacere a organismului, a crescut şi riscul de

afectare a acestuia.

Introducerea de noi materiale în domeniile biomedical şi farmaceutic ca

cele elaborate în cadrul tezei, presupune respectatea unor condiţii esenţiale precum:

� sǎ fie biocompatibile şi sǎ satisfacǎ diferite nevoi nutriţionale şi biologice

specifice populaţiei de celule existente;

� să fie reproductibile în forme diverse tridimensionale;

� să aibă structurǎ poroasǎ ce permite o distribuţie adecvatǎ a celulelor

însǎmânţate şi difuzia elementelor nutritive necesare creşterii şi

dezvoltǎrii celulare;

� să ofere un potenţial de reglare a proprietǎţilor chimice, fizice şi

mecanice;

� sa aibă biodegradabilitate controlatǎ.

Lucrarea de doctorat este structurată pe două părţi şi nouă capitole.

În primele trei capitole, ce constituie prima parte a lucrării, se prezintă

noţiuni generale şi date de literatură recentă în domeniu privind obţinerea de

biomateriale/hidrogeluri receptive la stimuli externi cu aplicaţii în domeniile

biomedical şi farmaceutic.

Primul capitol cuprinde noţiuni de bază ce vizează stadiul actual al

biomaterialelor receptive la unul sau mai mulţi stimuli externi ca temperatura, pH-

ul, tăria ionică, enzimele, etc.. S-a urmărit clasificarea şi aplicabilitatea acestora.

În capitolul al II-lea, atenţia este îndreptatǎ, în mod special, asupra

colagenului, o bioproteină cu aplicaţii multiple în ingineria tisularǎ, atât datoritǎ

biocompatibilitǎţii lui, cât şi datoritǎ posibilitǎţilor relativ crescute de obţinere din

ţesuturi animale (piele, tendon, os, etc.). Pe baza multor date bibliografice recente,

acest capitol vine în întâmpinarea noilor metode de îmbunǎtǎţire a proprietǎţilor

colagenului.

Problema realizǎrii de noi biomateriale pe bază de colagen, poate fi

abordatǎ din douǎ puncte de vedere:

3

- realizarea de noi biomateriale cu performanţe superioare celor deja

cunoscute;

- realizarea de noi biomateriale cu proprietǎţi similare sau îmbunătățite

celor deja cunoscute, dar cu preţ de cost mai redus.

Capitolul III prezintă succint tipurile de hidrogeluri şi utilizările acestora.

Materialele polimerice, sintetice sau naturale, sunt din ce în ce mai mult utilizate în

domeniul cercetării medicale şi farmaceutice. Gama largă a materialelor polimerice

cât şi cunoştinţele extinse din domeniu permit realizarea de noi biomateriale ale

cǎror proprietăţi sǎ fie cât mai apropiate de cele optime pentru implanturi.

Biomaterialele polimerice sunt sisteme minim invazive care pot transporta la

organul ţintă diferite principii biologic active, fiind sisteme de eliberare controlată

a medicamentelor şi altor principii active în organism.

Următoarele 5 capitole, încadrate în partea a doua a tezei de doctorat, cuprind rezultate proprii, originale privind sinteza şi caracterizarea noilor materiale

de colagen modificat şi a hidrogelurilor polimerice sensibile la pH dar şi

compararea acestora cu alte sisteme receptive la modificări ale condiţiilor

fiziologice.

Capitolul IV oferă date referitoare la materialele utilizate şi la metodele de

investigaţie utilizate în teză pentru a obţine rezultate concludente pentru viitoarele

aplicaţii biomedicale. Folosirea sistemelor polimerice pentru obţinerea produşilor

de inginerie tisulară presupune o etapă de prelucrare, în urma căreia se fixează

forma şi structura finală. Aceasta din urmă este cea care influenţează proprietăţile

produsului final. În acest context, este explicabilă importanţa deosebită acordată

metodelor de caracterizare a structurii şi morfologiei sistemelor polimerice în

vederea elucidării relaţiei ce există între parametrii de prelucrare, structura şi

proprietăţile produselor finale obţinute.

Capitolul V prezintă sinteza şi caracterizarea materialelor de colagen ce au

fost modificate chimic cu anhidrida citraconică şi anhidrida 2,3-dimetil maleică

atât în scopul îmbunătăţirii proprietăţilor prin optimizarea condiţiilor reacţiei de

sinteză cât şi în scopul fixării pe biopolimer a unor noi situsuri de legare ce pot

participa ulterior la reacţii de copolimerizare cu un monomer sintetic, şi anume 2-

hidroxietil metacrilatul, pentru obţinerea de hidrogeluri tridimensionale.

Capitolul VI este orientat spre studiul noului sistem polimeric sintetizat

alcătuit din colagenul funcţionalizat şi poli (2-hidroxietil metacrilat). Hidrogelurile

au fost obţinute cu diferite de tipuri de colagen modificat (cu grade diferite de

substituţie) şi analizate din punct de vedere structural dar şi din prisma aspectului

4

morfologic, a capacității de umflare şi a stabilităţii termice în stare uscată sau

hidratată prin intermediul calorimetriei diferenţiale de baleiaj.

Capitolul VII prezintă rezultatele originale asupra hidrogelurilor pe bază

de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride în care s-a variat

raportul masic al acestora. Pentru sinteza hidrogelurilor s-au selectat materialele de

colagen modificat cu cele mai mari grade de substituţie. S-a urmărit, în principal,

evaluarea sensibilităţii la variaţii ale pH-ului prin studii de umflare şi de eliberare a

principiilor active. Principiile active selectate pentru studiile de încărcare şi de

eliberare au fost ciprofloxacina hidroclorurată şi bisoprololul fumarat. De

asemenea, în ideea utilizării în ingineria tisularǎ ca pansamente de refacere tisulară,

noile sisteme polimerice sintetizate au fost evaluate din punct de vedere al

biodegradabilităţii, toxicităţii şi biocompatibilităţii la contactul cu ţesuturiile vii.

Capitolele VIII şi IX descriu caracterizarea unor sisteme sensibile la

schimbări ale mediului exterior şi anume hidrogelurile pe bază de poli (alcool

vinil) şi chitosan şi cele pe bază de poli N-izopropil acrilamidă şi colagen. S-au

realizat astfel studii de umflare şi de eliberare pentru a evidenţia sensibilitatea la

pH dar şi studii asupra stabilităţii termice pentru evidenţierea sensibilităţii la

temperatură.

Teza se încheie cu prezentarea într-o manieră succintă a concluziilor

generale cu privire la cele mai importante rezultate experimentale obţinute în

cadrul acestei tezei (Capitolul X) şi cu lista bibliografiei consultate.

Lucrarea se extinde pe 289 pagini şi cuprinde 105 figuri, 15 ecuaţii, 50

tabele şi 488 referinţe bibliografice.

Rezumatul tezei cuprinde într-o formă concentrată rezultatele originale

obţinute. În rezumat se menţine numerotarea tabelelor, figurilor şi schemelor din

materialul tezei.

5

CAPITOLUL V. MODIFICAREA COLAGENULUI CU ANHIDRIDE SUBSTITUITE ŞI OPTIMIZAREA CONDIŢIILOR DE REACŢIE

V.2. Stabilirea structurii chimice a colagenului modificat prin metodele spectroscopice

Procesul chimic de modificare al colagenului prin intermediul grupelor

aminice este descris în Figura V.1. Legarea chimică dintre atomul de carbon

provenit de la gruparea carbonil (C=O) a anhidridei ciclice cu gruparea aminică

(-NH2) din macromolecula de colagen are loc printr-o reacţie de adiţie nucleofilă -

eliminare ce conduce la obţinerea de colagen modificat care prezintă în structura sa

chimică legături vinil (HC=CH) şi carboxil (COOH). Reacţia dintre colagen şi AC

poate conduce la două posibilităţi de legare la grupele funcţionale ale colagenului

în funcţie de poziţia grupei metil (CH3) faţă de grupa carbonil (Figura V.1.a).

Figura V.1. Reacţia dintre o moleculă de colagen şi

anhidrida AC (a) sau ADM (b)

V.2.2. Caracterizarea prin spectroscopie 1H RMN În spectrele

1H RMN (Figura V.3.a şi V.3.b) colagenului modificat cu AC

(colagen:AC, 1:3 g/g) există trei semnale noi ce nu sunt prezente în spectrul

colagenului nemodificat. La δ = 6 ppm apare un semnal atribuit protonilor din

dubla legătură a grupării vinil (-HC=CH-) iar la δ = 8,7 ppm apare un semnal

corespunzător protonului din gruparea amidă (C=O-NH-). Protonul din gruparea

metil (CH3) a fost evidenţiată prin cel puţin un semnal la δ = 2,1 ppm.

Figura V.3. Spectrele 1H-NMR colagenului nemodificat (a) şi a probelor de colagen modificate cu AC

(b) şi ADM (c)

6

În spectrul prezentat în Figura V.3c ce a fost înregistrat pe proba de

colagen modificat cu ADM (colagen:ADM, 1:3 g/g) s-au observat două semnale la

8,7 ppm şi 2,1 ppm asociate protonilor din gruparea amidă şi respectiv din cele

două grupări metil.

V.3. Determinarea gradului de substituţie utilizând reacţia cu TNBS În Tabelul V.1 sunt prezentate rezultatele referitoare la gradul de

substituţie ale probelor de colagen modificat.

Tabelul V.1. Dependenţa valorilor procentuale ale gradului de substituţie în funcţie de tipul

şi cantitatatea de anhidridă şi de condiţiile mediului de reacţie.

Modificare cu anhidrida 2,3-dimetilmaleică Modificare cu anhidrida citraconică

Material* pH Raport C/ADM

(g/g)

Gradul de substituţie (mol %)

Material* pH Raport C/AC (g/g)

Gradul de substituţie (mol %)

ADM10.6 8 1/3 10,6 AC8.4 8 1/3 8,4

ADM8.2 8 1/5 8,2 AC5.6 8 1/5 5,6

ADM7.2 9 1/5 7,2 AC 9.6 9 1/5 9,6

*simbolul probei indică tipul de anhidridă folosit la modificare şi gradul de substituţie

Comparativ cu agentul de funcţionalizare AC, ADM a manifestat o

reactivitate mai crescută pentru colagen obţinându-se un grad de substituţie de 10,6

%, datorită susceptibilităţii mai mari de a hidroliza a anhidridei AC faţă de ADM.

V.4. Rezultatele titrării potenţiometrice şi ale analizei TOC/TN Curbele de titrare obţinute prin creşterea şi scăderea treptată a pH-ului

aproape au coincis şi sunt reversibile dovedind faptul că probele de colagen sunt

stabile, fără apariţia precipitării. Valorile medii pentru pKa pentru grupele carboxil

şi amino din colagenul nemodificat au fost de 4,3 şi respectiv 10,1 (Tabelul V.2).

Tabelul V.2. Valorile pKa obţinute pentru grupele carboxil şi amino ale materialelor de

colagen obţinute.

Denumirea probei

Media pKa pentru COOH

(pK1)

Conţinutul de grupări –COOH protonate

(mmol/Kg)

Media pKa pentru NH2

(pK2)

Conţinutul de grupări –NH3

+ protonate (mmol/Kg)

Colagen 4,3 33 10,1 13

AC 8.4 4,7 53 10 9

AC 9.6 4,8 70 10 2

ADM 7.2 4,7 46 9,9 7

ADM 10.6 5,1 81 9,9 4

La valori de pH de 4,3, jumătate din grupările carboxil din colagen sunt

deprotonate şi toate grupele amino sunt protonate. De asemenea, poate fi menţionat

că în jurul valorilor de pH 10, jumătate din conţinutul de −NH3+ sunt încă

disociate. Prin urmare, în structura colagenului (la pH puternic alcalin) vor fi

7

prezente un număr semnificativ de grupări amino terminale deprotonate care sunt

foarte propice în reacţia cu anhidride.

Grupele funcţionale cu valori mai mari ale pKa-ului au scăzut (grupele

amino) după modificarea colagenului, iar cele cu un pKa cuprins între 4,5–5,1 care

aparţin grupelor carboxil au crescut, fapt ce dovedeşte succesul modificării

colagenului.

V.5. Rezultatele DLS/SLS Masa moleculară medie (Mw) şi cel de-al doilea coeficient virial (A2) au

crescut după modificarea chimică, valori care au fost mai mari în cazul probelor cu

gradul de substituţie mai ridicat ceea ce semnifică faptul că, s-au format

interacţiuni puternice atât intramoleculare cât şi intermoleculare ce sunt în

concordanţă cu variaţia valorilor KA şi KB din datele vâscozimetrice.

Tabelul V.4. Valori ale Mw, A2, dimensiunea particulelor (media Z), PDI şi potenţialului

Zeta obţinute pentru colegenul modificat cu anhidride substituite.

Probă Mw (KDa) A2 104 (mL mol/g2)

Media Z (nm) PDI Potenţialul Zeta (mV)

Colagen 398 1,8 410 0,94 22,9 ADM7.2 876 10,44 1170 0,538 25,3

ADM8.2 1395 24,85 2100 0,165 28,0

ADM10.3 819 14,12 2700 0,407 24,1

AC5.6 558 22,45 2880 0,133 28,4

AC8.4 525 25,97 1840 0,559 26,3

AC9.6 598 17,56 2290 0,416 26,0

După reacţiile de modificare, indexul de polidispersitate (PDI) scade,

probele de colagen substituite devenind mult mai omogene în ceea ce priveşte

dimensiunea moleculelor. Dimensiunile particulelor au crescut după reacţia de

modificare cu anhidride de cel puţin 5 ori schimbându-se astfel şi distribuţia

acestora, efect pus pe seama modificării helixului triplu dar şi pe apariţia unor

aglomerări ale moleculelor de colagen.

V.6. Efectul concentraţiei şi temperaturii asupra comportamentului reologic al soluţiilor de colagen nemodificat şi al celor de colagen modificat cu anhidride

O diferenţă majoră este remarcată în vâscozitatea soluţiei de colagen

nemodificat comparativ cu vâscozităţile soluţiilor de colagen modificate cu AC şi ADM. Această diferenţă este cauzată de schimbarea formei şi dimensiunii

moleculelor de colagen în urma modificării cu anhidride. Astfel, prezenţa grupelor

acil în structura chimică a colagenului conduce la o creştere considerabilă a

dimensiunii moleculelor ce vor cauza ulterior creşterea vâscozităţii soluţilor.

Vâscozitatea intrinsecă şi cea inerentă au crescut semnificativ după

modificarea cu cele două anhidride demonstrând legarea chimică a acestora la

8

catenele din colagen provocând modificări conformaţionale ale moleculelor şi apariţia de interacţiuni puternice atât inter - macromoleculare cât şi cu moleculele

de solvent, fapt dovedit şi de valorile crescute ale mărimilor KA şi KB de până la de

20 sau 8 ori în cazul probelor de colagen modificate comparativ cu cel nemodificat.

Figura V.7 reprezintă graficul schimbării vâscozităţii relative la încălzire a

soluţiilor de colagen. După cum se poate vedea, toate soluţiile de colagen modificat

manifestă o descreştere bruscă a vâscozităţii relative (ηrel) în intervalul de

temperatură 28 - 38 oC urmând apoi o menţinere aproape constantă a acesteia la

temperaturi mai ridicate pâna la 46 oC. Probele de colagen modificate AC5.6 şi

ADM7.2, care au cel mai mic grad de substituţie, sunt mult mai stabile şi au o

temperatură de denaturare mai mare (32-33 oC) faţă de cele care au un grad de

substituţie mai mare şi care au arătat o Td mai scăzută (31 oC).

26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

1

2

3

4

5

6

7

8

9

28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

1.055

1.060

1.065

1.070

1.075

1.080

1.085

1.090

1.095

1.100

ηre

l

T, oC

ηre

l

Temperatura (o C)

Colagen

C-ADM7.2

C-ADM8.2

C-ADM10.6

C-AC5.6

C-AC8.4

C-AC9.6

Figura V.7. Reprezentarea

grafică a vâscozităţii relative

(ηrel) în funcţie de

temperatură a soluţiilor de

colagen modificate cu AC şi

ADM comparativ cu cea a

colagenului pur

V.7.1. Date termogravimetrice Curbele termogravimetrice (TG) pentru colagen şi materialele modificate

cu anhidride substituite au indicat prezenţa a două procese termice de pierdere a

masei. Primul etapă implică două procese suprapuse: denaturarea colagenului şi

eliminarea apei libere sau legate existente în material. Pe baza temperaturilor

iniţiale de descompunere prezentate în Tabelul V.7, se poate concluziona că

modificarea chimică a colagenului cu AC şi ADM a condus la creşterea stabilităţii

termice a materialelor în stare solidă.

Tabelul V.7. Caracteristici TG ale colagenului pur şi a celor modificate.

Probă Primul

proces Tmax (oC)

Al doilea proces Pierderea de masă (%)

(30 - 570 oC) Tonset

(oC)

Tmax

(oC)

Tendset

(oC)

Colagen 71 262 326 375 72

C-AC 9.6 82 273 318 373 69

C-ADM 10.6 77 270 326 371 72

Tonset = temperatura la care începe degradarea termică; Tmax = temperatura ce corespunde gradului maxim de degradare; Tendset = temperatura la care fiecare etapă de degradare ia sfârşit

9

Cel de al doilea proces de degradare termică, desfăşurat într-un interval

extins de temperatură, include reacţii de descompunere secvenţiale cu paşi multipli

de pierdere a masei. Făcând o comparaţie între temperaturile la care începe

degradarea termică (Tonset), au fost obţinute valori ridicate de 273 oC şi 270

oC

pentru produsele de colagen modificat comparativ cu Tonset a colagenului

nemodificat de 262 oC, fapt ce evidenţiază o rezistenţă termică mai ridicată.

V.8. Rezultatele testelor de adeziune in vitro S-au evidenţiat cele mai crescute valori ale lucrului mecanic în cazul

probelor C-ADM10.6 şi C-AC9.2 până la aproximativ 500 mm*mN comparativ cu

materialul de colagen nemodificat care a înregistrat un lucru mecanic de 234

mm*mN (Figura V.12). Prin urmare, proprietatea de adeziune a fost îmbunătăţită

pentru probele de colagen funcţionalizate cu anhidride cu cât gradul de substituţie a

fost mai crescut. Acest lucru este explicat de numărul mare grupări COOH nou

formate în urma procesului de modificare.

0

100

200

300

400

500

600

700

Colagen C-ADM7.2

C-ADM8.2

C-ADM10.6

C-AC5.6 C-AC8.4 C-AC9.2

Lu

cru

l m

ecan

ic d

e a

de

ziu

ne

(m

m*

mN

)

Figura V.12. Valorile medii ale lucrului mecanic necesar desprinderii materialelor

polimerice de colagen modificat de pe suprafaţa de analiză

CAPITOLUL VI. OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND

TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT

VI.2. Sinteza hidrogelurilor pe bază de 2-hidroxietil metacrilat şi colagen modificat cu anhidride (HEMA/CM)

Hidrogelurile au fost sintetizate prin utilizarea unui raport masic de 30 %

colagen modificat faţă de monomerul HEMA şi 2 % iniţiator APS (persulfat de

amoniu) faţă de TEMED (N, N, N’, N’ - tetrametiletilen diamina). De asemenea,

au fost utilizate 4 tipuri de colagen modificat cu anhidrida citraconică (AC) sau

anhidrida 2, 3 - dimetil maleică (ADM), obţinute şi caracterizate în capitolul

anterior: C-AC5.6, C-AC9.6, C-ADM7.2 şi C-ADM8.2. Hidrogelurile pe bază de

HEMA şi colagen modificat cu AC şi ADM au fost preparate prin reacţii de

polimerizare şi reticulare în prezenţa sistemului iniţiator redox APS/TEMED fără

implicarea agenţilor de reticulare chimici. Formarea hidrogelurilor a implicat mai

multe tipuri de reacţii chimice sau fizice între grupele funcţionale ale

componenţilor polimerici. Prin activarea macromoleculelor de colagen modificat

prin intermediul sistemului redox de iniţiatori, s-au produs reacţii de grefare ale

10

monomerilor de HEMA la catenele de colagen modificat (Figura VI.2.a).

Concomitent cu aceste reacţii au loc copolimerizarea şi reticularea

homopolimerului HEMA cu lanţurile funcţionalizate de colagen dezvoltându-se

astfel o reţea polimerică semi-interpenetrată (semi-IPN).

R1 =R2 =

(NH4)2S2O8 2SO4-

SO4-

+ H2O HSO4-+ OH

SO4-

NH

O

C C +

Colagen modificat

R1(R2)

C

CH3

COOH

(n+1) H2C C

CH3

C

HEMA

TEMED

APSOH +

O

O

OH

CH2 C

CH3

HC C

CH3

n

colagen modificat grefat cu pHEMA

C O

O

OH

C O

O

OH

NH C

O

C

OH

R1(R2)

C

COOH

CH3

H pentru AC

CH3 pentru ADM(a)

n = 1,2,.....

Figura VI.2. Reprezentarea schematică a reacţiilor posibile dintre macromolelculele de colagen modificat şi pHEMA induse de prezenţa sistemului inţiator redox APS/TEMED

Legăturile intermoleculare chimice şi fizice din reţeaua semi-

interpenetrată de hidrogel asigură integritate şi rezistenţă structurală crescută.

Materialele obţinute sunt insolubile în apă şi fluide biologice (Figura VI.3) şi au

caracter superabsorbant.

Figura VI.3. Aspectul hidrogelurilor menţinute

în apă bidistilată

VI.5. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor Hidrogelurile studiate au o capacitate mare de umflare. La începutul

procesului de umflare, gradul de retenţie a crescut brusc înregistrându-se un grad

maxim de umflare dependent de compoziţia hidrogelului după aproximativ 20 de

minute, urmat apoi de atingerea echilibrului de umflare (Figura VI.6).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1440 28800

50

100

150

200

250

300

37 oC / pH 7.4

Gra

du

l de u

mfla

re (

%)

Timp (minute)

C-AC5.6/HEMA

C-AC9.6/HEMA

C-ADM7.2/HEMA

C-ADM8.2/HEMA

Figura VI.6. Profilul de umflare al hidrogelurilor

pe bază de colagen modificat şi HEMA

11

Diametrul mare al porilor conduce la scăderea gradului de umflare al

hidrogelurilor. S-a observat o capacitate mare de umflare în cazul probelor C-AC

5.6/HEMA şi C-ADM 8.2/HEMA, care au înregistrat un grad maxim de umflare de

240 % şi respectiv 205 %. Valorile exponentului de difuzie nsw au înregistrat valori

mai mici de 0,5 ceea ce sugerează faptul că viteza de penetrare a solventului este

mai mică decât viteza de relaxare a catenelor polimerice. Aceast comportament,

care este o subclasă a difuziei Fickiane, corespunde unei difuzii denumite ’less

Fickian’ [361].

VI. 6. Rezultate analizei calorimetrice DSC VI.6.1. Analiza în stare uscată a materialelor de colagen modificate cu anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen

Calorimetria diferenţială de baleiaj DSC permite măsurători asupra

stabilităţii structurii de triplu helix a moleculelor de colagen prin monitorizarea

schimbărilor în timpul tranziţiilor de fază [362, 363]. Din curbele DSC obţinute în

primul ciclu de încălzire a probelor (Figura VI.7.a) se evidenţiază un proces

endoterm care este atribuit tranziţiei de ordinul întâi specifică denaturării colagenului aflat în stare uscată. Această tranziţie apare la 186

oC în cazul

colagenului nemodificat şi la temperaturi mai ridicate (189 – 195 oC) în cazul

probelor de colagen modificat datorită formării de legături de hidrogen

intermoleculare cu participarea grupelor carboxil din structura colagenului

modificat cu anhidride. Această modificare a temperaturii de denaturare spre valori

mai ridicate sugerează o creştere a stabilităţii termice în urma funcţionalizării cu

anhidride.

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200-0,60

-0,55

-0,50

-0,45

-0,40

-0,35

-0,30

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

Flu

x d

e c

ãld

urã

/ M

asã

(m

W/m

g)

Temperaturã (oC)

Colagen

C-AC 5.6

C-AC 9.6

C-ADM 7.2

C-ADM 8.2

Endo

Exo

(a)

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

-0,60

-0,55

-0,50

-0,45

-0,40

-0,35

-0,30

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

Flu

x d

e c

ãldu

rã /

Masã

(m

W/m

g)

Temperaturã (oC)

Colagen C-AC 5.6 C-AC 9.6 C-ADM 7.2 C-ADM 8.2

Endo

Exo

(b)

Figura VI.7. Curbele DSC înregistrate între 20 şi 220 oC pe probele de

colagen nemodificat şi modificat în stare uscată: primul ciclu de încălzire

(a), al doilea ciclu de încălzire (b)

În Figura VI. 7.b sunt prezentate curbele DSC înregistrate în timpul celui

de-al doilea ciclu de încălzire la care au fost supuse materialele de colagen

nemodificat şi modificate. Se observă că denaturarea endotermă dispare indicând

faptul că structura ordonată specifică colagenului se pierde în mod ireversibil.

Singurul fenomen observat pe curbele DSC înregistrate la cel de-al doilea ciclu de

încălzire este procesul de tranziţie sticloasă specific gelatinei care apare la

temperaturi mai scăzute faţă de procesul de denaturare al colagenului. În acest

studiu, temperatura de tranziţie sticloasă a gelatinei (Tg) a înregistrat valori

cuprinse între 165 şi 190 oC.

12

Au fost observate câteva diferenţe majore între proprietăţile materialelor

de colagen modificat şi hidrogeluri. Prin copolimerizarea colagenului modificat cu

HEMA, temperatura de denaturare suferă o descreştere semnificativă care poate fi

cauzată de formarea homopolimerilor de pHEMA (Figura VI.8.a) [369].

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200-0,40

-0,35

-0,30

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

-0,05

Flu

x d

e cã

ldurã

/ M

asã

(m

W/m

g)

Temperaturã (oC)

C-AC 5.6/HEMA C-AC 9.6/HEMA C-ADM 7.2/HEMA C-ADM 8.2/HEMAEndo

Exo

(a)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

-0,40

-0,35

-0,30

-0,25

-0,20

-0,15

-0,10

-0,05

Flu

x d

e cãld

urã

/ M

asã

(m

W/m

g)

Temperaturã (oC)

C-AC 5.6/HEMA C-AC 9.6/HEMA C-ADM 7.2/HEMA C-ADM 8.2/HEMAEndo

Exo

(b)

Figura VI.8. Curbele DSC înregistrate pentru

hidrogeluri aflate în stare uscată, pe un interval de temperatură cuprins între 0 oC şi 220 oC: primul (a) şi al doilea ciclu de

încălzire (b)

VI.6.2. Analiza în stare hidratată a materialelor de colagen modificate cu anhidride şi a hidrogelurilor ce conţin aceste tipuri de colagen

Parametrii de denaturare, care au valori foarte diferite faţă de cele obţinute

pe probe uscate, în cazul colagenului pur au fost: Tdh = 65 oC şi ∆Hdh = 58,2 J/g

(Figura VI.9), valori ce sunt apropiate cu cele raportate în literatură (64 oC) [370].

-40 -20 0 20 40 60 80 100

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

Flu

x d

e cã

ldurã

/ M

asã

(mW

/mg

)

Temperaturã (oC)

Colagen pur (primul ciclu de încãlzire)

Colagen pur (al doilea ciclu încãlzire)

Endo

Exo

Figura VI.9. Curba DSC a colagenului

nemodificat înregistrată între -50 oC şi 100 oC

Vârful larg ,endoterm care apare

la un interval de temperatură cuprins

între -20 oC şi 10

oC este atribuit apei

libere, care îngheaţă. Valorile

temperaturilor Tdh în cazul probelor în

stare hidratată sunt mai mici

comparativ cu cele ale aceloraşi

materiale dar care se află în stare

complet uscată. Acest fenomen este

pus pe seama efectului de plastifiere

al apei [371].

Creşterea valorilor în cazul temperaturilor de denaturare ale materialelor

de colagen modificate se explică prin reticularea parţială care se produce în timpul

procesului de modificare datorită prezenţei grupelor vinilice. Reticularea şi copolimerizarea colagenului modificat cu HEMA au condus la descreşterea

temperaturii de denaturare deoarece lanţurile reticulate formate sunt mai lungi şi

mai flexibile decât cele formate prin participarea grupelor vinilice. Prin urmare,

catenele din compoziţia hidrogelurilor aflate în stare umedă se pot reordona mult

mai uşor.

Valorile scăzute ale entalpiilor (∆Hdh) înregistrate pentru materialele de

colagen modificat cu AC (55,21 şi 52,17 J/g) şi cu ADM (50,07 şi 48,72 J/g)

sugerează o stabilitate mai scăzută comparativ cu colagenul pur în stare hidratată

13

(58,2 J/g), de asemenea hidrogelurile sunt mai puţin stabile (∆Hdh = 1,75–4,43 J/g)

la acest nivel de hidratare (60–65 %) comparativ cu celelalte forme hidratate ale

materialelor pe bază de colagen. Însă, la un nivel de hidratare maxim, atât

colagenul nemodificat cât şi probele de colagen modificate devin solubile în apă

sau soluţii acide, în timp ce hidrogelurile se menţin stabile (Figura VI.3). Prin

urmare, hidrogelurile investigate sunt forme stabile ce pot fi utilizate în scop

medical. La reîncălzire, denaturarea hidrogelurilor este ireversibilă datorită dispariţiei complete a vârfului corespunzător temperaturii de tranziţie.

S-a înregistrat un procent foarte ridicat de apă legată la primul ciclu de

încălzire în cazul materialelor de colagen modificat de aproximativ 50 % (adică

0,5–0,54 g/g) indicând prezenţa unei cantităţi mai mari de grupe polare ce dau

caracter puternic hidrofil al biopolimerilor modificaţi. O creştere şi mai însemnată a conţinutului de apă legată s-a observat la cel de-al doilea ciclu de încălzire (0,52–

0,66 g/g), ceea ce înseamnă că prin încălziri succesive apa liberă devine legată.

Valorile entalpiei de fuziune a gheţii din cel de-al doilea ciclu de încalzire sunt mai

mici decât cele din primul ciclu de încălzire pentru toate materialele investigate.

Comparativ cu matricea de colagen, reţelele semi-interpenetrate au prezentat o

descreştere a conţinutului de apă legată de la 0,5–0,64 la 0,32–0,36 g/g şi o creştere

a conţinutului de apă liberă probabil datorită angajării grupelor hidrofile în

formarea de noduri în reţeaua polimerică.

Toate caracteristicile termice ale procesului de topire a gheţii, şi anume

entalpia de topire ∆HW, şi temperaturile TonsetW şi TmaxW, pentru materialele de

colagen modificat sunt apropiate de cele ale colagenului pur. Însă, în cazul

hidrogelurilor s-a observat o creştere semnificativă a acestor parametri sugerând o

interacţiune puternică a apei cu moleculele polimerice din reţeaua de hidrogel.

Această observaţie este susţinută şi de valorile ridicate obţinute asupra

conţinuturilor de apă legată care se păstrează şi în urma celui de-al doilea ciclu de

încălzire comparativ cu cele ale probelor de colagen modificat care au scăzut în

urma ciclului secund de încălzire.

CAPITOLUL VII. OBŢINEREA DE HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN MODIFICAT ŞI 2-HIDROXIETIL METACRILAT VARIIND

CONŢINUTUL DE COLAGEN MODIFICAT ŞI AL AGENTULUI DE INIŢIERE

VII.2. Sisteme investigate Hidrogelurile de diferite compoziţii pe bază de 2-hidroxietil metacrilat

(HEMA) şi colagen modificat cu anhidridă (C-AC sau C-ADM) au rezultat în urma

reacţiilor de copolimerizare radicalică şi reticulare parţială ce s-au produs în

prezenţa sistemului de iniţiere redox format din persulfat de amoniu şi N,N,N’,N’–

tetrametiletilendiamină (APS/TEMED) (Figura VII.1).

14

Figura VII.1. Reprezentarea schematică a reţelei polimerice semi-interpenetrate pe bază de

colagen modificat şi HEMA

Pentru reacţia de copolimerizare a monomerilor de HEMA cu

macromoleculele de colagen modificat se are în vedere utilizarea unui conţinut

minim de CM (colagen modificat) care poate oferi sistemului proprietăţi

îmbunătăţite şi receptivitate la pH fără costuri ridicate. Rapoartele masice ale

acestor componenţi sunt prezentate în Tabelul VII.1.

Tabelul VII.1. Hidrogelurile copolimerice sintetizate.

Simbol HEMA (%) CM (C-AC sau C-ADM) (%) APS (%)

4C-CM/1.6APS 94,4 4 1,6

6C-CM/1.3APS 92,7 6 1,3

6.7C-CM/1.5APS 91,8 6,7 1,5

7C-CM/1APS 92 7 1

7C-CM/1.6APS 91,4 7 1,6

7C-CM/2APS 91 7 2

HEMA – 2 hidroxietil metacrilat, CM – colagen modificat, C-AC – colagen modificat cu AC, C-ADM – colagen modificat cu ADM, APS – persulfat de amoniu

VII.3. Analiza spectrală FT-IR În spectrele hidrogelurilor pe bază de colagen modificat (Figura VII.2) se

evidenţiază câteva modificări prin interferarea benzilor corespunzătoare

colagenului cu cele ale homopolimerului de pHEMA. Banda de absorbţie mult mai

largă şi mai intensă din regiunea 3655 – 3178 cm-1

este rezultatul suprapunerii

benzilor de absorbţie a grupărilor –OH ale pHEMA cu cele corespunzătoare

grupărilor –NH3+ ale colagenului de la amida A. De asemenea, vibraţia de alungire

a grupării esterice C=O (νC=O) (amida I) din colagenul modificat ce apare la 1656

cm-1

interferă cu banda de la 1650 cm-1

atribuită vibraţiei C=C din pHEMA

cauzând apariţia unui umăr la o lungime de undă de 1666 cm-1

în spectrele

hidrogelurilor.

15

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Tra

nsm

itan

tã (

u.a

.)

N um ãr de undã (cm-1

)

C -AC; pHEMA; C -AC/HEM A; C -ADM/HEMA

Figura VII.2. Spectrele FT-IR ale colagenului modificat (C-AC), homopolimerului de poli (2 -

hidroxietil metacrilat) (pHEMA) şi a hidrogelurilor pe bază HEMA şi colagen modificat cu anhidrida citraconică (C-AC/HEMA) şi anhidrida 2,3 – dimetil maleică (C-AMD/HEMA)

Valorile procentelor randamentului de reacţie au fost relativ crescute de

75- 89 % indicând faptul că hidrogelurile au prezentat o capacitate bună de

conservare a masei în urma reacţiei de sinteză, demonstrând în acelaşi timp şi

faptul că reacţiile de copolimerizare şi reticulare au avut loc cu succes. S-a

observat că o creştere a concentraţiei de iniţiator în reacţia de preparare a condus la

o creştere a eficienţei reacţiei de copolimerizare/reticulare.

VII.6. Analiza morfologică şi determinarea gradului de umflare în condiţii similare mediului fiziologic

Morfologia poroasă a hidrogelurilor observată în Figura VII.3 a fost

creată prin stabilizarea reţelei polimerice tridimensionale după procesul de

copolimerizare radicalică şi prin liofilizarea hidrogelurilor aflate în stare umflată.

Morfologia hidrogelurilor este caracterizată prin pori interconectaţi de dimensiuni

diferite care depind în principal de cantitatea de iniţiator utilizată la preparare.

(a) (b)

Figura VII.3. Imaginile SEM (400 µm) pentru hidrogelurile C-AC/HEMA (a) şi C-ADM/HEMA (b) realizate în secţiune şi la suprafaţă

S-au realizat studii asupra capacităţii de umflare a hidrogelurilor în soluţie

tampon de pH 7,4 la temperatura de 37 oC, care simulează condiţiile fiziologice.

Conform comportamentului la umflare (Figura VII.4) şi a imaginilor SEM (Figura

VII.3), sistemele polimerice obţinute pot fi clasificate ca hidrogeluri super-poroase

16

cu porozitate crescută şi pori interconectabili. Primul impact al hidrogelurilor cu

soluţia tampon a produs o umflare extrem de rapidă până la un minut datorită

capilarelor care au o putere de absorbţie mult mai mare decât simpla absorbţie prin

difuzie. Gradul de umflare (GU) al hidrogelurilor a atins un maxim după 2–3 ore,

apoi menţinându-se o stare de echilibru.

0 20 40 60 80 2800 2840 2880

0

50

100

150

200

250

37 oC / pH 7.4

Gra

dul d

e u

mflare

(%

)

Timp (minute)

4C-AC/1.6APS

6C-AC/1.3APS

6.7C-AC/1.5APS

7C-AC/1APS

7C-AC/1.6APS

7C-AC/2APS

(a)

0 20 40 60 80 2800 2840 2880

0

50

100

150

200

250

300

37 oC / pH 7.4

Gra

dul de

um

flare

(%

)

Timp (minute)

4C-ADM/1.6APS

7C-ADM/2APS

6.7C-ADM/1.5APS

7C-ADM/1.6APS

(b)

7C-ADM/1APS

6C-ADM/1.3APS

Figura VII.4. Profilele de umflare ale hidrogelurilor pe

bază de colagen modificat şi HEMA:

C-AC/HEMA (a) şi C-ADM/HEMA (b)

S-a observat o densitate mare asociată cu o flexibilitate şi elasticitate

scăzută în cazurile hidrogelurilor cu un conţinut mic de colagen modificat (4C-

AC/1.6APS cu GU = 104 % şi 4C-ADM/1.6APS cu GU = 136 %). Aceste aspecte

morfologice coincid cu o capacitate scăzută de expandare şi un grad de umflare

mic. Celelalte hidrogeluri copolimerice au arătat valori ale gradului de umflare mai

ridicate datorită prezenţei unei cantităţi mai mari de grupări funcţionale hidrofile

provenite de la componenta de colagen modificat [386].

Prezenţa unui conţinut crescut de iniţiator în matricea polimerică (de până

la 2 %) a indus descreşterea dimensiunilor porilor de la 11,8 µm până la 7,5 µm

cauzând ulterior descreşterea caracterului absorbant al hidrogelurilor de la 189 %

la 119 % datorită intensificării interacţiunilor interpolimerice care au ca efect

densificarea reţelei polimerice şi blocarea penetrării solventului în interiorul

matricei.

Valorile exponentului de umflare nsw sunt mai mici decât 0,5 şi indică un

mecanism de transport “less-Fickian”. Probele de hidrogel 4C-AC/1.6APS şi 7C-

AC/2APS au înregistrat cele mai mici valori ale exponentului nsw de 0,073 şi

respectiv 0,064, însemnând faptul că relaxarea lanţurilor polimerice este dominată

mai mult de o structură rigidă a matricei polimerice datorită prezenţei unui conţinut

mai scăzut de colagen modificat (4 % C-AC) sau mai crescut de iniţiator (2 %

APS). Valorile constantei de viteză ksw corespunzătoare probelor 4C-AC/1.6APS şi

4C-ADM/1.6APS au fost cele mai mici sugerând cele mai mici viteze de umflare,

fenomen observat de asemenea şi în Figura VII.4. Faptul că hidrogelurile au

manifestat un proces de umflare rapid cu un grad de umflare crescut, confirmă

posibilitatea acestora de a fi utilizate ca biomateriale flexibile şi cu grad crescut de

hidratare în aplicaţiile ingineriei tisulare.

17

VII.7. Dependenţa de pH a comportamentului la umflare al hidrogelurilor Proteina de colagen modificată cu anhidridă citraconică (C-AC),

cunoscută ca fiind o macromoleculă zwitterionică, a fost selectată pentru obţinerea

de hidrogeluri pe bază de HEMA sensibile la pH. Pentru a investiga dependenţa de

pH a comportamentului la umflare, hidrogelurile 4C-AC/1.6APS şi 6.7C-

AC/1.5APS, de compoziţii diferite, au fost imersate în soluţii tampon cu pH diferit

ce a variat între 3,0 şi 12,0.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

100

120

140

160

180

200

GU

(%

)

pH

4C-AC/1.6APS

6.7C-AC/1.5APS

Figura VII.6. Reprezentarea valorilor

gradului de umflare la echilibru (GU) în funcţie de pH mediului de umflare

Din Figura VII.6 se observă o

dependenţă a gradelor maxime de umflare

în funcţie de pH, curba rezultată având

forma literei ”U”. Prin urmare,

hidrogelurile au avut o capacitate mai mare

de umflare în condiţii de pH mai mici decât

4,7 şi mai mari decât 10,0, iar odată cu

apropierea pH-ului spre valori neutre

capacitatea de absorbţie a solventului a

scăzut.

Creşterea gradului de umflare al hidrogelurilor la pH<4,7 este cauzată de

ionizarea tuturor grupelor amino, iar la pH>10,0 creşterea GU este datorată

ionizării tuturor grupelor carboxil care au ca efect creşterea repulsiei electrostatice

dintre grupele carboxilat încărcate negativ [390]. Mai mult, la valori de pH=3,0

gradul de umflare a fost mult mai crescut decât în condiţii de pH = 12,0 probabil

datorită prezenţei unui conţinut mai scăzut de grupe carboxil libere în urma sintezei

hidrogelurilor, acestea reacţionând cu monomerii de HEMA în timpul reacţiei de

copolimerizare şi reticulare. Cel mai mic grad de umflare a fost înregistrat la

imersarea probelor în soluţii tampon de pH=7,2, pH ce este apropiat de valoarea

punctului izoelectric al colagenului modificat (P.I.=7,3) unde apare un echilibru

între absorbţia şi eliberarea de protoni.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130,04

0,08

0,12

Exp

on

en

tul

de

um

flare

n

pH

4C-AC/1.6APS

6.7C-AC/1.5APS

(a)

Figura VII.7. Variaţia valorilor nsw în funcţie de pH

Din datele cinetice de umflare

s-a remarcat, de asemenea, că la

valori extreme de pH, şi anume la pH

3,0 şi respectiv 10,0, exponentul de

umflare nsw a înregistrat cele mai

mari valori ce corespund unui proces

de umflare controlat mai mult de

difuzie (Figura VII.7.a).

VII.8. Degradarea enzimatică in vitro a hidrogelurilor Degradarea hidrogelurilor pe bază de colagen modificat cu anhidride au

fost expuse la colagenaza provenită din Clostridium histolyticum. Degradarea

18

hidrogelurilor a fost evidenţiată prin analiza spectrelor FT-IR în care s-a observat

dispariţia benzii de absorbţie corespunzătoare amidă II din structura colagenului

modificat.

În Figura VII.9 sunt ilustrate imaginile SEM ale hidrogelurilor C-

AC/HEMA nedegradate şi degradate.

4C-AC/1.6APS 7C-AC/1APS 7C-AC/1.6APS 7C-AC/2APS

Hidrogeluri nedegradate

Hidrogeluri degradate

Figura VII.9. Imaginile SEM realizate în secţiune ale unor hidrogeluri liofilizate de C-AC/HEMA aflate în stare nedegradată (sus) şi degradată (jos); scala imaginilor este de 100 µm

Dezintegrarea enzimatică a generat formarea de pori cu dimensiuni mici

în interiorul matricei de colagen ce înconjoară porii foarte mari.

În urma procesului de degradare porii au devenit mult mai mari

nemaifiind interconectaţi ci bine definiţi datorită distrugerii componentei proteice

de către enzimă. Dacă în cazul hidrogelurilor nedegradate media dimensiunii

porilor a fost de 7,5–11,8 µm, după degradarea enzimatică aceasta a crescut la

10,2–23,4 µm.

Hidrogelurile nu s-au degradat în totalitate ci doar componenta de colagen

din matrice a fost “digerată” de colagenază. În consecinţă, deşi viteza de degradare

este considerată a fi destul de rapidă (câteva zile), semi-biodegradabilitatea lor

dobândită prin prezenţa lanţurilor de pHEMA (care sunt rezistente la degradarea

enzimatică) le dă posibilitatea de a fi utilizate în aria biomedicală ca pansamente

parţiale pentru tratarea rănilor superficiale sau moderate.

19

VII.9. Studiul de eliberare a ciprofloxacinei în condiţii care simulează mediul fiziologic

În vederea evaluării funcţiei de suport/transportor pentru înglobare şi

eliberare de principii active a hidrogelurilor pe bază de HEMA şi colagen

modificat cu AC sau ADM, s-a utilizat monohidratul ciprofloxacinei hidroclorurate

(CF), un antibiotic foarte cunoscut în tratarea infecţiilor.

Spectrele FT-IR şi imaginile SEM (Figura VII.13) au confirmat prezenţa

medicamentului în matricea polimerică a hidrogelurilor.

(a) (b)

Figura VII.13. Imaginile SEM ale hidrogelurilor 4C-

AC/1.6APS (a) şi 4C-ADM/1.6APS (b) încărcate cu CF

În imaginile SEM ale hidrogelurilor încărcate cu medicament se pot

observa diferite forme de microcristale ale pudrei de ciprofloxacină ce se regăsesc

fie sub formă de aglomerări, fie individuale. Se observă prezenţa cristalelor

înglobate în interiorul matricei polimerice dar şi în spaţiile porilor.

Modul de eliberare a CF din matricile polimerice este reprezentat în

Figura VII.14 şi a fost studiat la o temperatură constantă de 37 oC în soluţie tampon

fosfat pH 7,4 similar cu valoarea de pH a sângelui sau a unei răni infectate.

În prim stadiu, viteza de eliberare a CF a fost rapidă (câteva minute) fiind

asociată cu efectul ”burst” care este cauzat de capacitatea de umflare rapidă a

hidrogelurilor sau de difuzia mai rapidă a medicamentului situat pe sau în

apropierea suprafeţei polimerice [400]. Ulterior, s-a remarcat un proces de

eliberare gradual ce s-a extins pe o perioadă de câteva ore (până la 50 de ore)

datorită unei difuzii lente a antibioticului din matricea polimerică spre mediul

exterior.

0 1000 2000 3000 4000 5000 60000

2

4

6

8

10

12

14

16 37 oC / pH 7.4

Gra

dul d

e d

eg

rad

are

(%

)

Timp (minute)

7C-AC/1 APS

7C-AC/1.6 APS

7C-AC/2 APS

(a)

Figura VII.11. Efectul colagenazei asupra

degradării hidrogelurilor

Creşterea conţinutului

agentului de iniţiere (APS) a

permis crearea unei reţele cu o

densitate crescută care la rândul

ei a cauzat o scădere a capacităţii

de umflare şi a restricţionat

degradarea enzimatică a

hidrogelurilor (Figura VII.11).

20

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 30000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

37 oC / pH 7.4

Gra

du

l d

e e

lib

era

re (

%)

Timp (minute)

4C-AC/1.6APS-CF

7C-AC/1APS-CF

7C-AC/1.6APS-CF

7C-AC/2APS-CF

(a)

Figura VII.14. Profilele de eliberare ale ciprofloxacinei

din hidrogelurile C-AC/HEMA-CF în condiţii

care simulează mediul fiziologic

Atât timpul necesar eliberării totale de CF (tmax) cât şi timpul necesar

scăderii la jumătate a concentraţiei de CF din cantitatea totală încorporată (t1/2) au

crescut odată cu creşterea conţinutului de CM şi APS datorită legăturilor de

hidrogen formate între medicament şi grupele polare ale componenţilor polimerici

din hidrogeluri. Viteza de eliberare a depins de difuzia medicamentului prin porii

hidrogelurilor. Astfel, o viteză de eliberare mai mare a fost evidenţiată în cazul

hidrogelurilor cu pori de dimensiuni mai mici şi cu o cantitate mai mică de colagen

modificat.

VII.10. Dependenţa de pH a eliberării ciprofloxacinei din hidrogeluri Dependenţa procesului de eliberare a CF în funcţie de pH-ul mediului de

eliberare a fost evaluată la următoarele valori de pH: 3,0; 4,3; 5,5; 7,4; 10,1 şi 12,0.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0

500

1000

1500

2000

2500

t max (

min

ute

)

pH

4C-AC/1.6APS-CF

7C-AC/1APS-CF

7C-AC/2APS-CF

Figura VII.16. Influenţa timpului necesar

eliberării totale de CF (tmax) în funcţie de pH-ul mediului de eliberare

Se poate constata o viteză mai lentă de

eliberare a ciprofloxacinei hidroclorurate

în cazul ambelor hidrogeluri investigate la

utilizarea unui mediu tampon de pH 7,4

sau 10,1 (Figura VII.16). În condiţii de pH

7,4 acest efect este cauzat atât de

capacitatea de umflare scăzută a

hidrogelurilor la pH neutru încetinind

astfel difuzia medicamentului din

matricea polimerică spre exterior, cât şi de

solubilitatea scăzută a CF la acest pH.

Timpul necesar atingerii platoului la o cantitate maximă eliberată (tmax) a

crescut semnificativ pâna la 1080–2220 minute când probele au fost imersate în

soluţii de pH 7–10. La efectuarea testelor de eliberare în medii de pH foarte acid

(pH = 3,0) sau foarte bazic (pH=12,0), starea de echilibru a fost atinsă într-un

interval foarte scurt de timp de doar 170–345 minute şi respectiv 255 – 390 minute.

VII.11. Determinarea toxicităţii acute in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA În urma evaluării in vivo din punct de vedere toxicologic, se poate aprecia

că DL50 (doza letală care produce moartea a 50 % din animale) pentru materialele

21

polimerice investigate este mai mare de 4000 mg/kg corp la 24 de ore, la 48 de ore,

72 de ore, 7 zile şi 14 zile de la administrarea intraperitoneală a suspensiei. Acestă

valoare a DL50 încadrează hidrogelurile în grupul celor cu grad redus de toxicitate.

VII.12. Rezultatele testelor de biocompatibilitate in vivo a hidrogelurilor CM/HEMA

Studiul de biocompatibilitate in vivo a evidenţiat apariţia unei reacţii

inflamatorii, prin creşterea uşoară a granulomului apărut la locul implantului de

hidrogeluri, însă valorile obţinute s-au încadrat în limite normale neexistând

diferenţe semnificative faţă de lotul control sănătos. Implantarea de pelete cu

hidrogeluri încărcate cu CF a cauzat o scădere a mediei modificărilor greutăţii animalelor şi a granulomului uscat comparativ cu lotul care a primit pelete cu

hidrogeluri neâncărcate cu CF indicând un efect intens de inhibare a procesului de

proliferare a celulelor macrofage.

Faţă de hidrogelurile fără medicament, materialele polimerice încărcate cu

CF au inhibat semnificativ reacţiile inflamatorii subcutanate, fapt argumentat de

scăderea capacităţii fagocitare a leucocitelor polimorfonucleare neutrofile din

sângele periferic şi a procentelor de limfocite serice.

De asemenea, buna biocompatibilitate a hidrogelurilor implantate sub

formă de pelete a fost atestată de lipsa variaţiei activităţii transaminazelor hepatice,

ceea ce nu denotă o influenţă negativă a fenomenului inflamator asupra funcţiei

hepatice. Parametrii imuni determinaţi pe loturile ce au primit pelete pe bază de

hidrogeluri sau hidrogeluri înglobate cu ciprofloxacină nu au prezentat schimbări faţă de lotul martor.

CAPITOLUL VIII. TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA PH A UNOR HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)

VIII.2. Sensibilitatea la pH a comportării la umflare a hidrogelurilor PVA/CHT

Influenţa pH-ului asupra gradului maxim de umflare a membranelor de

PVA respectiv PVA/CHT a fost evaluată prin imersarea în soluţii tampon de pH

1,2; 4,0; 5,5; 6,5; 7,4; 8,5 şi 9,5 la temperatura constantă de 37 oC.

Deoarece chitosanul folosit în acest studiu are o masă moleculară medie

mică difuzia moleculelor de solvent printre lanţurile polimerice are loc mult mai

rapid [430] astfel încât adaosul unei cantităţi mai însemnate de chitosan în etapa de

sinteză a hidrogelurilor va conduce la o creştere a capacităţii lor de umflare (Figura

VIII.2.a). De asemenea, prin scăderea conţinutului de chitosan, s-a observat o

descreştere a sensibilităţii la pH în ordinea următoare: PVA/CHT60/40 >

PVA/CHT80/20 > PVA/CHT90/10.

Pentru toate sistemele polimerice investigate, cel mai mare grad de

umflare a fost înregistrat la pH 1,2, iar odată cu creşterea pH-ului proprietăţile de

umflare ale acestora au scăzut şi cel mai mic grad de umflare înregistrându-se la

22

imersarea în soluţie tampon de pH 9,5. Aceste rezultate sunt datorate prezenţei de

grupări cu sensibilitate la pH cum sunt grupările amino libere (-NH2) de la

carbonul C-2 al chitosanului care în soluţii acide se ionizează (–NH2+H+↔–NH3

+).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

180

210

240

270

300

330

360

390

420

GU

(%

)

CHT (%)

pH 1.2 pH 6.5

pH 4.0 pH 7.4

pH 5.5 pH 8.5

(a)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

200

250

300

350

400

450

GU

(%

)pH

PVA

PVA/CHT 90/10

PVA/CHT 80/20

PVA/CHT 60/40

(b)

Figura VIII.2. Reprezentarea grafică a gradului de umflare la echilibru (GU) în funcţie de conţinutul de chitosan (a) şi de pH-ul mediului de imersare (b) la 37 oC pentru hidrogelurile de PVA şi PVA/CHT

Membrana de PVA nu prezinta o variaţie a gradului de umflare cu pH-ul -

Figura VIII.2b. Gradul de umflare al hidrogelurilor de PVA/CHT având conţinuturi

diferite de chitosan a scăzut odată cu creşterea pH-ului. O variaţie bruscă a

gradului de umflare a fost observată la pH = 6,68 pentru proba PVA/CHT 90/10,

pH = 6,65 pentru proba PVA/CHT 80/20 şi pH = 6,37 pentru proba PVA/CHT

60/40, evidenţiind sensibilitatea la pH a membranelor investigate.

Exponentul de umflare nsw a scăzut odată cu creşterea pH-ului şi a variat

în intervalul 0,099–0,33 indicând un mecanism de transport ”pseudo-Fickian” în

care relaxarea lanţurilor polimerice a fost neglijabilă în timpul sorbţiei. Acest

comportament al difuziei poate fi atribuit structurii dense a reţelei care limitează

capacitatea hidrogelului de a încorpora o cantitate mare de solvent [434].

1 2 3 4 5 6 7 8 9 100,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

k (

min

-n)

pH

PVA

PVA/CHT 90/10

PVA/CHT 80/20

PVA/CHT 60/40

Figura VIII.3. Reprezentarea grafică a variaţiei constantei de

viteză ksw în funcţie de pH-ul soluţiei de imersare

O creştere a valorilor constantei ksw odată cu

creşterea pH-ului spre alcalin însoţită de o variaţie

bruscă în jurul valorii de pH = 6,5 care este

asociată pKa–ului chitosanului a fost observată în

FiguraVIII.3 demonstrând-se caracterul de

receptivitate al hidrogelurilor la varierea

stimulului de pH. În cazul probei de PVA, fără

chitosan, acest parametru cinetic nu a manifestat

schimbări semnificative la modificarea valorilor

de pH sugerând lipsa de interacţiuni specifice între

reţeaua polimerică şi moleculele de solvent.

VIII.4. Studii de eliberare in vitro a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate (CF) din matricile hidrogelurilor pe bază de PVA şi PVA/CHT

Profilul cinetic de eliberare al ciprofloxacinei din matricile hidrogelurilor

de PVA şi PVA/CHT pe durata a 24 de ore este prezentat în Figura VIII.6.

Rezultatele experimentale au evidenţiat o eliberare controlată dependentă

de compoziţia hidrogelurilor polimerice şi de mediul în care acestea au fost

imersate. Iniţial, în primele 5 - 7 minute de eliberare are loc o difuzie mult mai

23

rapidă a antibioticului spre exteriorul matricei polimerice, care este asociată cu

efectul ”burst” şi care este datorată solubilităţii foarte crescute al antibioticului.

Efectul ”burst” este mult mai pronunţat în cazul hidrogelurilor cu un conţinut de

chitosan mai mare şi în condiţii de pH acid. Ulterior, are loc o încetinire a vitezei

de eliberare urmată de atingerea unui echilibru.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

37 oC / pH 4.5

Gra

du

l de

elib

era

re (

%)

Timp (minute)

PVA_CF

PVA/CHT 90/10_CF

PVA/CHT 80/20_CF

PVA/CHT 60/40_CF

(a)

0 200 400 600 800 1000 1200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

37 oC / pH 7.4G

radul de e

libera

re (

%)

Timp (minute)

PVA_CF

PVA/CHT 90/10_CF

PVA/CHT 80/20_CF

PVA/CHT 60/40_CF

(b)

Figura VIII.6. Evidenţierea dependenţei profilului de eliberare al medicamentului (CF) din hidrogeluri în funcţie de conţinutul de CHT la pH 4,5 (a) şi la pH 7,4 (b)

În ceea ce priveşte dependenţa de conţinutul de CHT (Figurile VIII.6.a şi

VIII.6.b), se observă o scădere a timpului necesar eliberării totale a

medicamentului în mediul de imersare (tmax) odată cu creşterea conţinutului de

chitosan datorită creşterii gradului de umflare care cauzează difuzia mult mai

rapidă a medicamentului din matricea polimerică în mediul tampon. Astfel,

matricea de PVA a înregistrat cel mai lent proces de eliberare al ciprofloxacinei iar

matricea PVA/CHT 60/40 a eliberat medicamentul în cel mai scurt timp.

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

72

76

80

84

88

92

96

100

Gra

dul de e

libera

re (

%)

pH

PVA_CF

PVA/CS 90/10_CF

PVA/CS 80/20_CF

PVA/CS 60/40_CF

Figura VIII.7. Variaţia cantităţii maxime de medicament eliberată la echilibru cu

pH-ul mediului de eliberare şi cu compoziţia de chitosan din hidrogeluri

Odată cu creşterea conţinutului de chitosan

s-a înregistrat o creştere a cantităţii maxime

eliberate, fenomen asociat cu creşterea

gradului de umflare la creşterea conţinutului

de chitosan. În comparaţie cu hidrogelurile

ce conţin chitosan, matricea de PVA a

înregistrat cel mai scăzut grad de eliberare.

De asemenea, se poate remarca o scădere

bruscă a cantităţii maxim eliberate în jurul

valorii de pH 6,56 care reprezintă punctul

critic al hidrogelurilor (Figura VIII.7).

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,00

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Tim

pu

l n

ec

es

ar

eli

be

rãri

i

tota

le d

e C

F (

min

)

pH-ul mediului de eliberare

PVA_CF

PVA/CHT 90/10_CF

PVA/CHT 80/20_CF

PVA/CHT 60/40_CF

Figura VIII.8. Reprezentarea grafică a

timpului necesar eliberării totale de CF din

hidrogelurile investigate în funcţie de pH

24

S-a înregistrat profilul de eliberare cel mai susţinut (până la 16 ore) în

cazul imersării sistemelor polimerice în soluţie tampon de pH 7,4 atât datorită

gradului de umflare al matricilor polimerice care este cel mai scăzut la acest pH cât

şi datorită solubilităţii scăzute a medicamentului în mediu bazic (Figura VIII.8).

Scăderea gradul de umflare în mediu bazic este cauzată de deprotonarea grupărilor

amino din chitosan. Contrar, la pH scăzut grupele aminice sunt protonate conferind

chitosanului un comportament policationic.

CAPITOLUL IX. HIDROGELURI HIBRIDE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL

ACRILAMIDĂ

IX.3. Analiza de calorimetrie diferenţială de baleiaj (DSC) a hidrogelurilor în stare hidratată

Starea apei şi procesul de denaturare al colagenului, hidrogelului pe bază

de colagen şi PNIPAAm (ND) şi hidrogelurilor hibride ce conţin nanoparticule au

fost studiate prin calorimetria DSC.

Curbele DSC realizate pe bureţii de colagen în stare hidratată au

înregistrat pentru primul ciclu de încălzire trei procese endoterme (Figura IX.1).

Procesul de topire a gheţii de la -8 oC cu generarea unei entalpii de ∆H = 39,5 J/g a

fost urmat de un proces de relaxare a fibrelor de colagen care apare la temperatura

de 18 oC cu o absorbţie de căldură de ∆H = 1,3 J/g şi de un proces de denaturare

care se produce la 74 oC cu entalpie de ∆H = 48 J/g. Pe curba DSC înregistrată în

urma celui de-al doilea ciclu termic apare un proces endoterm intens la temperatura

de -6 oC cu o entalpie de ∆H = 52,9 J/g. De asemenea, se observă dispariţia

procesului endoterm înregistrat la 74 oC în primul ciclu termic, subliniindu-se

caracterul ireversibil de denaturare al colagenului.

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

Flu

x d

e c

ald

ura

/ M

asa

(m

W/m

g)

Temperatura (oC)

Endo

Exo

Colagen (primul ciclu de încalzire)

Colagen (al doilea ciclu de încalzire)

ND (primul ciclu de încalzire)

ND (al doilea ciclu de încalzire)

Figura IX.1. Curbele calorimetrice pentru buretele de colagen şi hidrogelul ND (fără

nanoparticule) aflaţi în stare hidratată

Denaturarea lanţurilor din reţeaua

ND a avut loc la valori ale temperaturii de

53 oC cu un consum de energie de ∆H =

6,1 J/g. Un alt proces endoterm mai mic se

observă la temperatura de 49 oC. Topirea

apei îngheţate în cazul hidrogelului ND

apare la temperaturi mult mai ridicate (0,6 oC) comparativ cu cea a colagenului pur (-

8 oC). Această diferenţă de temperatură

este cauzată de formarea reţelei

polimerice şi de abilitatea acesteia de a

reţine moleculele de apă în interior prin

intermediul interacţiunilor cu grupele

funcţionale ale lanţurilor polimerice.

25

Procesele endoterme din primul ciclu termic şi din cel de-al doilea în

cazul hidrogelurilor hibride aflate în stare hidratată sunt atribuite procesului de

topire a apei libere şi parţial legate, caracteristice pentru materiale hidrofile

(Fiugura IX.2). Datorită interacţiunii diferite a apei cu componentele hidrogelului

hibrid valorile TonsetW şi TmaxW variază pentru fiecare probă în parte.

-40 -20 0 20 40 60 80

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

40 45 50 55 60 65 70

-0,70

-0,65

-0,60

-0,55

-0,50

-0,45

-0,40

-0,35

-0,30

Temperature (oC)

Heat Flo

w / M

ass

(m

W/m

g)

Temperatura (oC)

Flu

x d

e c

ald

ura

/ M

asa

(m

W/m

g)

C

ND

2 HPS

2 G

2 G 20 HA

2 G 80 HAEndo

Exo

(a)

-40 -20 0 20 40 60 80

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

40 45 50 55 60 65 70

-0,70

-0,65

-0,60

-0,55

-0,50

-0,45

-0,40

-0,35

-0,30

Temperature (oC)

Heat F

low

/ M

ass (

mW

/mg)

Temperatura (oC)

Flu

x d

e c

ald

ura

/ M

asa

(m

W/m

g)

C

ND

2 HPS

2 G

2 G 20 HA

2 G 80 HA

Endo

Exo

(b)

Figura IX.2. Curbele DSC înregistrate între -50 oC şi 100 oC la primul ciclu de

încălzire (a) şi al doilea ciclu de încălzire (b) pentru nanocompozitele de

hidrogeluri hibride aflate în stare hidratată

Se pot obţine informaţii despre starea apei din probe prin examinarea

aspectului procesului de topire care apare pe curbele DSC. Hidrogelurile hibride au

prezentat cantităţi considerabile de molecule de apă liberă comparativ cu proba de

colagen pur şi cu hidrogelul ND. Procentul de apă legată a scăzut în urma celui de-

al doilea proces termic, iar cel cel de apă liberă a crescut.

Curbele pentru probele G şi G / 20% HA au prezentat câte două procese

endoterme la topirea gheţii evidenţiind diferenţele care există între cele două tipuri

de apă. Cu cât capacitatea de umflare a fost mai mare cu atât cele două procese

endoterme au fost mai proeminente. Acest fenomen nu a fost întâlnit în cazul

probelor G/80%HA datorită capacităţii scăzute de umflare.

Se presupune că la începutul procesului de umflare, moleculele de apă mai

întâi distrug legăturile de hidrogen intermoleculare ale matricei polimerice care

sunt mai slabe şi apoi se leagă de capătul hidrofil rămas liber. Aceste molecule de

apă sunt izolate şi uniform distribuite în masa polimerică asigurând o mobilitate

limitată, astfel temperatura la care gheaţa se topeşte este mai mare în cazul

hidrogelurilor hibride comparativ cu materialul colagenic pur.

Temperatura situată între 34 şi 39 oC pe curbele DSC, corespunde

colapsării lanţurilor de PNIPAAm. În cel de-al doilea ciclu de încălzire această

tranziţie devine mai mică, însă rămâne apropiată de valoarea temperaturii din

primul ciclu. Acest fapt se explică prin existenţa unei structuri mai puţin ordonate a

catenelor de colagen după primul ciclu de încălzire. Prezenţa ei pe curbele

înregistrate la cel de-al doilea ciclu de încălzire poate fi explicată de reversibilitatea

colapsării lanţurilor de PNIPAAm la reîncălzire [482]. O altă explicaţie pentru care

s-au obţinut valori ale acestei temperaturi de tranziţie mai mici în cel de-al doilea

ciclu de încălzire este schimbarea interacţiunilor colagen/PNIPAAm cu cele de

gelatină/PNIPAAm ca urmare a denaturării colagenului în timpul primului ciclu de

încălzire. De aici se poate deduce sensibilitatea la temperatură a PNIPAAm-ului.

26

Cel de-al doilea proces endoterm de pe curba DSC înregistrată la primul

ciclu termic corespunde denaturării colagenului. Temperatura de denaturare a

hidrogelurilor hibride variază între 58 şi 64 oC şi este ireversibilă, nefiind observată

la cea de-a doua încălzire.

Temperaturile de denaturare ale hidrogelurilor hibride aflate în condiţii de

umiditate de RH = 23 % au prezentat valori mai ridicate decât cea a colagenului

nativ. Aceste rezultate se află în concordanţă cu cele raportate de alţi autori. Tronci

şi colab. au demonstrat că materialele reticulate au o temperatură de denaturare

într-un intervalul de valori 68 - 88 oC mai mare decât temperatura de denaturare a

colagenului (Td ~ 67 oC) [483].

IX.4. Determinarea unghiului de contact Efectul nanoparticulelor anorganice este, de asemenea, evidenţiat prin

variaţia valorilor unghiului de contact care depind foarte mult de tipul de

nanoparticule folosite (Figura IX.3).

ND

1 HPS

2 HPS

3 HPS

1 G

2 G

3 G C

0

20

40

60

80

100

Un

gh

iul d

e c

on

tact,

gra

de a)

ND

1G 20H

A

1G 8

0HA

2G 2

0HA

2G 80H

A

3G 20 HA

3G 8

0HA

0

20

40

60

80

100

Un

gh

iul d

e c

on

tact,

gra

de b)

Figura IX.3. Unghiul de contact dintre picătura

de apă şi suprafaţa hidrogelurilor ce conţin nanoparticule de argilă (a) şi a celor care conţin nanoparticule de argilă

şi HA (b)

Prin urmare, în cazul hidrogelurilor ce conţin Dellite® HPS şi Cloisite

®

93A, valoarea unghiului de contact a scăzut comparativ cu valoarea obţinută în

cazul hidrogelului fără nanoparticule (ND), în timp ce prin încorporarea cu

nanoparticule Dellite® 67G hidrogelurile au înregistrat valori ale unghiului de

contact mai mari. Această variaţie depinde de hidrofilia nanoparticulelor de argilă.

În cazul setului de hidrogeluri pe bază de HA (hidroxiapatită), s-a observat că prin

creşterea cantităţii de nanoparticule de hidroxiapatită încorporate, unghiul de

contact scade.

CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE

CAPITOLUL V: MATERIALE DE COLAGEN MODIFICAT CU DIFERITE GRADE DE SUBSTITUŢIE

� Colagenul solubil investigat în această teză a fost modificat utilizând ca

agenţi de funcţionalizare 2 anhidride şi anume, anhidrida citraconică (AC) şi

anhidrida 2,3 –dimetil maleică (ADM). Reacţia de modifcare chimică a

presuspus implicarea grupelor funcţionale amino ale proteinei. S-au sintetizat

6 probe de colagen modificat, trei funcţionalizate cu AC şi trei cu ADM.

27

� În urma analizei structurale prin spectroscopie FT-IR şi 1H RMN, s-a

demonstrat că reacţia de modificare a avut loc prin remarcarea unor

modificări apărute în spectrele de colagen modificat.

� Gradul de substituţie al colagenului a fost determinat folosind metoda cu

acidul 2, 4, 6 – trinitrobenzen sulfonic (TNBS). Reacția a fost dependentă de

tipul şi cantitatea de anhidridă folosită şi de condiţiile de reacţie în special de

valoare pH-ului de reacţie. Folosirea anhidridei 2,3-dimetil maleică şi a unui

raport masic între colagen şi anhidridă de 1/3 a condus la obţinerea celui mai

mare grad de substituţie de 10,6 %.

� Modificarea colagenului a fost demonstrată şi prin metoda titrării

potenţiometrice şi a conţinutului total de carbon şi azot (TOC/TN). Curbele

de titrare au dovedit stabilitatea probelor de colagen modificat în timpul

creşterii şi scăderii pH-ului, fără apariţia precipitării dar şi sensibilitatea la pH

a acestora. Au fost calculate valorile pKa ale grupelor carboxil şi amino.

Media pKa pentru grupările carboxilice a crescut de la 4,3 la 5,1 dovedind

succesul modificării colagenului. Conţinutul total de carbon organic (TOC)

calculat pentru probele modificate a crescut fiind de 40,66 mmol/g faţă de

colagenul pur care a prezentat doar un conţinut de 33,21 mmol/g.

� În urma analizei DLS/SLS, masa moleculară medie (Mw) şi cel de-al doilea

coeficient virial (A2) au crescut după modificarea chimică, valori care au fost

mai mari în cazul probelor cu gradul de substituţie mai ridicat. După reacţiile

de modificare, PDI scade, probele de colagen substituite devenind mult mai

omogene în ceea ce priveşte dimensiunea moleculelor.

� S-a evaluat comportamentul reologic al soluţiilor de colagen modificat în

funcţie de concentraţie şi de temperatură prin studii de vâscozimetrie. După

modificare, vâscozitatea soluţiilor de colagen a crescut semnificativ datorită

schimbării formei şi dimensiunii moleculelor de colagen în urma modificării

prin legarea chimică a anhidridelor la catenele de colagen. La creşterea

temperaturii, soluţiile de colagen modificat au manifestat o descreştere bruscă

în intervalul 28 - 38 oC a vâscozităţii relative relevând transformarea

colagenului în gelatină prin dezintegrarea structurii de triplu helix.

Temperatura de denaturare a probelor de colagen modificat în soluţie acidă a

scăzut odată cu creșterea gradului de substituție.

� Stabilitatea termică mai ridicată a fost evidenţiată în cazul materialelor de

colagen modificat prin evaluarea comportamentului termic în stare uscată prin

termogravimetrie. Analiza produşilor volatili obţinuţi din probele de colagen

modificat a indicat o întârziere a evoluţiei diferiţilor produşi datorită

stabilităţii termice crescute.

� Adeziunea la suprafaţa unei membrane celulozice de dializă a fost

îmbunătăţită pentru probele de colagen funcţionalizate cu anhidride cu cât

gradul de substituţie a fost mai crescut datorită prezenţei unui număr mai

mare de grupări COOH în urma procesului de modificare.

28

CAPITOLUL VI: HIDROGELURI PE BAZĂ DE HEMA ŞI COLAGEN MODIFICAT VARIIND TIPUL DE COLAGEN MODIFICAT

� S-au obţinut hidrogeluri poroase pornind de la colagenul modificat cu

anhidride, prin grefarea, copolimerizarea, şi reticularea cu monomerul sintetic

HEMA, în prezenţa unui sistem de iniţiere redox APS/TEMED, fără

implicarea agenţilor de reticulare chimici. Pentru obţinerea hidrogelurilor în

acest capitol s-a menţinut constant raportul masic dintre biopolimer şi monomer sintetic dar şi conţinutul de iniţiator, variind doar tipul de colagen

modificat. S-au sintetizat astfel patru tipuri de hidrogeluri: C-AC 5.6/HEMA,

C-AC 9.6/HEMA, C-ADM 7.2/HEMA şi C-ADM 8.2/HEMA. Legăturile

intermoleculare chimice şi fizice din reţeaua semi-interpenetrată de hidrogel

au asigurat integritate şi rezistenţă structurală crescută. � Noile materiale obţinute sunt insolubile în apă şi au caracter superabsorbant.

� Spectrele FT-IR au evidenţiat interacţiunea chimică şi fizică între

componenţii naturali şi sintetici implicaţi în sinteza hidrogelurilor. În urma

analizei morfologice prin intermediul imaginilor SEM, s-a observat o reţea

poroasă cu pori interconectaţi de diferite dimensiuni cuprinse între 30 şi 300

µm comparativ cu proba de colagen pur care a prezentat o microstructură neomogenă lipsită de pori. Hidrogelurile pe bază de colagen modificat cu

ADM au prezentat pori de dimensiuni mai mari probabil datorită prezenţei

celor două grupări metil în molecula de ADM.

� Hidrogelurile au prezentat o capacitate mare de absorbţie a solventului de

până la 240 % ce a depins de tipul de colagen modificat. Un grad de umflare

mai însemnat a fost evidenţiat în cazul hidrogelurilor compuse din colagen

modificat cu un grad de substituţie mai mare.

� Integritatea colagenului a fost analizată prin măsurători DSC pentru materiale

în stare hidratată şi uscată. Prin modificarea chimică a colagenului cu

anhidride, temperatura de denaturare (Td) a crescut, efect ce este asociat cu

îmbunătăţirea stabilităţii termice cauzată de prezenţa grupelor carboxil ce a

condus la formarea de noi legături de hidrogen intermoleculare. Absenţa apei

în reţeaua materialelor de colagen a condus la creşterea temperaturii de

denaturare a acestora comparativ cu cele aflate în stare hidratată, apa având

rol de plastifiere.

� Curbele DSC ale reţelelor aflate în stare hidratată au înregistrat un proces

endoterm intens care a fost asociat entalpiei de denaturare. Ireversibilitatea

denaturării probelor a fost dovedită prin dispariţia la reîncălzire a procesului

endoterm atribuit temperaturii de denaturare. S-a demonstrat că formarea de

reţele polimerice a condus la o descreştere a capacităţii de retenţiei a apei

legate şi la o creştere a conţinutului de apă liberă datorită implicării grupelor

hidrofile în formarea hidrogelurilor.

� În urma analizei conţinutului tipurilor de apă prezente în structura

materialelor de colagen hidratate s-a evidenţiat caracterul puternic hidrofil al

29

acestora sugerând posibilitatea lor de a fi utilizate ca biomateriale în diferite

aplicaţii biomedicale şi farmaceutice.

� S-a evaluat capacitatea de încărcare şi eliberare a bisoprololului fumarat din

matricea hidrogelurilor în condiţii care simulează pe cele fiziologice. Cinetica

de eliberare a fost controlată de difuzia soluţiei tampon în matricea poroasă şi

de conţinutul hidrogelurilor.

CAPITOLUL VII: HIDROGELURI PE BAZĂ DE HEMA ŞI COLAGEN MODIFICAT VARIIND RAPORTUL MASIC AL COMPONENŢILOR

� S-au sintetizat şase hidrogeluri pe bază de HEMA şi colagen modificat cu

anhidrida citraconică şi anhidrida 2,3-dimetil maleică, care au înregistrat cele

mai mari grade de substituţie, variind raportul masic între componenți astfel:

4C-CM/1.6APS, 6C-CM/1.3APS, 6.7C-CM/1.5APS, 7C-CM/1APS, 7C-

CM/1.6APS şi 7C-CM/2APS. Randamentul de reacţie a fost mare de până la

89 % indicând capacitatea mare de conservare a masei în urma reacţiei de

sinteză şi în acelaşi timp succesul reacţiei de polimerizare şi reticulare.

� Imaginile SEM ale hidrogelurilor au evidenţiat o structură super-poroasă cu

pori intercomunicabili care au ca avantaj capacitatea de retenţie mare şi rapidă a fluidelor. Dimensiunile porilor au depins în principal de cantitatea de

iniţiator utilizată la prepararea hidrogelurilor. O densitate mare asociată cu o

flexibilitate şi elasticitate scăzută a fost observată la folosirea unui conţinut

mai mic de colagen modificat şi un conţinut mai mare de iniţiator. Aceste

modificări observate în aspectele morfologice ale hidrogelurilor au avut o

influenţă asupra gradului de umflare. În urma studiului amănunţit al cineticii

de umflare în condiţii care simulează pe cele fiziologice s-a constatat că

hidrogelurile manifestă un mecanism de umflare special de difuzie Fickiană

denumit ”less-Fickian” în care viteza de umflare este dependentă de

conţinutul de iniţiator.

� Sensibilitatea la pH a hidrogelurilor a fost demonstrată prin evaluarea

comportamentului la umflare al acestora în medii cu diferite pH-uri.

Hidrogelurile au avut o capacitate mai mare de umflare în condiţii de pH mai

mic decât 4,7 şi mai mare decât 10,0, valori ce sunt caracteristice pKa-urilor

grupărilor carboxil şi amino din colagenul modificat, iar odată cu apropierea

pH-ului spre valoarea punctului izoelectric capacitatea de absorbţie a

solventului a scăzut. Mai mult, la valori de pH = 3,0 gradul de umflare a fost

mult mai crescut decât în condiţii de pH = 12,0 datorită prezenţei unui

conţinut mai scăzut de grupe carboxil libere în urma sintezei hidrogelurilor,

acestea reacţionând cu monomerii de HEMA în timpul reacţiei de

copolimerizare şi reticulare. Prin analiza cineticii de umflare a fost

reconfirmată sensibilitatea hidrogelurilor la variaţia pH-ului.

� Gradul de degradare al hidrogelurilor în prezenţa colagenazei a fost

semnificativ redus, iar procesul de digestie enzimatică a fost influenţat de

30

raportul masic biopolimer modificat/HEMA. Creşterea conţinutului de

iniţiator şi scăderea conţinutului de colagen modificat a permis restricţionarea

degradării enzimatice. Hidrogelurile şi-au păstrat integritatea structurală pe

tot parcursul procesului de degradare, însă aspectul morfologic şi structural a

suferit modificări aşa cum s-a observat în urma testelor FT-IR şi SEM

datorită degradării părţii proteice.

� Din punct de vedere al potenţialelor aplicaţii în domeniul farmaceutic,

hidrogelurile au capacitatea de a încorpora şi elibera controlat şi susţinut un

principiu activ în condiţii fiziologice simulate. Eliberarea ciprofloxacinei

hidroclorurate monohidratate (CF) din hidrogeluri a fost descrisă de o viteză

rapidă în primele minute urmând apoi un proces de eliberare gradual ce s-a

extins până la 50 de ore. Viteza de eliberare a fost influenţată de compoziţia

hidrogelurilor, de comportamentul diferit la umflare al acestora dar şi de

solubilitatea antibioticului.

� Caracteristicile de sensibilitate la pH ale hidrogelurilor au fost demonstrate şi

prin studii de eliberare a ciprofloxacinei hidroclorurate monohidratate în

medii tampon fosfat de pH diferite. Hidrogelurile au manifestat un

comportament de eliberare ce s-a caracterizat printr-o variaţie a tipului de

mecanism de transport la variaţia pH-ului.

� Studiul de biocompatibilitate in vivo a arătat că hidrogelurile prin implantarea

intraperitoneală la şobolani au cauzat apariţia unei reacţii inflamatorii, prin

creşterea uşoară a granulomului apărut la locul implantului de hidrogeluri,

însă valorile obţinute s-au încadrat în limite normale neexistând diferenţe

semnificative faţă de lotul control sănătos. Implantarea de pelete cu

hidrogeluri încărcate cu CF a cauzat o scădere a mediei modificărilor greutăţii

animalelor şi a granulomului uscat comparativ cu lotul care a primit pelete cu

hidrogeluri neâncărcate cu CF indicând un efect intens de inhibare a

procesului de proliferare a celulelor macrofage.

� Faţă de hidrogelurile fără medicament, materialele polimerice încărcate cu CF

au inhibat semnificativ reacţiile inflamatorii subcutanate, fapt argumentat de

scăderea capacităţii fagocitare a polimorfonuclearelor neutrofile din sângele

periferic şi a procentelor de limfocite serice. În cazul hidrogelurilor,

parametrii sanguini nu au variat faţă de lotul martor.

� De asemenea, buna biocompatibilitate a hidrogelurilor implantate sub formă

de pelete a fost atestată de lipsa variaţiei activităţii transaminazelor hepatice,

ceea ce nu denotă o influenţă negativă a fenomenului inflamator asupra

funcţiei hepatice. Parametrii imuni determinaţi pe loturile ce au primit pelete

pe bază de hidrogeluri sau hidrogeluri înglobate cu CF nu au prezentat

schimbări faţă de lotul martor.

� Hidrogelurile descrise în acest studiu prezintă caracteristicile unui biomaterial

ce poate fi utilizat în diferitele aplicaţii medicale asigurând biocompatibilitate

31

şi biodegradabilitate, în special în obţinerea de pansamente pentru vindecarea

rănilor.

CAPITOLUL VIII: HIDROGELURI PE BAZĂ DE CHITOSAN ŞI POLI (ALCOOL VINILIC)

� S-au investigat hidrogeluri în care raportul masic dintre componenta naturală

(chitosan-CHT) şi cea sintetică (poli (alcool vinilic) -PVA) a variat

(PVA/CHT 90/10, PVA/CHT 80/20 şi PVA/CHT 60/40) şi un hidrogel ce a

conţinut doar polimer sintetic de poli (alcool vinilic). � Gradul de umflare al hidrogelurilor în condiţii fiziologice a scăzut odată cu

creşterea concentraţiei de chitosan. � Hidrogelurile au demonstrat sensibilitate la schimbări ale pH-ului prin

producerea unor modificări asupra comportamentului la umflare şi prin

variaţia valorilor parametrilor cinetici de umflare. Sensibilitatea la pH al

hidrogelurilor a scăzut odată cu scăderea conţinutului de chitosan în

următoarea ordine: PVA/CHT 60/40 > PVA/CHT 80/20 > PVA/CHT 90/10.

În urma analizei cineticii de umflare s-a evidenţiat un mecanism de difuzie

pseudo-Fickian fără implicarea proceselor de relaxare ale lanţurilor

polimerice din reţeaua de hidrogeluri.

� Atât încărcarea cât şi profilele de eliberare a principiului activ din hidrogeluri

au fost controlate de compoziţia polimerică (raportul masic). Capacitatea de

încărcare a hidrogelurilor a fost mai eficientă în cazul hidrogelurilor cu un

conţinut mai mare de chitosan. Procesul de eliberare al ciprofloxacinei

hidroclorurate monohidratate din hidrogeluri a fost dependent de pH atât

datorită proprietăţilor de umflare ale matricilor polimerice cât şi datorită

solubilităţii medicamentului, ambele suferind modificări la variaţia stimului

pH. Astfel, s-a observat o creştere a gradului de eliberare al medicamentului

odată cu creşterea conţinutului de chitosan din hidrogeluri şi cu scăderea pH-

ului.

� Cantitatea maximă de medicament eliberată şi parametrii cinetici de eliberare

au arătat o variaţie bruscă în jurul pH-ului critic al chitosanului şi al

medicamentului. Ca efect al sensibilităţii la pH al hidrogelurilor, s-a

înregistrat o modificare a tipului de mecamism de transport odata cu

modificarea pH-ului.

� Hidrogelurile de PVA/CHT sensibile la pH şi încărcate cu ciprofloxacina

hidroclorurata monohidratată pot fi utilizate ca potenţiale sisteme de eliberare

controlată a principiilor active în diversele patologii întâlnite în practica

medicală, în special în tratarea rănilor unde ciprofloxacina are acţiune

puternică asupra infecţiilor.

CAPITOLUL IX: HIDROGELURI PE BAZĂ DE COLAGEN ŞI POLI N-IZOPROPIL ACRILAMIDĂ

32

� Au fost studiate şi comparate 15 probe, dintre care una a fost buretele de

colagen pur, una a fost un hidrogel pe bază de colagen şi poli N-izopropil

acrilamidă (ND) şi restul au fost hidrogeluri, cu rapoarte masice diferite între

colagen şi N-izopropil acrilamidă, ce au conţinut o concentraţie de 1 %

nanoparticule de argilă (Dellite® HPS, Dellite

® G67, Cloisite

® 93A). În

sinteza hidrogelurilor hibride cu două tipuri de nanoparticule (Dellite® G67 şi

hidroxiapatită) s-a folosit un raport de 20 % sau 80 % de hidroxiapatită faţă de conţinutul de colagen.

� Hidrogelurile pe bază de colagen şi poli N-izopropil acrilamidă au fost studiate

în principal pentru sensibilitatea la variaţia temperaturii şi a comportării

termice în starea hidratată faţă de comportarea în stare uscată.

� Studiul şi înţelegerea comportamentului termic şi a temperaturii de denaturare

a colagenului în special în mediu fluid este foarte utilă având în considerare

folosirea intensă a terapiilor ce presupun procese termice ca de exemplu în

cardiologie, dermatologie, ginecologie, neurochirurgie, oncologie,

oftalmologie, ortopedie şi inginerie tisulară.

� Studiile de calorimetrie diferenţială au demonstrat că denaturarea colagenului

este un proces cinetic ireversibil care este guvernat de istoria termică a probei,

tipul de nanoparticule încorporate în reţeaua hidrogelurilor hibride, gradul de

hidratare şi de conţinutul agentului de reticulare.

� În cazul hidrogelurilor, ce au avut un grad de hidratare cunoscut, temperatura

maximă corespunzătoare denaturătii a scăzut la 53 oC comparativ cu matricea

de colagen pur care s-a denaturat la 74 oC. Tranziţia ce apare în intervalul de

temperatură 34 - 39 oC a fost observată la reîncălzire şi explică reversibilitatea

colapsării lanţurilor de PNIPAAm. Prin urmare, hidrogelurile hibride îşi

păstrează receptivitatea la temperatură chiar şi după cicluri termice repetate.

� În condiţii de umiditate cu RH de 23 % (mediu ambiant), hidrogelurile

hibride au prezentat valori ale temperaturii de denaturare mai ridicate decât în

stare hidratată. Hidrogelurile reticulate au înregistrat o temperatură de

denaturare într-un intervalul de valori 77 - 98 oC mai mare decât temperatura

de denaturare a colagenului (Td ~ 75 oC).

� Entalpia de topire a apei a crescut semnificativ în cazul hidrogelurilor hibride

comparativ cu materialul colagenic pur şi al probei de hidrogel fără

nanoparticule, subliniindu-se efectul nanoparticulelor anorganice asupra

procesului termic.

� Interacţiunea apei cu materialele hibride pe bază de colagen şi starea apei în

structura lor a depins de compoziţia hidrogelului şi de istoria termica al

probei. După primul ciclu de încălzire, raportul dintre apa liberă şi cea legată

a fost schimbat. Valorile cantităţilor de apă legată au prezentat o uşoară

descreştere în cel de-al doilea ciclu termic, în timp ce valorile cantităţilor de

apă liberă au crescut.

33

� Din măsurătorile unghiului de contact şi a gradului de umflare s-a observat o

corelare între balanţa hidrofob/hidrofil, starea apei din reţelele polimerice

investigate şi valorile temperaturilor de denaturare.

� Pentru hidrogelurile ce conţin Dellite® HPS şi Cloisite

® 93A, valoarea

unghiului de contact a scăzut comparativ cu valoarea obţinută în cazul

hidrogelului fără nanoparticule, iar această variaţie depinde de hidrofilia

nanoparticulelor de argilă. Nanoparticulele Dellite® 67G sunt puternic

hidrofobe iar Dellite® HPS şi Cloisite

® 93A sunt hidrofile şi au capacitatea de

a descreşte unghiul de contact. În cazul setului de hidrogeluri pe bază de

hidroxiapatită, s-a observat că prin creşterea cantităţii de nanoparticule de

hidroxiapatită încorporate, unghiul de contact a scăzut.

Bibliografie selectată: [361] J. Ostrowska-Czubenko, M. Gierszewska-Druzẏńska, Mechanism of water diffusion into noncrosslinked and ionically crosslinked chitosan membranes. Progress on Chemistry and Application of Chitin and its Derivatives; Polish Chitin Society: Lodz, Vol. 17, pp 59−66, 2012. [362] A. Sionkowska, A. Kaminska, Thermal helix-coil transition in UV irradiated collagen from rat tail tendon, Int. J. Biol. Macromol., 24 (4), 337−340, 1999. [363] P. Gill, T. T. Moghadam, B. Ranjbar, Differential Scanning Calorimetry Techniques: Applications in Biology and Nanoscience, J. Biomol. Technol., 21 (4), 167−193, 2010. [369] T. Nezu, N. Nishiyama, K. Nemoto, Y. Terada, The effect of hydrophilic adhesive monomers on the stability of type I collagen, Biomaterials, 26 (18), 3801−3808, 2005. [370] S. Vyazovkin, L. Vincent, N. Sbirrazzuoli, Thermal denaturation of collagen analyzed by isoconversional method. Macromol. Biosci., 7 (11), 1181−1186, 2007. [371] Y. L. Guan, L. Shao, K. D. Yaoz, A study on correlation between water state and swelling kinetics of chitosan-based hydrogels, J. Appl. Polym. Sci., 61 (13), 2325−2335, 1996. [386] M. Sahiner, D. Alpaslan, B. O. Bitlisli, Collagen-based hydrogel films as drug-delivery devices with antimicrobial properties, Polym. Bull., 71, 3017–3033, 2014. [390] H. Saito, T. Taguchi, H. Aoki, S. Murabayashi, Y. Mitamura, J. Tanaka, T. Tateishi, pH-responsive swelling behavior of collagen gels prepared by novel crosslinkers based on naturally derived di- or tricarboxylic acids, Acta Biomater., 3, 89–94, 2007. [400] S. A. Elkheshen, D. H. Mobarak, S. Salah, T. Essam, Formulation of ciprofloxacin hydrochloride loaded biodegradable nanoparticles: optimization of the formulation variables, J. Pharm. Res. Opinion 3, 11, 72 – 81, 2013. [430] H. Mahdavi, H. Mirzadeh, M. Jalal Zohuriaan-Mehr, F. Talebnezhad, Poly(vinyl alcohol)/chitosan/clay nano-composite films, J. Amer. Sci., 9 (8), 203-214, 2013. [434] F. Song, L.-M. Zhang, C. Yang, L. Yan, Genipin-crosslinked casein hydrogels for controlled drug delivery, Intern. J. Pharm., 373, 41–47, 2009. [482] J. Wu, B. Zhou, Z. Hu, Phase Behavior of Thermally Responsive Microgel Colloids, Phys. Rev. Lett., 90, 048304-1-4, 2003. [483] G. Tronci, A. Doyle, S. J. Russell, D.J. Wood, Structure–property–function rela-tionships in triple-helical collagen hydrogels, MRS Proc., 1498, 145–150, 2013.

34

ACTIVITATEA ŞTIINŢIFICĂ ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT

Articole publicate/în curs de publicare în reviste ştiinţifice internaţionale sau naţionale cotate ISI: 1. D. Pamfil, M. T. Nistor, L. Zemljic, L. Verestiuc, M. Cazacu, C. Vasile, Preparation and

characterization of methyl substituted maleic anhydride - modified collagens destined to

medical applications, Ind. Eng. Chem. Res., DOI: 10.1021/ie403563r, vol. 53 (10), pp 3865–

3879, 26 February 2014. FI = 2.587.

2. D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, New Hydrogels Based on Substituted Anhydride

Modified Collagen and 2-Hydroxyethyl Methacrylate. Synthesis and Characterization, Ind.

Eng. Chem. Res., DOI: 10.1021/ie5016848, vol. 53 (28), pp. 11239–11248, 30 June 2014.

FI = 2.587.

3. M. T. Nistor, D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, Study of the heat - induced denaturation

and water state of hybrid hydrogels based on collagen and poly (N – isopropylacrylamide) in

hydrated conditions, Thermochimica Acta, DOI:10.1016/j.tca.2014.05.020, vol. 589, pp.

114–122, 10 August 2014. FI = 2.184.

4. R. P. Dumitriu, D. Pamfil, M. T. Nistor, C. Vasile, Stimuli responsive matrices for

medical applications, 17 - 20 September 2014. Key Engineering Materials, vol. 638 (2015),

pp. 249-254, Trans Tech Publications, Switzerland,

doi:10.4028/www.scientific.net/KEM.638.249. FI = 0.19.

5. I. E. Raschip, A. D. Panainte, D. Pamfil, L. Profire, C. Vasile, In vitro testing of

xanthan/lignin hydrogels as carriers for controlled delivery of bisoprolol fumarate, Rev.

Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi, 119 (4), 1189 - 1194, Oct - Dec 2015. BDI= B+.

6. C. Vasile, R. N. Darie, C. N. Cheaburu-Yilmaz, G.-M. Pricope, M. Bračič, D. Pamfil, G.

E. Hitruc, D. Duraccio, Low density polyethylene - chitosan composites, Composites: Part

B, vol. 55, pp. 314–323, 2013. FI = 2.983.

7. D. Pamfil, E. Butnaru, C. Vasile, Poly (vinyl alcohol)/chitosan cryogels as ph responsive

ciprofloxacin carriers, Journal of Polymer Research (trimis spre publicare).

8. D. Pamfil, C. Vasile, L. Tarţău, L. Vereştiuc, Hydrogels based HEMA /citraconic

anhydride modified collagen as pH-responsive drug carriers (trimis spre publicare).

Carte publicată: 1. D. Pamfil, C. Vasile, Aplicaţiile medicale şi farmaceutice ale unor biomateriale şi biocompozite sensibile la stimuli externi, Tehnopress, ISBN 978-606-687-149-5, 2014, Iaşi, Romania.

Capitol de carte: 1. D. Pamfil, M. T. Nistor, C. Vasile, Chapter 13: Collagen-based materials for

pharmaceutical applications, in "Handbook of Polymers for Pharmaceutical Technologies",

editors: Vijay Kumar Thakur, Manju Kumari Thakur, Volume 3, Scrivener Publishing,

ISBN: 978-1-119-04142-9, DOI: 10.1002/9781119041450.ch13, 2015, pg. 439-482.

Comunicări în cadrul unor conferinţe naţionale şi internaţionale: 1. D. Pamfil, L. Verestiuc, A. G. Rusu, E. Pintilie, “Hydrogels based on collagen and poly

(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) with applications in restoration burns”, The XII-rd

Symposium of Biomedical Engineering, May 2010, Iaşi, Romania.

35

2. D. Pamfil, C. Vasile, L. Verestiuc, M. Nistor, “Anhydride-modified collagen”, 2ème

Colloque Franco-Roumain de Chimie Médicinale, CoFRROCM, 3 - 5 October 2012, Iaşi, Romania.

3. R. N. Darie, A. Sdrobis, G. Pricope, A: Baklavaridis, C. Panayiotou, I. Zuburtikudis, L.

Fras, D. Pamfil, C. Vasile, “Polyethylene / chitosan-Na+-MMT nanocomposites”, 10th

International Conference on Nanoscience & Nanotechnologies (NN13), 9 - 12 July

2013,Thessaloniki, Greece.

4. D. Pamfil, C. Vasile, Ch. Schick, “Caracterizarea termica a retelelor semi-interpenetrante

pe baza de colagen si 2-hidroxietil metacrilat”, A XXIV-a Sesiune de Comunicari Stiintifice

A Institutului de Chimie Macromoleculara “Petru Poni”, Z.A.I., 3 - 5 October 2013, Iasi,

Romania.

5. D. Pamfil, C. Schick, C. Vasile, “Thermal characterization of hydrogels based on

anhydride modified collagen and 2 - hydroxyethyl methacrylate”, International Conference

“Eco-sustainable Food Packaging Based on Polymer Nanomaterials”, 26 - 28 February

2014, Rome, Italy.

6. D. Pamfil, E. Părpăriţă, C. N. Yilmaz, O. Yilmaz, C. Vasile, “In vitro testing of polyvinyl

alcohol/chitosan hydrogels as systems for controlled delivery of bisoprolol fumarate”,

Faculty of Chemistry Conference, “Alexandru Ioan Cuza” University Days & 3ème

Colloque Franco-Roumain de Chimie Médicinale, 31 October - 1 November 2014, Iaşi, Romania.

7. I. E. Răschip, D. Pamfil, C. Vasile, “The in vitro testing of xantan/lignin hydrogels as

carriers for controlled delivery of bisoprolol fumarate”, Faculty of Chemistry Conference,

“Alexandru Ioan Cuza” University Days & 3ème Colloque Franco-Roumain de Chimie

Médicinale, 31 October - 1 November 2014, Iaşi, Romania.

8. D. Pamfil, L. Vereştiuc, C. Vasile, ”Biomaterials based on substituted anhydride

modified Collagen / HEMA hydrogels”, Apollonia University Days & The XXV-rd

International Congress “Preparing the Future by Promoting Excellence”, 26 February – 1

March 2015, Iaşi, Romania.

9. E. Părpăriţă, D. Pamfil, C. Vasile, ”Poly (vinyl alcohol) / chitosan hydrogels as carriers

for drug”, Apollonia University Days & The XXV-rd International Congress “Preparing the

Future by Promoting Excellence”, 26 February – 1 March 2015, Iaşi, Romania.

Postere prezentate în cadrul unor conferinţe naţionale şi internaţionale: 10. C. Vasile, M. T. Nistor, D. Pamfil, C. Schick, “Study of thermal properties and heat-

induced denaturation of hybrid hydrogels based collagen”, International Conference “Eco-

sustainable Food Packaging Based on Polymer Nanomaterials”, 26 - 28 February 2014,

Rome, Italy.

11. D. Pamfil, R. P. Dumitriu, M. T. Nistor, C. Vasile, “Stimuli responsive matrices for

medical applications”, 6th International Conference “Biomaterials, Tissue Engineering &

Medical Devices”, 17 - 20 September 2014, Constanţa, Romania.

12. A. D. Panainte, D. Pamfil, I. E. Răschip, E. Părpăriţă, C. Vasile “In vitro evaluation of

novel controlled release system of bisoprolol fumarate”, The XV-rd National Congress of

Pharmacy from Romania, 24 - 27 September 2014, Iaşi, Romania.

13. A. D. Panainte, G. Ţânţaru, N. Bibire, M. Apostu, M. Vieriu, D. Pamfil, V. Dorneanu,

“Development and validation of a PP-HPLC method with UV Detection for the estimation

36

of bisoprolol fumarate in tablets”, The XV-rd National Congress of Pharmacy from

Romania, 24 - 27 September 2014, Iaşi, Romania.

14. D. Pamfil, C. Vasile, “New biomaterials responsive to external stimuli containing

proteins“, The 7th Edition of EUROINVENT European Exhibition of Creativity and

Innovation, 14 - 16 May 2015, Iaşi, Romania.

15. D. Pamfil, L. Tarţău, L. Vereştiuc, L. Niţă, A. Chiriac, C. Vasile, ”Biocompatibility,

biodegradability and drug carrier ability of some substituted-anhydride modified collagen

based hydrogels”, Seventh Cristofor I. Simionescu Symposium, Frontiers in

Macromolecular and Supramolecular Science, 4-6 June 2015, Iaşi, Romania.

16. E. Stoleru, D. Pamfil, A. Irimia, M. Brebu, C. Vasile, ”Evaluarea Compozitiei si

Activitătii Antioxidante a Unor Uleiuri Vegetale”, Zilele Academice Ieşene, A XXV-a

Sesiune de Comunicări ştiinţifice “Progrese în Ştiinţa Compuşilor Organici şi Macromoleculari”, 25 - 26 Septembrie 2015, Iaşi, Romania.

Stagii în străinătate: 1. Participant la programul Erasmus – Socrates între 1 Ianuarie 2011 şi 30 Iunie 2011

(5 luni) la Universitatea din Portsmouth, United Kingdom.

2. Universitatea din Maribor, Slovenia; mobilitatea s-a efectuat în cadrul proiectului

„Functionalization of synthetic polymers for development of new antimicrobial

packaging”, Programul: Capacităţi; FPSNewPack nr: 525/2012, în perioada 19

Noiembrie 2012 – 1 Decembrie 2012.

3. Participant la programul Short Term Scientific Mission în cadrul proiectului

ştiinţific COST Action FA0904, în perioada 14 Ianuarie 2013 – 28 Februarie

2013, în Rostock, Germania.

4. Participare la cursurile intensive din cadrul proiectului Erasmus + TL-IRMP 2014-

1-PL01-KA203-003611 “Joint innovative training and teaching/learning program

in enhancing development and transfer knowledge of application of ionizing

radiation in materials processing” care a constat în 2 stagii în: Polonia, Varsovia,

perioada 5 - 19 Septembrie 2015 şi în Italia, Palermo, perioada 27 Septembrie – 4

Octombrie 2015.

Membru în echipe de cercetare pentru proiecte naţionale/internaţionale: 1. Denumire proiect Improving Food Safety through the Development and Implementation

of Active and Biodegradable Food Packaging Systems. Proiect international Romania-

Norvegia EEA Grants ACTIBIOSAFE 1SEE/30.06.2014/Cornelia Vasile, Durata: 2014-

2018.

2. Denumire proiect Bionanocompozite antimicrobiene pentru aplicatii medicale

(BIONANOMED). Program PN II – Partneriate; Contract nr. 164/2012 UEFISCDI., Durata:

2012-2015.