MINISTERUL EDUCA IEI, CERCET RII, TINERETULUI I SPORTULUI ... · Se eviden iaz anizocitoza, celule...

MINISTERUL EDUCA�IEI, CERCET�RII, TINERETULUI �I SPORTULUI

UNIVERSITATEA DE VEST „VASILE GOLDI�” ARAD FACULTATEA DE �TIIN�E CATEDRA DE BIOLOGIE

Annamaria (Pallag) Ritli

EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR

Rezumatul tezei de doctorat

Conduc�tor �tiin�ific Prof. univ. dr. Aurel Ardelean

- ARAD, 2010 –

2

CUPRINS INTRODUCERE............................................................................................................. 6 PARTEA I. ASPECTE GENERALE............................................................................

10

CAPITOLUL 1. RELA�IA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR CU PROCESELE FIZIOLOGICE �I BIOCHIMICE CELULARE NORMALE �I MALIGNE.......................................................................................................................

10 1.1. Generalit�i privind metabolismul energetic celular............................................ 10 1.1.1. Explicarea nevoilor de energie ale materiei vii................................................... 11 1.1.2. Transferul energiei în metabolism....................................................................... 12 1.2. Organizarea structural-func�ional� a mitocondriilor.......................................... 14 1.2.1. Fosforilarea oxidativ� în lan� respirator............................................................. 15 1.3. Schimburile efectuate între mitocondrie �i citosol................................................ 18 1.4. Efectul Warburg �i metabolismul energetic celular............................................ 22 1.5. Apoptoza �i metabolismul energetic celular.......................................................... 26 1.5.1. Mitocondriile �i apoptoza..................................................................................... 28 1.6. Rolul mitocondriilor în generarea speciilor reactive ale oxigenului................... 34 1.7. Hipoxia, angiogeneza �i rela�ia cu mecanismele metabolismului celular...............................................................................................................................

38

CAPITOLUL 2. CELULA MALIGN� �I CHIMIOTERAPIA ANTINEOPLAZIC�.....................................................................................................

42 2.1. Caracteristicile fenotipice ale celulei maligne....................................................... 42 2.2. Generalit��i despre chimioterapia antineoplazic�................................................ 45 2.2.1. Principiile generale ale chimioterapiei antineoplazice...................................... 46 2.2.2. Clasificarea medicamentelor antineoplazice...................................................... 48 2.3. Modalit��i de urm�rire a efectelor chimioterapiei............................................... 50 PARTEA A II-A. CERCET�RI PROPRII..................................................................

54

CAPITOLUL 3. OBIECTIVELE CERCET�RII.......................................................

56

CAPITOLUL 4. MATERIALE �I METODE UTILIZATE......................................

59

4.1. Organizarea cercet�rii............................................................................................. 59 4.1.1. Stabilirea loturilor de studiu pentru tumori solide……………........................ 59 4.1.1.1. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor mamare.............................. 59 4.1.1.2. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor colorectale.......................... 61 4.1.1.3. Descrierea administr�rii ciclurilor de tratament antiangiogenetic………... 63 4.1.2. Alegerea �i stabilirea loturilor de studiu pentru hemopatii maligne................ 65 4.1.2.1. Organizarea lotului de studiu LA..................................................................... 69 4.1.2.2. Organizarea lotului martor LA-M................................................................... 71 4.2. Metode �i tehnici utilizate în studiul efectelor terapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular în tumori solide �i hemopatii maligne...................

71

4.2.1. Metode histologie................................................................................................... 71 4.2.2. Tehnici histoenzimatice........................................................................................ 73

4.2.2.1. Metoda Wachstein i Meissel pentru determinarea activit�ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei).............................................................................

75

4.2.2.2. Metoda Hess-Scarpelli-Pearse pentru determinarea activit�ii lactatdehidrogenazei (LDH)..........................................................................................

75

4.2.2.3. Metoda Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman pentru determinarea activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)......................................................................

76

3

4.2.3. Tehnici imunohistochimice................................................................................... 77 4.2.4. Tehnici biochimice................................................................................................ 81 4.2.4.1. Determinarea malondialdehidei prin metoda colorimetric�......................... 81 4.2.4.2. Determinarea ceruloplasminei prin metoda colorimetric� (metoda Ravin)…………………………………………………………………………………...

84

4.2.5. Metode �i tehnici hematologice............................................................................ 86 4.2.5.1. Testul cu nirtobleu tetrazolium (NBT)............................................................. 86 4.2.5.2. Studiul apoptozei prin analize de citometrie în flux....................................... 87 4.2.6. Metode pentru evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antineoplazic �i a tratamentului antiangiogenetic...............................

90

4.2.6.1. Utilizarea m�sur�torilor antropometrice....................................................... 92 4.2.6.2. Utilizarea chestionarelor pentru evaluarea st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale ......................................................................................................................

93

CAPITOLUL 5. REZULTATE �I DISCU�II.............................................................

94

5.1. EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELLULAR ÎN TUMORI SOLIDE.............

94

5.1.1. Rezultatele analizelor histologice......................................................................... 96 5.1.2. Rezultatele analizelor histoenzimatice................................................................ 104 5.1.3. Studiul neoangiogenezei……………………....................................................... 122 5.1.4. Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic……………………….………………………………………..

134

5.1.5. Influen�a terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice......................................................

144

5.1.6. Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic...............................................................................................................

149

5.1.7. Evaluarea calit��ii vie�ii........................................................................................ 152 5.1.8. Discutarea rezultatelor ob�inute.......................................................................... 156 5.2 STUDIUL EFECTELOR POLICHIMIOTERAPIEI ANTINEOPLAZICE ÎN HEMOPATII MALIGNE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR.......................................................................................................................

159 5.2.1 Studiul activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute……………….............................................................

160

5.2.2. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux.............................. 165 5.2.3. Influen�a polichimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemiile acute.

173

5.2.4. Discutarea rezultatelor ob�inute……….............................................................. 179 CONCLUZII …………...................................................................................................

182

BIBLIOGRAFIE............................................................................................................. 186 Lista lucr�rilor �tiin�ifice publicate din teza de doctorat…………………................ 202 Anexe................................................................................................................................ 204

4

“Metabolismul celulelor maligne

reprezint� tendonul lui Achile pentru tumori.” ��

PARTEA I. ASPECTE GENERALE

Se cunoa�te de mult faptul c� celula tumoral� are un metabolism modificat. La începutul secolului XX. cercet�torul german O. Warburg a ini�iat cercet�ri privind

leg�tura dintre alterarea respira�iei mitocondriale �i apari�ia celulelor canceroase. El a propus un mecanism pentru a explica transform�rile care duc la procesul carcinogenezei, punând în eviden�� c� la baza carcinogenezei st� “stricarea ma�in�riei respiratorii” �i cre�terea sintezei de ATP pe cale glicolitic� (Warburg O., 1956; Carew J.S. �i colab., 2002).

Celulele maligne î�i satisfac necesit��ile energetice prin producerea unei cantit��i mari de ATP prin glicoliz� �i nu prin fosforilare oxidativ�, dar astfel aceste celule vor consuma cantit��i mult mai mari de glucoz�.

Aceasta reprezint� o deosebire dintre celulele maligne �i normale, care utilizeaz� fosforilarea oxidativ� pentru sinteza de ATP, proces cu eficien�� mult mai mare.

Organitele celulare implicate direct în desf��urarea metabolismului energetic celular sunt mitocondriile.

Etapele metabolismului energetic celular au leg�turi strânse cu generarea speciilor reactive ale oxigenului, cu ini�ierea procesului de apoptoz� celular�, precum �i cu fenomenele de hipoxie, perturbarea ciclului celular �i angiogenez�. Orice perturbare la nivelul acestor mecanisme vor avea ca rezultat modific�ri sesizabile la nivelul întregului organism.

În ultimii ani, au fost eviden�iate o multitudine de evenimente �i mecanisme biologice ce reflect� interac�iunea permanent� a celulelor maligne cu organismul gazd�, rezultatul fiind un proces selectiv continuu �i secven�ial.

Medicamentele antineoplazice sau citostaticele utilizate ac�ioneaz� prin inhibarea diviziunii sau prin distrugerea celulelor canceroase �i au o selectivitate foarte variat�.

Aten�ia cercet�torilor se îndreapt� azi c�tre posibilit��ile terapeutice oferite de medicamentele care ac�ioneaz� prin modificarea metabolismului energetic al celulelor tumorale.

PARTEA II. CERCET�RI PROPRII

Pornind de la aceste premize am considerat util� ini�ierea unui studiu pentru eviden�ierea mecanismelor metabolismului energetic care sunt modificate în urma tratamentului antineoplazic. Pornind de la nivel celular, molecular �i ajungând la nivelul organismului am studiat efectele terapiei antineoplazice asupra metabolismului �i în special asupra metabolismului energetic.

Din dorin�a de a ob�ine rezultate cât mai exacte �i complete, având în vedere în acela�i timp diversitatea neoplaziilor maligne, a manifest�rilor clinice �i patofiziologice extrem de complexe, cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Din acest punct de vedere partea practic� a lucr�rii se împarte în dou� subcapitole independente.

În cadrul tumorilor solide studiul s-a realizat cu scopul investig�rii evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antineoplazice cu bevacizumab. Au fost inclu�i în studiu pacien�i cu neoplazie mamar� �i colorectal� care au parcurs tratamentul primar antineoplazic cu r�spuns par�ial (RP) sau boal� sta�ionar� (BS). Nu au fost inclu�i pacien�i care au prezentat r�spuns complet (RC) sau boal� în evolu�ie

5

(BEv) dup� tratamentul primar. În lotul A sunt inclu�i pacien�ii cu tumori mamare, în lotul B pacien�ii cu tumori colorectale.

În lotul A.I. de studiu, format din 21 paciente (vârsta medie 56,50 ± 10,60 ani), au fost inclu�i paciente care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic. Acest lot reprezint� lotul martor din punct de vedere a cercet�rii r�spunsului la tratamentul antiangiogenetic. În lotul A.II. de studiu, format din 22 paciente (vârsta medie 53,75 ± 12,77 ani), au fost inclu�i paciente care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.

Lotul B.I. sau lotul martor cuprinde 24 pacien�i (vârsta medie 57,55± 9,80 ani) care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic, iar în lotul B.II sau lotul de studiu au fost inclu�i 22 pacien�i (vârsta medie 54,95 ±10,25 de ani) care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.

În cazul hematopatiilor maligne s-au urm�rit acelea�i efecte de modificare a metabolismului energetic în urma aplic�rii de tratamente citostatice polichimioterapeutice standard.

Lotul de studiu LA cuprinde 21 bolnavi cu leucemie acut�, din care 18 cu LAL (leucemie acut� limfoblastic�), 3 cu LAM (leucemie acut� mieloblastic�), copii cu vârsta cuprins� între 0-16 ani. Pentru oganizarea lotului martor M-LA, am selectat caz pereche, 20 persoane s�n�toase, care prezint� urm�toarele caractere comune cu lotul de studiu LA: vârst�, sex, mediul de provenien��.

Obiectivele stabilite de la început ne-au permis s� apreciem în mod punctual:

- efectul tratamentului antineoplazic la nivel celular în tumori solide prin evaluarea intensit��ii desf��ur�rii metabolismului energetic; - corela�ia dintre ac�iunea biologic� a tratamentului antiangiogenetic, neoangiogeneza �i poten�ialul apoptotic al celulelor tumorale; - evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului în timpul tratamentului citostatic �i antiangiogenetic; - evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional precum �i a st�rii de s�n�tate în timpul tratamentului antiangiogenetic; - impactul produs de tratamentul antineoplazic polichimioterapeutic în hemopatii maligne, asupra celulelor prin corelarea procentului de celule apoptotice, activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului; - corelarea datelor ob�inute �i punerea în eviden�� a importan�ei practice

Pentru realizarea obiectivelor propuse am efectuat o gam� complex� de analize bazate pe metode �i tehnici biochimice, hematologice, histologice, histoenzimatice �i imunohistochimice, dar �i m�sur�tori antropometrice �i chestionare pentru evaluarea calit��ii vie�ii pacien�ilor.

REZULTATE �I DISCU�II

EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR ÎN TUMORI SOLIDE

Analizele au început la nivel macroscopic a pieselor proaspete preluate de la sec�ia

de chirurgie imediat dup� extirpare (10-15 minute), continuate apoi de analize histologice, histoenzimologice �i imunohistochimice în laboratorul de Anatomie patologic�, a Spitalului Clinic Jude�ean de Urgen��, Oradea.

Fiecare caz din studiu reprezint� un pacient de la care s-a recoltat material biopsic, fie prin interven�ie minim�, fie prin interven�ie larg�. Colora�ia uzual� HE pune în eviden�� structura tisular� general� �i unele tr�s�turi celulare, fiind utilizate pentru toate tipurile de

6

preparate histologice. La pacine�ii din lotul AI, cu carcinom ductal invaziv cu recidive loco-regionale la colora�ia hematoxilin�-eozin� (HE), apar microscopic celule carcinomatoase dispuse sub form� de glande sau sub forma unor grupuri izolate. Se eviden�iaz� anizocitoza, celule gigante, o morfologie foarte variat� a nucleilor, cromatina granular� neomogen�, raportul nucleo-citoplasmatic evident modificat în favoarea nucleului, distrofie la nivelul citoplasmei, alterând cu zone în care citoplasma este eozinofil�.

Fig.II.11. Lotul AI Carcinom ductal invaziv. a -

mitoz� atipic�, b - vas de sânge intratumoral,

c - distrofie citoplasmatic� (HE X400)

Fig.II.12. Lotul AI Carcinom ductal invaziv.

cu s�geat� sunt marcate mitoze atipice (HE

X400)

La lotul de studiu AII, la colora�ia cu hematoxilin�-eozin�, apare invazie tumoral�,

boal� în plin� evolu�ie. Dup� �ase luni de tratament antiangiogenetic, în urma anlizelor f�cute în colora�ia hematoxilin�-eozin�, la obiectivul X40 �i detaliu, s-au putut identifica corpii apoptotici (Fig II.17, II.18.). În loturile BI �i BII au fost inclu�i pacien�i cu cancer metastatic colonorectal la care s-au ob�inut rezultate asem�n�toare.

Fig. II.17. Lotul AII (luna 6) Carcinom ductal

invaziv Eviden�ierea corpilor apoptotici,(HE X

400)

Fig. II.18. Eviden�ierea corpilor apoptotici,

a- cromatina nuclear� în form� de semilun�; b-

halou clar în jurul celulei (HE X 1200 ) Rezultatele analizelor histoenzimatice Colora�iile speciale, cum sunt cele histoenzimologice �i imunohistochimice permit

eviden�ierea unor mecanisme �i structuri moleculare. Analizele histoenzimatice au fost incluse astfel în protocolul experimental, cu ajutorul lor se poate preciza desf��urarea diferitelor procese metabolice în celule �i �esuturi (Mure�an E. �i col.,1976) permi�ând eviden�ierea unei activit��i enzimatice în chiar situsul celular în care se produce aceasta (Ross M.H. �i col., 2007). Pe de alt� parte, integritatea frac�iunilor subcelulare poate fi demonstrat� printr-o activitate specific� mare a enzimelor caracteristice acelei frac�iuni. Astfel, pentru mitocondrii �i activitatea enzimatic� mitocondrial� marker enzimatic specific este adenozintrifosfataza (ATP-aza) �i succinatdehidrogenaza (SDH), (Mixici �i col, 1997), iar pentru matricea citoplasmatic�, terenul glicolitic, lactat dehidrogenaza (LDH). (Rusu �i col. 2005, Cucuianu M.. �i col., 1998, Rusu M.A. �i col., 1980).

7

Deoarece tehnicile de colorare histoenzimatice utilizate nu permit vizualizarea structurilor tisulare, pentru analiza imaginilor microscopice �i cuantificarea rezultatelor s-au achizi�ionat câte trei imagini la m�rimea X200, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). la nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care evaluarea activit��ii enzimatice s-a realizat semicantitativ, astfel:

� = lipsa activit��ii enzimatice; �/+ = activitate enzimatic� sc�zut�; + = activitate enzimatic� intens�; ++ = activitate enzimatic� foarte intens� (Tudose N., Laz�r E, 1996; Olinici C.D.,

Vaida M.F., 1997; Fox S.B., Harris A.L, 2004; Bancroft J.D., Gamble M., 2007). Rezultatele ob�inute s-au centralizat, astfel am primit o imagine real� �i cuantificat�

asupra activit��ii enzimelor studiate.

Studiul activit��ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei) ATP-aza se vizualizeaz� printr-o colora�ie brun� prin metoda Waschstein �i Meissel.

Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6

++ 28,3

+/- 30,5

+ 41,2

++ 37,1

+/- 26,4

+ 36,5

++ 24,2

+/- 27,3

+ 48,5

++ 8,7

+/- 52 +

39,3

Fig.II.29. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azice la loturile AI �i AII

Atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII se observ� o sc�dere a activit��ii

ATP-azice în urma tratamentului antiangiogenetic.

Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6

++38,1

+/- 25,9

+ 36

++40,5

+/- 23

+ 36,5

++ 34

+/- 27,9

+ 38,1

++5

+/- 38,4

+ 56,4

Fig. II.34. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azei la loturile BI �i BII

Fig. II.35. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom

de colon. Activitate ATP-azic� (X100);

cu s�ge�i sunt marcate zonele cu activitate

enzimatic� intens�


de colon ascendent Activitate ATP-azic�

(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu

activitate enzimatic� intens�

8

Studiul activit��ii lactatdehidrogenazei (LDH)

Enzima lactat dehidrogenaza (LDH) localizat� în citoplasm� se eviden�iaz� histoenzimatic printr-o colora�ie albastru închis�.


+ 49,4

+/- 11,3

++40,3

+ 54,4

+/- 9,5

++36

+ 48,4

+/- 17,4++

34,2

++ 35,1

+/- 7,4

+ 57,5

Fig. II.39. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile AI �i AII

Fig. II.38. Lotul AII (luna 0) Activitatea LDH

(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu


Fig.II.40. Lotul AII (luna 6) Activitatea LDH

(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu


Se remarc� o cre�tere a activit��ii LDH la loturile de studiu AII �i BII fa�� de loturile martor AI �i BI (Fig. II.39, II.44).


+ 56

+/- 6,6

++37,4

+ 52,4

+/- 8,1

++39,5

+ 53,6

+/- 10,1

++36,3

++ 56,1

+/- 6,2

+ 47,7

Fig. II.44. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile BI �i BII

Studiul activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)

Succinatdehidrogenaza (SDH) a fost pus� în eviden�� cu ajutorul metodei Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman.

Locurile tisulare cu activitate enzimatic� apar colorate în albastru. Activitatea enzimei d� indica�ii despre func�ionarea ciclului Krebs.

9


+ 31

+/- 46,4

++22,6

++ 20,3

+/- 51,2

+ 28,5

+ 42,3

+/- 47,3

++10,4

+ 28,5

+/- 67,5

++4

Fig. II.48. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile AI �i AII

Fig. II.50. Lotul BII (luna 0) Activitatea SDH

(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu


Fig. II.51. Lotul BII (luna 6) Activitatea SDH

(X100)cu s�ge�i sunt marcate zonele cu



++ 19,5

+/- 49,7

+ 30,8

++ 21,6

+/- 48,4

+ 30

++ 23,5

+/- 50,4

+ 26,1

+ 32 +/-

61,2

++6,8

Fig. II.52. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile BI �i BII

Medicamentul antiangiogenetic analizat ac�ioneaz� asem�n�tor la nivelul enzimelor

metabolismului energetic indiferent de localizarea tumorii. Studiul neoangiogenezei Am considerat deosebit de important studiul neoangiogenezei având în vedere faptul c� medicamentul antineoplazic studiat este un anti-angiogenetic.

Evaluarea extinderii re�elei vasculare nou formate s-a exprimat cantitativ prin aprecierea la microscop a densit��ii microvasculare (microvessel density) - MVD pe baza num�r�rii vaselor neoformate.

Determinarea MVD, prin identificarea celulelor endoteliale, constituentele de baz� ale vaselor, s-a f�cut prin metoda anatomopatologic� de rutin� �i prin examen imunohistochimic. Identificarea imunohistochimic� a endoteliilor vasculare a utilizat anticorpul monoclonal anti-CD31. Am apelat la reac�ia imunohistochimic�, deoarece examenul histopatologic la colora�ia de rutin� nu a permis diferen�ierea între vasele sanguine normale �i cele intratumorale.

10

S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal CD31. CD31 s-a exprimat pe suprafa�a celulelor endoteliale.

Am utilizat metoda semicantitativ�, propus� de Korkolopoulou �i colaboratorii (2001), astfel:

- s-au prelucrat sec�iuni colorate pentru CD31; - prin examinare, cu obiectiv mic �i mare, s-au identificat ariile de capilare �i vase

mici cu densitate maxim�; - s-a ales câmpul microscopic x 200, cu densitatea cea mai mare; - imaginea a fost captat� cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl,

16,7 milioane culori, 24-bit); - când nu a fost evident� o arie de maxim� vasculariza�ie, s-au ales 3 câmpuri, �i s-au

stocat MVD; - s-a luat în considerare doar câmpul cu vasculariza�ie maxim�; - s-au exclus din interpretare ariile cu infiltrat abundent, necroze �i ulcera�ii; - celulele endoteliale, izolate sau în grupuri mici, au fost considerate vase individuale;

au fost excluse din num�r�toare vasele cu perete muscular; - s-au apreciat cantitativ tipurile de vase intratumorale: imature, intermediare �i

mature, calculându-se a�a numitul indice de pozitivare pentru fiecare caz în parte, �i s-a calculat media (câmp conven�ional de 0,5/0,5 cm);

- s-a f�cut cuantificarea MVD pe fiecare caz în parte. (Korkolopoulou �i colab., 2001).

Vasele intratumorale observate au avut o structur� heterogen�, adesea peretele fiind incomplet maturat. Vasele intratumorale au fost împ�r�ite pe baza dimensiunii perfuz�rii, respectiv a prolifer�rii celulelor endoteliale �i a prezen�ei pericitelor, în trei categorii:

- vase imature; - intermediare; - mature.

AI luna 0 AI luna 6 AII luna 0 AII luna 6

Vase imature

43%

Vase mature

31%

Vase interme

diare26%

Vase interme

diare36%

Vase imature

12%

Vase mature

52%

Vase imature44,7%

Vase mature31,3%

Vase interme

diare24%

Vase imature24,3%

Vase mature6,6%

Vase interme

diare69,1%

Fig. II.55. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare pentru lotul AI �i AII

7

2 3

9

4

13

16

7

11

22

19

26

13

4,3

7,8

12,9

9,3

18,6

0

5

10

15

20

25

30

IMATURE

luna 0

IMATURE

luna 6

INTERMED

luna 0

INTERMED

luna 6

MATURE

luna 0

MATURE

luna 6

Fig. II.61. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AI

11

6

02

45

0

20

5

109

18

2

14,5

1,8

7,8

5,2

10,1

0,50

5

10

15

20

25

IMATURE

luna 0

IMATURE

luna 6

INTERMED

luna 0

INTERMED

luna 6

MATURE

luna 0

MATURE

luna 6

Fig.II.62. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AII

BI luna 0 BI luna 6 BII luna 0 BII luna 6

Vase imature

46%

Vase interme

diare21% Vase

mature33%

Vase imature

15%

Vase interme

diare28%

Vase mature

57%

Vase imature41,3%

Vase interme

diare28,5

Vase mature30,2%

Vase imature

23%

Vase interme

diare68,6

Vase mature8,4%

Fig. II.63. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare la lotul BI �i BII

Fig. II.65. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom de

colon, a - imunoreac�ie pozitiv� pentru CD 31;

b – glande atipice transformate malign, celule

cu nuclei tahicromi pseudostratifica�i;(X 400)


de colon,Cu s�ge�i sunt marcate zonele cu

imunoreac�ie slab pozitiv� pentru CD 31;(X

400)

9

42

8

4

9

21

12 12

16

20

30

15,5

5,67

10,4 11

21,2

0

5

10

15

20

25

30

35

IMATURE

luna 0

IMATURE

luna 6

INTERMED

luna 0

INTERMED

luna 6

MATURE

luna 0

MATURE

luna 6

Fig. II.69. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BI

12

10

13

4 4

0

21

7

1311

15

3

14,4

2,3

10

7,1

10,5

0,90

5

10

15

20

25

IMATURE

luna 0

IMATURE

luna 6

INTERMED

luna 0

INTERMED

luna 6

MATURE

luna 0

MATURE

luna 6

Fig. II.70. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BII

În perioada studiat� apar modific�ri majore atât la nivelul num�rului de vase f�r� a

�ine cont de diferen�ierea pe tipuri de vase, dar �i la nivelul vaselor diferen�iate în cele trei tipuri, atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII. Aceste diferen�e demonstreaz� clar ac�iunea antiangiogenetic� a medicamentului bevacizumab, care const� în supresia marcat� a angiogenezei, reducerea num�rului de vase intratumorale, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine, inhibarea matur�rii vaselor existente.

Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic Pentru eviden�ierea �i evaluarea procesului apoptotic s-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, kitul Cytochrome c Ab-2 (Clone 7H8.2C12). Kitul utilizat marcheaz� citocromul c eliberat din spa�iul intermembranar mitocondrial în citosol, eveniment necesar pentru finalizarea apoptozei. Citocromul c citosolic activeaz� caspaza-3 �i moleculele enzime, cistein proteazelor din familia ICE, care sunt efectorii cheie al apoptozei.

S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, care s-a exprimat la nivel citoplasmatic celular.

Sec�iunile colorate pentru cit c au fost examinate cu obievtive diferite, s-au identificat ariile cu imunoreac�ie pozitiv�, s-au ales câte 3 câmpuri microscopice x 200 pentru fiecare caz în parte, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). La nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care num�rul de celule cu imunoreac�ie pozitiv� sau negativ� pentru anticorpul monoclonal utilizat, a fost evaluat semicantitativ astfel:

� = imunoreac�ie negativ�; �/+ = rare elemente cu imunoreac�ie pozitiv�; + = elemente cu imunoreac�ie pozitiv� prezente constant; ++ = numeroase elemente cu imunoreac�ie pozitiv�.

Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. . Luna 0 Lot A II. Luna 6

�

64,3

+/- 35,7

�

87,7

+/- 12,3

� 62,6

+/- 37,4

+ 43,2

+/- 25,1

++ 31,7

Fig. II.75. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul AI �i AII

13

Fig. II.79. Lotul AII luna 0. Imunoreac�ie slab

pozitiv� pentru citocromul c ,(X 800); cu

s�ge�i sunt marcate celulele în care citoplasma

prezint� imunoreac�ie pozitiv� pentru

citocromul c

Fig.II.81. Lotul AII luna 6 Imunoreac�ie

intens pozitiv� pentru citocromul c (X 1200);

cu s�ge�i sunt marcate celulele tumorale cu

nucleu balonizat, meganucleoli, citoplasm�

cu imunoreac�ie pozitiv� pentru citocromul c

Lot B I. . Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. . Luna 0 Lot B II. Luna 6

� 76,8

+/- 23,2

+/- 10,5

� 89,5

� 67,5

+/- 32,5

+

36,4

+/-

21,2++

42,4

Fig. II.82. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul BI �i BII

Rezultatele ob�inute arat� cre�terea imunoreactivit��ii pentru citocromul c în urma tratamentului antiangiogenetic. Influena terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice

Am studiat efectele terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra sintezei de specii reactive ale oxigenului prin m�surarea malondialdehidei serice (MDA), care este unul din produ�ii de peroxidare lipidic�, determinarea ei din sânge reprezintând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ. Pentru urm�rirea ac�iunii antioxidan�ilor plasmatici în timpul tratamentului antineoplazic am urm�rit nivelul ceruloplasminei serice.

Nivelul seric al malondialdehidei �i al ceruloplasminei s-a determinat la debutul studiului �i lunar în cele �ase luni de studiu.

La loturile de studiu (AII �i BII) are loc o cre�tere a nivelului seric de MDA fa�� de loturile martor, împreun� cu o cre�tere progresiv� a nivelului seric de CP.

Comparând valorile ob�inute pentru luna 0 �i luna 6 pentru nivelul seric al malondialdehidei �i a ceruloplasminei la lotul martor �i la lotul de studiu se constat� c� diferen�ele penrtu MDA nu sunt semnificative statistic (p > 0,05) dar cele ob�inute pentru CP sunt semnificative statistic (p < 0,05). Nivelele de semnifica�ie sunt asem�n�toare penrtu pacien�ii cu tumori mamare �i tumori colorectale,

Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic

Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional s-a f�cut în func�ie de determin�rile antropometrice periodice, lunare. Indicatorii antropometrici urm�ri�i au fost: greutatea, înâl�imea, rata metabolismului bazal (RMB) �i indicele de mas� corporal� (IMC).

14

La toate loturile luate în studiu a sc�zut rata metabolismului bazal dar �i a indicelui de mas� corporal� în decursul celor �ase luni, dar diminuarea parametrilor urm�ri�i au fost mai evidente în cadrul loturilor martor f�r� tratament antiangiogenetic.

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

p < 0.05

RM

B

LOT MARTOR BI 991,53 1000,13 1011,32 1017,32 995,92 968,87 915,33

LOT STUDIU BII 1004,4 999,62 997,52 1000,87 994,75 991,88 975,53

0 1 2 3 4 5 6

Fig.II.97. Evolu�ia ratei metabolismului bazal (RMB) la pacien�ii cu neoplazii colorectale

Evaluarea calit��ii vie�ii Dup� completarea lunar� a chestionarelor de evaluare a st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale, a avut loc prelucrarea datelor. Se constat� c� are loc sc�derea nivelului st�rii func�ionale �i a st�rii de nutri�ie în decursul celor �ase luni, dar la pacien�ii care au urm�rit tratamentul antiangiogenetic sc�derea a fost mult mai lent� comparativ cu lotul martor, iar dup� �ase luni atât starea de nutri�ie cât �i starea func�ional� a fost mult mai bun� la lotul de studiu decât la lotul martor. Diferen�ele între loturile martor �i cele aflate în terapie sunt semnificative statistic în ceea ce prive�te starea de s�n�tate �i starea func�ional�, indiferent de localizarea tumorii.

Urm�rind curbele de supravie�uire se constat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar. (Fig. II. 104, II. 105)

Fig.II.104.Curba de supravie�uire la loturile

de studiu cu cancer mamar Fig.II.105. Curba de supravie�uire la loturile

de studiu cu cancer colorectal

STUDIUL EFECTELOR POLICHIMIOTERAPIEI ANTINEOPLAZICE ÎN HEMOPATII MALIGNE ASUPRA

METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR

În aceast capitol am studiat pe loturi de pacien�i cu leucemii acute diversele aspecte ale modific�rilor metabolismului energetic în timpul tratamentului antineoplazic. Boala

15

leucemic� trebuie v�zut� nu numai ca o proliferare necontrolat� a unei clone celulare ci ca o boal� a întregului organism. Am eviden�iat activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i viabilitatea celular�, desf��urarea procesului de apoptoz�, precum �i varia�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a antioxidan�ilor plasmatici. Toate procesele studiate sunt p�r�i integrante sau legate foarte strâns de procesele metabolismului energetic celular. Studiul activit�ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute

Am studiat intensitatea metabolismului energetic celular prin punerea în eviden�� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare, atât înainte cât �i în timpul tratamentului antineoplazic, cu ajutorul testului cu nitrobleutetrazolim (NBT).

Înainte de începerea tratamentului în medie 14,73 % dintre celulele studiate prezint� o activitate oxido-reduc�toare intens�. Acest procent este apropiat de cel ob�inut la lotul mator. Rezultatele procentuale medii sunt prezentate tabelul 2.3. �i figura II. 106.

înainte de tratamentzi 1-3

zi 15/33

0

2

4

6

8

10

12

14

16

% c

elu

le N

BT

po

ziti

ve

Momentul

recolt�rii

Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive

LA

MLA

Fig.II .106. Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive

la lotul LA fa�� de lotul martor M LA

Realizând o compara�ie între valorile procentuale medii de celule NBT pozitive de la

cele dou� tipuri de leucemii acute, se constat� diferen�e mici, nesemnificative (p > 0,05). O caracteristic� ce le deosebe�te semnificativ r�mâne momentul în care se ating

valorile minime, cu valoare predictiv� a r�spunsului la tratament, reprezentat� de ziua 15 dup� tratament la loturile LAM �i ziua 33 la LAL. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux

Interesul tot mai mare pentru studiul apoptozei a stimulat introducerea unor metode variate de detectare, una dintre ele fiind utilizarea coloran�ilor fluorescen�i în citometria în flux. Analizele s-au realizat din sângele periferic recoltat de la pacien�ii cu leucemie acut� limfoblastic� �i leucemie acut� mieloblastic�, fiind inclu�i în lotul de studiu LA. Popula�ia de celule din sângele periferic în leucemia acut� are în general urm�torul spectru: în faza de diagnostic, de invazie blastic� se caracterizeaz� prin prezen�a de bla�ti leucemici în propor�ie de 80-95% �i celule normale 5-20%.

Rezultatele ob�inute sunt reprezentate grafic în programul Cell-Quest sub form� de citograme (dot plot Annexin V-PE/7-AAD). Pe citogramele rezultate, bidimensionale, fiecare eveniment (celul�) este reprezentat printr-un punct.

16

Înainte detratament

zi 1-3zi 33

5,2

37,15

59,57

0,2

38,18

8,55

94,6

24,67

31,88

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pro

cen

t ce

lule

Momentul evalu�rii

Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL

Celule vii

Celule în proces

Celule moarte

Înainte detratament zi 1-3

zi 15

Cel ule vi i

Celule în proces

Celule moart e

7,27

29,59

52,38

0,35

38,01

13,56

92,38

32,4 34,06

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pro

cen

t ce

lule


Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAM

Celule vii

Celule în proces

Celule moarte

Fig.II.116. Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL �i LAM

Fig.II.118. Citograme ob�inute prin analiz� de citometrie în flux în 1-3 zile (24-72 ore) de la

începerea tratamentului antineoplazic conform protocolului ALL-IC BFM 2002 (Dot plot Annexin-

PE/7-AAD). Nr. de celule num�rate: 10000. Rezultatele prezentate prin citograme sunt reprezentative

pentru lotul de studiu LA, pacien�i cu leucemie acut� limfoblastic�. (LAL).

Rezultatele noastre arat� c� eviden�ierea apoptozei prin citometrie de flux este o metod� sigur� �i extrem de sensibil� petru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic. Coroborat� cu datele clinice ale pacien�ilor devine o metod� foarte util� în luarea deciziilor terapeutice subsecvente de continuare sau de modificare a terapiei.

Influena chimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemii acute

Pân� acum, nu s-a stabilit cu precizie dac� stresul oxidativ prezent la pacien�ii cu boli neoplazice rezult� dintr-o producere crescut� a radicalilor liberi în organism sau dintr-un e�ec al sistemului fiziologic antioxidant. În cercetarea de fa�� am urm�rit nivelul seric al ceruloplasminei în timpul polichimioterapiei în paralel cu nivelul seric al malondaldehidei, determinarea lor din sânge reprezentând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ.

17


zi 33

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Val

ori

med

ii M

DA

(n

mo

l/ml)


Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehid� seric�

MLA LA

Fig.II.122. Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehida seric� (lotul de studiu LA

comparativ cu lotul martor M LA)


zi 15/33

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Val

ori

med

ii C

P (

mg

/ml)


Evolu�ia valorilor medii ale CP la loturile LA/MLA

LA

Martor MLA

Fig.II.126. Evolu�ia valorilor medii pentru ceruloplasmina seric� (lotul de studiu LA comparativ cu

lotul martor M LA )

Înainte de începerea tratamentului exist� un nivel u�or crescut al speciilor reactive al oxigenului în sângele periferic al pacien�ilor cu leucemie acut�, împreun� cu un nivel sc�zut al antioxidantului plasmatic, ceruloplasmina.

Nivelul sc�zut al ceruloplasminei (CP) men�inut pe tot parcursul terapiei împreun� cu un nivel mult crescut al malondialdehidei (MDA), arat� c� stresul oxidativ persist�, iar ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate. CONCLUZII

Cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Cele dou� sunt tratate separat reprezentând fa�ete diferite ale temei cercetate, nu beneficiaz� de compara�ii deoarece arat� aspecte particulare diferite ale celor dou� tipuri de tumori �i au fost realizate pe loturi diferite de pacien�i.

Prin urm�rirea efectelor terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra metabolismului energetic celular, cu ajutorul metodelor �i tehnicilor histologice, histoenzimatice, imunohistochimice �i biochimice, prin urm�rirea evolu�iei st�rii generale de s�n�tate, comparând rezultatele ob�inute pentru loturile de studiu cu cele ob�inute pentru loturile martor, putem formula urm�toarele concluzii:

1. Studiile au eviden�iat înaintea ini�ierii tratamentului un metabolism glicolitic foarte intens, demonstrat prin activitatea excesiv� a LDH-ului. Sinteza de ATP se realizeaz�

18

mai ales pe cale glicolitic�. La nivel mitocondrial, activitatea metabolic� este de o intensitate mai redus�, dar mitocondriile au membranele integrale, citocromul c nu se elibereaz� în citosol, celulele nefiind antrenate în procesul apoptotic;

2. S-a eviden�iat prezen�a vasculariza�iei intratumorale, furnizând oxigen �i substan�e nutritive celulelor tumorale, care împreun� cu prezen�a unei glicolize intense demonstreaz� ac�iunea efectului Warburg în celulele tumorale;

3. În timpul tratamentului antiangiogenetic scade activitatea ATP-azic�, se amplific� u�or glicoliza împreun� cu diminuarea activit��ii mitocondriale. Datorit� amplific�rii hipoxiei glicoliza devine mai intens�, activitatea enzimatic� mitocondrial� scade prin reducerea fosforil�rii oxidative �i a activit��ii ciclului acizilor tricarboxilici;

4. Exist� o activitate antiangiogenetic� accentuat� în urma tratamentului antineoplazic, ac�iune anti-VEGF (VEGF – factor de cre�tere endotelial vascular), care se realizeaz� printr-o supresie marcat� a vasculogenezei, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine dar �i printr-un efect asupra vaselor sangvine tumorale deja existente, prin inducerea apoptozei celulelor endoteliale. Se remarc� reducerea semnificativ� a num�rului de vase sanguine, precum �i a tipurilor de vase, mai ales a celor imature (inhibarea dezvolt�rii de noi vase) �i mature (distrugerea vaselor existente);

5. Reducerea vasculariza�iei tumorale, determinând sc�derea aportului de oxigen, duce la aprofundarea st�rii de hipoxie. În aceast� stare se destind invagin�rile mitocondriale, cristele, scade sinteza de ATP la nivel mitocondrial, astfel se activeaz� calea glicolitic� a metaboliz�rii glucozei. Datorit� acumul�rii acidului lactic scade pH-ul care determin� inhibarea enzimelor celulare �i duce la autoliza celulei. Tot hipoxia induce �i activarea factorului HIF (hypoxia inducing factor) care stimuleaz� angiogeneza prin reglarea factorului VEGF, fapt ce explic� utilitatea administr�rii anticorpului monoclonal bevacizumab pân� la evolu�ia bolii;

6. Rezultatele ob�inute arat� c� poten�ialul apoptotic al celulelor maligne cre�te semnificativ în timpul tratamentului antiangiogenetic, împreun� cu reducerea vasculariza�iei tumorale, este activat� calea apoptotic� mitocondrial� prin eliberarea citocromului c din spa�iul intermembranar mitocondrial;

7. În timpul tratamentului antiangiogenetic se dimiueaz� gradul de peroxidare lipidic�. O sc�dere a nivelului seric de specii reactive ale oxigenului se constat� �i la loturile martor incluse în studiu dar într-o m�sur� mult mai mic�;

8. Capacitatea antioxidant� a organismului pentru neutralizarea activit��ii radicalilor liberi cunoa�te o cre�tere progresiv� semnificativ� (p < 0,05);

9. Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional, evolu�ia st�rii generale de s�n�tate arat� o diminuare progresiv�, dar mult mai lent� la loturile de studiu decât cea observat� la loturile martor, f�r� tratament antiangiogenetic;

10. În privin�a aspectelor metabolismului energetic celular studiate la nivel celular, nu exist� diferen�e semnificative între tumorile mamare �i colorectale, dar rezultatele m�sur�torilor antropometrice, a st�rii de s�n�tate �i func�ionale, arat� c� la loturile de pacien�i cu cancer colorectal degradarea biologic� este mai rapid� decât la loturile cu cancer mamar, probabil �i datorit� influen�ei mai mari a localiz�rii tumorii în statusul metabolic general al organismului, împiedicând frecvent un aport �i o metabolizare eficient� a nutrien�ilor;

11. Curbele de supravie�uire realizate arat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar;

12. Pe tot parcursul studiului am comparat rezultatele cu cele ob�inute la loturile martor �i am constatat c� administrarea acestui medicament a determinat urm�toarele rezultate pozitive: a crescut poten�ialul apoptotic al celulelor maligne, s-a diminuat gradul de peroxidare lipidic�, a crescut capacitatea antioxidant� a organismului, starea general� a

19

organismului, statusul metabolic �i nutri�ional au fost mai pu�in afectate, s-a încetinit evolu�ia bolii împreun� cu cre�terea supravie�uirii generale a pacien�ilor;

13. Rezultatele ob�inute descriu un tablou complex metabolic al ac�iunii medicamentului antineoplazic studiat �i reprezint� o contribu�ie original� în ceea ce prive�te investigarea evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antiangiogenetice.

Rezultatele studiului efectelor polichimioterapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular, în leucemiile acute, arat� c�:

1. Medicamentele antineoplazice au o ac�iune semnificativ� de inhibare a proliferativit��ii �i viabilit��ii celulare prin diminuarea accentuat� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare. Diminuarea este semnificativ� (p < 0,05) deja în primele 1-3 zile de tratament;

2. Inducerea apoptozei are loc la 1-3 zile de la începerea tratamentului, iar propor�ia celulelor moarte prin apoptoz� cre�te semnificativ pân� la induc�ia remisiei. Deficien�a c�ii apoptotice ar determina rezisten�a celulelor la polichimioterapie, ducând la sc�derea ratei de remisie. Studiul poten�ialului apoptotic, prin tehnica citometriei în flux, confer� informa�ii valoroase pentru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic;

3. Perturbarea echilibrului oxidant/antioxidant este confirmat. Sub ac�iunea terapiei antineoplazice se ini�iaz� peroxidarea lipidic� poten�ând stresul oxidativ. Substan�ele citotoxice activeaz� o succesiune de c�i metabolice în urma c�rora sunt generate specii reactive de oxigen. Concentra�ia acestor specii reactive a crescut semnificativ (p < 0,05) în timpul tratamentului polichimioterapeutic, deteriorând mecanismul de ap�rare antioxidant endogen, a c�rui nivel scade semnificativ (p < 0,05);

4. Antioxidantul endogen, ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate;

5. Aspectele metabolismului energetic celular supuse studiului efectuat asupra hemopatiilor maligne nu arat� diferen�e semnificative în r�spunsul la nivel celular la tratamentul polichimioterapeutic între cazurile de leucemie acut� limfoblastic� �i cazurile de leucemie acut� mieloblastic�;

6. Datele prezentate reflect� atât condi�iile de metabolism celular caracteristice celulelor tumorale cât �i tulbur�rile induse de citostatice. Separarea acestor dou� elemente nu are consecin�e practice, ne intereseaz� imaginea global� care poate s� sugereze puncte de interven�ie diagnostic�, prognostic�, de supraveghere �i poate explica anumite fenomene atât pentru cercet�tor cât �i pentru clinician.

Rezultatele studiilor întreprinse î�i aduc aportul în domeniul cercet�rilor fundamentale,

prin eviden�ierea unor mecanisme moleculare ale metabolismului energetic, implicate în r�spunsul la tratamentul antineoplazic. În acela�i timp studiul prezint� posibilit��i reale de aplicabilitate în modificarea strategiilor �i standardelor terapeutice din domeniul oncologiei �i onco-hematologiei.

BIBLIOGRAFIE

1. Ardelean A., Biologia molecular� a medicamentului, “Vasile Goldi�” University Press, Arad, 2009, 49-53. 2. Carew J.S., Huang P., Mitochondrial defects in cancer, Molecular Cancer, 2002; 1:9, 7. 3. Kopper L., Fesus L., Apoptozis, Medicina Konyvkiado R.T., Budapest, 2002, 103-115. 4. Korkopoulou P., Konstantinidou A.E., Kavantzas N., Patsouris E., Pavlopoulos P.M., Cjristodoulou P., Thomas-Zsalgi E., Davaras P. - Morphometric microvascular characteristics predict prognosis in superficialand invasive bladder cancer, Virchows Arch, 2001, 438: 603-611.

20

5. Kroemer G., Pouysseger J., Tumor cell metabolism: Cancer’s Achilles Heel, Cancer Cell, 2008, 13, 6:472-482. 6. Lopez-Lazaro M., A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy, Molecular Medicine, 2010, 16 (3-4), 144-153. 7. Lopez-Lazaro M., Role of oxygen in cancer looking beyound hypoxia, Anticancer Agents Medical Chemystry, 2009, 9: 517-525. 8. Lopez-Lazaro M., The Warburg effect why and how do cancer cells activate glycolysis in the presence of oxygen, Anticancer Agents Medical Chemistry, 2008, 8(3): 305-312. 9. Mixich F., Ardelean A., Principii fundamentale de biologie molecular�, Editura Medical� Universitar� Craiova, 2002, 292-305. 10. Mure�an, E., Bogdan, A.T., Gaboreanu, M., Baba, A.I., Tehnici de histochimie normal� �i patologic�, Ed. Ceres, Bucure�ti, 1976, 5-74, 185-214, 317-319. 11. Nagy V. Principii de cancerologie, Celula malign� �i fenotipul malign, Editura Medical� Universitar� Cluj-Napoca, 2007, 46-67. 12. Nicolau S. Popa I., Oncologie general� �i oncopediatrie, Editura Helicon, Timi�oara, 1999, 358-379. 13. Ross M.H., Pawlina W., Histology: A Text and Atlas, With Correlated Cell and Moleclar Biology, Fifth Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2007, 459-472. 14. Verde� D., Mitocondria, Editura Mirton, Timi�oara, 2000, 78-106. 15. Warburg O., On the origin of cancer cells, Science, 1956; 123: 309-314. Lista lucr�rilor tiinifice publicate din teza de doctorat cuprinde 9 titluri Anexa 1 cuprinde Formular de informare �i consim��mânt Anexa 2 cuprinde Chestionarul de evaluarea st�rii de s�n�tate �i func�ional�

MINISTERUL EDUCA IEI, CERCET RII, TINERETULUI I SPORTULUI ... · Se eviden iaz anizocitoza, celule...

Documents

Transcript of MINISTERUL EDUCA IEI, CERCET RII, TINERETULUI I SPORTULUI ... · Se eviden iaz anizocitoza, celule...