Micropropagarea La Specii

8/13/2019 Micropropagarea La Specii

http://slidepdf.com/reader/full/micropropagarea-la-specii 1/20

CAPITOLUL XII

12.1 MICROPROPAGAREA SPECIILOR HORTICOLE,ORNAMENTALE ŞI FORESTIERE

12.1.1 Micropropagarea a cri!a"#e$e % Chrisanthemum morifolium &

I"#ro'(cere

Crizantemele ( Dendranthema grandiflora Tzelev, sinonim cuCrysanthemum morifolium Robat) fac parte din cea mai răspândită speciefloricolă cultivată atât pentru împodobirea spaţiilor verzi cât şi pentru utilizarealor ca plante ornamentale în g ivece sau flori tăiate! Crizantemele, cu originea în"rientul #ndepărtat, fac acum parte din culturile cele mai importante în multeţări ale lumii! $a%oritatea, din cele câteva sute de cultivare, este propagatăcomercial prin butăşire convenţională, dar multe dintre cultivare au fostmicropropagate cu succes prin te nica de lăstărire adventivă (organogeneză),din variate tipuri de ţesut şi prin cultură de calus! &nele protocoale de regenerare pot fi folosite pentru obţinerea de plante libere de virusuri (cultura demeristeme) la ma%oritatea cultivarelor, pentru obţinerea unui număr mare de plante în timp scurt la plantele elită, pentru înlăturarea mutaţiilor induse c imicsau fizic şi în transformările genetice în scopul obţinerii unui nou colorit al floriisau pentru inducerea rezistenţei la boli!

Crizantemele pot fi folosite pentru a demonstra funcţionarea mai multorte nologii şi concepte în protocoalele de regenerare bazate pe organogenezadirectă!

Preg)#irea $a#eria ( (i *ege#a 'o"or

$aterialul biologic necesar în realizarea unei culturi de ţesuturi poate fiac iziţionat sub formă de butaşi ce vor fi cultivaţi în g ivece de plastic deapro'imativ cm diametru, pentru înrădăcinare, cu cca * săptămâni înainte deînceperea e'perimentului! +e recomandă luarea în cultură a cât mai multor soiuri pentru a reuşi observarea diferenţelor ce apar între genotipuri în ceea ce priveştecapacitatea de regenerare în culturain vitro !

Condiţiile de creştere a plantelor donor prezintă o mare importanţă deaceea se recomandă cultivarea acestora fie în camere de creştere fie în sereiluminate cu becuri fluorescente incandescente într un regim de fotoperiodism

-.



de / ore lumină, la o temperatură de 00 0.oC! #n cazul în care plantele suntcultivate primăvara sau toamna se va suplimenta iluminarea pentru a asiguracondiţii de zi lungă, ce vor in iba înflorirea plantelor! +e recomandă prelevareavârfurilor principale de creştere (folosirea lor ca sursă nouă de butaşi) pentruinducerea ramificării secundare şi producerea de frunze tinere!

Preg)#irea e+p a"#e or i a $e'i( (i 'e c( #(r)

1entru realizarea unor rezultate notabile, se recomandă selectarea, pentrurealizarea e'plantelor doar a frunzelor tinere, parţial dezvoltate, de culoare verdedesc is, de 0 . cm lungime! +e realizează sterilizarea frunzelor folosind ,0/2

ipoclorit de sodiu, timp de . minute cu agitare continuă, urmată de clătirirepetate în apă distilată sterilă! +e plasează câte o frunzuliţă cu parte superioarăîn sus, într o cutie 1etri sterilă şi se elimină surplusul de apă prin răsturnareavasului şi apăsarea cu fineţe a frunzuliţei! +e poate folosi şi ârtie de filtru sterilă pentru absorbirea surplusului de apă de la suprafaţa frunzei! 1artea superioară afruzuliţei se poate identifica uşor datorită culorii mai înc ise şi a prezenţei perişorilor într un număr mare! +e va fasona frunzuliţa, înlăturându se marginileacesteia, folosind un bisturiu, izolându se fragmente de cca ,. cm0!

3ragmentele rezultate vor fi plasate la suprafaţa mediului de cultură cusuprafaţa inferioară a frunzei în contact cu mediul!

$ediul bazal de cultură este compus din sărurile specifice mediul $+

( -/0), la care se adiţionează * g4l (55m$) za aroză, g4l ( ,.. m$)mioinozitol, .mg4l (0,- 6$) tiamină 7Cl şi agar 5g4l, stabilindu se un p7 de.,8! +tabilirea p7 ului se realizează înainte de adăugarea agarului şi deautoclavare, reglarea p7 ului făcându se, în funcţie de caz, cu o bază sau unacid! 9upă autoclavare (la 0oC), timp de 0* * minute (în funcţie de volumulde mediu), mediul de cultură se repartizează în vase 1etri sterile, în condiţiiaseptice, la ota cu flu' de aer steril! 3ito ormonii necesari vor fi adăugaţi, înfuncţie de tipul de cultură dorit, după autoclavare!

12.1.2 Micropropagarea a pe#("ie % Petunia hybrida &

Petunia hybrida 7ort! :ilm ;ndr! este petunia comună de grădină! ;reun fond genetic comple' alcătuit din ibrizi proveniţi din trei sau patru specii de

Petunie ! <ste considerată un =cultigen> deoarece este rezultatul ameliorăriiartificiale şi nu ibridărilor sălbatice!

1etunia este una dintre cele mai populare flori utilizată în organizareaornamentelor stradale, în grădini sau parcuri! +e înmulţeşte în special prinseminţe, dar la unele cultivare se poate realiza şi înmulţirea prin stoloni!

1etunia face parte din familiaSolanaceae ! $ulte dintre studiile realizatein vitro au fost efectuate pe specii aparţinând acestei familii, deoarece

-/



regenerează uşor în condiţii artificiale de cultură! 9intre membrii acestei familiide plante, petunia este cel mai receptiv la culturilein vitro ,putând regenera dinantere, protoplaşti, ipocotile, cotiledoane, fragmente de tulpină, frunze şi altetipuri de ţesuturi şi organe! 1etunia este ideală în realizarea de e'erciţii în scopdidactic deoarece răspunde cu uşurinţă la cultura de ţesuturi, seminţele fiinduşor de obţinut, păstrat şi germinat! ?ăstarii cresc repede şi pot fi utilizaţi casurse de e'plante tot timpul anului!

1etunia poate regenerain vitro atât prin organogeneză directă cât şi prinorganogeneză indirectă în funcţie de balanţa ormonală utilizată! "rganogenezadirectă are loc atunci când lăstarii se formează direct pe e'plantele inoculate pemediu! "rganogeneza indirectă implică trecerea prin faza de calus, lăstariiregenerând din celule de calus!

#n ambele cazuri, celulele generatoare de lăstari trebuie să se întoarcă înstadiul meristematic! Celulele fiice, ce formează un meristem, devin gradatspecializate şi diferenţiază în celule ce vor alcătui organele unei noi plante!@alanţa ormonală influenţează direcţia în care va decurge diferenţierea!Celulele specializate sau diferenţiate trebuie să devină mai puţin specializate pentru a forma un meristem! ;cest proces este invers procesului de diferenţiereşi poartă denumirea de =dediferenţiere>! 9e aceea, celulele generatoare de lăstaritrebuie să dediferenţieze înainte, pentru a fi capabile să reiniţieze un procesregenerativ!


Răspunsul în culturain vitro este genotip dependentă, cultivare diferitevor genera răspunsuri diferite şi vor avea necesităţi variate în ceea ce priveşte balanţa ormonală pentru a fi capabile să inducă neoformarea de plantule!Totuşi, marea ma%oritate a cultivarelor de petunie regenerează prin formarea delăstari, fie adventivi fie prin lăstărire a'ilară multiplă!

+e recomandă luarea în cultură, în general, a cultivarelor de tipulAradiflora, deoarece cele de culoare roşie sunt recalcitrante la culturain vitro !

Cu apro'imativ opt săptămâni înainte de iniţierea culturii de ţesuturi,seminţele vor fi semănate în sere sau camere de creştere, în pământ steril sau în perlit, în vase de vegetaţie de apro'imativ cm în diametru, sau în g ivecedreptung iulare! +eminţele de petunie sunt de dimensiuni mici, de aceea, serecomandă semănarea lor mai la suprafaţă! +e pot face şănţuleţe de apro'imativ

cm adâncime şi semăna la o densitate de 0 sau *4cm liniar! +e recomandă a nuse semăna prea des deoarece vor rezulta plantule subţiri, firave şi greu deseparat! Temperatura în camera de creştere trebuie să fie de apro'imativ 00BoC, e'plantele foliare provenite de la plante crescute la temperaturi de * oC

nu vor răspunde la culturain vitro !

-8



+e recomandă e'ecutarea periodică de fertilizare cu azot, după încolţireaseminţelor! rigarea se va face cel mai bine pe bază de capilaritate sau prinsistem de picurare la rădăcină! " irigare prea abundentă poate duce lacontaminări fungice sau bacteriene la iniţierea culturilorin vitro ! Trebuie avutăîn vedere realizarea unui control strict asupra răspândirii musculiţei albe de seră,care poate determina, de asemenea, infecţii fungice sau bacteriene la iniţiereaculturiiin vitro ! +e recomandă aplicarea de tratamente împotriva musculiţei albede sere săptămânal sau ori de câte ori este necesar şi folosirea, în cultura decelule, a unui ec ipament adecvat constituit din alate, bonete, mănuşi!


Recoltarea e'plantelor foliare se poate realiza pe toată durata formăriifrunzelor până la stadiul de înflorire! +e pot folosi şi frunzele tinere de la planteînflorite, e'istând însă pericolul contaminărilor fungice şi bacteriene atunci cândse iniţiază cultura de ţesuturi! +e evită prelevarea e'plantelor de la plantelecrescute în aer liber deoarece acestea pot fi foarte contaminate, iar sterilizarea see'ecută cu dificultate!

$ediul de cultură necesar este alcătuit, în general, din elementeleminerale ale mediul bazal $+, la care se adaugă *2 za aroză şi ,8 2 agar, iar p7 ul mediului trebuie să fie .,5! 9upă autoclavare mediul de cultură serepartizează în vasele de cultură, fiecare vas fiind inoculat cu e'plante foliare!

12.1.- Micropropagarea a *io e#e e 'e Par$a % Saintpaulia ionantha &

Saintpaulia cunoscută cu denumirea populară de violete de 1arma sauviolete africane, este un gen ce cuprinde şase specii de plante erbacee perene,aparţinând familieiGesneriaceae, ce provine din Tanzania şi DenEa, cu cea maimare concentraţie de specii în munţii Fguru din Tanzania! ;cest gen seînrudeşte cel mai bie cu genulStreptocarpus ! Fumele lor vine de la asemănareadintre florile acestui gen şi cele ale genuluiViola , familiaViolaceae, adevăratele

violete (9arbEs ire, 0 /)! Fumele genului este dat după baronul Galter von+aint 1aul llaire ( 5/ - ), un distins misionar, care a descoperit această planta în Tanzania în 5-0 şi i a trimis seminţe tatălui său, un botanist înfocat,care trăia în Aermania! AenulSaintpaulia şi speciaS. ionantha , au fost primadată descrise de H!C!Gendland în 5-*!

:ioletele de 1arma sunt plante cu o talie de / * cm, cu frunzele de larotunde la ovale, cu o lungime între 0,. 5,.cm şi peţiol de 0 cm, pubescenteşi te'tura cărnoasă, de culoare verde înc is, prezintă de curând şi varietăţi cufrunze bicolore, verde înc is cu dungi albe, de forme şi consistenţe diferite!

3lorile cu diametrul de 0 * cm şi o corolă cu cinci petale lobate de culoare violetcresc în ciorc ini de * sau c iar mai multe! Culoare florilor speciilor

-5



sălbatice poate varia de la violet, la purpuriu, albastru desc is, roz sau c iar alb,unele varietăţi fiind c iar bicolore! +unt în general plante de interior, crescute îng ivece de dimensiuni mici, dar e'istă c iar şi varietăţi agăţătoare, perfecte pentru g ivecele fi'ate pe ziduri sau pereţi!

$ulte dintre speciile şi subspeciile genuluiSaintpaulia sunt pe cale dedispariţie datorită reducerii abitatului lor natural în favoarea agriculturii ()!

+peciile genuluiSaintpaulia se pretează cu uşurinţă la multiplicareainvitro , fiind una dintre plantele e'emplu mai ales pentru sistemul de multiplicare prin organogeneză directă, şi anume, inducerea de muguri adventivi! #n cadrulacestui sistem de multiplicare, se induce formarea mugurilor adventivi direct pee'plantele inoculate (fragmente de limb foliar, fragmente de peţiol, fragmentede tulpină), sau indirect în calusuri! Cea mai folosită în multiplicare esteinducerea directă pe e'plante, deoarece parcurgerea fazei de calus presupune şiinducerea variabilităţii somaclonale!


Te nica de multiplicare prin inducerea de muguri adventivi presupune parcurgerea mai multor etape astfelI iniţierea culturilor, inducerea formăriimugurilor adventivi, creşterea lăstarilor pe acelaşi mediu, sau pe un mediu dealungire, înrădăcinarea lăstarilor pe un mediu cu au'ină sau pe un mediu lipsitde fito ormoni!

1lantele donor vor fi crescute în sere climatizate, nivelul potrivit alintensităţii luminii este cel mai important factor de care trebuie ţinut cont înîngri%irea violetelor africane! ;cestea au nevoie de lumină puternică, darindirectă! <le cresc e'celent şi în lumina fluorescentă a neonului! &n alt factorimportant este udatul! :ioletele se udă imediat după ce solul din g iveci începesă se usuce! ;cesta nu trebuie lăsat să se usuce prea mult, şi nici nu se va adăugaapă în e'ces! 1entru a menţine umiditatea la un nivel optim, g ivecele pot fiaşezate în tăvi pe fundul cărora se pune un strat subţire de pietriş! ;pa din sol seva scurge în tavă, iar stratul de pietriş va împiedica rădăcinile să stea direct în

apă! Treptat, apa din stratul de pietriş se va evapora menţinând astfel constantnivelul de umiditate! ;pa de robinet se va ţine 0B de ore într un vas desc is, latemperatura camerei, înainte de a fi folosită la udarea plantei! #n acest fel apaeste adusă la temperatura camerei, apa rece fiind dăunătoare plantelor! 9easemenea, nivelul clorului conţinut de apa de la robinet se reduce prinevaporare!

+e fertilizează de două ori pe lună cu un fertilizant solubil în apă! #ncomerţ se găsesc fertilizanţi speciali pentru această specie! +olul trebuie să fieun sol bogat în materie organică, şi să asigure un bun drena% al apei şi o bună

aerare a rădăcinilor! Temperatura între 0 05o

C este temperatura ideală pentruvioletele africane! +e va evita supunerea plantelor la sc imbări bruşte de

--



temperatură, sau la temperaturi e'treme, c iar şi pentru o perioada scurta detimp! " bună circulaţie a aerului în încăperea în care sunt menţinute g iveceleva preveni apariţia unor boli precum mucegaiurile!


Ca material biologic se utilizează fragmente de limb şi peţiol deSaintpaulia ionantha ! +e detaşează limbul împreună cu peţiolul de pe o plantădin g iveci! +terilizarea se face astfelI presterilizarea J spălarea în apă de robinetşi imersie în alcool 8o timp de 0 secunde, sterilizarea în ipoclorit de calciu.2 timp de 0 minute şi poststerilizarea prin clătiri repetate în apă distilatăsterilă (. clătiri)!

$ediul de cultură folosit pentru această te nică de multiplicare este$uras ige +Koog ($+) cu diferite concentraţii ale fito ormonilor! #n general seurmăreşte ca raportul citoc inină au'ină să fie favorabil citoc ininelor!

#n condiţii sterile, la ota cu flu' de aer steril, se pregătesc materialelenecesare şi vasele cu mediul de cultură pentru inducerea multiplicării! #ntr ocutie 1etri sterilă şi utilizând instrumentar steril se scot frunzele, din vasulutilizat la clătire şi se detaşează limbul de peţiol! 3ragmentarea limbului se facesub forma unor pătrate cu latura de cm, iar peţiolul sub forma unor fragmentecu lungimea de cm ! nocularea se face cu partea inferioară pe mediu, în cazulfragmentelor de limb şi paralel cu suprafaţa mediului în cazul peţiolului! +e

izolează vasele cu parafilm şi se incubează în camera de creştere în regim defotoperioadă, la 0.oC! ;pariţia mugurilor adventivi, din care se vor formalăstari, se poate observa după B / zile de la inoculare! 9upă B / săptămâni dela inoculare, lăstarii formaţi se fragmentează, urmând ca aceştia să fiesubcultivaţi fie pe acelaşi tip de mediu, pentru multiplicarea în continuare, fie pemediu de cultură $+ cu au'ină sau fără ormoni, pentru înrădăcinare!

12.1. Micropropagarea a or/i'ee %ge"( Cymbidium &

3amilia or ideelor este formată din apro'imativ * ! de specii, dardacă se iau în considerare şi ibrizii pe care îi au şi dezvoltă cultivatorii din toatecolţurile lumii, numărul or ideelor probabil că depăşeşte 0 ! ! "r idee segăsesc pe fiecare continent în afară de ;ntarctica şi e'istă specii endemice înfiecare colţ al lumii!

"riginare din zonele cu clima temperată şi tropicală din ndia, Fepal,C ina, Haponia şi până în $alaiezia şi ;ustralia, cEmbidium sunt probabil celemai mult cultivate or ideeL de asemenea, florile lor durează cel mai mult! 9incele B . de specii s au creat sute de ibrizi, cu flori de diferite culori, de la

alb, galben şi portocaliu, până la roşu, maro şi verdeL dimensiunile variază de la. până la cm în diametru!

0



"r ideele CEmbidium apar pentru prima dată în scrieri în C ina şiHaponia, în cântece populare c inezeşti compuse înainte de perioada luiConfucius (.. B8- îC !)! 1rima lucrare scrisă despre or idee a fost publicat înC ina în 0** dC şi cuprindea descrierile a peste 00 specii de or idee! 1rimadescriere sistematică şi clasificare formală a genului a fost făcută de "laf+Martz, în 8--! 1rima or idee cEmbidium a fost adusă în ;nglia din C ina decătre Hames 3ot ergill, în 885, iar primul ibrid al acestei specii a fost cultivatîn 55-!

Fumele CEmbidium provine din cuvântul grecesckymbe, care înseamnă barcă şi e legat de forma florii! 1oate părea incredibil, dar nu mai mult de 8 sau5 specii sunt NresponsabileN de - 2 din miile de ibrizi cEmbidium care e'istăastăzi! #n perioada anilor -* şi -B , cei mai populari ibrizi erau cei creaţi în;merica, pentru ca în ani -/ să domine cei din $area @ritanie!

CEmbidium standard are frunzele lungi, subţiri şi drepte sau pendulare,de . cm sau mai mult în lungimeL la ibrizii în miniatură frunzele sunt maiscurte şi mai înguste! 3lorile apar la capătul unor tulpini viguroase, fără frunze şimulte durează până la 0 luni, fie pe plantă, fie ca flori tăiate!

9e când Dnudson ( -B/) a pus la punct o metodă de culturăin vitro pentru inducerea germinării seminţelor de or idee, cultura de ţesuturiin vitro a %ucat un rol important şi foarte semnificativ în cultivarea, înmulţirea,ameliorarea şi conservarea speciilor şi ibrizilor acestei specii!

niţial, culturilein vitro aveau ca scop obţinerea unui grad de germinare

mai mare a seminţelor ce cădeau din fructele mature ale speciilor sau ibrizilorde or idee! Totuşi, pe la mi%locul secolului trecut s a început recoltarea fructelorimature (verzi) şi realizarea de culturi aseptice în ideea de a depăşi unele barierede incompatibilitate şi a produce astfel noi ibrizi!

"dată ce $orel ( -/ ) şi Gimber ( -/*) au demonstrat aplicabilitateaculturilor de ţesuturiin vitro pentru obţinerea unei multiplicări clonale rapide laor idee, această te nologie a început să fie aplicată cu succes pe scarăindustrială pentru a produce or ideele selecţionate în scopuri comerciale!"bţinerea de cantităţi mari de plante de înaltă calitate, realizarea de ibrizi noi,

multiplicarea şi conservarea germoplasmei sunt unele dintre beneficiile derivatedin aplicarea acestor te nici de cultură!9eşi se consideră că or ideele sunt plante uşor de înmulţit prin culturain

vitro , datorită numărului mare de lucrări ştiinţifice publicate pe această temă,atâta timp cât familiaOrchidaceae cuprinde peste B. de genuri şi .! despecii şi este e'trem de eterozigotică, în urma culturii pe mediu aseptic se poate obţine o varietate mare de răspunsuri!

$ai mult, atâta timp cât de la iniţierea culturii de ţesuturi până lmaturitatea plantei obţinute pot trece mai mulţi ani, datele asupra uniformităţii,

stabilităţii şi fidelităţii transmiterii în descendenţă a informaţiei genetice suntfoarte rare!

0




+terilizarea materialului donor se realizează în 0 sau * paşi, folosind fieipoclorit din comerţ, fie ipoclorit de sodiu în diferite concentraţii ( 0 2) pe

perioade variabile de timp ( . 0 minute) şi TMeen 0 (0 * picături4 ml), undetergent cu rolul permite creşterea aderenţei agentului de sterilizare la suprafaţamaterialului biologic! #ndepărtarea agentului de sterilizare se face prin clătirirepetate în apă distilată sterilă! 9acă materialul biologic donor este foartecontaminat, lăstarii de la care se vor preleva e'plantele se ţin sub %et continuu deapă timp de * minute până la 0 ore! &n tratament mai eficient, dar şi mai dur,ce ar putea duce la necrozarea unora dintre e'plante, este imersia lăstarilordonori în alcool etilic 8 2, timp de minut urmată de clătirea în apă distilatăsterilă înainte de trecerea la sterilizarea propriu zisă cu agentul de sterilizarecorespunzător!


<'plantele sunt prelevate fie din lăstari porniţi în vegetaţie, fie dininflorescenţe tinere, fie din frunze sau rădăcini! 9e preferat sunt mugurii a'ilarişi apicali ai lăstarilor aflaţi în vegetaţie proveniţi de la plante sănătoase! $uguriiapicali conţin meristemul apical plus * B noduri cu frunzele adiacente!

<'plantele radiculare sunt constituite din * B mm din vârful rădăcinii!+e cunosc mai multe medii de cultură bazale utilizate în culturaor ideelor (;rditti, -88), dar cele mai utilizate sunt mediul bazal Dnudson C(Dnudson, -B/) şi :acin Gent (:acin şi Gent, -B-), ce au incorporat încompoziţia mediului şi aditivii organici şi fitoregulatorii de creştere! Totuşi, de preferat este utilizarea mediului :acin Gent la care se poate adăuga lapte decocos! 9acă mediul este preparat cu atenţie a%ustarea p7 ului se va realiza cuuşurinţă, stabilindu se la valoarea optimă de B,5 ., ! ?aptele de cocos ( .2 v4v)este adăugat în mediu atunci când acesta este destinat iniţierii şi multiplicării

or ideelor! ;tunci când se doreşte înrădăcinarea e'plantelor se pot adăuga înmediu banane verzi omogenizate (. g4l)! Oa aroza se adaugă înconcentraţie mică sau deloc în mediile destinate iniţierii şi multiplicăriimonopodiale a or ideelor şi adăugată în concentraţii normale în mediiledestinate proliferării şi înrădăcinării lăstarilor! #n cazul în care laptele de cocosnu este disponibil pentru a fi adăugat în mediul de cultură se pot adăuga alţifitoregulatori de creştere!

Culturile aseptice vor fi incubate în regim de iluminare continuăfurnizată de lămpi de neon cu lumină rece la o temperatură de apro'imativ 0.

05o

! +e poate institui şi un regim fotoperiodic de / ore lumină! Culturile lic idevor fi plasate fie pe agitatoare verticale, fie pe agitatoare orizontale!

0 0



CEmbidium face parte din or ideele cu creştere simpodială, cu două a'ede creştereI una orizontală care este nedeterminată şi una verticală determinatăşi care se termină cu inflorescenţa!

?a speciile cu creştere simpodială cele mai optime sisteme de culturăinvitro sunt cultura de meristeme şi lăstărirea a'ilară multiplă!

12.1.0 Micropropagarea a pi" % Pinus silvestris L&

+uprafeţele destinate agriculturii, cât şi cele destinate pădurilor, audescrescut rapid în ultimele decenii datorită creşterii populaţiei pe Terra şiindustrializării masive! ;ceastă depreciere a pădurilor, foarte valoroase, a dus laapariţia necesităţii reîmpăduririi, mai ales în zonele predispuse eroziunii şialunecărilor de teren, ceea ce implică creşterea necesităţii producţiei de puieţi

sănătoşi, rezistenţi la boli, ce vor constitui material biologic folosit pentrureîmpăduriri!Aimnospermele, în special genul Pinus , sunt cele mai pretabile pentru

reînfiinţarea zonelor împădurite, datorită ciclului lor de viaţă îndelungat şi a polenizării alogame, fiind pretabile atât în zonele calde, subtropicale, cât şi înzonele temperate! 9e aceea, micropropagareain vitro a speciilor din genul

Pinus au o semnificaţie considerabilă în obţinerea rapidă de material semincersănătos!

+peciile genului Pinus acoperă marea ma%oritate a zonelor colinare din

numeroase ţări, reprezentând baza de c erestea şi răşină în industria lemnului!C eresteaua este tot mai mult folosită în industria mobilei, pentru construcţiacăilor ferate, uşilor, ferestrelor şi producţia de celuloză! Pinus ro burghii , un pinde esenţă tare şi Pinus !allichiana , un pin de esenţă moale, sunt cele mairăspândite surse de c erestea! 9in răşinile uleioase ale unor specii din genul

Pinus se e'trag uleiuri folosite în diferite ramuri ale industriei, iar miezulseminţelor unor specii nordice de Pinus sunt comestibile, constituind o sursăimportantă de calorii în sezonul rece!

+ au realizat multe încercări pentru micropropagarea speciilor genului Pinus , e'plantele de le care s a pornit au fost constituite, în general, dinembrioni imaturi, embrioni maturi sau embrioni de%a germinaţi!


$aterialul biologic poate fi constituit din vârfuri de creştere verzi, foartetinere sau seminţe, ce vor constitui sursa de embrioni, imaturi, maturi saugerminaţi!

1entru sterilizare, vârfurile de creştere sunt imersate în alcool şiflambate, urmate de incubare în 70" 0 2 la BoC timp de 0B de ore! 9upărealizarea mai multor clătiri în apă distilată sterilă, vârfurile de creştere vor fi

0 *



tratate cu miostatină ( ! unităţi4ml), pentru B. de minute! +e clătesc din noufoarte bine şi se imersează în soluţie de ipoclorit de sodiu 2 timp de .minute, urmată de imersie în clorură mercurică , 2 timp de . minute şi 0minute imersie în etanol 8 2! 9upă clătirea finală, în apă distilată sterilă,rămurelele de pin se deco%esc şi se fragmentează în segmente de / 5 mm!


3ragmentele de vârfuri de creştere (lăstari) se inoculează pe mediu $+cu mai multe variante ormonale, deoarece fiecare genotip poate da un răspunsdiferit la culturain vitro ! +e recomandă realizarea de combinaţii între o au'inăI0,B9 sau ;F; şi o citoc ininăI Din sau @;1!

;stfel, pentru obţinerea de calus embriogen, fragmentele de lăstari vor fiinoculate pe mediu $+ cu 0,B9 (B.6$) şi Din (0* 6$)! Calusul va fisubcultivat pe mediu de germinare fără ormoni sau va constitui baza de pornire pentru realizarea de suspensii celulare! 1e această variantă ormonală rezultatelevor putea fi observate în apro'imativ trei săptămâni!

" altă variantă ormonală ce ara putea fi folosită este constituită din;F; (0,. n$) şi @;1 (0 6$), ce va genera calus într o perioada mai lungă detimp! Calusul obţinut va putea constitui rezerva de germoplasmă, material biologic de pornire în realizarea unor suspensii celulare sau pentru regenerareade plante noi prin embriogeneză somatică sau c iar organogeneză somatică, în

funcţie de răspunsulin vitro al genotipului cultivat!+eminţele sunt sterilizate în soluţie de ipoclorit de sodiu 2 timp de. minute, urmat de tratament cu miostatină ( ! unităţi4ml) şi tetraciclină

( mg4ml) timp de * de minute cu agitare continuă! ;poi sunt imersate însoluţie de clorură mercurică , 2 pentru . minute, urmată de imersie în etanol8 2 pentru 0 minute! 1ost sterilizarea constă în efectuarea de clătiri repetate cuapă distilată sterilă (* . ori)! <mbrionii e'cizaţi vor fi inoculaţi pe mediu bazal$+, în poziţie orizontală, mediu îmbogăţit cu lapte de cocos (C$ , 2),asparagină (/. 6$) şi glutamină (/. 6$)! 9e asemenea, se pot testa mai

multe variante ormonale, în diferite concentraţii, indivizi şi4sau diferitecombinaţii!1ornind de la e'plante embrionare, fragmente cotiledonare sau de

ipocotil, se pot obţine, pe mediu $+ adiţionat cu asparagină (/. $),glutamină (/. 6$), ;F; ( ,.6$), @;1 (0 6$) şi lapte de cocos ( 2), atâtcalus din radicelă, cât şi lăstari prin lăstărire a'ilară multiplă! Rezultatele vor putea fi observate după apro'imativ patru săptămâni de cultură!

#nainte de autoclavare, se a%ustează p7 ul mediului la .,/ cu acidclor idric sau idro'id de sodiu, în funcţie de caz! ;utoclavarea se realizează la

0o

C, atm, timp de . 0 minute, în funcţie de cantitatea de mediu din

0 B



recipient! Culturile sunt incubate în regim de fotoperiodism de ore lumină( / lucşi) la o temperatură de 0.P0oC şi o umiditate relativă de ..P.2!

12.1. Micropropagarea a #e3ar % Quercus robur &

Quercus robur L ! este o specie diversă, cu multe forme şi varietăţiI dupăforma frunzelor ( glabra (Aod) +c ur!, pendula (?asc ) +c ur, etc!)L după formag indei (brevipes (7euff!) @ecK,e tensa +c ur!, perrobusta @org!, etc!) şi dupăatributele coroanei ( fastigiata (?am) +c ur!, pendula (?oud) 9C)! ;rborele estede tipul , cu valoare specială datorată calităţii lemnului, producţiei mari şi uneiregenerări relativ uşoare (9oniţăet al , 0 B)!

+te%arul ("uercus robur ), este unarbore din zona temperată, înalt de . 0 m, cu ramuri puternice, noduroase, coroană largă şi bogată! +coarţa ste%aruluieste de culoare brun negricioasă, aspră, adânc brăzdată, adăpostind adesea omicro faună activă (în special furnici şi anumite specii de gândaci)!3runzele sunt lobate, cu B 5 perec i de lobi de culoare verde înc is!1eţiolul este scurt (B5 cm)! +te%arul înfloreşte în luna mai! 3ructul esteac enă (g indă)! +e întâlneştemai ales la câmpie şi în zonele colinare, foarte rar la deal!

#n afară de pădurile curate de ste%ar, numite ste%ărete, ste%arul se găseştşi în amestec cu alte foioase, în aşa numitele păduri de şleau! ;re pretenţiimoderate faţă de umezeala din aer şi din sol, preferă solurile profunde, permeabile, reavene, dar vegetează destul de bine şi pe soluri compact argiloase!+uporta bine gerurile! 9in punct de vedere ornamental este apreciat datorită

formei piramidale a coroanei şi a coloritului de toamnă a frunzelor maroniugălbui! &til în aliniamente pe marginea aleilor şi drumurilor, poate fi plantat şiizolat sau în biogrupe (* . buc!) în parcuri şi grădini!

Termenul ste%ar este probabil de originetracică! #n trecut lingviştiiromâni i au atribuit, eronat, origine mag iar ă sau bulgărească, însă 9imitrie Cantemir îl menţionează în Descrierea #oldovei ca fiind un cuvânt ine'istent înmag iară sau bulgară!

1rincipalele metode de micropropagare a ste%arului pornesc de laseminţe, ceea ce rezultă într o sursă importantă de variabilitate, necesară atunci

când se doreşte ameliorarea unei specii! Totuşi, posibilităţile de reproduceregenerativă sunt limitate de durata lungă de viaţă a acestei specii, de necesitateaunei perioade lungi de timp până la atingerea maturităţii plantei, de calitatea şi productivitatea scăzută a seminţelor şi de depozitarea dificilă a g indelor!

+eminţele de ste%ar prezintă diferite grade de recalcitranţă şi pot fi păstrate o scurtă perioadă de timp datorită predispoziţiei lor la des idratare! #n plus, metodele convenţionale de înmulţire vegetativă a arborilor maturi prin butăşire prezintă dificultăţi în înrădăcinarea lăstarilor! 1roblemele apărute înînmulţirea ste%arului din material biologic %uvenil sau matur ar putea fi rezolvate

prin utilizarea te nicilorin vitro ! $icropropagareain vitro pornind de la muguridorminzi recoltaţi din arbori maturi prezintă o mare importanţă mai ales pentru

0 .

http://ro.wikipedia.org/wiki/Arbore

http://ro.wikipedia.org/wiki/Frunz%C4%83

http://ro.wikipedia.org/w/index.php?title=Pe%C5%A3iol&action=edit&redlink=1

http://ro.wikipedia.org/wiki/Achen%C4%83

http://ro.wikipedia.org/wiki/Trac

http://ro.wikipedia.org/wiki/Maghiar

http://ro.wikipedia.org/wiki/Bulgar

http://ro.wikipedia.org/wiki/Dimitrie_Cantemir


http://ro.wikipedia.org/wiki/Arbore

http://ro.wikipedia.org/wiki/Frunz%C4%83

http://ro.wikipedia.org/w/index.php?title=Pe%C5%A3iol&action=edit&redlink=1

http://ro.wikipedia.org/wiki/Achen%C4%83

http://ro.wikipedia.org/wiki/Trac

http://ro.wikipedia.org/wiki/Maghiar

http://ro.wikipedia.org/wiki/Bulgar





obţinerea de puieţi în scop comercial, pentru înmulţirea clonală a genotipurilorselecţionate pentru calitatea lemnului şi4sau pentru rezistenţa sau toleranţa la boli şi poluare (+an HosQ şi colab!, -55)!


<mbrionii imaturi sau maturi, ce vor constitui e'plantele pentru iniţiereaculturilorin vitro la ste%ar, se vor e'ciza din seminţe de ste%ar, recoltate înaintede maturizarea acestora, respectiv de căderea g indelor (1alada Ficolau, 0 )!A indele se sterilizează prin imersie în alcool etilic 8 2, timp de un minut,după care se imersează în ipoclorit de sodiu B /2 cu adaos de TMeen 0 ( 0 picături la ml), timp de 0 minute, procedură urmată de clătiri repetate cuapă distilată sterilă (. reprize a câte trei minute fiecare)!

9upă sterilizare g indele se vor secţiona, în condiţii aseptice, la ota cuflu' de aer laminar steril, şi se vor e'ciza embrionii ce vor fi inoculaţi pe mediiaseptice!

<mbriogeneza somatică la ste%ar poate fi indusă şi din e'plante foliare provenite de la lăstari epicormici! 1entru obţinerea acestor lăstari se prelevează,în luna $artie, ramuri de ste%ar, de la un arbore matur, şi se plasează pe unsubstrat steril, de obicei constituit din sol sau perlit! +egmentele de ramuri vorinduce formarea de lăstari din mugurii laterali e'istenţi, iar din frunzele acestorlăstari se vor fasona e'plante! ;ceste e'plante, inoculate pe medii de cultură

aseptice adiţionate cu fito ormoni vor genera formarea de embrioni somatici!Preg)#irea e+p a"#e or i a $e'i( (i 'e c( #(r)

+e pot utiliza ca e'plante embrioni zigotici imaturi triaţi pe . stadii dedezvoltare! nducţia embriogenă are loc, în general, la nivelul cotiledoanelor, petoată suprafaţa acestora, în cazul e'plantelor reprezentate prin embrioni imaturiîn stadiul , respectiv predominant în zona bazală, la e'plantele mai avansate!Randamentele medii ale inducţiei embriogene, pe stadii, pot fi cuprinse între

2 şi /* 2, cu variaţii semnificative în funcţie de stadiul de dezvoltare alembrionului zigotic imatur în momentul inoculării, randamentul inducţieiscăzând de la /.2 la stadiul , la sub .2 la stadiul şi la * 2 în stadiile

: şi :!esuturile embriogene se subcultivă pe mediu 10B cu ,. !0 mg4l @;1

şi pe mediu 10B fără fito ormoni, medii care s au dovedit propice pentrumultiplicarea ţesutului embriogen în condiţiile conservării capacităţiiembriogene pe timp îndelungat! nducţia embriogenă poate fi predominantdirectă, realizându se mai ales la baza şi pe suprafaţa cotiledoanelor embrionilor

zigotici imaturi! Conform observaţiilor microscopice, embriogeneza directă areloc pe baza unor proliferări epiteliale în urma cărora se organizează nodulii

0 /



embriogeni, care sunt în realitate embrioni în stadiul globular (C alupa, -55)!;ceştia evoluează până în stadiul cotiledonar precoce (cotiledoane translucidefoliacee şi clorotice) şi se multiplică prin embriogeneză adventivă repetitivă,formând colonii de embrioni precotiledonari şi cotiledonari, mai mult sau mai puţin compacte! ;glomerările embriogene se subcultivă pe mediu $+ 40 sau10B cu ,0 mg4l @;1, iar într o fază mai avansată a stabilizării, pe mediu fărăfito ormoni! #n acelaşi timp cu multiplicarea se va efectua şi purificareamecanică, prin eliminarea calusului neembriogen compact! Culturile embriogenede ste%ar, se prezintă sub formă de mici agregate de embrioni cotiledonari îndiferite stadii de dezvoltare, în care embrionii sunt mai uşor sau mai greuseparabili! 1entru realizarea unei culturi permanente de linii embriogene seefectuează lunar noi subculturi, pe mediu 10B lipsit de fito ormoni! ?a fiecaresubcultură, embrionii somatici cotiledonari de peste 0 * mm se izolează şi triazădupă mărimea şi consistenţa cotiledoanelor, cei mai avansaţi fiind trecuţi încondiţii de maturare! ?a ste%ar, conversia embrionilor în plantule are loc cu unrandament scăzut fata de cel al germinării!

;tunci când se iniţiază cultura de embrioni din e'plante foliare se vorfasona fragmente pătrate cu latura de apro'imativ cm ce vor fi plasate pemediu nutritiv cu faţa inferioară la suprafaţa mediului! #nainte de fasonare şiinoculare e'plantele se sterilizează prin imersie în alcool 8o timp de secunde, urmată de imersie în ipoclorit de calciu .2 timp de minute!#nlăturarea agentului de sterilizare se face prin clătiri repetate în apă distilată

sterilă (. clătiri)!<'plantele se vor inocula pe mediu A9 (Aupta şi 9urzan, -5.)cu10 µ M/l 2,4-D şi 2 µ M/l BAP sau GD cu 5 µ M/l ANA şi 5 µ M/l BAP.

Vasele de cultură v r !i i"cu#ate $" c "di%ii c "tr late dete&'eratură (22-24 )*, u&iditate (+0-+5 * şi lu&i"ă(! t 'eri adă 1 re lu&i"ă*.

niţierea culturilorin vitro din material biologic %uvenil permite producerea unui număr mare de plante cu o vitalitate crescută la diversegenotipuri necesare pentru menţinerea diversităţii genetice în ecosistemeleforestiere! +ursele potenţiale de e'plante pentru iniţierea unei culturi de ţesuturila ste%ar ar putea fi constituite din embrioni zigotici maturi şi imaturi! Culturilede embrioni zigotici reprezintă cele mai practice şi eficiente te nici demicropropagarein vitro la ste%ar! ;ceste te nici permit evitarea avortuluiembrionilor zigotici rezultaţi în urma polenizării libere sau controlate şi, deasemenea, induc ieşirea lor din starea de latenţă!

12.1.4 Micropropagarea a ar5ore e 'e a ea % Liriodendron tulipifera &

;rborele de lalea este un arbore originar din zona tropicală şisubtropicală a ;mericii de Ford, unde reprezintă unul dintre cei mai distinctivi

0 8



şi valoroşi arbori de esenţă tare şi unde a%unge la B . m înălţime! ?a noi în ţarăeste cultivat ca arbore ornamental în parcuri şi grădini! <ste un arbore înalt, cutulpina dreaptă, cilindrica, bine legată cu scoarţa gri înc is! Coroana are formaovoidală, cu frunze în formă de liră, mari de 8 0 cm lungime au patru lobidispuşi simetric, doi cate doi! 1e faţă au culoarea verde lucitor, iar pe dos verzidesc is sau verzi albăstrui! Toamna se colorează în galben auriu!

1eriantul de culoare galben verzuie are forma de lalea sau de crin (dingrecescul leirion S crin şi dendron S arbore), florile sunt ermafrodite cugineceul în poziţie superioară! #nfloreşte la sfârşitul lunii mai şi în luna iunie!3ructele au forma de conuri alungite! +pecia preferă ţinuturi cu clima moderată!+uportă bine gerurile dar, în tinereţe, este puternic afectată de îng eţurile târzii!<ste indicată în cultura pe soluri profunde, trofice, afânate, %ilave, pe cât posibilcu apa freatică la mică adâncime! Fu este rezistentă la secete prelungite!1rezintă o deosebită valoare ornamentală datorita frunzelor sub formă de liră,formei şi coloritului florilor, şi c iar a trunc iului! <ste indicat a se folosi în parcuri şi grădini, de a lungul aleilor, pe peluze în plină lumină, izolat, îngrupuri, la marginea grupurilor arborescente, cu un aspect ornamental deosebitîn amestec cu unele specii de $agnolia! 1rezintă o rezistenţă mare la poluareacu o'idul de sulf!

9eoarece mai puţin de 2 din seminţele de arbore de lalea sunt fertiles au depus importante eforturi pentru a pune la punct un protocol optim de producere de material clonal, care să constituie materialul semincer în înfiinţarea

de noi pepiniere! + au raportat mai multe modalităţi de micropropagare laarborele de lalea, cum ar fi microbutăşirea, cultura de rădăcini şi lăstărireaa'ilară multiplă! Fu s au obţinut rezultate notabile din microbutăşire decâtatunci când s au prelevat vârfuri de creştere de la plante aflate la intrarea învegetaţie!

Cele mai mari succese, în micropropagarea arborelui de lalea, s auobţinut atunci când s a indus embriogeneza somatică! 9ar, ca la toate speciilelemnoase la care s a reuşit regenerareain vitro prin embriogeneza somatică, celmai mare impediment implicat de această metodă este faptul că iniţierea

culturilor de ţesuturi în vederea inducerii embriogenezei somatice la arborele delalea presupune folosirea embrionilor zigotici imaturi, a căror valoare geneticănu este cunoscută cu e'actitate! Totuşi, c iar şi în ciuda impedimentului descrismai sus, acest sistem de cultură este optim pentru arborele de lalea, fiind unimportant instrument în transformarea genetică prin metoda biolistică sau de agenera protoplaşti (Rug şi colab, --5)!

$icropropagarea arborelui de lalea prin sistemul de embriogenezăsomatică, presupune trecerea culturilor embriogene printr o fază intermediară,rar raportată la speciile lemnoase, şi anume prin faza de masă preembriogenă

(7alperin, -//)! +tadiul de masă preembriogenă se crede a fi caracterizat dee'istenţa unor preembrioni într un stadiu incipient de dezvoltare, şi trecerea lor

0 5



prin cicluri repetitive de proliferare, ceea ce duce la formarea unei mase mari de preembrioni! ;ceastă proprietate, face ca arborele de lalea să fie pretabil laînmulţirea clonală prin sistemul embriogen şi la transformarea genetică prinmetoda biolistică!


Cele mai multe dintre culturile embriogene la speciile lemnoase, pornescde la ţesuturi embrionare sau plantule în stadiul incipient de dezvoltare, cu doardouă frunzuliţe! &nul din factorii ce se dovedesc a fi cei mai importanţi şi criticiîn iniţierea cu succes a culturilor embriogene la multe specii, dar mai ales laspeciile lemnoase, este stadiul de dezvoltare al embrionului zigotic sau seminţei,atunci când se inoculează pe mediul de cultură! #n ma%oritatea cazurilor, s aobservat că embrionii imaturi prezintă cea mai mare rată de regenerare şi de producere a embrionilor somatici comparativ cu embrionii zigotici maturi sauseminţele încolţite!

3ructele imature de arbore de lalea, de culoare verde gălbuie, serecoltează la apro'imativ opt săptămâni de la înflorire! +e taie agregatelesemincere în două, pe lungime! +e izolează seminţele, care sunt samare şi seîndepărtează aripioarele! +eminţele, de la care vor fi e'cizaţi embrionii imaturi,în vederea iniţierii culturiiin vitro , se sterilizează prin imersie în alcool 8 2timp de 0 secunde urmată de imersie în ipoclorit de sodiu 2 timp de 0 .

minute şi apoi de clătiri repetate (* . reprize) în apă distilată sterilă, a câte treiminute fiecare, după care se imersează în acid clor idric , F timp de *minute! +e clătesc din nou în apă distilată sterilă, trei reprize a câte trei minutefiecare!


+amarele se secţionează cu a%utorul unui bisturiu ascuţit pentru a izolaconţinutul lor, şi anume embrionul şi endospermul! <mbrionii imaturi împreună

cu endospermul se plasează la suprafaţa mediului de cultură bazal $+ adiţionatcu 0mg4l 0,B 9 şi ,0.mg4l @;1 şi transferaţi pe acelaşi tip de mediu proaspăt odată pe lună! :asele de cultură vor fi bine izolate la gură şi incubate în camerelede creştere, la 0.oC, la întuneric!

?a sfârşitul primei luni de subcultură, se observă, la unele e'plante,apariţia unor formaţiuni calusare de dimensiuni mici, care de obicei nu suntmorfogenice! ;cestea împreună cu embrionii care le au generat se vor transfera pe acelaşi tip de mediu de cultură! ?a sfârşitul celei de a doua luni de cultură,va apărea un ciorc ine nodular de celule, de culoare gălbuie, care formează

masele preembrionare! 9acă se doreşte continuarea proliferării de celule, masele preembrionare se vor subcultiva pe acelaşi tip de mediu, iar dacă se doreşte

0 -



inducerea formării embrionilor somatici se vor transfera pe medii cu oconcentraţie foarte mică de au'ină sau c iar fără fito ormoni! <mbrionii aflaţi înstadiul globular pot fi cu uşurinţă identificaţi datorită aspectului lor neted şilucios, comparativ cu masele preembrionare ce au aspect neregulat, rugos!

1entru germinarea embrionilor somatici şi obţinerea de plantule, aceştiavor fi transferaţi pe mediul de cultură proaspete, fără ormoni şi c iar fără

idrolizatul de cazeină! Culturile de embrioni vor fi incubate în condiţiicontrolate, la temperatura de *oC şi fotoperiodism de / ore lumină!Rezultatele pot fi cuantificate după apro'imativ două săptămâni, când seobservă că unii embrioni au format rădăcinuţe şi4sau frunzuliţe!

9upă aclimatizare, plantulele crescute în g ivece mici trebuie să producăîn medie o frunză pe săptămână şi să dezvolte, după apro'imativ şase săptămâni,un sistem radicular bogat ramificat, cu rădăcini de . cm lungime!

12.1.6 Micropropagarea a car#o7 % Solanum tuberosum L&

Cartoful este una din cele mai importante plante în alimentaţia omului şia animalelor, ocupând locul patru în lume, după orez, grâu şi porumb! <ste ospecie la care metodele biote nologice au fost aplicate cu succes! 1lante liberede boli, somaclone, aploizi şi ibrizi somatici, plante rezistente la mană,nematozi, tolerante la erbicide, microtuberculi obţinuţiin vitro au ieşit dinlaborator, în câmp şi astfel o serie de soiuri de cartof înmulţite clonal au fost

propagate pe scară largă în diferite ţări (@a%a%, -58 )!#n consecinţă, la cartof, te nologiain vitro , combinată cu practiciletradiţionale de producere a tuberculilor, a permis producerea comercială de

sămânţă> liberă de boli (microtuberculi şi minituberculi)!<forturile au fostîndreptate şi în direcţia perfecţionării metodelorin vitro pentru depozitarea petermen lung a germoplasmei la cartof, prin crioconservare! $anipularea genetică prin culturi de celule şi ;9F recombinat sunt câteva căi folosite în ameliorareain vitro a calităţilor nutriţionale ale tuberculilor de cartof, precum şi pentrucreşterea producţiei culturilor de cartof!

$icropropagarea cartofului se poate face pe mai multe căiI formarealăstarilor adventivi, lăstărirea a'ilară multiplă şi embriogeneza somatică!?ăstarii adventivi pot fi obţinuţi prin organogeneză directă sau indirectă, ultimultip fiind asociat însă cu o instabilitate genetică evidentă! #n cazul cartofului, ratade multiplicare este mai rapidă în mediu lic id comparativ cu mediul solid!$icrobutaşii pot genera rădăcini putând fi plantaţi în câmp pentru multiplicare!

"bţinerea de microtuberculi a constituit un aspect cu deosebită rezonanţăîn producerea de material săditor la cartof! $icrotuberculii au dimensiuni mici(* 5 mm) şi o greutate medie de , . , .g fapt ce le permite să fie produşi în

laborator (in vitro ) într un număr mare indiferent de sezonL pot fi uşor

0



depozitaţi, împac etaţi şi e'pediaţi (@a%a%, -58L C iru şi colab, --8L C iru--5)!

Culturain vitro de celule şi ţesuturi, este utilizată în vederea multiplicăriişi propagării unor genotipuri valoroase, pe lângă importante avanta%eeconomice, are şi o deosebită însemnătate ştiinţifică! 1ractic într un an se potobţine zeci, sute de mii, c iar milioane de plante, utilizate ca material săditorsănătos!

?a noi în ţară preocupări privind micropropagareain vitro a cartofului secunosc din anul -5*, când Cac iţă şi colab! au început devirozarea şimultiplicarea unor linii de cartof produse la !C!1!C! @raşov! #n lucrarea citată afost prezentată posibilitatea devirozării culturilor de cartof pornind de lae'plante din oc i> de cartof, plantate în g ivece! 9e la plantele de cartofdezvoltate din aceşti oc i> au fost apoi prelevate meristeme caulinare, apicaleşi laterale! Cultivareain vitro a anterelor, respectiv a polenului fenomen numitandrogeneză, a condus la obţinerea de plante aploide la cartof! 1lante aploideau fost obţinute şi prin culturile de ovule sau saci embrionariin vitro , te nicădenumită ginogeneză! 1racticile moderne de multiplicarein vitro asigură nunumai obţinerea în scurt timp a unui număr infinit de plante, ci şi stocareamaterialului vegetal şi conservarea lui pe o durată mai lungă sau mai scurtă detimp în aşa numitele bănci de gene!

1roblema principală care se ridică în cazul micropropagării plantelor esteaceea a obţinerii unor clone identice cu planta mamă donatoare, fără alterarea

zestrei genetice şi a calităţii genotipului supus micromultiplicării pentru ca înfinal să se înfiinţeze culturi omogene, de cea mai bună calitate, parametriimposibil de atins prin procedee tradiţionale (Cac iţă, -58)!


1rincipalele tipuri de e'plante de la care se porneşte în iniţierea uneiculturi de ţesuturi la cartof sunt constituite de mugurii din tuberculii de cartofsau colţi, din care se pot regenera direct lăstari sau din care sunt prelevate

meristeme, în cazul în care se porneşte de la material donor bolnav, reuşindu seastfel să se obţină regeneranţi sănătoşi! 9e asemenea, izolarea de meristeme se poate face direct din vârfuri în creştere, cu dezavanta%ul că sterilizarea acestorase face mai greoi decât în cazul colţilor!

1entru înmugurirea cartofului acesta trebuie să treacă printr o perioadăde minim B săptămâni de temperaturi scăzute, fapt ce se poate realiza artificial prin ţinerea acestora la frigider (BoC), la întuneric, după care vor porni învegetaţie!

" altă metode de stimulare a înmuguririi cartofilor prevede imersia

tuberculilor în fito ormoni, din clasa giberelinelor, o perioadă de timpdeterminată e'perimental! ;stfel, tuberculii de cartof se taie în fragmente de

0



0 g, deţinând 0 oc i! 3ragmentele astfel obţinute sunt ţinute într o soluţie deA; * g4l timp de o oră, pentru a scoate mugurii din repausul vegetativ, dupăcare sunt plantaţi în vermiculit steril! ?ăstarii formaţi din oc i, după ce atinglungimea de * centimetri servesc la prelucrarea de e'plante meristematice de ,.cm!


Ranalli ( --8) a raportat o metodă tipică de multiplicare a cartofului şianume multiplicarea prin minibutaşi! $inibutaşii sunt fragmente de lăstarialcătuite dintr un singur nod, cu lungimi de . mm! ;ceştia sunt inoculaţi pemediu de cultură solidificat şi vor genera din mugurii a'ilari câte plăntuţă!1lăntuţele vor fi multiplicate prin fragmentarea lor în segmente de B mmincluzând un nod şi %umătate din internodurile vecine, şi subcultivarea lor încă patru săptămâni pe mediu de multiplicare! Rata multiplicării este de * . ori lafiecare patru săptămâni!

$ediul bazal pentru cultura fragmentelor uninodale este constituit dinsăruri $+ ($uras ige +Koog, -/0), za aroză, mioinozitol, tiamină 7Cl şi agar!3itoregulatorii sunt omişi în general deoarece pot genera alte tipuri de ţesut(calus), iar p7 ul mediului este a%ustat la .,8, dar poate varia între .,0 /,.conform lui Hones ( -55)!

?ăstărirea a'ilară multiplă la cartof este o metodă folosită şi raportată

pentru prima dată de 9odds şi colab! ( --0)! 3ragmentele de tulpină de pe cares au înlăturat trei sau patru noduri bazale (deoarece frunzele acestora sunt preamari) sunt plasate într un vas adânc de ml ce conţine . ml de mediu decultură lic id! 9upă 0 * săptămâni, în fiecare vas se vor diferenţia / 8 denoduri! :asele vor fi incubate în condiţii controlate de temperatură, lumină şiumiditate, pe un agitator la 5 rotaţii pe minut! ?ăstarii generaţi vor fifragmentaţi în segmente ce vor conţine / noduri fiecare şi plasaţi în vase de plastic cu . ml mediu solid urmând a fi incubaţi în camera de creştere pe rafturimetalice!

Cultura de muguri adventivi se face la cartof pe medii lic ide în bioreactoare cu air lift> sau în vase plasate pe un agitator mecanic! <'plantelesunt constituite din lăstari cu un singur nod proveniţi de pe plăntuţe generate invitro> în urma culturii de meristeme, care au primit certificarea că sunt libere deviroze! $ediul de cultură folosit este alcătuit din macro şi microelementele prevăzute în reţeta mediului $+, adiţionat cu vitamine, in ibitori de creştere(etilena) şi citoc inine, pentru a permite doar proliferarea numărului de lăstari şinu creşterea acestora! 9upă * B săptămâni se observă obţinerea unei mase demeristeme ce vor avea frunzele şi tulpinile mult reduse! ?ăstarii astfel obţinuţi

vor fi fragmentaţi şi trecuţi în continuare în bioreactor pentru multiplicare sau peun mediu solid fără citoc inine şi in ibitori de creştere pentru alungire! <ventual

0 0



se poate adăuga în mediu A;* (acid giberelic) pentru stimularea alungiriiinternodurilor!

$icrotuberculii sunt tuberculi miniaturali produşi în cultura in vitro>,iar minituberculii sunt tuberculi mici produşi e' vitro> în condiţii controlate din propaguli proveniţi din cultura in vitro>!

9eşi minituberculii sunt mai mari ( g) decât microtuberculii ( , 0Bg),ambii sunt cu mult mai mici decât materialul semincer clasic ce cântăreşte între. 8 g4tubercul!

$icrotuberculii se pot dezvolta în vase de cultură pe muguriiminibutaşilor (+eabrooK şi colab!, --*), pe lăstari (?eclerc, --B) sau pemuguri adventivi (Oiv şi + emes , --/) şi pot fi produşi pentru o largă paletăde cultivare!

Cea mai simplă şi eficientă metodă de producere a microtuberculilor afost descrisă de <strada şi colaboratorii săi în -5/, şi consta în cultivarea unorfragmente de tulpină în vase de 0. ml cu 0 ml mediu de cultură lic id! $ediulde cultură conţine macroelemente şi microelemente $+L ,B mg4l tiamină 7ClL0 mg4l pantotenat de CaL ,B mg4l A;*L ,. mg4l @;1L , mg4l ;F;L mg4l mEo inositol şi 02 za aroză! :asele de cultură sunt amplasate pe unagitator la / rpm în condiţiile unui fotoperiodism de / ore lumină! 9upă 0 *săptămâni plăntuţele dezvoltate sunt subcultivate pe un mediu specific pentruinducerea tuberizării, ce conţine pe lângă sărurile $+ şi ,B mg4l tiaminăL mg4l mEo inositolL . mg4l @;1L . mg4l CCC (clorid clorclorină), ,82 agar

şi 52 za aroză! Culturile vor fi incubate pe rafturi, la întuneric, la temperaturade 00oC, timp de B de zile!3actorii care influenţează iniţierea tuberizării sunt I genotipul, condiţiile

de mediu (lumina, temperatura), mediul de cultură, azotul şi regulatorii decreştere!

$inituberculii sunt tuberculi mici proveniţi din microtuberculi sau plăntuţe care sunt plantate în densitate crescută pe paturi nutritive în casa devegetaţie, în condiţii controlate! $ărimea şi numărul minituberculilor depind desoi, condiţiile de mediu, anotimp, mediul de cultură, densitatea de plantare şi

modul de îngri%ire!Creşterea densităţii de plantare duce la creşterea numărului deminituberculi pe m0 şi la scăderea dimensiunii acestora! Ui înfometările repetate,dar nedistructive, duc la creşterea numărului de minituberculi pe m0, dar scad deasemenea dimensiunile acestora! ;stfel, ?ommen şi +taniK ( --0) au raportat căînfometarea în trei reprize duce la o producţie de 5 de minituberculi pe m0,cu o greutate de 0 g, iar neînfometarea a dus la obţinerea de *. deminituberculi4m0, dar cu o greutate medie de .g!

#n continuare minituberculii vor fi plasaţi în câmp conform unei sc eme

de producere de sămânţă, iar factorul ma%or pentru rezistenţa şi performanţaacestora în noile condiţii este mărimea lor! Tuberculii mici au o perioadă de

0 *



latenţă mai lungă, pornind mai târziu în vegetaţie, cu lăstari subţiri şi sensibili lafactorii de stres şi cu rezerve nutritive scăzute! Areutatea minimă necesară unuiminitubercul în câmp este de ,. g!

$inituberculii %oacă un rol important în reducerea ciclurilor de producere a materialului semincer la cartof! 9e e'emplu, în srael, cartoful RV9?td, produce material semincer pentru comercializare în doi ani! #n primul an plăntuţele sau microtuberculii cu câte 0 lăstari sunt plasaţi în casa de vegetaţie lao densitate de . 0 indivizi pe metru pătrat, în funcţie de cultivar! 1lăntuţele produc între 0 de minituberculi 4 m0 cu diametrul de 0 B mm, iarmicrotuberculii produc cu . 2 mai mult decât acestea! #n anul al doilea,minituberculii sunt plantaţi în sol sub o plasă impermeabilă insectelor! Culturaeste înfometată păstrată în condiţii optime şi apoi replantată în câmp în acelaşian! +ămânţa pentru comercializare este vândută în al treilea an cu 0. * dolari pe tonă, ceea ce este cu mult sub preţul de cost al materialului semincerimportat!

0 B

Micropropagarea La Specii

Documents

Transcript of Micropropagarea La Specii