Noţiuni elementare de microbiologie specială

Genul StaphylococcusDiagnostic de laborator = diagnostic bacteriologic

1. Recoltare

- puroi din leziuni deschise – recoltare cu pipeta Pasteur, ansa bacteriologică, tampon,

instrumente chirurgicale sterile

- din leziuni închise – se colectează prin puncţie cu o seringă sterilă cu ac gros

- exsudate nazale & faringiene, secreţii otice, conjunctivale, spută, urină, secreţie

vaginală / uretrală / de col uterin, sânge, lichid peritoneal, LCR, lichid de puncţie

articulară, material necroptic, materii fecale, vomismente

- probe de aliment incriminat în declanşarea toxiinfecţiei alimentare (TIA)

- pt depistarea purtătorilor de stafilococ patogen în rinofaringe – EF şi EN cu tampoane

sterile

Precauţii – evitarea contaminării (prezenţa naturală a stafilococilor pe piele poate duce cu

uşurinţă la apariţia unor dificultăţi în interpretarea datelor de laborator)

2. Transportul probei

- proba recoltată trebuie însămânţată în cel mult 2 ore de la recoltare.

3. Examenul direct microscopic al produsului patologic

- valoare orientativă, în special în produsele normal sterile (LCR, lichid articular,

secreţie bronşică recoltată prin puncţie traheală) – diagn. de certitudine rămâne cel

prin cultivare şi identificare

- se fac frotiuri colorate albastru-de-metilen şi Gram

- Frotiuri Gram – coci Gram-pozitivi, grupaţi în ciorchine, intra-/extracelulari, alături

de alţi germeni Gram-pozitivi, Gram-negativi, leucocite, detritusuri celulare

4. Izolare şi identificare

mediul pe care se face însămânţarea trebuie ales în funcţie de tipul probei clinice

(intens/moderat contaminată sau necontaminată)

- intens contaminate – fecale, vomă, alimente

- moderat contaminate – spută

- necontaminate – LCR, lichide de puncţie, urină, sânge (hemocultură)

- probele intens şi moderat contaminate se însămânţează pe medii cu proprietăţi

selective: mediul hiperclorurat lichid şi hiperclorurat solid (Chapman), ulterior

făcându-se dispersie pe geloză-sânge

- celelalte probe pot fi însămânţate direct pe bulion sau geloză - sânge

Citire şi interpretare:

- bulion – stafilococii tulbură uniform mediul, formând depozit la fundul tubului

- geloză – colonii mari, 1-2mm diametru, bombate, opace, rotunde, cu margini

regulate, cu suprafaţă netedă sau uşor neregulată, de consistenţă moale, care se

detaşează uşor de pe mediu

- geloză-sânge – S. aureus – colonii rotunde, de tip S, alb-cremoase, cu zonă de

hemoliză completă; S. epidermidis – colonii mai mici, non-hemolitice; S.

saprophiticus – colonii ceva mai mari.

- Pe mediu Chapman – Staf. patogeni manito-pozitivi – colonii galbene care virează şi

culoarea mediului în galben.

- ! identificarea stafilococilor doar pe baza morfologiei coloniei nu este recomandată

Identificare

Testul catalazei - stafilococii = catalazo-pozitivi (efervescenţă la contactul cu o

picătură de perhidrol diluat)

Cercetarea caracterelor de patogenitate

a) in vitro

pigmentogeneza

- însămânţarea stafilococilor pe mediu cu ser (mediu Löffler) sau pe geloză nutritivă cu

10% lapte, în prezenţa aerului, favorizează producerea de pigment

- 3 tipuri de pigment - S. aureus – pigment galben-auriu

- S. saprophyticus - pigment citrin

- S. epidermidis - pigment alb

testul hemolizei

- pe medii geloză-sânge – hemoliză totală la S. aureus

fermentarea manitei

- stafilococii patogeni fermentează manita pe mediu Chapman solid sau apă

peptonată turnesolată cu manită 1%, fermentarea manitei obiectivându-se prin

acidifierea mediului şi virajul culorii indicatorului. Stafilococii patogeni (S. aureus)

dezvoltă pe medii solide colonii galbene, cei care nu fermentează manita (SCN)

produc colonii roz-roşcate.

testul coagulazei

- permite diferenţierea S. aureus (= coagulazo-pozitiv) de ceilalţi stafilococi coagulazo-

negativi (SCN)

- coagulaza - liberă – enzimă eliberată în mediu – acţionează asupra factorilor

coagulării

- legată (clumping factor, receptor pentru fibrinogen)

Testul pe lamă

- o picătură de apă distilată în care se suspendă o colonie de stafilococi (suspensia să

fie foarte densă şi uniformă) se adaugă o picătură de plasmă nediluată, proaspătă

- reacţie pozitivă – în 15-20 secunde apar aglutinate

- reacţie negativă – absenţa aglutinării în 2-3 minute – trebuie confirmat rezultatul prin

testul în tuburi

Testul în tuburi

- 0,5ml plasmă oxalatată + 0,1ml cultură de 16-20h în bulion

- 2 martori – Stafilococ coagulazo-pozitiv (S. aureus)

- SCN (S. epidermidis)

- păstrare la 37°C – examinare la 30 min, 60 min, 4 h pentru constatarea coagulării

- reacţie pozitivă – coagulare, indiferent de gradul ei (în masă, văl de fibrină)

- reacţie negativă – absenţa cheagului

testul fibrinolizinei

- stafilococii patogeni secretă fibrinolizină care lizează coagulul de plasmă format de

coagulază

- prezenţa enzimei se pune în evidenţă prin însămânţarea tulpinii de stafilococ într-un

mediu cu 7 părţi geloză nutritivă şi 1 parte plasmă oxalatată – incubare 12-18h la

37°C – în jurul coloniilor de stafilococi se observă o zonă clară datorită topirii

coagulului de plasmă produs de coagulază.

testul fosfatazei

- stafilococii patogeni secretă fosfatază – scindează molecula de fosfat

b) in vivo – inoculare la animale de laborator – acţiunea dermonecrotică a toxinei

stafilococice.; iepurele este animalul cel mai sensibil – injectat iv – septicemie

mortală; injectat sc sau im – abcese localizate.

Cercetarea sensibilităţii la acţiunea bacteriofagilor - lizotipia

- principiu = o celulă bacteriană poate fi sensibilă la unul sau mai mulţi bacteriofagi→

aceasta presupune atât existenţa unor receptori pentru fiecare bacteriofag pe suprafaţa

celulei bacteriene (care asigură posibilitatea de fixare a acestuia), cât şi permisivitatea

celulei bacteriene faţă de toate etapele ciclului litic de multiplicare a bacteriofagului.

- Susceptibilitatea diverselor tulpini la acţiunea litică a bacteriofagilor este

sistematizată într-un sistem de lizotipie bacteriofagică.

- Receptorii pentru bacteriofagi existenţi în peretele celular al microorganismelor

aparţinând aceleiaşi specii bacteriene variază în funcţie de tulpină; celulele bacteriene

care posedă aceiaşi receptori se încadrează în acelaşi grup fagic.

- Lizotipia poate fi aplicată numai tulpinilor patogene de stafilococ coagulazo-pozitiv

(SCN nu sunt susceptibili la acţiunea preparatelor bacteriofagice folosite în lizotipie)

- În practică, lizotipia stabileşte mai mult un diagnostic individual de tulpină şi mai

puţin un diagnostic de tip, pentru că o tulpină de stafilococ izolată într-un produs

patologic poate fi lizată de câţiva din bacteriofagii standard folosiţi în lizotipie – nu e

metodă de clasificare, ci doar epidemiologică

- ! o tulpină de stafilococ îşi păstrează constant tipul bacteriofagic, chiar şi în condiţiile

trecerii succesive de la bolnav la purtător şi invers – e posibilă urmărirea filiaţiei

cazurilor

- Tehnică de lucru – se pune în contact tulpina de cercetat cu un set de bacteriofagi

standard; notarea sensibilităţii se face prin numărarea plajelor de liză; dacă tulpina e

sensibilă la bacteriofagul respectiv apar plaje de liză.

Bacteriocinotipie (tipizarea tulpinilor după capacitatea de a produce bacteriocine)

Genotipie

Antibiograma – obligatorie

Genul StreptococcusDiagnosticul de laborator în angina streptococică determinată de S. pyogenes (streptococul β-hemolitic de grup A)Diagnostic bacteriologicRecoltare- exsudat faringian (pacientul nu trebuie să fi mâncat, să fi băut, să se fi spălat pe dinţi

sau să fi mestecat gumă înainte de recoltare)

- transport – 4 ore (se poate transporta în mediu Pike – mediu selectiv şi de îmbogăţire)

Examenul direct microscopic al produsului patologic

- valoare orientativă (nu se face de rutină) – diagn. de certitudine rămâne cel prin

cultivare şi identificare (pe frotiu colorate Gram streptococii apar sub formă de coci

Gram-pozitivi, sferici, izolaţi sau grupaţi în perechi / lanţuri, alături de alţi germeni

Gram-pozitivi, Gram-negativi, leucocite (PMN), detritusuri celulare)

Izolare şi identificare

- epuizare pe geloză-sânge – 24 h la 37 °C – se urmăreşte prezenţa şi numărul coloniilor

β-hemolitice (suspiciune de S. pyogenes) – dacă sunt prezente – se face testul la

bacitracină.

- frotiu din cultură – coci Gram +, sferici sau ovalari, dispuşi în lanţuri de diferite

lungimi

Testul catalazei

- streptococi = catalazo-negativi

Susceptibilitatea la bacitracină

- diferenţiază streptococii de grup A de cei non-A

- streptococii grup A sunt sensibili la bacitracină (0,04U) – zonă de inhibiţie mai mare

sau egală cu 10mm

- nu este test de certitudine 100% (există tulpini non-A care pot fi sensibile la

bacitracină) – identifică prezumptiv un izolat de S. pyogenes.

- Se foloseşte doar pentru culturi pure (cultură însămânţată uniform pe agar-sânge; disc

de bacitracină în contact complet cu agarul; incubare la 35°C, 18-24h)

- Interpretare - pozitiv – zonă de inhibiţie în jurul discului de bacitracină

- negativ – creştere uniformă a culturii până la marginea discului.

Diagnosticul de grup de certitudine – punerea în evidenţă a Ag specific de grup – reacţie

de aglutinare pe lamă

Antibiograma- S. pyogenes – sensibil la Penicilină – tratament de elecţie (antibiograma nu e

obligatorie atunci când se izolează un streptococ β-hemolitic)

Diagnostic serologic Reacţia ASLO

= determinarea anticorpilor antistreptolizină O- metodă standardizată folosită pt diagnosticarea infecţiilor poststrepto (inclusiv complicaţii tardive)

Materiale necesare:-ser limpede şi nehemolizat, inactivat 30 min la 56°C- hematii de iepure recoltate pe perle din vena marginală a urechii resuspendate în sol. clorurată izotonică 5%- SLO (streptolizină O)

- Se fac diluţii 1/100 şi 1/500 din serul de cercetat, se repartizează în tuburi, se completează cu sol. clorurată izotonică ad 1ml şi se adaugă în fiecare tub câte o unitate combinantă de SLO în volum de 0,5ml.- 37°C 15 min- se adaugă sol. de hematii de iepure, se agită, se lasă la baie încă 45 min- se face o primă citire imediat, apoi se lasă peste noapte la frigider - ultimul tub în care hemoliza lipseşte complet indică titrul exprimat în unităţi /ml.

InterpretareSe consideră pozitiv un titru > 200u/ml

Streptococcus pneumoniae (pneumococul)Recoltare - exsudat nazo-faringian, LCR, sânge, spută…..

Transport - însămânţare rapidă pe mediu sau transport în mediu Stuart.

Examen microscopic al produsului patologic

- diplococi Gram-pozitivi, cu capete ascuţite (aspect ovalar sau lanciolat)

- capsula evidenţiabilă cu coloraţia Hiss sau albastru de metilen

IzolareCaractere de cultivare- medii de cultivare: bulion infuzie cord-creier, agar-tripticază de soia, agar chocolat; unele izolate au nevoie de atmosferă de CO2.

- streptococ α-hemolitic

- coloniile tinere – rotunde, umede, mucoide, bombate, strălucitoare

- coloniile mai vechi – autoliză – colaps al centrului coloniei.

Identificarea – importantă este diferenţierea S. pneumoniae de S. viridans (tot α-hemolitic)

Sensibilitatea la optochin

- test ce diferenţiază S. pneumoniae de alţi α-hemolitici

- însămânţez colonia deja izolată pe agar-sânge – plasez un disc de optochin (=etil

hidrocuprein – hidroclorid) în centrul plăcii – apariţia unei zone de inhibiţie în jurul

discului denotă sensibilitate la optochin, ceea ce îi este caracteristic lui S. pneumoniae

(diametrul zonei de inhibiţie depăşeşte 14mm). Un rezultat negativ (adică lipsa zonei

de inhibiţie = creştere bacteriană până la marginea discului, sau diametrul zonei sub

14mm) este caracteristică celorlalţi streptococi α-hemolitici.

Testul bilolizei

- principiu – inducerea şi accelerarea autolizei pneumococilor de către bilă sau săruri biliare

- reacţia se face în tuburi

- tulpină capsulată de S. pneumoniae în bulion + dezoxicolat de Na liză soluţia se clarifică

- alţi streptococi α-hemolitici + dezoxicolat de Na NU liză soluţie cu aspect floconos

Testul (reacţia) de umflare a capsulei

- poate fi folosit pentru identificarea directă a pneumococului în spută, LCR

- se amestecă produsul patologic (specimen clinic sau colonie izolată) cu ser anti-

pneumococic + albastru de metilen – se examinează cu obiectivul cu imersie – reacţie

pozitivă când pneumococii sunt amestecaţi cu antiserul capsular omolog – capsula

devine umflată şi retractilă

Teste de apreciere a virulenţei – inoculare la şoareci

Identificare de tip – reacţii de aglutinare cu seruri specifice

Antibiograma

- ! - multirezistenţă la antibiotice

Genul NeisseriaDiagnosticul de laborator în infecţia cu meningococ (Neisseria meningitidis) Caractere generale- coci ovalari, cu diametru de 0,6-1μm, dispuşi în diplo, cu feţele adiacente aplatizate

sau uşor concave. Pot fi dispuşi în tetrade (în cultura foarte tânără) sau izolaţi. In

cultura veche, datorită procesului de autoliză, pe frotiu se pot observa bizarerii (frotiu

necaracteristic). Capsulaţi în produsul patologic (LCR, sânge) – în exsudate sunt

necapsulaţi. Sunt imobili, nesporulaţi.

Diagnostic de laborator Recoltare- LCR, sânge, lichid de puncţie, exsudat nazofaringian… Transport- bacterii extrem de “fragile” – e bine să se izoleze în cultură cât mai repede (ideal – în

maximum 15 minute de la recoltare). Până atunci se păstrează la temperatura camerei, nu în termostat unde e grăbit procesul de autoliză, nici în frigider unde sucombă. Dacă se ştie că însămânţarea nu poate fi făcută rapid – se păstrează în mediu de transport (Stuart) maximum 3 zile.

Examen microscopic al produsului patologic- diplococi Gram-negativi, ca boabele de cafea, intra sau extra celulari…..

Izolare şi identificare

LCR – mod de lucru:

- se recoltează prin puncţie lombară, suboccipitală, ventriculară (la copiii f. mici).

- 5-10ml la adult, 2-3 ml la copil

- se examinează macroscopic: LCR în tensiune, tulbure-purulent, aspect de “zeamă de

varză”.

- Se centrifughează – se separă supernatantul de sediment

- Din supernatant se fac reacţii biochimice – proteine (hiperalbuminorahie), glucoză

(hipoglicorahie), electroliţi (hipoclorurorahie) …- şi se încearcă determinarea directă

a polizaharidului capsular (există truse comerciale pt reacţii de aglutinare sau co-

aglutinare care conţin reactivi bazaţi pe polizaharidele celor 3 germeni cel mai

frecvent incriminaţi în etiologia meningitelor: S. pneumoniae, N. meningitidis,

Haemophilus influenzae).

- Din sediment –frotiu colorat Gram / albastru de metilen / Giemsa

- Pe frotiul Giemsa se analizează celularitatea – PMN 100%, întregi şi alterate.

Însămânţare pe medii neselective (geloză-sânge, geloză-chocolat), mediu Mueller-

Hinton, sau medii selective (Thayer-Martin, New York city modificat). Pt izolarea

neisseriilor din prelevate contaminate e recomandat să se utilizeze în paralel două medii

(unul selectiv şi unul neselectiv). Se însămânţează pe medii încălzite. Se incubează la

37°C, în atmosferă de 5-8% CO2.

- neisseriile patogene dezvoltă colonii vizibile după 24h, însă citirea optimă este la 48h,

iar plăcile nu trebuie aruncate decât după 72h de observaţie.

- dacă sunt cultivaţi pe mediu fără sânge – colonii transparente, cu diametru de 1-2 mm

(sau mai mic), suprafaţă convexă, netedă, în cultură proaspătă emulsionează uşor cu

ser fiziologic

- pe medii cu sânge – colonii cu aspect gris-lucios (unele gălbui, altele albicioase).

Obs: dacă se recoltează sânge (în septicemii) se fac minimum 2 hemoculturi (recoltare în

febră şi frison) şi se însămânţează pe mediu BHI (bulion cord-creier)

Identificare – Reacţia oxidazei

- metoda Kovacs - se foloseşte un reactiv lichid (tetrametil p-fenilendiamina) – se

impregnează o hârtie de filtru – cu ansa sau pipeta Pasteur se ia o cantitate de cultură

şi se descarcă pe hârtia de filtru. Reacţie pozitivă culoare roşu-purpur (mov-

albastru) în 5-10 secunde.

Diferenţierea speciilor de Neisseria prin caractere metabolice

- utilizarea oxidativă a zaharurilor (glucoză, fructoză, maltoză, zaharoză, lactoză) -

fermentează glucoza şi maltoza

- reducerea nitraţilor şi a nitriţilor

- producerea de dezoxiribonuclează

- sinteza de polizaharid din zaharoză

Serogrupare

– la noi circulă serogrupurile A, B, C, D, X, Y, Z.

- iniţial fac testarea cu 2 seruri polivalente (ABC, DXYZ) şi cu ser fiziologic

- dacă se produce aglutinare

- cu serul fiziologic tulpină autoaglutinabilă

- cu ambele seruri polivalente tulpină poliaglutinabilă

- cu 1 ser polivalent se testează cu serurile monovalente corespunzătoare

se obţine grupul.

- Serotipaj & serosubtipaj – ELISA cu anticorpi monoclonali

- MLST (multilocus enzyme electrophoresis) – la nivelul membranei citoplasmatice

există enzime pe baza cărora, prin această tehnică, meningococii sunt clasificaţi în

electrotipuri. Se poate stabili clona din care au provenit.

- PCR – detectează direct meningococii din LCR.

Antibiograma

Diagnostic de laborator în infecţiile gonococice (Neisseria gonorrheae)

Diagnostic microbiologic

Recoltare

la femei – din canalul endocervical, uretră, vagin (din fundul de sac posterior – numai la

femeile histerectomizate), rect, orofaringe.

La bărbaţi heterosexuali – din uretră

La homosexuali – din uretră, rect şi orofaringe.

Transport

tamponul cu produsul patologic trebuie introdus imediat în mediu de transport (mediu

non-nutritiv de tip Stuart sau Amies sau un mediu selectiv), nu înainte de a fi întins

un frotiu (din produs patologic). Rata de izolare a gonococului după transport în

medii non-nutritive la 25°C ajunge la 100% în primele 12 h de la recoltare.

Examinare microscopică

frotiu colorat albastru de metilen – diplococi + celule inflamatorii

frotiu colorat Gram – diplococi Gram-negativi “în boabă de cafea” intracelulari + PMN.

Atenţie – aşa arată un frotiu în faza acută a bolii. Când boala e cronicizată frotiul e dificil

de interpretat (gonococi cu morfologie atipică)

Izolare - se face pe medii selective Thayer-Martin sau New York City (NYC)

plăcile însămânţate se incubează la 34-36°C în atmosferă umedă cu 3-10% CO2.

Se examinează după 18-24h, apoi după 48h.

După 1 zi de incubare coloniile tipice vor avea diametru de 0.5-1mm, culoare variabilă

(alb/gris), de la transparente la opace, ridicate convex ad plate. După o incubare

suplimentară pot ajunge la 3mm şi pot deveni mai puţin netede. De multe ori apar ambele

tipuri de colonii descrise mai sus

Identificare prezumptivă a coloniilor gonococ-like: frotiu Gram + testul oxidazei

(detectează citocrom C oxidaza)

Teste de confirmare – pe mediu CTA (cystine tryptic agar), mediu Hill

- fermentarea zaharurilor – doar glucoza

În vogă – mediile cromogene – pt ambele tipuri de Neisserii patogene (atât meningococ

cât şi gonococ)

Antibiograma

Diagnostic imunologic

detectare de antigen prin metode imunoenzimatice - au specificitate şi sensibilitate mare

şi se obţine rezultatul în 4 ore. Dar:

nu pot fi aplicate unor produse patologice extra-genitale (se lucrează

doar cu secreţie uretrală / cervicală)

antibiograma rămâne nefăcută…….

imunofluorescenţă directă folosind anticorpi monoclonali anti-proteina I.

diagnostic serologic – se foloseşte doar în studii de cohortă (nu diagnostic individual); nu

diferenţiază infecţiile recente de cele vechi; încă nu a apărut un test suficient de

sensibil şi de specific.

Familia EnterobacteriaceaeCaractere generale- BGN (bacili Gram-negativi) nesporulaţi, mobili (flageli peritrichi) sau imobili,

nepretenţioşi nutritiv (cersc pe medii cu peptonă în prezenţa bilei), fermentează glucoza, oxidazo-negativi, produc catalază, reduc nitraţii în nitriţi.

Diagnostic de laborator- recoltare – în funcţie de sediul infecţiei (urină, materii fecale, sânge, bilă, lichid de

vomă, spută, alimente suspecte, piese necroptice, tampoane plăgi, puncţii

aseptice…..)

- transport – pe mediu Cary-Blair care inhibă microbiocenoza şi permite viabilitatea

germenilor patogeni aproximativ 4-6 zile.

- Frotiu din produs patologic +/-

- Însămânţare în scopul izolării & identificării

- identificare preliminară (sisteme multitest) –încadrare gen/specie

- identificare de certitudine – încadrare specie/tip

- biologică – teste convenţionale, kituri microtest

- serologică (lamă / tub)

- tipizare bacteriofagică (lizotipie), bacteriocinică

(bacteriocinotipie), biochimică (biotip), antibiotică

(rezistotip), moleculară genetică (ribotip, tip

plasmidic)

Cultivare pe medii nutritive simple

- bulion simplu (bulion glucozat)

- colonii S – cultură tulbure, uniformă, fără depozit

- colonii R – limpede ori tulbure în grade diferite, cu inel sau văl, cu depozit

- agar nutritiv

- colonii S – 2-3 mm, rotunde, bombate, umede, cu suprafaţa netedă şi margini

regulate

- colonii R – 2-3 mm, rotunde, plate, cu suprafaţa rugoasă şi margini neregulate

- pot exista colonii mucoide (4-5 mm, rotunde, bombate, margini neregulate,

tendinţa la confluare) – Klebsiella, +/- Escherichia

- colonii pigmentate

- fenomen de creştere invazivă – în jurul coloniilor se dezvoltă zone de migrare

concentrică (Proteus)

- agar-sânge

- aspectul coloniilor ca pe agarul nutritiv +/- dezvoltare de hemoliză

Medii de îmbogăţire

- bulionul selenit de sodiu – selenitul inhibă în special bacteriile lactozo-pozitive – se

folosesc în diagnosticul salmonelozelor

- bulionul pt. BGN – inhibă cocii, +/- bacilii Gram-pozitivi.

- Mediul Müller-Kauffman (mediu lichid cu verde briliant ca indicator) – pt izolarea

Salmonella typhi

Medii selective

slab selective

- de obicei inhibitorii pt toţi cocii Gram-pozitivi şi bacilii Gram-pozitivi şi pt fungi

- permit creşterea diferenţiată a unor BGN oxidativi-fermentativi

- ex: Mac Conkey (inhibitor = săruri biliare, zahăr = lactoza, indicator = roşu neutru),

EMB (inhibitor = albastru de metilen)

- pe Mac Conkey Salmonella, Shigella şi Proteus dezvoltă colonii lactozo-negative

semitransparente ce modifică culoarea mediului

- enterobacteriile condiţionat patogene lactozo-pozitive cresc sub formă de colonii mari

cu centru roşu; pot fi înconjurate de un halou opac roz prin precipitarea sărurilor

biliare

moderat selective

- inhibitori pt toată flora Gram-pozitivă, alţi BGN care nu sunt enterobacterii (excepţie:

Vibrio) şi chiar parţial pt enterobacterii lactozo-pozitive

- cresc bine lactozo-negativii (Salmonella, Shigella)

- mediul ADCL (Leifson) – agar, dezoxicolat, citrat, lactoză – pt izolarea Salmonella

- unele bacterii (Salmonella, +/- Proteus) au capacitatea de a metaboliza citratul:

citrat de fier – se eliberează Fe - în prezenţa H2S - colonii cu centru negru

(Salmonella – colonii transparente; Proteus – colonii mate)

- lactozo-pozitivii (E. coli, Klebsiella), deşi parţial inhibaţi, apar de culoare roşie.

- mediul SS (Salmonella – Shigella) – cu săruri biliare

înalt selective

- inhibă toate enterobacteriile cu excepţia Salmonella – ţintite pe bacilul tific

- mediul Wilson-Blair – glucoză, tiosulfat de sodiu, citrat amoniacal de bismut, verde

briliant, sulfat feros

- coloniile de Salmonella typhi – colonii negre, cu suprafaţă rugoasă R, margini

crenelate, dezvoltă în jur un halou negru cu reflexe metalice

- pt investigarea purtătorilor cronici sau a contacţilor

- mediul CIN (cefsulodin = antibiotic, Irgasan = inhibitor, novobiocină) – pt izolarea

Yersinia

Medii diferenţiale

- AABTL – agar, albastru de bromtimol, lactoză + hiposulfit de sodiu

- coloniile apar sub formă de colonii - verzi-albăstrui – lactozo-negative

- galbene – lactozo-pozitive

- pe acest mediu, Proteus nu produce fenomen de invazie (datorită prezenţei

hiposulfitului de sodiu)

Coloniile suspecte de pe mediile selective se retestează pe medii multitest. În paralel se

fac teste biochimice adiţionale.

TSI

MILF

MIU

TSI = triple sugar iron

- agar tripluzaharat ( glucoză, lactoză, zaharoză), sulfat feros, roşu fenol

- virare în galben

- panta – fermentare lactoză-zaharoză

- porţiunea dreaptă – fermentare glucoză

- fragmentare mediu, împingere mediu spre suprafaţă (poate sări dopul!) – producere de gaz prin degradarea glucozei

- înnegrirea porţiunii drepte – elaborare de H2S (formare de sulfură de fier)

- neînsămânţat – culoare roz-roşu

- !!!! Dacă nu se îngălbeneşte porţiunea dreaptă – nu e enterobacterie!!!!

- Însămânţarea se face cu firul – se înţeapă partea dreaptă a mediului, apoi se trasează

pe pantă mişcări în zig-zag. – se citesc după incubare 18h la 37°.

MILF = mobilitate / indol / lizindecarboxilază / fenilalanil-dezaminază

- neînsămânţat – mov

- geloză, substrate diferenţiale (peptonă cu triptofan, L-lizină, fenilanină), indicator

brom cezol purpur şi roşu crezol

- hârtie impregnată cu reactiv de culoare (Ehrlich)

- mobilitate = turbiditate pe toată coloana de mediu

- indol – se colorează hârtia în roşu-violet (triptofanul metabolizat la stadiul de indol)

- lizindecarboxilaza – virează culoarea mediului în violet intens

- lizină-negativ – se îngălbeneşte mediul

- fenilalanin dezaminaza – apariţia unui inel verde la adăugarea de soluţie apoasă 10% de

clorură ferică acidifiată

MIU – mobilitate / indol / uree

- neînsămânţat – roz-portocaliu

- mobilitate & indol – idem MILF

- culoare alcalinizată (roşie) – urează prezentă

- culoare nemodificată – urează absentă

Dacă se lucrează cu MILF se testează ureea separat – mediu Black-Christensen – incolor

la neutralitate; dacă produce urează – cyclamen

Citrat Simmons – neînsămânţat – verde

- bacteria utilizează citratul – culoare albastră.

Modern – pt identificare – sistemul API – în kituri (20-24 de teste)

Identificarea serologică (serotipia)

- pt tulpinile de E. coli izolate pe AABTL din materiile fecale de la nou-născut cu

sindrom toxico-septic epidemic

- r. de aglutinare pe lamă / confirmare în tuburi

- seruri polivalente anti E. coli

- seruri monovalente

- alternativă: imunofluorescenţa în materii fecale

- Shigella – pt încadrarea într-una din subgrupele antigenice

- A – Sh. dysenteriae – 10 serotipuri

- B – Sh. flexneri – 6 serotipuri

- C – Sh. boydi – 15 serotipuri

- D – Sh. sonnei – 2 serotipuri

- aglutinarea pe lamă (de pe TSI), confirmată de aglutinarea în tub

- Salmonella – de pe mediu TSI sau AABTL

- Se folosesc truse cu seruri imune de diagnostic

- Ser anti Vi

- Ser polivalent “O” anti-Salmonella

- Seruri de grup “O” (AO, BO, CO, DO, EO….)

- Seruri monovalente flagelare anti-H

- pentru identificare se foloseşte schema Kauffmann White

Tipizarea – lizotipia

- principiu – tulpina de cercetat se însămânţează pe geloză repartizată în cutii Petri pe

care în prealabil s-au desenat pătrăţele notate. În pătrăţele se dispune cu ansa setul de

bacteriofagi, se incubează la 37° / 18 h şi se citesc reacţiile litice (liză confluentă,

semiconfluentă, opacă, plajă). Se compară spectrul de lizosensibilitate al tulpinii

testate cu cele incluse în scheme standardizate

- este necesară pentru stabilirea sursei de infecţie şi a filiaţiei cazurilor în

enterobacteriozele epidemice

Genul Escherichia - Escherichia coli

****Urocultura

prelevare – recoltare după toaletă; prelevare din jetul mijlociu direct în recipient

steril cu gât larg, înainte de instituirea trat Ab

în situaţii speciale – recoltare directă din vezică prin puncţie suprapubiană

ex direct – macro – aspect (limpede / tulbure)

- micro – centrifugare – ex. sediment

urocultură cantitativă - metoda diluţiilor seriale

– din urina omogenizată se fac diluţii zecimale în ser fiziologic (1/10, 1/100, 1/1000…)

Din fiecare diluţie se depun câte 0,1ml pe suprafaţa a două plăci Petri cu următoarele

medii de cultură: geloză sânge şi un mediu diferenţial (Mac Conkey sau AABTL). După

incubare 18-20h la 37° se numără coloniile izolate, iar rezultatul se calculează după

formula:

nr. germeni = nr. colonii dezvoltate x 10 x diluţia

Neguţ: nr. germeni = nr. colonii x factor de corecţie x inversul diluţiei / nr. de plăci

f. de corecţie = 5 la 0,1ml şi respectiv 10 la 0,2 ml.

Interpretare

105 germeni/ml = bacteriurie ce denotă sigur o infecţie urinară

104-105 germeni/ml = bacteriurie suspectă – se repetă

<104 germeni / ml = bacteriurie fiziologică, nesemnificativă

poate fi semnificativă pt infecţie urinară în urm. Împrejurări:

- urină recoltată suprapubian

- bv. sub tratament Ab

- prezenţa în urină a unor germeni ce se dezvoltă greu

- bv. hidratat masiv

- urină cu pH acid (<5)

Genul Klebsiella

- prezenţa de capsulă pe frotiu

- dezvoltă colonii mucoide pe mediile de cultură

-Tipare serologică; tipare bacteriofagică

-Antibiograma obligatorie: Klebsiella prezintă rezistenţă multiplă la antibiotice

Genul Salmonella

- salmoneloze - sistemice – febre tifoide & paratifoide

- enterice – toxiinfecţii alimentare, boli diareice acute

Caractere morfologice, culturale, biochimice

- BGN mobili, cili peritrichi

- cresc pe agarul nutritiv în 18-24h – colonii în majoritate S (rotunde, bombate, unede,

diam 2-3mm); pe agar sânge nu dezvoltă hemoliză

- Mac Conkey – colonii transparente în culoarea mediului

- ADCL - colonii transparente în culoarea mediului, cu centru negru de H2S

- Mediu XLD (xiloză, lizină, dezoxicolat; mediu moderat selectiv) – colonii roşii cu

centrul negru

- Wilson Blair – colonii negre, rugoase, cu halou metalic.

Febrele enterice – febra tifoidă –patogenie

Diagnostic de laborator

examen Săpt 1 Săpt 2 Săpt 3 Săpt 4 convalescenţă purtător

Hemocultură +++ ++ ++ - - -

Coprocultură + ++ +++ + +/- +/-

Urocultură + + - - - -

Bilicultură nu nu nu nu +/- +/-

Medulocultură + ++ ++ + nu nu

Serologie ASC +/- ++ +++ +++ +++ nu

Serologie Vi nu nu nu nu +++ +

ASC – analiză serică calitativă – reacţia Widal – Ag O şi Ag H

Seroreacţia Vi (de înveliş) – semnificativ titru > 1/40

Urmărirea purtătorilor – prin coprocultură & seroreacţia Vi

- se recoltează sânge şi materii fecale după administrare de purgativ (3 probe recoltate

în 3 zile succesive)

- interpretare

Seroreacţia Vi coprocultură Interpretare

+ + Se menţine în evidenţă

+ - Se menţine în evidenţă; reinvestigare după 3 luni

- + Se menţine în evidenţă

- - Se scoate din evidenţă

Genul Proteus

Caractere morfologice, culturale, biochimice

- BGN mobili - Pe medii gelozate prezintă fenomen de invazie sau de migrare în

cercuri concentrice, caracteristic exclusiv genului ( migrare până la marginea

mediului sau până la locul de întâlnire cu altă colonie; dacă coloniile migratorii

aparţin aceleiaşi tulpini – se intrică – formează o pânză continuă; dacă sunt 2 tulpini

diferite, chiar din aceeaşi specie – migrările se opresc la 1-2 mm distanţă, între ele

trasându-se o linie de demarcaţie = fenomenul de demarcaţie Diens = marker

epidemiologic)

Tipare serologică, lizotipie, serotipie, rezistotipie

Genul Shigella

Taxonomie – 4 specii: Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei

Implicaţii în patologie: dizenteria bacilară şi toxiinfecţii alimentare

Coprocultura

- Recoltarea materiilor fecale – înainte de administrarea antibioticelor, din scaun emis

spontan. Se recoltează porţiuni caracteristice (mucus, sânge). Se însămânţează

imediat sau pe mediu de transport Cary Blair

- La purtători se poate folosi sonda Nelaton – recoltare din sigmoid

- Recoltare în timpul rectoscopiei (din leziuni recto-sigmoidiene)

- Însămânţare – suspensie din materii fecale (1g m.f. / 3-4ml SF) – se pune o picătură

pe placă (mediu slab selectiv Mac Conkey, moderat selectiv ADCL) – incubare 24 h

– citire – repicarea coloniilor suspecte (se face identificarea lactozo-negativilor prin

minimum 3 biochimii din colonii diferite); dacă pe placă nu au crescut lactozo-

negativi sau este vorba de copii mici şi pe placă sunt prezente colonii de lactozo-

pozitivi – repicare pe AABTL şi efectuare de biochimii pentru identificare.

Identificare serologică – aglutinare pe lamă / confirmare în tub

Genul Yersinia

- 3 specii înalt patogene pt om: Y. pestis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis

Caractere morfologice, culturale, biochimice

- morfologie coco-bacilară, Gram-negativi, dimensiuni mici, nesporulaţi, aşezaţi în

grămezi / lanţuri, tendinţă la colorare bipolară, polimorfism accentuat în culturi vechi

- flageli peritrichi – mobilitate la 22-30° (Y. pestis imobilă)

- Y. pestis dezvoltă capsulă la 37° in vivo sau pe medii bogat nutritive.

- Pe Mac Conkey, după 48h, dau colonii mici, lactozo-negative, transparente, rotunde,

bombate, cu margini regulate.

Diagnostic serologic – se practică pentru tulpinile patogene

R. de aglutinare cu Ag “O” (semnif. sunt titrurile > 1/160) ELISA, immunoblotting

Genul PseudomonasDiagnostic de laborator Recoltare – în funcţie de sediul infecţiei Frotiu produs patologic – BGN polimorfici, nesporulaţi, necapsulaţi + celule Izolare –însămânţare pe geloză şi bulion; cresc bine la 42° pe agar infuzie cord-creier

- în bulion – turbiditatea mediului; apariţia la suprafaţă a unei membrane cenuşii, aderentă de pereţii eprubetei; după incubare 18-24h la 37° mediul devine vâscos, la suprafaţă apare un pigment albastru verzui + degajare de miros de flori de salcâm / de iasomie

- pe geloză – colonii izolate – rotunde, lucioase, convexe, cu reflexe metalice, de culoare albastru-verzui, care colorează şi mediul; frecvent prezente plaje de autoliză

- pe agar-sânge – multe tulpini sunt puternic hemolitice; tardiv colorează mediul în brun

- pe Mac Conkey / Istrati-Meitert (medii slab selective) – colonii mici, lactozo-negative, aderente la mediu

- subcultivarea pe mediu King – se foloseşte pentru evidenţierea pigmentogenezei (stimulează sinteza piocianinei / pioverdinei)Culoarea albastru-verzuie este dată de pigmentul piocianină. Bacilul mai produce şi

pioverdina (galben-verde, galben-brun)Germenul prezintă mobilitate printr-un flagel unic – testarea mobilităţii se face între

lamă şi lamelă, din cultura în bulion.Oxidează glucozaReduce nitraţii

Serotipia, lizotipia, piocinotipia – utile în investigarea epidemiologică Antibiograma

Genul VibrioDiagnostic de laboratorRecoltare – materii fecale şi lichid de vomăTransport – se însămânţează în maximum 1-3h; dacă nu se poate – se păstrează la frigider 24-48h sau se conservă în mediu de transportFrotiu din produs patologic – BGN încurbaţi, cca 2μ lungime, cu polimorfism foarte accentuat (forme cocoide ad filamentoase) + leucocite + hematii… Preparat proaspăt – bacilul are mişcări de rostogolireIzolare– pe medii BSA (Bile Salts Agar) şi TCBS (Thiosulphate – Citrate – Bile Salts -

Sucrose) = medii selective pentru vibrioni– dacă se folosesc medii de îmbogăţire = apă peptonată alcalină – opacifiere omogenă,

pot produce văl– pe BSA – colonii transparente ca picăturile de rouă– pe TCBS –mediu verde albăstrui, colonii galbene– pe medii cu sânge - uzual tulpinile non O:1 produc β-hemoliză după 24h incubare

– frecvent β-hemolitice sunt şi tulpinile biovarului El Tor - V. cholerae poate creşte pe Mac Conkey – colonii lactozo-negative Testul oxidazei – pozitiv

Izolatele cu colonii galbene pe TCBS şi cu testul oxidazei pozitiv se supun aglutinării pe lamă cu ser anti-holeric O:1 şi O:139. Aglutinarea se confirmă ulterior prin teste biochimice (fermentarea glucozei fără producere de gaz este esenţială pt diagnostic)

Biotipia – diferenţierea biovarurilor clasic şi El TorSerotipia – În cazul Vibrio cholerae O:1, indiferent de biovar, există trei serovaruri definite prin factorii antigenici a, b şi c (Ogawa, Inaba şi Hikojima)LizotipiaPrin biologie moleculară se pot identifica unii markeri epidemiologici pentru biovarul El Tor.Antibiograma

Genul HelycobacterDiagnostic de laborator- se investighează infecţia cu H. pylori în scop de:

- diagnostic la persoanele cu simptomatologie digestivă superioară- verificare a eradicării bacteriei la persoanele care au urmat tratament- studii epidemiologice (aprecierea incidenţei)

- prelevare – biopsie gastrică – atenţie: bolnavul să nu fi urmat tratament antibiotic în ultima lună. Examinarea sucului gastric NU este utilă, bacteria fiind foarte rar prezentă.

- Din materialul bioptic, un fragment va fi plasat direct în mediu cu uree şi indicator de pH pentru evidenţierea ureazei preformate, alte două fragmente vor fi destinate frotiului şi culturii (se vor depune într-un flacon cu soluţie salină izotonă pentru a evita desicaţia şi contactul cu aerul atmosferic) şi un alt fragment va fi destinat examenului histopatologic.

Testul ureazei (test comercial = Helicotest) – decelează prezenţa ureazei produse de H. pylori în fragmentul bioptic prin plasarea în

mediu tamponat cu uree şi indicator de pH (roşu fenol). – Ionii de amoniu rezultaţi alcalinizează mediul şi modifică culoarea indicatorului (de

la galben la roz-roşu). Timpul de reacţie variază în funcţie de numărul de bacterii prezente. Citirea se face la 30 min, o oră, 3h şi 24h. Incubarea la 37° accelerează reacţia.

Microscopia- frotiu colorat Gram sau Giemsa - bacili încurbaţi în formă de virgulă sau sub forma

literei S, uneori spiralaţi.Cultura- se omogenizează fragmentul prelevat, se depune pe suprafaţă unor medii selective şi

neselective (dispersie cu ansa) – incubare la 37°, în condiţii de microaerofilie şi atmosferă umedă – examinarea culturilor se face din ziua a treia până într-a şaptea – colonii mici, transparente – identificare microscopică şi biochimică

Diagnostic serologic- avantaj – metodă neinvazivă- ELISA – sensibilitate şi specificitate bună, dar posibil reacţii fals-pozitive în infecţii

cu Campylobacter jejuni.Se mai poate face testul respirator cu uree marcată (i se administrează pacientului o soluţie ce conţine uree marcată, anterior unui prânz cu conţinut bogat în lipide sau cu acid citric care întârzie evacuarea gastrică). Se determină cantitatea de CO2 marcat (se foloseşte 13C neradioactiv) în aerul expirat de bolnav. Dezavantaj – costisitor, necesită echipament special.

Genul Bordetella

Recoltare – tampon nazal, metoda “plăcilor tuşite”Cultivare- germeni pretenţioşi nutritiv- pe mediu Bordet-Gengou (conţinut crescut în amidon) incubare la 35-37°C în

atmosferă umedă, până la 7 zile, cu citire zilnică după 48 h de incubare- B. pertussis formează după 3-4 zile colonii f. mici, convexe, uşor transparente, cu

strălucire metalică în lumină oblic transmisă apar ca picăturile de Hg sau ca jumătăţi de perle f. aderente, înconjurate de o zonă îngustă de hemoliză difuză, vizibilă în special când coloniile sunt confluente. După 5-6 zile coloniile pot atinge 2-3 mm diametru.

- pe geloză-sânge – coloniile aparţinând tulpinilor virulente sunt hemolitice

Caractere microscopice

- cocobacili Gram-negativi, 0,2-0,5μm, izolaţi sau în perechi, rar în lanţuri scurte, cu tendinţă la pleomorfism, filamentare şi formă bacilară prin subcultivare. Se colorează bipolar, în general palid (se observă mai bine după prelungirea recolorării până la 2 minute). În primoculturi prezintă capsulă (vizibilă doar prin coloraţii speciale). Imobili (excepţie B. bronchiseptica în culturi la temperatura camerei)

Identificare preliminară suspiciune de Bordetella teste adiţionale mobilitate, catalază, oxidază, utilizare citrat, reducere nitraţi, urează….Reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri anti – B. pertussis, anti – B. parapertussis confirmă identitatea izolatelor şi identifică serovarurile de B. pertussis ca markeri epidemiologici.Antibiograma - utilă în faza catarală

Examen serologic – Ac precipitanţi apar în săptămâna a 3-a de boală (serologia nu este utilă la începutul bolii). Se face testare în dinamică. După unii nu este test diagnostic.

Vaccinarea – DTP. Există şi tetravaccin DTPH (+ Haemophilus tip B). Doar la copiii sub 7 ani. Anticorpii se elimină în aproximativ 10 ani, lăsând adolescenţii şi adulţii mai susceptibili la boală. Infecţia este mai puţin severă, dar bolnavii reprezintă o sursă de infecţie pentru copiii neimunizaţi.

Genul BrucellaCaractere generale- cocobacili sau bacili scurţi Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, strict aerobi, catalazo-

pozitivi, uzual oxidazo-pozitivi. Hidrolizează ureea şi reduc nitraţii.

Diagnostic de laborator- evidenţiere: lapte, fecale, bilă, urină, puroi, ganglioni, splină, ficat, LCR, lichid

articular, sânge, embrion avortat…- frotiu produs patologic – bacili scurţi sau cocobacili Gram-negativi. În general se

colorează palid (este indicată prelungirea recolorării cu fucsină).- însămânţare – pe medii lichide sau solide (agar triptoză cu 5% ser bovin = mediul

standard pentru izolarea brucelelor)- izolarea brucelelor din prelevate contaminate impune suplimentarea mediilor cu

amestecuri selective: bacitracină, polimixină B, vancomicină, acid nalidixic, nistatină- la izolare, creşterea brucelelor este lentă culturile incubate aerob în atmosferă de 5-

10% CO2 trebuie urmărite până la 10 zile, iar hemoculturile până la 3 săptămâni.Caractere culturale- în bulion - la câteva zile după însămânţare tulbură uniform mediul, după care

creşte mai abundent, face sediment cu supernatant clar- pe medii solide colonii izolate, rotunde, opace, lucitoare (seamănă cu coloniile de

enterobacterii)- pe medii glicerinate – creştere mai rapidăInoculare pe ou embrionat (în sacul vitelin) sau la cobai (1ml subcutanat). Se triturează (embrionul după 120h, cobaiul sacrificat după 60 de zile) se însămânţează pe medii de culturăIdentificarea biochimică- producerea de H2S- prin introducerea unor coloranţi în mediu (fucsină bazică, verde malachit) – diagostic

diferenţial de specieAntibiograma - este limitată la câteva Ab

Genul Haemophylus

Diagnosticul de laborator

Recoltare - H. influenzae – spută, LCR, lichid pleural, pericardic, sânge…- H. ducreyi – din şancru (leziunea genitală)

Frotiu produs patologic

! - frotiul colorat Gram pentru depistarea hemofililor trebuie decolorat 20sec (hemofilii nedecoloraţi corect se confundă cu S. pneumoniae), iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii) ci numai cu fuxină bazică 0,1% sau cu fuxină Ziehl diluată 1/10, timp de 10min sau 20-30 min la frotiurile din secreţii şancroide.- H. influenzae – cocobacili Gram-negativi în fazele de debut & stare; polimorfismul

apare în convalescenţă; în LCR – apar polimorfi, majoritatea bacteriilor fiind extraleucocitare. Tulpinile capsulate izolate din LCR sunt cocobacili, tulpinile

meîncapsulate, izolate din spută sunt pleomorfe şi apar deseori sub formă de filamente sau aciculară.

- H. ducreyi – cocobacili intra / extraleucocitari, coloraţi bipolar (capete măciucate), dispuşi în lanţuri scurte sau medii (“lanţ de bicicletă”)

Fenomenul de umflare a capsulei

- pe o lamă: 3 picături de ser anti – H. influenzae + 3 picături produs patologic + 1 picătură albastru de metilen examinare la microscop: umflarea capsulei. – relativ frecvent rezultate fals-negative.

Caractere de cultivare

- Hemofilii au nevoie de factorul X (hemina, protoporfirina IX) şi factorul V(NAD nicotin-adenin-dinucleotid sau NADPH)

- incubarea: în atmosferă umedă, preferabil în aer cu 5-10% CO2, cu suplimentarea mediilor agarizate cu Ab (bacitracină, linco, oxa…)

- medii speciale care conţin factori de creştere X şi V. Obişnuit geloza-sânge conţine factori X şi V, dar cantitatea de factor V e foarte mică – creşterea foarte slabă. Dacă se trasează un striu de stafilococ pe geloză, hemofilii vor creşte în imediata apropiere a stafilococului, deoarece acesta îi furnizează factorul V necesar (fenomen de satelitism)

- infuzie de cord bovin – pentru hemoculturi- geloză cu sânge de cal / iepure, geloză chocolat (prin adăugare de sânge la o geloză la

80°C), HTM (Haemophilus Test Medium)...- pe medii solide – colonii nepigmentate gris-lucioase sau uşor gălbui, plate ori

convexe, cu suprafaţă netedă, diametru maxim 2 mm după 48 h la 37°C.- pe medii cu sânge hemofilii hemolitici produc β-hemoliză- medii lichide – turbiditate uniformă (cu excepţii)Aspectul coloniilor variază în funcţie de mediul de cultură, specia şi serovarul / biovarul tulpinilor

H. influenzae

- pe geloză-chocolat – creştere cu aspect de condens – tulpinile capsulate produc colonii mai mari (1-3mm) şi mai mucoide, cu tendinţă la confluare)

- pe medii transparente (HTM, Levinthal…) – colonii rotunde, convexe, transparente sau albastru-verzui, 1-2mm; tulpinile capsulate examinare în lumină transmisă oblic strălucire aparte (iridescenţă)

- pe medii cu sânge – hemoliză β.

H. ducreyi

- se dezvoltă slab pe majoritatea mediilor- geloză chocolat – după 72h – colonii de diametru 0,5mm, plate, netede, gris-lucioase,

translucide- se dezvoltă mai bine incubate în atmosferă de 10%CO2 la 33°C- medii cu sânge – hemoliză β- după 2-3 zile coloniile se măresc până la 2mm diametru, centrul devine crateriform.

Identificare serologică

- reacţia de precipitare cu ser imun preparat pe iepure (1ml lichid de cercetat + 1ml ser anti- H. influenzae specific de tip) la limita de contact între cele 2 lichide apare un inel alb de precipitare dacă reacţia este pozitivă.

Identificare definitivă

- determinarea caracterelor metabolice – necesitatea de factor de creştere X şi V- producerea de indol, urează, ornitin decarboxilază, producere de H2S, reducere nitraţi.

Tiparea antigenică a izolatelor – pt H. influenzae- tipare capsulară – prin reacţia de umflare a capsulei, IF, ELISA, RIA,

immunoblotting, reacţie de aglutinare, coaglutinare, latexaglutinare- tipare pt Ag OMP (outer membrane proteins) electroforeză în gel de poliacrilamidă- tipare pt. lipooligozaharide (AgLOSs) Western blot, imunoprecipitare- tipare pt. proteinele fimbriale- tipare & caracterizare ADN.

Antibiograma

- pe geloză chocolat.Profilaxie- există vaccinuri – se recomandă administrarea lor începând cu luna a doua de viaţă. De regulă vaccinarea nu mai este necesară la copiii peste 5 ani sau la adulţi şi bătrâni (excepţie siclemici, cei cu transplante medulare, HIV-SIDA, splenectomizaţi, neoplazici sub tratament).

Genul Corynebacterium- bacili gram-pozitivi, polimorfi, măciucaţi, aşezaţi în litere chinezeşti sau în palisadă, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi.Corynebacterium diphteriae - Difteria = toxiinfecţie gravă. Bacilul rămâne cantonat la poarta de intrare unde determină leziunile specifice (= false membrane), iar toxina difuzează în organism.Celelalte specii ale genului – bacterii difteromorfe – sunt în general comensale, putând însă determina îmbolnăvire la imunodeprimaţi.Caractere culturale - Medii de cultură Gundel-Tietz ( agar-sânge, telurit de potasiu, L-cistină)- mediu selectiv pentru izolarea şi diferenţierea biovarurilor de C. diphteriae

- gravis - colonii negre, late, cu margine translucidă, uşor crenelată, cu striaţii radiare şi suprafaţă granulară, friabile; după 48h - aspect de margaretă

- mitis - colonii negre, convexe, lucioase, cremoase- intermedius - colonii negre, netede, cu margine circulare şi centru uşor

mamelonat Tinsdale (agar, ser, cistină, telurit, tiosulfat)- mediu selectiv-diferenţial pentru bacilii difterici

-colonii negre, mici, înconjurate de halou cafeniu Agar-sânge - colonii cu aspect alb-gris perlat OST (ou, ser, telurit) - mediu de îmbogăţire

Loeffler- mediu selectiv pe care C. diphteriae creşte cu morfologie caracteristică

Diagnostic de laborator# la bolnav- se recoltează 3 tampoane faringiene şi un tampon nazal- tampoanele faringiene se însămânţează pe geloză-sânge, Tinsdale şi OST. Tamponul

care urmează a fi însămânţat pe geloză-sânge serveşte şi la efectuarea frotiului din produs patologic (se colorează Gram).

- Tamponul nazal se însămânţează pe OST.- După 24 h se face o primă citire, cu frotiu din cultură şi repicarea coloniilor cu halou

de pe Tinsdale pe Loeffler şi geloză-sânge, urmată de identificare- Din mediul de îmbogăţire (OST) se fac treceri pe Tinsdale, cu continuarea

diagnosticului. # la purtător- se recoltează un tampon din faringe şi unul nazal- se însămânţează pe OST, se face trecere pe Tinsdale, după 24 de ore se repică pe

Loeffler şi pe geloză-sânge coloniile cu halou, urmată de identificare. Se poate face o purificare şi repicare pe Gundel-Tietz, urmată de repicare pe Loeffler.

IdentificareTestul pirazinamidazei- hidrolizarea pirazinamidei cu apariţia culorii portocaliu la developarea prin sulfat feriamoniacalTestul cistinazei- pe mediu PISU - C. diphteriae - halou brun în lungul traiectului de însămânţare (cistinază hidrolizarea cistinei din mediu eliberare H2S în prezenţa acetatului de plumb se produce sulfură de plumb de culoare neagră)Testul catalazei- tulpinile catalazo-pozitive - apariţia bulelor de gaz la adăugare de peroxid de hidrogenTestul ureazei- pe mediu Black-Christensen; ureaza hidrolizează ureea cu formare de NH3 şi CO2; NH3

alcalinizează mediul cu virarea indicatorului roşu fenol de la galben la roşu-cyclamen. C. diphteriae - ureazo-negativ.Reducerea nitraţilor- C. diphteriae reduce nitraţii în nitriţiTeste biochimice adiţionale- pe mediu His cu indicator Andrade; API-CORYNE- glucoză, zaharoză, dextrină, glicogen, maltoză.... - variaţii între biotipuriToxigenezaCapacitatea de a produce toxina difterică = caracteristică doar tulpinilor de C. diphteriae lizogenizate de bacteriofagul β purtător de genă tox+- in vivo - inoculare la cobai- in vitro - testul ELEK (reacţie de precipitare în gel)Antibiograma

Genul ListeriaRecoltare produs patologic (LCR, lichid amniotic, placentă, ţesuturi fetale, materii fecale, secreţii vaginale, alimente etc)Frotiu produs patologic: bacili scurţi, drepţi/încurbaţi sau cocobacili, extracelulari sau fagocitaţi. În LCR dispuşi în perechi sau în lanţuri scurteÎnsămânţare pe agar triptozat cu 5% sânge de berbec, eventual suplimentate cu glucoză sau lichid de ascităRepicare pe medii agarizate selectiveCultivare optimă la 20-37°CAspectul coloniilorColonii netede, rotunde, uşor bombate, transparenete (picături de rouă), centru cu aspect cristalin sticlos, consistenţă apoasăIrizaţie bleu-verzuie la examinarea în lumină oblicăDupă repicare lasă amprentă pe agarL. monocytogenes – zona îngustă de β-hemolizăMiros caracteristic de lapte acidulat (culturile pe medii solide)Culoare albăstruie pe medii cromogeneTeste preliminareMobilitatea în preparat umed / coloană de agar moale însămânţare prin înţepare – Listeria creşte sub forma unei umbrele la 3-5 mm de suprafaţa agarului mobilitate marcată.Fermentează glucozaProduce oxidază, catalază, urează, H2S pe mediu TSI.Teste de identificare definitiva pt L. monocytogenesProducerea de hemoliză βTestul CAMP

Se insamanteaza un striu din tulpina de S. aureus pe un diametru al placiiTulpinile de testat si tulpinile martor se nsamanteaza perpendicular pe striul de S.

aureus, fara a-l atingeIncubare peste noapte la 37 CTest pozitiv – largirea cuneiforma in varf de sageata sau in flacara a ariei de

hemoliza produsa de cultura de stafilococTest negativ – nicio modificare a hemolizei

Identificare serologică cu seruri imune (1a, 4b) pe lamă şi în tuburiTestarea serologicăTest de screening

- Util la gravide pt estimarea riscului- Determinarea prezenţei şi a titrului anticorpilor în sânge

Valori pozitive: titru > 1/160Valorile indeterminate (1/160) necesită repetare în dinamică

Genul Bacillus

Bacilus anthracis- bacili Gram-pozitivi, mari, dispuşi în lanţuri sau izolaţi, cu spori centrali sau

subterminali, mai mici decât grosimea bacilului, mobili sau imobili, încapsulaţi în produsele patologice, aerobi

Diagnostic de laboratorRecoltare – în funcţie de afecţiunea clinică (serozitate din vezicula cutanată sau din pustulă, lichid de edem, spută, materii fecale, sânge, material necroptic, alimente)Examinarea directă (macroscopică şi microscopică) a produsului patologic - serozitate & lichid de edem – caracter hemoragic; spută hemoptoică; materii fecale

sanguinolente.- Frotiu – bacili Gram-pozitivi, cu capete drepte, încapsulaţi în produs patologic

proaspăt, izolaţi sau dispuşi în lanţuri scurte (2-3 germeni), cu spori centrali sau subterminali (pe medii agarizate sau în cadavrele deschise ale animalelor decedate prin antrax; în prelevatele patologice de la bolnavi sau cultivat în bulion apare nesporulat)

Izolare- însămânţare pe medii simple (bulion, geloză) + geloză-sânge + medii selective- tulpinile virulente sunt de tip R

- în bulion – flocoane care se depozitează pe pereţii eprubetei, mediul rămânând limpede

- pe medii solide – colonii mari, diametru 4-5 mm, alb-cenuşii, turtite, opace, cu suprafaţa rugoasă, marginile neregulate – aspect de “cap de meduză” sau “coamă de leu” (periferia coloniei, examinată cu lupa, apare înconjurată de prelungiri laterale ondulate ca şuviţele de păr)

- pe medii cu sânge – colonii nehemolitice sau slab hemolitice- pe mediu Loeffler (cu ser coagulat de bou) – colonii albicioase care lichefiază

mediulCaractere biochimice- elaborează catalază- fermentează glucoza fără producere de gaz- acţiune proteolitică – pe medii cu gelatină lichefiază mediul după aprox. 10 zile- produce lecitinază- asimilează citratulTeste de patogenitate – inoculare la şoarece – animalul moare prin septicemie cărbunoasă cu edem gelatinos la locul inoculării (faţa internă a coapsei) şi hepatosplenomegalie)

Diagnostic retrospectiv – cadavre umane sau animale= reacţia Ascoli – evidenţierea antigenului cărbunos din organele cadavrelor printr-o reacţie de precipitare în inel cu ser anticărbunos - antigenul de cercetat = filtrat de organ (preparat prin mojararea fragmentelor de splină

sau ficat cu soluţie izotonică de NaCl şi fierbere 5-10 minute)- serul anticărbunos – ser de cal- metodă – într-un tub de precipitare se pun 0,5ml ser şi se adaugă 0,5ml filtrat cu o

pipetă Pasteur, având grijă ca cele 2 lichide să nu se amestece. Extractul e mai uşor,

deci rămâne deasupra serului, iar prin difuziunea lentă a celor două lichide, în 5-10 minute apare un inel de precipitare la zona de echivalenţă.

Genul ClostridiumClostridiile gangrenei gazoase- bacili mari, mobili, necapsulaţi (excepţie: Cl. perfringens – imobil, capsulat)- spori mari centrali sau subterminali- Gram-pozitivi, anaerobiDiagnostic de laborator- recoltare – sânge pt hemocultură, secreţii din plăgi, lichid peritoneal sau din alte

cavităţi închise, materii fecale, alimente.- Însămânţare în maximum 1 h de la recoltare – nu se păstrează la rece deoarece Cl.

perfringens în stare vegetativă e f. puţin rezistent la temperaturi joase.- Bacterioscopia directă (frotiu din produs patologic) – obligatorie pt. diagnostic- Însămânţare pe medii selective (f. frecvent este prezentă floră de asociaţie)

- Inactivarea produsului patologic la 70° 30 de minute pt distrugerea formelor vegetative, cu menţinerea viabilităţii sporilor – însămânţare pe medii speciale în condiţii de anaerobioză

- însămânţarea pe medii selective lichide / solide = bulion VF- însămânţare în profunzime în geloză VF în tuburi Weinberg

- Cl. perfringens – colonii biconvexe, cu margini bine delimitate- Celelalte clostridii – colonii sub formă de “grenadă explodată” (centru

opac, având la un pol numeroase filamente)- însămânţarea se face în condiţii de anaerobioză (amestec reducător + parafină)- însămânţarea pe mediu Willis (gălbenuş de ou + lactoză)

- elaborarea de lecitinază – în jurul coloniilor mediul se opacifiază (lecitinaza desface lecitina din gălbenuşul de ou)

- reacţie intens pozitivă – Cl. perfringens- reacţie pozitivă – Cl. oedematiens

- fermentarea lactozei – virarea culorii coloniilor în galben- însămânţarea în lapte turnesolat – dă indicaţii cu privire la reducerea, acidifierea,

coagularea & digestia coagulului din lapte; Cl. perfringens – laptele se înroşeşte datorită fermentării lactozei şi coagulează. Datorită producerii de gaze cheagul se rupe, se lipeşte de pereţii eprubetei şi în spaţiile libere apare un lichid limpede (cheag alveolar)

Teste de patogenitate – pe animale sensibile la toxinele histotoxice ale clostridiilor (şoarecele alb şi cobaiul)Antibiograma – obligatorie

Toxiinfecţiile alimentare cu clostridii - botulismul

- Cl. botulinum = bacil mare, cu spor central / subterminal, cu diametru mai mare decât grosimea bacilului, anaerob.

Diagnostic de laborator- scop = evidenţierea şi identificarea tipului de toxină +/- izolarea Cl. botulinum din

produsul patologic (vărsătură, materii fecale, produse necroptice) + alimente incriminate.

- Evidenţierea toxinei = toxinotipie = test biologic pe şoareci sau cobai- Se centrifughează alimentul / produsul patologic în care se presupune că

există toxină botulinică. Se adaugă antibiotic pt inhibarea florei de asociaţie. Se urmăreşte evidenţierea tipului de toxină A sau B (circulante la noi)

Lot animal 1 2 3 4Probă de cercetat

Inoculare supernatant

(0,5ml la şoarece, 1ml

la cobai

Inoculare supernatant inactivat 15 minute la

100°, aceleaşi cantităţi

Inocularea aceleiaşi cantităţi de supernatant +

0,1 ml ser antibotulinic anti-A

Inocularea aceleiaşi cantităţi de

supernatant + 0,1 ml ser antibotulinic

anti-BScop Animalul

moare există toxină

botulinică

Animalul supravieţuieşte

există toxină botulinică (e termolabilă).

Diagnostic diferenţial cu toxinele vegetale (termorezistente)

Identificarea tip A toxină (dacă

animalele supravieţuiesc în lotul 3 şi mor în

lotul 4)

Identificarea tip B toxină (dacă

animalele supravieţuiesc în

lotul 4 şi mor în lotul 3)

Clostridium tetani- bacili Gram-pozitivi lungi, cu spor ovalar sau rotund, mai mare decât grosimea

germenului, dispus la una din extremităţi, dând bacililor aspectul de băţ de chibrit sau rachetă. Sunt mobili, necapsulaţi.

Diagnostic de laborator- recoltare – puroi de la nivelul plăgilor, fragmente de ţesuturi, cordon ombilical- frotiul din produs patologic este frecvent neconcludent (examen negativ, rata de

multiplicare a bacilului este redusă)- însămânţare pt izolare – în condiţii de anaerobioză, în plăci Petri, pe geloză cu

gălbenuş de ou sau geloză Willis (gălbenuş de ou + lactoză) antibiotice cu caracter selectiv

- condiţiile de anaerobioză sunt asigurate prin mijloace chimice (amestec reducător care se fixează pe capacul plăcii) şi fizice (etanşeizarea plăcii Petri cu parafină solidă)

- identificare – pe baza caracterelor morfologice – frotiu colorat Gram – germeni Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri, cu spor terminal.

- În medii lichide (bulion V.F.) – tulbură uniform bulionul cu producere de gaze şi degajă un miros de con ars

- Pe geloză V.F. în tuburi lungi şi subţiri, însămânţată în profunzime – colonii cu aspect de puf de păpădie cu un centru opac (germeni mobili) + prezenţa unor bule de gaz

- Pe medii geloză – sânge – hemolizăCaractere biochimice- lihefiază gelatina- produce H2S- produce hemoliză

testul biologic – tetanos experimental la şoarece sau cobai – inoculare de probă prelevată din plaga tetanigenă sau filtrat de cultură. La un lot de animale se administrează doar produsul, la celălalt lot se administrează produsul şi ser antitetanic.Test pozitiv – animalele din primul lot fac tetanos experimental (contractură musculară cu generalizare rapidă şi deces în 3-4 zile), iar animalele din al doilea lot supravieţuiesc.

Genul Treponema

Diagnosticul de laborator

Diagnostic etiologic = frotiu din produsul patologic- leziunea tipică = şancrul dur – evidenţierea treponemelor în serozitatea obţinută de la

nivelul şancrului dur.- Examinarea se face între lamă şi lamelă (produs proaspăt recoltat) la microscopul cu

fond întunecat (formă specifică, spiralată, spire uniforme şi subţiri la extremităţi, 7-13 spire strânse şi regulate, mobilitate, mişcare de flexiune caracteristică treponemelor patogene)

Diagnostic serologic

- teste - netreponemice – de depistare – RBW, VDRL, RPR- treponemice – de confirmare – TPHA, FTA-Abs

RBW = reacţia Bordet-WassermanVDRL = Venereal Diseases Research LaboratoryRPR = Rapid Plasma ReaginTPHA = Treponema pallidum Haemagglutination AssayFTA-Abs = Fluorescent Treponemal Antibody Absorption.

Testele netreponemice sunt teste nespecifice care identifică anticorpi IgM şi IgG anti-lipoidali (anti-cardiolipină)

Testele treponemice au specificitate înaltă, confirmă serurile reactive cu VDRL. Identifică anticorpii treponemici (FTA-Abs → Treponema Reiter)

Titrul este variabil cu stadiul infecţiei, scăzând spre stadiul tardiv, dar rămânând pozitiv ani de zile (martor de infecţie). Seroreversia se produce foarte rar (excepţie: pacienţii HIV-pozitivi trataţi).

Protocol de diagnostic Pentru depistare se face VDRL & TPHA

- VDRL – negativ, TPHA – negativ → exclude infecţia / repetă peste 21 zile.

- VDRL –pozitiv, TPHA – negativ →debut de boală – repetă peste 21 zile→ reacţie fals-pozitivă dacă după 21 zile rezultatul este identic

- VDRL – pozitiv, TPHA – pozitiv → sifilis confirmat, în evoluţie- VDRL – negativ, TPHA – pozitiv → sifilis confirmat, tratat (?).Serurile VDRL-pozitiv trebuie repetate cantitativ.

În neurosifilis- VDRL-LCR –pozitiv → confirmă diagnosticul- LCR-TPHA – pozitiv → nu este diagnostic pentru neurosifilis- LCR-FTA-Abs – negativ → diagnostic de neurosifilis improbabil.

Urmărirea gravidelor se face prin testare obligatorie la prima vizită ante-natală şi întrimestrul III. Dacă prima vizită ante-natală coincide cu internarea în maternitate,atunci se face testarea gravidei şi a copilului la naştere.

Pacienţii confirmaţi cu sifilis sunt urmăriţi prin VDRL cantitativ. Tratamentul trebuie continuat până când titrul scade de minimum 4 ori (două diluţii) faţă de cel iniţial.

Genul Borellia

Diagnostic

- principiul de bază în toate cazurile de borrelioză Lyme este diagnosticul clinic, criteriile clinice (istoricul cazului, simptomele, datele clinice) reprezentând factori decisivi pentru diagnostic şi pentru evaluarea datelor de laborator.

- Criterii de laborator pentru diagnostic:- Izolarea B. burgdorferi dintr-un specimen clinic sau- Demonstrarea prezenţei anticorpilor IgM sau IgG anti – B. burgdorferi

în ser sau LCR. Se recomandă identificarea prezenţei anticorpilor prin test ELISA sau imunofluorescenţă şi continuarea cu Western blot. (seruri pozitive sau dubioase).

- după 3-6 săpt. Apar Ac IgM, mai târziu apar şi IgG – decelabil titrul timp de luni / ani! la pacienţii cu titru mare la testarea cu Ac treponemici fluorescenţi – să nu aibă de fapt o borrelioză…

Tratament – amoxicilina şi ceftriaxona sunt încă antibiotice de elecţie. Răspunde bine şi la penicilină şi tetraciclină

Genul Leptospira

Diagnostic de laborator

Diagnostic bacteriologic- prezenţa leptospirelor se poate cerceta în sânge, LCR, urină, apa de băut…- în prima perioadă a bolii (primele 10 zile) se caută germenul în sânge, LCR. La

cadavre se examinează fragmente de organe interne (ficat, rinichi). Examinarea se face prin:

- examen direct, preparat nativ (între lamă şi lamelă)- cultivare şi izolare pe medii speciale sau prin inoculare la animale

- în a doua perioadă a bolii (ziua 10-21) leptospirele se caută în urină sau în ser. Se asociază diagnosticul serologic.

Cultivarea – pe medii simple, lichide / semisolide, suplimentate cu ser de iepure (mediu Korthof, Uhlenhuth…), în aerobioză, la 28-30°C. Însămânţarea trebuie făcută în primele 2 ore de la recoltare (după 2-4 ore leptospirele se lizează şi dispar). Culturile se urmăresc 60 de zile (se incubează o parte la 28°C, restul la 37°C). Culturile care se tulbură nu conţin leptospire (creşterea şi înmulţirea leptospirelor nu modifică mediul de cultură, care rămâne limpede). Din mediile de cultură se fac din 5 în 5 zile frotiuri colorate May Grünwald Giemsa (leptospirele apar colorate în violet) sau cu coloraţie argentică Fontana – Tribondeau (leptospirele apar colorate în negru pe fond galben)- reacţia oxidazei - pozitivă

Diagnostic serologic

- reacţia de aglutinare → anticorpii aglutinanţi apar din ziua a 8-a de boală, titrul fiind maxim în săptămâna 3-4, apoi scăzând treptat, menţinându-se un titru mic ani de zile.

- Reacţia de fixare a complementului → are valoare practică pt precizarea diagnosticului pozitiv precoce (diagnostic diferenţial între o boală recentă şi una mai veche) ; reacţii pozitive foarte precoce (din ziua a 3-a de boală); titrul creşte în paralel cu evoluţia bolii, fiind maxim în ziua 20

- ELISA - decelare IgG sau IgM – indică stadiul infecţiei.Diagnostic biologic – inoculare la animale de laborator (cobai, hamster, iepure, şoarece) – recoltare de sânge prin puncţia cordului; prezenţa leptospirelor în peritoneu; la moartea animalului, leptospirele se găsesc în leziunile hemoragice din organe.Tratament – elecţie – penicilina / alternative: tetra, eritro, strepto.

Genul Chlamydia

- morfologie – corpii elementari = forme extracelulare infecţioase, dense, inerte metabolic – aderă la celulele ţintă – induc internalizarea în acestea (Macrofage, cel epit) – la pătrunderea în celulă corpul elementar este înconjurat de o vacuolă-fagozom – chlamidiile viabile împiedică fuzionarea fagosomului cu enzimele lizozomale – în vacuolă corpul elementar se transformă în corp reticular (celulă mai mare, cu perete celular mai puţin rigid) care se divide – vacuola capătă aspectul unei incluzii – după 18-20h de la pătrunderea corpilor elementari în celulă AND-ul corpilor reticulari se condensează şi se constituie noi corpi elementari în interiorul vacuolei – sunt eliberaţi odată cu liza celulei gazdă

- corpii elementari se colorează în purpuriu cu Giemsa şi în roşu cu Machiavello – vizibili în citoplasma albastră a celulei gazdă.

Cultivare în lab – pe ou embrionat / culturi de celuleDg lab- prelevare: secr conjunctivală, secr uretrale, vaginale, aspirat ggl în LGV, EF, aspirat

traheo-bronşic, spută, sânge pt serologie- ex microscopic (Giemsa, Machiavello)

- cultivare – ou embrionat / inoculare la şoarece / culturi de celule- serologie – RFC – evid Ac faţă de Ag de grup Chlamidia – Semnif dg la titru >= 1/64 sau

mărirea de 4x între 2 determinări // hemaglutinare, ELISA

Genul RickettsiaDiagnosticul de laborator în tifosul exantematic

Diagnostic bacteriologic- pe frotiurile colorate apar în lanţuri de bacili, dând aspectul de filament- bacterii Gram-negative. Pot fi colorate cu coloraţia Giemsa sau Machiavello.- Izolarea – doar în laboratoare specializate – inocularea sângelui de la bolnav pe

culturi celulare, embrion de găină, cobai.- Toate tulpinile de rickettsii izolate în culturi celulare / embrion / cobai se identifică

prin metode imunologice:- Reacţia de microaglutinare- Reacţia de seroneutralizare a puterii patogene cu seruri de referinţă

Diagnostic serologic

1. – reacţii cu antigen specific Reacţia de hemaglutinare pasivă – decelează IgG şi IgM – poate deosebi tifosul primar

de recădere- reacţie pozitivă – depozit mic de hematii, uneori cu inel central de eritrocite sedimentate,

la agitare apărând grunji fini.- Titrul hemaglutinant al serului de cercetat este dat de ultima diluţie care determină

reacţie pozitivă- Reacţia de hemaglutinare pasivă este pozitivă din ziua a 4-a de la debutul bolii; titrul creşte progresiv până în săptămâna a 3-a de boală, apoi scade la valori mici. RFC– ca antigen specific se foloseşte o suspensie de Rickettsia prowazeki- titru pozitiv 1/16 – 1/32 - creşte în cursul bolii- titrul pozitiv este titrul indicat de ultima diluţie care determină o reacţie de fixare a

complementului pozitivă (hemoliză parţială 50%, sediment de eritrocite mici, lichid supernatant colorat în roşu).

- reacţia se repetă de 2-3 ori în cursul bolii pentru a se urmări dinamica anticorpilor.- În cursul bolii RFC cu antigen rickettsian este pozitivă din ziua a 6-a – a 7-a de boală,

creşte progresiv şi are valoare maximă în ziua 20-25 de boală- În tifosul de recădere, RFC cu antigen rickettsian este pozitivă din a 4-a – a 6-a zi de

boală, titrul fiind maxim în ziua 8-10 de boală.

2. – reacţii cu antigen nespecific Reacţia de aglutinare în tuburi (reacţia Weil-Felix)

- Rickettsia prowazeki conţine un polizaharid comun cu antigenul somatic al bacilului Proteus OX 19.

- titruri mari 1/1000 – 1/10000 la prima îmbolnăvire- titruri mici 1/25 – 1/250 sau negative în boala Brill-Zinsser (tifosul de recădere)

Genul Candida

Diagnostic- recoltarea produsului patologic (fir de păr, scuame, unghii, exsudate, puroi, urină, secreţii

vaginale, uretrale, materii fecale, LCR, lichid pleural, bilă, material bioptic….) examen microscopic direct

- produs patologic lichid – preparat direct lamă/lamelă- produs patologic solid – în hidroxid de potasiu- poate evidenţia celule levuriforme înmugurite +/- pseudomicelii – permite

diagnosticul de grup- în cazul puroiului recoltat în micozele profunde se examinează aspectul şi

structura filamentelor – diagnostic de gen- frotiuri colorate Albastru de metilen, Gram

însămânţarea pe medii de cultură – mediul Sabouraud (solid / lichid) (glucoză, apă peptonată, agar, apă distilată + streptomicină care inhibă dezvoltarea bacteriilor)

- se urmăresc: timpul de dezvoltare, forma, consistenţa, pigmentaţia coloniilor- frotiu din cultură – morfologia fungilor – diferenţiere de grup (levuri sau mucegaiuri) + prezenţa de micro/macroconidii, spori…

studii biochimice – pt identificare de specie- fermentarea zaharurilor (glucoză, maltoză, zaharoză, lactoză, rafinoză…)- asimilarea zaharurilor

Infecţia experimentală- pt dermatofiţi – cobai, şoarece alb- pt levuri - iepure-pt alţi agenţi micotici (în special în cazul micozelor profunde) – cobai, şobolani,

şoarece Antifungigrama