09.02.2009

1

Metode de analiză a cromozomilor

Când putem presupune o anomalie crs de NR sau de structură ?

• Anomalii de dezvoltare mutiple – sindrom plurimalformativ

• Anomalii de sexualizare

• Anomalii de reproducere

– Nou născut mort plurimalformat

– Avorturi spontane repetate

– Sterilitate primară

Are 4 anişori (arată de 2 ani)

Bagaj de cuvinte minim

Reacţionează inadecvat la cei din jur

Nas mic, urechi mici, gură mică cu limba protruzionată

Mâini scurte

Are viciu cardiac, rinichi în potcoavă

Sindrom plurimalformativ

Ce cariotip are?

09.02.2009

2

1. Colectăm sîngele pentru a obţine celule nucleate

(!!! leucocitele sîngelui periferic au n uclee în interfaz ă)

2. Obţinerea culturii de celule în diferite perioade ale mitozei

Termostat

37º C

72 ore

Cel sâgelui

+ mediu de

creştere

Cel în diferite faze ale mitozei

P r o l i f e r a r e

Peste 72 ore

09.02.2009

3

3.Pregătirea cromozomilor pentru microscopie

Celule în diferite faze ale mitozei

Sol hipotonică

Citostatic -colhicină

Stoparea metafazei

Sedimentarea celulelor

Dispersarea cromozomilor

Lamă cu cel fixate Lamă cu plăci metafazice

Colorare

4. Colorarea şi microscopia preparatului cromozomic

09.02.2009

4

5. Analiza cariotipului

Fotografierea

plăcii metafazice

Decuparea cromozomilor

Realizarea cariogramei = cariotipului

Are 4 anişori (arată de 2 ani)

Bagaj de cuvinte minim

Reacţionează inadecvat la cei din jur

Nas mic, urechi mici, gură mică cu limba protruzionată

Mâini scurte

Are viciu cardiac, rinichi în potcoavă

Sindrom plurimalformativ

47,XY,+21 – sindrom Down

12

Tehnici de citogenetică – de analiză a cariotipului:

Pentru identificarea anomaliilor de număr – analiza cromozomilor metafazici cu colorate omogenă.

Pentru identificarea anomaliilor de număr şi de structură –analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R; analiza cromozomilor prometafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R.

Pentru identificarea polimorfismului cromozomial – analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată C, T.

09.02.2009

5

Studiul cariotipului uman

Analiza crs metafazici

Analiza crs prometafazici

Analiza crs interfazici

colorare uniformă

colorareîn benzi G,Q,R,C,T

colorare în benziG, R

Testul cromatinei

sexualeX şi Y

Metode molecular

citogeneticeFISH, mFISH

SKYCGH

*** NR benzi pentru setul haploid: 300-400 m / 550 pm / 850p

14

Tipul bandării Colorant

G Giemsa

Q Quinacrin

(fluorescent)

R (revers) Giemsa sau

fluorescent

C (centromer) Giemsa sau

fluorescent

T (telomer) Giemsa sau

fluorescent

Colorarea cromozomilor

Omogenă Diferenţiată, în benzi

G Q R C T

Benzile G+ = Q+ = R –

Benzile G- = Q- = R +

09.02.2009

6

Cum se colorează diferit acelaşi crs?

09.02.2009

7

Colorare omogenă

•Stabilirea numărului de cromozomi

•Stabilirea cariotipului

•Identificarea anomaliilor

cromozomiale numerice

Bandare C•Stabilirea numărului de cromozomi

•Stabilirea cariotipului

•Concretizarea cromozomilor implicaţi

în anomalie

09.02.2009

8

Nomenclatura benzilor

Cromozomul

benzi

braţe

subbenzi

4p22.2

5q13.4

9p21.3

regiuni

Bra

ţ

Re

giu

ne

Ba

nd

ă

46,XY,del(1)(p11-p34)

1p35

1p22

1q23

1q41

Bra

ţe

Re

giu

ni

Be

nz

i

46,XY,del(1)(p11-p34)

09.02.2009

9

46,Y,del(X)(q12.1-q24.3)

Subbenzi

Benzi

Prometafază Metafază

26

Cromosomul 4 Stabilirea crs. X şi 18 Stabilirea crs. X, Y şi 18

Stabilirea crs. 18 şi 21 Stabilirea crs. 18 şi 21

Utilizarea tehnicii

FISH în analiza

cromosomială

46,XX 47,XX,+21

47,XX,+2147,XX,+21

09.02.2009

10

SKY

mFISH

09.02.2009

11

Cariotip

46,XX

46,XY

46,XX,9qh+

46,XY,16qh-

46,XX,14s++

47,XX,+21

45,XY,-12

48,XXXY

45,X

69,XXX

69,XXY

46,XX,1q-

46,XY,16p+

46,X,r(X)

46,XY,del(5p)

46,XX,t(12,22)

Normal Normal cu polimorfisme

Aneuploid Poliploid Cu aberaţiicromosomiale

Fenotip normal

invt

rob

Anomalii de structură echilibrate

Fenotip patologic

Trisomii – 47,XXX; 47,XXY; 47,+21; 47,+13; 47,+18; 47,+8

Monosomii – 45,X

Anomalii de număr

Fenotip normal

Crs D şi G – variaţii ph sau s:Crs 1,9,16,9,Y – variaţii qh

Polimorfisme

Fenotip normal

46,XX

46,XY

Cariotip normal

Fenotip patologic

deldup

r

i

Anomalii de structură neechilibrate

09.02.2009

12

??? polimorfisme

• p şi q – conţin segmente cromozomiale codificatoare şi necodificatoare

• p+ sau p- - anomalii• q+ sau q- - anomalii• c mai mare sau mai mic – polimorfism• t mai mare sau mai mic – polimorfism• h+ sau h- - polimorfism• s+ sau s- - polimorfism

Testul cromatinei sexule

Testul cromatinei sexule X = testul Barr - vizualizarea crs X inactiv, heterocomatinizat pe nucleele interfazice ale celulelor somatice

Testul cromatinei sexule Y = testul F – vizualizarea a 2/3 din braţul qY pe nucleele interfazice ale celulelor somatice sau ale spermatozoizilor

Cariotip normal

09.02.2009

13

Cromozomul Y- 255 gene:

• gene reglatoare masculinizante

• pseudogene

• !!! Braţul q conţine heterocromatină constitutivă

Cromozomul X - 1141 gene:

•gene structurale somatice

•gene reglatoare feminizante;

•gene structurale feminizante;

•gene structurale masculinizante

!!! Important

• Cromozomul X – este indespensabil celulei somatice şi :

• În cel 46,XX – este activ numai un X

• În cel 46,XY – este activ şi X şi Y

• În cel 47,XXX - este activ numai un X

• În cel 47, XXY- este activ numai un X şi un Y

• În cel 48, XXXY- este activ numai un X şi un Y

• Cromozomul Y – este obligator pentru

De ce? Există o explicaţie?

Dimorfismul sexual - echilibrat

• Caractere sexuale primare - diferite

• Caractere sexuale secundare - diferite

• Caractere somatice - asemănătoare

09.02.2009

14

45,X 47,XXY

46,XX 46,XY

Crs X – activ

eucromatinizat

Crs X – activ

eucromatinizat

Crs Y

Braţ p - activ

Braţ q - inactiv

Crs X – neactiv

heterocromatinizat

Corpuscul F

= 0,25 μm

Corpuscul Barr

= 1μm

09.02.2009

15

Corpuscul Barr – cromatina sexuală X

NrBarr = X - 1

Test Barr

XXX X XXXX XXXXX

Y YY

Test F

48,XXXY 45,X 50,XXXXYY 49,XXXXX

09.02.2009

16

Testul BarrCromatina sexuală X:

- reprezintă cromozomul X inactiv, heterocromatină facultativă,

în celulele somatice 46,XX;

- se prezintă sub forma unui corpuscul Barr de 1 m în nucleii interfazici ai celulelor somatice;

- testul Barr este util în identificarea nr de crs X în celulele somatice: NR crsX = nr corpusculilor Barr + 1 (un crs X activ).46,XX – 1 corpuscul Barr46,XY – 0 47,XXX – 247,XXY - 145,X – 048,XXXX – 3!!! Explicaţ ia o riginii cro matinei X – ipoteza M. Lyon (1961)

Ipoteza Mary Lyon

După a 16 zi

!!! Celule 46,XX - după a 16 zi de dezvoltare au numai un crs X activ

În 50% de cel – este activ crs matern şi în 50% - crs X patern

46,XX

45,X activi +Xpatern inactiv

45,X activi + Xmatern inactiv

09.02.2009

17

Testul FCromatina sexuală Y:

- reprezintă braţul q al crs Y, heterocromatină constitutivă (2/3q), în cel. somatice 46,XY sau în spermatozoizii 23,Y;

- se prezintă sub forma unui corpuscul F (fluorescent) de 0,25 m în nucleele interfazice;

- testul F este util în identificarea crs Y (determinarea prenatală a sexului):

NR crsY = NR corpusculilor F46,XX – 046,XY – 1 47,XYY – 247,XXY - 148,XXYY – 246,X,i(Yp) – 046,X,i(Yq) – 1 (0,5 m)