Manualul de microbiologia alimentelor.pdf

Coordonator: Simona Ivana autori: Simona Ivana, nicolae alexandru POPESCU

MICrObIOlOgIa alIMEntElOr

Manual de laborator

* ediie mbuntit i adugit *

Editura asclepiusBucureti, 2013

toate drepturile sunt rezervate Editurii asclepiusAll rights reserved to Asclepius Publishing House

ISBN electronic: 978-606-8236-34-6

Editura Asclepius este o editur recunoscut internaional. Lucrrile acestei edituri sunt indexate in peste 500 biblioteci internaionale. Comitetul editorial al editurii este format din persoane de prestigiu internaional din domeniul tiinelor vieii.

Asclepius Publishing House books are indexed in over 500 internaional libraries. Editorial board is made of prestigious persons in the Life Sciences domain.

Aceast carte este protejat prin copyright. Reproducerea integral sau parial, multiplicarea prin orice mijloace i sub orice form, cum ar fi xeroxarea, sca-narea, transpunerea n format electronic sau audio, punerea la dispoziia public, in-clusiv prin internet sau prin reele de calculatoare, stocarea permanent sau temporar pe dispozitive sau sisteme cu posibilitatea recuperrii informaiilor cu scop com-ercial sau gratuit precum i alte fapte similare svrite fr permisiunea scris a deintorului copyright-ului reprezint o nclcare a legislaiei cu privire la protecia proprietii intelectuale i se pedepsesc penal i/sau civil n conformitate cu legile n vigoare.

This book is protected by copyright. Reproduction in whole or in part, re-production by any means and in any form, such as copying, scanning, electronic or audio implementation, providing the public, including via the Internet or com-puter networks, permanent or temporary storage devices or systems with the possibil-ity of recovering information or free commercial and other similar acts committed without written permission of the copyright's owner is an infringement on intellec-tual property and is punished by criminal and/or civil liability under applicable law.

Director: Nicolae Alexandru POPESCUDesign copert: Ioana Irinel POPESCU

Grafic i tehnoredactare: Ioana Irinel POPESCU

2013 Editura Asclepius

Refereni tiinifici:

Prof. univ. Dr. Marian Negu Universitatea de Medicin i Farmacie "Carol Davila", Bucureti

Prof. univ. Dr. Iulian ogoe Facultatea de Medicin Veterinar, Bucureti

Prof. univ. Dr. Gheorghe Rpuntean Facultatea de Medicin Veterinar, Cluj-Napoca

Prof. univ. Dr. Constantin Vasiu Facultatea de Medicin Veterinar Cluj-Napoca.

n memoria profesorului Ion Miclu, cel care a fost i va rmne venic n sufletele noastre.

Cuprins

Cuvant nainte 1Norme de protecia muncii n laboratorul de microbiologie 3Noiuni introductive privind tehnicile de diagnostic de laborator 4Aparatura utilizat n laboratorul de microbiologie 5Posibiliti de transmitere a infeciilor de laborator la om 6Sterilizarea 7Transportul i conservarea probelor 10Triajul de calitate al probelor 11Conduita general a identificrii bacteriilor 13Clasificarea bacteriilor din alimente 19

CaPItOlUl 1 RECOLTAREA PROBELOR ALIMENTARE 201.1. Noiuni introductive 201.2. Ambalarea i expedierea probelor 221.3. Primirea i prelucrarea probelor n laborator 221.4. Examenul de laborator 231.5. Determinarea numrului total de germeni (NTG) 23

CaPItOlUl 2DEtErMInarEa tItrUlUI COlI I A BACTERIILOR COLIFORME 272.1. Testul de confirmare pentru coliformii totali 282.2. Testul de confirmare pentru coliformii fecali 292.3. Testul de confirmare pentru Escherichia coli 292.4. Metoda MUG pentru numrarea rapid a lui E. coli 292.5. Testul prezumptiv LT-MUG pentru E. coli 302.6. Testul de confirmare a LT-MUG 30

CAPITOLUL 3 IZOLAREA I IDENTIFICAREA SALMONELELOr DIn alIMEntE DEtErMInarEa BACTERIILOR DIN GENUL SALMONELLA 343.1. Consideraii generale 343.2. Metoda de lucru 353.3. Sistemele microtest 38

CaPItOlUl 4IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA 424.1. Caracterizare general 424.2. Izolarea i identificarea shigelelor din alimente 42

CaPItOlUl 5 IZOLAREA I IDENTIFICAREA STAFILOCOCILOR DIN ALIMENTE 485.1. Caractere generale 485.2. Metoda de numrare direct n plci Petri 505.3. Teste auxiliare 515.4. Determinarea numrului cel mai probabil de germeni 52

CaPItOlUl 6 IZOLAREA I IDENTIFICAREA LUI BACILLUS CEREUS DIn alIMEntE 586.1. Caractere generale 586.2. Determinarea numrului cel mai probabil de germeni 59

v

6.3. Confirmarea lui B. cereus 596.4. Teste pentru diferenierea membrilor grupului B. cereus 61

CaPItOlUl 7IZOLAREA I IDENTIFICAREA SPECIEI LISTERIA MONOCYTOGENES DIn alIMEntE 677.1. Caractere generale 677.2. Metoda i schema de lucru utilizat pentru izolarea i identificarea lui Lis. monocytogenes 687.3. Identificarea i confirmarea lui Lis. monocytogenes 68

CaPItOlUl 8 IZOLAREA I IDENTIFICAREA LUI VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DIn alIMEntE 738.1. Caractere generale 738.2. Tehnica de lucru 74

CaPItOlUl 9IZOLAREA I IDENTIFICAREA GENULUI CAMPYLOBACTER DIn alIMEntE 819.1. Caractere generale 819.2. Prepararea probelor 829.3. Izolarea speciilor de Campylobacter 839.4. Identificarea speciilor de Campylobacter 849.5. Confirmarea campilobacteriilor 84

CAPITOLUL 10 DETERMINAREA PREZENEI I A NUMRULUI DE BACTERII DIn SPECIa CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 9110.1. Caractere generale 9110.2. Izolarea i identificarea lui C. perfringens 93

CAPITOLUL 11 IZOLAREA I IDENTIFICAREA SPECIEI CLOSTRIDIUM BOTULINUM DIn alIMEntE 9811.1. Caractere generale 9811.2. Detectarea lui C. botulinum viabil 10011.3. Detectarea toxinei botulinice 101

CAPITOLUL 12DETERMINAREA NUMRULUI DE DROJDII I MUCEGAIURI DIN ALIMENTE 10312.1. Scurt prezentare a genurilor de drojdii i mucegaiuri din alimente n ordine alfabetic 10312.2. Metoda de lucru 119

CAPITOLUL 13 MEDII DE CULTUR, REACTIVI, DILUANI 13013.1. Caractere generale 13013.2. Medii de cultur folosite n diagnosticul de laborator 13113.3. Prepararea mediilor de cultur 133 13.4. Clasificarea mediilor de cultur 13313.5. Diluani 156

vi

Motto:Dac o bacterie funcioneaz cu virtuozita-te, aceasta se datoreaz faptului c strmoii si i-au exercitat dibcia n aceast chimie, timp de 2 miliarde de ani, notndu-i cu contiinciozitate reeta fiecrei reuite.

Cuvnt nainte

Lucrarea de fa intitulat Microbiologia alimentelor - Manual de labo-rator se adreseaz, n primul rnd studenilor dar i masteranzilor i doctoranzilor pentru parcurgerea unui minim de cunotine, n ceea ce privete activitatea de labo-rator.

Manualul ofer o lectur plcut i o expunere clar, putndu-se parcurge astfel, de orice categorie de cititori, indiferent de nivelul de pregtire.

Lucrarea este structurat n 13 capitole, i anume:Capitolul 1 cuprinde recoltarea probelor alimentare, fiind format din 5 sub-

capitole i anume: noiuni introductive, ambalarea i expedierea probelor, precum i primirea i prelucrarea lor n laborator. Tot n acest capitol este inclus i determina-rea numrului de germeni (NTG).

Capitolul 2 se refer la determinarea titrului coli i a bacteriilor coliforme; confirmarea coliformilor totali, fecali i pentru Escherichia coli.

Capitolul 3 cuprinde izolarea i identificarea salmonelelor din alimente.Capitolul 4 cuprinde identificarea genului Shigella.Capitolul 5: izolarea i identificarea stafilococilor din alimente;Capitolul 6: izolarea i identificarea lui Bacillus cereus;Capitolul 7: izolarea i identificarea speciei Listeria monocytogenes;Capitolul 8: izolarea i identificarea lui Vibrio parahaemolyticus;Capitolul 9: izolarea i identificarea genului Campylobacter;Capitolul 10: determinarea prezenei i a numrului de bacterii din specia

Clostridium perfringens;Capitolul 11: izolarea i identificarea speciei Clostridium botulinum;Capitolul 12: prezentarea genurilor comune de mucegaiuri din alimente;Capitolul 13: medii de cultur, reactivi, diluani i colorani.

Manualul cuprinde 20 de tabele, 8 scheme i 102 imagini color.

1

2Autorii adreseaz sincere mulumiri tuturor celor care i-au oferit ajutorul n realizarea acestui manual. n acest sens mulumete cu recunotin profesorilor refereni tiinifici ai lucrrii, pentru bunele aprecieri, grija i competena tiinific cu care au analizat manuscrisul.

Autoarii.

Norme de protecia muncii n laboratorul de microbiologie

Pentru protejarea stundenilor i a personalului din laboratorul de microbiologie este necesar s se cunoasc i s respecte urmtoarele norme de protecia muncii:

1. Este obligatorie folosirea halatului de protecie, care asigur reducerea riscu-lui de contaminare, efectuarea corespunztoare a operaiunilor de sterilizare, proteja-rea hainelor mpotriva aciunii diferiilor ageni chimici;

2. Pstrarea lucrurilor personale n locuri special amenajate, departe de masa de lucru;

3. Pstrarea ntr-o ordine perfect a laboratorului i ncperilor anexe;4. Efectuarea experimentelor n cadrul lucrrilor practice de ctre studeni nu se

realizeaz dect dup primirea instruciunilor preliminare de la cadrul didactic;5. n timpul lucrrilor practice , pentru a preveni contaminarea se interzic depla-

srile, vorbitul, fumatul, mncatul, etc.6. Dac masa de lucru a fost contaminat cu produse care conin germeni, se va

anuna cadrul didactic rspunztor; se va acoperi zona respectiv cu un tifon mbibat cu atiseptice i numai dup ce a trecut timpul necesar distrugerii acestora se efectueaz curirea propriu-zis a locului respectiv;

7. Dac pe masa de lucru s-au rspndit substane chimice periculoase, ele vor fi n prealabil neutralizate, dup care se recurge la ndeprtarea lor;

8. Mediile nsmnate se incubeaz la termostat, culturile folosite se trimit la infecte pentru autoclavare, frotiurile i pipetele se inscripioneaz i se depun n cutii speciale

9. Dup fiecare lucrare se cur i se dezinfecteaz mesele de lucru, pentru ca la nceperea unei alte lucrri practice s existe condiii corespunztoare de lucru;

10. Nu se va atinge aparatura de laborator sau culturile pregtite n prealabil pentru lucrrile practice, dect dup acceptul cadrului didactic rspunztor;

11. Se vor respecta normele minime de asepsie i se va menine distana cores-punztoare fa de becul de gaz;

12. Nu se vor amesteca la ntmplare substanele, coloranii, reactivii, care se gsesc n laborator;

13. Microscoapele se vor folosi cu mare atenie, iar la terminarea lucrului se vor strnge corespunztor, se vor aranja la marginea mesei de lucru i se va terge oleul de cedru cu pulpa degetului, dup care se vor acoperi cu huse.

14. nainte de a prsi laboratorul, studentul respectiv va trece la splarea i dezinfecia minilor;

Respectarea acestor norme minime n laboratorul de microbiologie va permite desfurarea lucrrilor practice n condiii de siguran deplin.

3

Noiuni introductive privind tehnicile

de diagnostic de laborator

Tehnicile de diagnostic n laboratorul de microbiologie au drept scop izolarea i identificarea speciilor bacteriene care se gsesc n alimente.

Probele de alimente o dat recepionate i triate calitativ sunt preluate de ctre microbiolog, care trebuie s hotrasc:

- mediile de cultur i metodele indicate pentru izolare;- atmosfera, temperatura i intervalul necesar pentru izolarea microorganismelor

respective.Metodele de investigaie le putem mpri n dou mari grupe:

metode directe;metode indirecte.

Prin metodele directe se urmrete depistarea rapid a microorganismelor prin diverse examene, ca:

efectuarea de preparate microscopice colorate i necolorate;tehnici de biologie molecular (de exemplu: reacia PCR = Polymerase

Chain Reaction);izolarea i identificarea microorganismelor n cultur pur, precum i

efectuarea antibiogramei.Metodele indirecte se refer la diagnosticul serologic, diagnosticul prin reacii

intradermice, etc.Identificarea bacteriilor n laborator este posibil dup izolarea n cultur pur

din proba de examinat i studiul caracteristicilor morfobiologice ale acestora.Examenul bacteriologic se desfoar n mai multe etape, astfel:recoltarea probelor;izolarea bacteriilor n cultur pur;identificarea bacteriilor n funcie de caracteristicile lor morfologice, culturale,

metabolice, antigenice, de patogenitate, etc., folosind teste corespunztoare.Selecionarea testelor de diagnostic, n vederea stabilirii genului i a speciei

bacteriene se face pe baza rezultatelor obinute la examenul caracterelor morfologice i culturale.

Identificarea unui germen reprezint de multe ori o operaie dificil i n astfel de cazuri se face apel la determinatorul Bergeys Manual of Systematic Bacteriology.

Diagnosticul se trece n registrul laboratorului, la numrul sub care a fost nregistrat proba. Fiecare tulpin se individualizeaz fie printr-un numr, fie printr-un simbol.

Pentru a avea condiii ct mai riguroase de sterilizare, n cursul diferitelor operaiuni n laboratoarele de bacteriologie, se recomand ca lucrrile s se efectueze n ncperi speciale, denumite boxe, cu restricii de circulaie i prevzute cu lmpi cu ultraviolete, utilizarea hotelor simple sau a hotelor laminar/linear flow. n astfel

4

de hote, aerul ptrunde linear spre operator i este forat s treac printr-un prefiltru i apoi printr-un sistem de filtre HEPA (high efficiency particulate air).

Aparatura utilizat n laboratorul de microbiologie

Recipienii utilizai n microbiologie trebuie s fie din sticl neutr (pentru a nu altera pH-ul coninutului) i suficient de groas i termorezistent, pentru a evita spargerea lor i contaminarea consecutiv a mediului.

Recipienii din sticl boro-silicat (Pyrom, Turdaterm, Ryrex i Jena) sunt cei mai indicai, pentru c prezint o rezisten mare la ocurile termice (25-255C) invers proporional cu grosimea) i elibereaz cantiti nesemnificative de alcali n mediu.

Sticla ordinar, calcosodic are o rezisten redus la ocurile termice (ntre 40-90C) i elibereaz alcali n soluii. Fiecare lot trebuie supus unui tratament de neutralizare.

Aparatura care nu poate lipsi din nici un laborator de microbiologie este reprezentat de:

eprubete (pentru 2-4 ml de mediu); trebuie s aib gura dreapt, fr boruri;tuburi de centrifug, cu fund rotund sau conic, din sticl i din material

plastic;tuburi Durham: reprezentate de tubulee de sticl, care se introduc cu gura n

jos, n mediul de cultur lichid, pentru a detecta formarea de gaz;plci (cutii) Petri: plcile din sticl boro-silicat; nu se zgrie, sunt perfect

plate i uor de stivuit, dar extrem de scumpe i fragile; cele din sticl calco-sodic sunt mai groase, mai rezistente i mai ieftine; cele din material plastic, de unic folosin sunt ieftine, uor de manipulat i stivuit;

pipete Pasteur pot fi scurte sau lungi, cu calibrul de 6-7 mm, confecionate din sticl sau polipropilen. Se sterilizeaz ca i pipetele gradate, ambalate n cutii de aluminiu;

pipete gradate au o capacitate de 1, 2, 5, 10 i 25 ml. Se folosesc nchise cu vat nehidrofil la extremitatea de seciune, pentru a preveni contaminarea lichidului pipetat cu microbi din propipet;

propipete pot fi reprezentate de o par de cauciuc adaptat la extremitatea de seciune;

lame i lamele de microscop lame cu margini palisate sau simple (mai ieftine).

Pentru colorarea preparatelor microscopice, folosim:1.stative din srm anexate la tvi metalice emailate;2.cutii pentru bi de colorat.Stative i panere. Pentru tuburile i flacoanele cu medii de cultur sunt indicate

stative autoclavabile din propilen, care reduc riscul spargerii eprubetelor, un dezavantaj al stativelor din metal.

5

Stativele din lemn sunt total neigenice i dificil de decontaminat.Courile din srm se folosesc numai pentru recipienii cu material neinfecios.Firul de nsmnare este confecionat din srm inoxidabil, de platin sau

crom nichel, cu grosime n funcie de consistena materialului microbian de manipulat. Este fixat ntr-un port fir din metal, care trebuie inut perfect curat prin frecare periodic, uoar, cu mirghel fin, a extremitii inferioare, pentru ndeprtarea materialului carbonizat. Port firul din sticl este contraindicat.

Firul perfect drept. Este utilizat pentru nsmnri prin nepare.Ansa (firul buclat la o extremitate) pentru nsmnarea n medii lichide i

pentru epuizarea inoculului n striuri.Firul spatulat pentru manipularea coloniilor microbiene, cu consisten

ferm.Posibiliti de transmitere a infeciilor

de laborator la om

n laborator, agenii infecioi pot ptrunde n organism pe urmtoarele ci:mucoasa digestiv (ingestia) n cursul pipetrii cu gura, introducerea n

gur a degetelor i obiectelor de pe mesele de laborator (creioane, igri, alimente) contaminate prin scurgeri, stropiri neobservate sau insuficient dezinfectate. Riscul inhalrii se realizeaz prin aerosoli (culturi liofilizate) la deschiderea sau spargerea fiolelor. Stropii de fluid infecios ajuni n ochi pot determina infecii grave;

transmiterea transcutanat a infeciilor n laborator se poate realiza prin nepturi cu ace de sering, pipete Pasteur sau cioburi de sticl contaminate; prin contaminarea plgilor tiate, zgriate, a abraziunilor.

Evoluia infeciilor de laborator este atipic i frecvent grav. OMS a stabilit 4 niveluri de exigen, n ceea ce privete clasificarea laboratoarelor din punct de vedere al exigenei: nivelurile 1 i 2 corespund laboratoarelor de baz, nivelul 3, laboratoarelor cu regim restrictiv i nivelul 4, celor cu regim de maxim restricie.

Ne intereseaz nivelurile 1 i 2, care corespund sistemelor de nvmnt i sntate public.

nivel Aplicat n: Mijloace de protecie Locul de munc

1(de baz)

nvmntul secundarTehnologie microbiologic

foarte bunLucru pe masa deschis

2(de baz)

nvmntul universitarSntate public

Halat de protecieSemnalizarea riscului biologicTehnologie microbiologic foarte bun

Lucru pe masa deschisBox de siguran, clasa I sau a II-a (pentru activiti generatoare de aerosoli)

6

n laboratorul de microbiologie difereniem trei bariere antiinfecioase:primare care previn rspndirea unui microb n laborator;secundare care protejeaz personalul n cazul depirii accidentale, de

ctre microorganisme a barierelor primare;teriare, care previn rspndirea n comunitate a microorganismelor care au

depit barierele primare i secundare.

Sterilizarea

Sterilizarea reprezint operaia de ndeprtare a microorganismelor dintr-un spaiu sau de pe o suprafa delimitat cu ajutorul agenilor fizici sau chimici.

Fizicianul englez John Tyndall a demonstrat c bulionul de cultur, nclzit, nu se altereaz, dac este pstrat n camere fr praf. Studiile sale au furnizat dovada c unii microbi din praf sau din aer prezint o termorezisten extrem de mare, iar pentru distrugerea lor este necesar un tratament deosebit de energic.

Mai trziu, descoperirea i descrierea detaliat a unor endospori bacterieni termorezisteni, de ctre bacteriologul german Ferdinand Cohn, au elucidat de ce cldura nu reuete uneori s elimine complet microorganismele.

Sensul modern de steril (care implic absena oricrei forme de via), a fost stabilit pornind de la aceast constatare. Capacitatea de sterilizare a obiectelor i materialelor constituie o parte esenial a microbiologiei, precum i, a altor sectoare, ca medicina, industria, etc.

nc de timpuriu, microbiologii au nceput s suspecteze c nu numai alterarea i descompunerea sunt provocate de microorganisme, dar i bolile infecioase. Ei au mers pn acolo, nct s susin c nsui corpul uman reprezint o surs de infecie.

Oliver Holmes (medic american) a observat c mamele care nteau la domiciliu, prezentau mai puine infecii dect cele care nteau n materniti, iar medicul ungur Ipraz Semmebicis a artat, clar, c unele femei se infectau n saloanele maternitilor, dup ce erau examinate de medici, care veneau direct din camerele unde se fceau autopsiile.

Chirurgul englez Joseph Lister, a fost primul care a introdus tehnicile aseptice*, avnd ca obiectiv reducerea microbilor ntr-un mediu medical i prevenirea infectrii plgilor. Aceast asepsie a constat n esen, n dezinfectarea minilor i aerului, nainte de manoperele chirurgicale, cu substane chimice antiseptice puternice, ca fenolul. Aceste tehnici i aplicarea cldurii, pentru sterilizare au devenit bazele controlului microbian prin metode fizice i chimice, care mai sunt i azi utilizate.

Reguli de asepsie n laborator:Se ordoneaz pe masa de lucru echipamentul strict necesar;Studentul se aeaz comod pe scaun cu antebraele complet pe blatul mesei,

executnd toate micrile sub controlul vederii;

7* asepsie = manipulare la adpost de microorganisme

Ansa se ine n mna dreapt, apucndu-se ca pe un creion, de extremitatea opus firului;

n mna stng se ine recipientul n care se prelev sau se introduce materialul manipulat, ct mai aproape de extremitatea inferioar;

Se scoate dopul recipientului cuprinzndu-l ntre auricular, inelar i palma minii drepte;

Se sterilizeaz, prin flambare gura eprubetei;Se introduce ansa n eprubet pentru prelevarea i depunerea materialului

microbian. Se evit atingerea cu ansa a pereilor recipientului;Dup retragerea ansei, se flambeaz gura recipientului i se introduce dopul

sau se nurubeaz capacul;Se resterilizeaz ansa.n laboratorul de microbiologie sterilizarea se obine prin tehnici bazate pe

urmtorii ageni:cldura uscat:

o nclzire la rou;o flambare;o aer cald;o incinerare.

cldura umed:o peste 100C: autoclavare;o la sau sub 100C: tindalizare.

filtrare;radiaii ultraviolete;sterilizare chimic prin oxid de etilen.

Sterilizarea prin nclzire la rou este indicat pentru firul drept, ansa i spatula de nsmnare.

Flambarea se folosete pentru sterilizarea capilarului eprubetelor Pasteur, a gurii eprubetelor i flacoanelor.

Incinerarea presupune arderea, cu reducere la cenu. Este indicat pentru materialele din plastic, reziduuri organice.

Sterilizarea prin aer cald se realizeaz n etuv la 160-180C, timp de o or. Timpul crete peste o or n cazul ambalajelor voluminoase sau a obiectelor, substanelor care se nclzesc greu.

Este indicat n sterilizarea obiectelor de laborator din sticl sau porelan, instrumente chirurgicale, substane groase, pulberi termostabile.

Aceast metod este contraindicat n sterilizarea unor soluii apoase, obiecte de cauciuc sau cu garnituri de cauciuc, seringi din sticl cu metal, esturi, vat, bumbac,

8

fibr sintetic, materiale contaminate de laborator.

Etuva este o incint cilindric sau paralelipipedic cu perei dubli, din tabl termorezistent. Rezistenele electrice i un termostat permit meninerea constant a temperaturii selectate, uniformizat n incinta de sterilizare printr-un sistem de ventilaie. Obiectele de sterilizat se aeaz n etuv pe rafturi confecionate din sit metalic.

Sterilizarea prin cldur umed se realizeaz cu ajutorul autoclavelor, n care vaporii de ap saturai realizeaz 115C la 0,5 atmosfere, 121C la 1 atmosfer i 134C la 2 atm.

Prezena aerului compromite acest tip de sterilizare.Autoclavul este un cazan cu perei rezisteni, n care dup nchiderea etan cu

un capac masiv, fixat prin buloane, vaporii de ap se comprim la presiunea necesar sterilizrii.

tindalizarea sau sterilizarea fracionat evit nclzirea la temperaturi peste 100C, fiind destinat sterilizrii unor medii de cultur, alimente, etc., care se degradeaz la temperaturi mai mari.

Sterilizarea fracionat const n nclzirea materialelor de sterilizat la temperatura impus de compoziia lor, timp de 30-60 de minute, la interval de 24 de ore, de trei ori consecutiv.

n prima zi de nclzire se distrug formele vegetative, ale bacteriilor, sporii rezistnd. Acetia se transform (n intervalul de 24 de ore de incubaie la 37C) n forme vegetative, care vor fi distruse prin nclzire, a doua zi. nclzirea de a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme vegetative, rezultate din germinarea sporilor.

n intervalul dintre nclziri, recipienii cu substanele supuse sterilizrii se menin la temperatura camerei, pentru germinarea sporilor.

Pasteurizarea ca i ultrapasteurizarea (uperizarea) distruge numai formele vegetative, nefiind o sterilizare propriu-zis. Se folosesc n industria alimentar (la sterilizarea laptelui, a berii, a sucurilor, etc).

Pasteurizarea const n nclzirea lichidelor la temperaturi ntre 55C i 95C, un timp variabil (la 65C, 90 de minute, la 90C, cteva secunde), iar ultrapasteurizarea n injectarea de vapori supranclzii (150C) n masa lichidelor destinate sterilizrii.

Sterilizarea prin radiaii ultraviolete se realizeaz cu ajutorul lmpilor germicide. Acestea reprezint tuburi de sticl special, n care descrcrile electrice ntr-o atmosfer cu vapori de mercur la joas presiune genereaz radiaii ultraviolete.

Viaa de funcionare este de aproximativ 100 de ore.Instalarea lmpilor germicide este indicat pentru:reducerea ncrcturii microbiene a spaiilor de lucru;

9

constituirea unei bariere protectoare ntre aria cu animale inoculate, boxele de necropsie, etc. i personalul de laborator sau animalele sntoase.

Controlul eficacitii sterilizrii

Se realizeaz prin indicatori fizici (manometru, termometru), chimici i biologici. Indicatorii fizici i chimici ne dau indicaii asupra timpului, ct s-a meninut temperatura de sterilizare.

Indicatorii biologici: tuburi cu fire de bumbac impregnate cu spori de Geobacillus (Bacillus) stearothermophilus i uscate (pentru etuve) sau fiole cu suspensie de acelai bacil (pentru autoclavare), prezint o mare fidelitate.

Prezervarea sterilizrii se realizeaz diferit, n funcie de material.Eprubetele i flacoanele se sterilizeaz, prevzute cu dopuri de vat i tifon,

protejate cu capion de hrtie, sau aluminiu. Foarte eficient este protejarea prin capac nurubat.

Pipetele se sterilizeaz prevzute cu filtru de vat, nvelite individual n benzi de hrtie pergament sau grupate n cutii de tabl de aluminiu, prevzute cu capac.

Plcile Petri se sterilizeaz nvelite, individual sau grupate n hrtie pergament. Mojarele i pistilele se nvelesc separat n hrtie.

Sterilizarea prin ageni chimici se poate realiza cu ajutorul:substanelor dezinfectante, pe care le putem aplica numai pe suprafee inerte

din cauza efectelor iritante ori toxice (de exemplu: sublimat corosiv 1, formol 40%, sod caustic, clorur de var);

substanelor antiseptice, care pot fi aplicate pe tegument, unele mucoase sau plgi, avnd o toxicitate mai redus (de exemplu: alcool medicinal, etilic 70%, tinctur de iod, ap oxigenat, permanganat de potasiu 0,1%, acid acetic 1%, cloramin, detergeni).

Niciodat aceast metod nu se va utiliza pentru sterilizarea materialelor (instrumente, medii) destinate cultivrii sau manipulrii microbilor.

Transportul i conservarea probelor

Transportul i conservarea probelor se realizeaz dup urmtoarele reguli:meninerea ct mai mult posibil a condiiei microbiologice iniiale a probei,

care const n:supravieuirea microbului infectant;inhibarea multiplicrii microbilor contaminani, pe baza nutrienilor

din prelevatul patologic sau distrugerea acestora.prevenirea rspndirii microbului infectant la personal i n colectivitate.

Moartea microbilor poate fi provocat de razele solare, deshidratare, modificri de pH, autoliz, oxigen (n cazul germenilor anaerobi). De aceea, o dat recoltate,

10

probele trebuiesc examinate n cel mai scurt timp posibil sau conservate prin refrigerare i medii de transport adecvate.

Refrigerarea se realizeaz la 0C (n container izoterm cu ghea umed) sau la 4C (la frigider). Majoritatea microbilor patogeni supravieuiesc n aceste condiii cteva ore necesare transportului, multiplicarea contaminanilor fiind oprit. Foarte puine bacterii nu rezist la refrigerare: meningococul, gonococul, Haemophilus influenzae.

Mediile de transport asigur supravieuirea microorganismelor prevenind disecarea, variaiile de pH, oxidarea i autoliza. Cel mai frecvent sunt utilizate, n bacteriologie, mediile care conin substane stabilizatoare non-nutritive: Cary-Blair, Amies sau Stuart. Pentru monitorizarea pH-ului se poate folosi un indicator (rou fenol) cnd aceast condiie este critic pentru supravieuirea unor microbi (virusuri, shigele, etc.).

Microbii care se izoleaz pe culturi de celule sau embrioni de gin (virusuri, chlamidii) se transport n medii cu antibiotice (penicilin, streptomicin, nistatin).

Cnd, ns, n acelai prelevat urmrim i virusuri i bacterii, proba va fi suspensionat n mediile de transport fr antibiotice, urmnd ca acestea s fie adugate difereniat la prelucrarea probei n laborator.

O atenie aparte trebuie s acordm bacteriilor anaerobe, astfel:dac transportul i examinarea se fac fr ntrziere, cea mai accesibil

metod este aspirarea probelor fluide n sering etan, cu ndeprtarea imediat a bulelor de aer i obturarea acului prin nepare ntr-un dop steril;

pentru probele biopsice i tampoane sau dac intervalul pn la examinare se prelungete sunt indispensabile containere comerciale speciale (tuburi, flaconae, pungi), care conin un sistem generator de dioxid de carbon, un agent reductor i un indicator redox (resazurin sau albastru de metilen) pentru monitorizarea vizual a anaerobiozei.

Containerele speciale cu atmosfer mbogit n dioxid de carbon i mediu microaerofil sunt avantajoase pentru probele n care urmrim Neisseria sau Campylobacter.

Cei interesai de expedierea produselor microbiene prin pot, trebuie s respecte exigenele de conservare i securitate impuse de standarde recunoscute internaional.

triajul de calitate al probelor

Are loc n dou etape:controlul macroscopic, care se realizeaz prin nscrierea datelor n registrul

de intrri sau introducerea acestora n terminalul unui computer. Se urmresc:consemnarea complet a datelor de identificare a probei, de pe eticheta

recipientului i din cererea de analiz;consemnarea diagnosticului prezumptiv i a datelor anamnetice

eseniale;

11

recoltarea probelor sub terapie antimicrobian;formularea precis a diagnosticului solicitat n raport cu diagnosticul

prezumptiv i natura prelevatului;intervalul dintre prelevare i nregistrare;natura mediului de transport;virajul indicatorilor de pH sau redox;tipul i starea ambalajului.

controlul microscopic se realizeaz pe preparate umede sau colorate Gram.

12

Conduita general a identificrii bacteriilor

Identificarea i clasificarea bacteriilor trebuie s foloseasc n mod obligatoriu un numr ct mai mare de caractere distinctive de ordin morfologic, biochimic, fiziologic, antigenic, ecologic, etc., uor de observat i relativ stabile, independent de modificrile mediului.

n identificarea unei bacterii trebuie s se in seama de caracterele unitare (de exemplu: sporogeneza, fermentarea, etc.).

Se va evita practicarea unui numr excesiv de teste, preferndu-le pe cele care se efectueaz rapid i simplu.

Datorit faptului c, bacteriile izolate direct de la animale, plante sau din medii naturale apar rar n culturi pure, este necesar izolarea lor n culturi pure (axenice), lipsite de prezena altor microorganisme.

Caracterele morfologice i tinctoriale reprezint un criteriu preliminar, necesar pentru plasarea unei tulpini necunoscute ntr-o subdiviziune primar. n unele cazuri ele pot fi utilizate n practic drept un prim criteriu de diagnostic (de exemplu, prezena bacilului tuberculozei n sput).

Caracterele de cultur. Dei variaz n limite largi, n funcie de vrsta culturii, de natura mediului i de temperatur i pH, acestea pot furniza informaii cu caracter ajuttor pentru identificarea bacteriilor respective.

Caracterele biochimice i fiziologice furnizeaz date importante n ceea ce privete capacitatea de a utiliza anumii nutrieni; de a metaboliza anumite substraturi specifice ale unor enzime (fermentarea unor zaharuri, cu sau fr producere de gaz, modificri de pH evideniate de un indicator colorat).

Condiii de cultivare. Pe baza acestui aspect se pot obine informaii privind limitele de temperatur, pH, care permit multiplicarea, reacia la presiunea osmotic, relaia cu oxigenul i lumina.

Caracterele antigenice (serologice). Sunt deosebit de importante deoarece permit identificarea unui antigen (microorganism) necunoscut pe baza unui anticorp cunoscut, n diferite reacii serologice:

de aglutinare;de precipitare;RFC;ELISAPCRde imunofluorescen, i multe altele.

Caracterul de patogenitate a crui manifestare depinde n primul rnd de virulen. Acest caracter este relativ i neunitar, deoarece virulena variaz cu tulpina i se poate atenua sau chiar pierde n culturi de laborator.

13

Pe de alt parte, eficacitatea aciunii patogene depinde i de receptivitatea individual a gazdei, folosite pentru evidenierea ei.

Patogenitatea se testeaz prin inoculare experimental la organisme sensibile, pe o cale adecvat.

Sunt luate n consideraie numai rezultatele pozitive, deoarece cele negative pot fi datorate fie utilizrii unei gazde neadecvate, fie unor condiii de inoculare nepotrivite.

Caracterele ecologice. Habitatul natural al microorganismelor i relaiile lui n mediul natural cu alte forme de via pot varia n funcie i de ali factori dect cei proprii speciei date, precum i pentru faptul c una i aceeai specie bacterian poate tri n medii naturale foarte diferite.

Parametrii ecologici utili pentru caracterele unei specii sunt reprezentai de: temperatura optim de cretere sau de patogenitate, temperatura tolerant, intensitatea luminii, pH, simbioza cu unele microorganisme, etc.

Sensibilitatea la fag. Se testeaz stabilind activitatea unui set standard de fagi cunoscui. Permite stabilirea de subdiviziuni n cadrul speciei (fagovar) cu importan n epidemiologie, pentru determinarea sursei de infecie i a cilor de transmitere.

Deoarece multe tulpini sunt lizogene, ele pot fi caracterizate prin tipizare fagic indirect (lizogenotipie), adic prin detectarea i identificarea fagilor temperai prezeni ca profag n genomul lor.

Cheile de identificare. Cheile de identificare conin enumerarea caracterelor constante (caractere-cheie) prezente sau absente totdeauna la un taxon dat.

Cea mai cunoscut cheie de identificare este cea elaborat de Skerman i publicat n determinatorul lui Bergey.

Caracterele cheie pozitive sunt considerate markeri sau caractere de diagnostic.Coleciile de culturi. Meninerea tulpinilor bacteriene n colecii se poate realiza

prin:transfer activ (n subculturi efectuate la intervale fixe, n funcie de

particularitile biologice ale speciei respective);prin uscare (pe diferite suporturi inerte ca: nisip, silicogel, etc.);prin liofilizare (uscare n vid urmat de congelare la temperaturi joase -30

- 80C);prin crioprezervare la -70C - 90C, care asigur nivelul maxim de

supravieuire n timp.

Pentru fiecare specie microbian nou aprut se recomand pstrarea unei culturi pure, a tulpinii tip originare, cu o descriere complet, care s poat fi completat cu noi caractere, pe msur ce tehnicile de investigare se perfecioneaz.

Dac tulpina este pierdut se recomand nlocuirea ei cu o tulpin neotip, care i seamn foarte mult.

Pstrarea unui astfel de specimen tip practicabil este extrem de dificil.Din grupele de caractere enumerate se examineaz un numr variabil, dar minimal

14

pentru identificarea tulpinii, fiind foarte utile schemele de diagnostic i cheile de identificare.

Pentru a definitiva identificarea unei tulpini, datele examenului bacteriologic, trebuie selectate, asamblate i comparate. n acest scop se impune confruntarea caracterelor evideniate cu datele prezentate n determinatoare, manuale, ghiduri.

Determinatoarele cuprind descrierea complet a speciilor bacteriene care prezint interes pentru ramurile aplicative ale bacteriologiei. Sistemele de clasificare utilizate n determinatoare variaz uneori de la un autor la altul, mai ales n ceea ce privete taxonii de rang superior (ncrengtur, ordin).

Determinatorul cel mai folosit n lume, este lucrarea Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, a crei prim ediie a aprut n 1923. n 1984, a aprut primul volum al manualului reeditat sub titlul Bergeys Manual of Systematic Bacteriology.

Indexurile conin liste alfabetice ale tuturor denumirilor utilizate n prezent i n trecut pentru bacterii.

Cataloagele de colecii cuprind liste alfabetice cu laboratoarele i bacteriologii posesori de colecii de tulpini, pe specii bacteriene i adresele acestora. n fiecare colecie bacterian, tulpinile trebuie s posede o fi individual cu simbolul tulpinii, locul, data i materialul din care a fost izolat, proprietile ei morfologice, culturale, biochimice, antigenice, de patogenitate, etc.

15

Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante

Clas/Subclas

Ordin/Subordin

Familie (nr. genuri)

gen (nr. de specii)

Cl. Bacilli

Ord. Bacillales

Staphylococcaceae (5) Staphylococcus (41)

Bacillaceae (17) Bacillus (184)

Listeriaceae (2) Listeria (8)

Ord. Lactobacillales

Lactobacillaceae (3) Lactobacillus (130)

Streptococcaceae (2)Streptococcus (83)Lactococcus (5)

Enterococcaceae (5) Enterococcus (35)

Leuconostocaceae (3) Leuconostoc (19)

Cl. Clostridia Ord. Clostridiales Clostridiaceae (23)Clostridium (180)

Acetivibrio (4)

Cl. ActinobacteriaScl. Actinobacteridae

Ord. ActinomycetalesSrd. Actinomycineae

Actinomycetaceae (5)Actinomyces (37)Actinobaculum (3)

Arcanobacterium (6)

Ord. Actinomycetales Srd.

Corynebacterineae

Corynebacteriaceae (1)

Corynebacterium (89)

Nocardiaceae (2)Nocardia (73)

Rhodococcus (37)

Mycobacteriaceae (1) Mycobacterium (118)

Ord. ActinomycetalesSrd. Micrococcineae

Micrococcaceae (9) Micrococcus (10)

16

Taxonii de rang superior ai speciilor bacteriene importante

Clas/Subclas

Ordin/Subordin


gen (nr. de specii)

Cl. Gammaproteobacteria

Ord. Enterobacteriales

Enterobacteriaceae (44)

Escherichia (7)Klebsiella (12)Morganella (1)Plesiomonas (1)Proteus (8)Providencia (6)Salmonella (9)Serratia (13)Shigella (4)Yersinia (13)

Ord. Pasteurellales Pasteurellaceae (7)

Pasteurella (22)Actinobacillus (18)Haemophilus (23)Lonepinella (1)Mannheimia (5)

Ord. Thiotrichales Francisellaceae (1) Francisella (3)

Ord. Pseudomonadales

Pseudomonadaceae (10)Pseudomonas (161)Cellvibrio (7)

Ord. Vibrionales Vibrionaceae (8) Vibrio (77)

Ord. Aeromonadales Aeromonadaceae (4) Aeromonas (20)

Ord. Cardiobacteriale

Cardiobacteriaceae (3) Dichelobacter (1)

Ord. Legionellales

Legionellaceae (1) Legionella (50)

Coxiellaceae (3) Coxiella (1)

Cl. Betaproteobacteria Ord. Burkholderiales

Burkholderiaceae (10) Burkholderia (42)

Alcaligenaceae (11) Bordetella (8)

Cl. Alphaproteobacteria

Ord. Rhizobiales Brucellaceae (3) Brucella (6)

Ord. Rickettsiales Rickettsiaceae (2)Rickettsia (23)Orientia (1)

17

Clas/Subclas

Ordin/Subordin


gen (nr. de specii)

Cl. Spirochaetes Ord. Spirochaetales Leptospiraceae (2)Leptospira (13)Leptonema (1)

Cl. Spirochaetes Ord. Spirochaetales

Spirochaetaceae (9)

Borrelia (32)Treponema (23)Cristispira (1)Brevinema (1)

Serpulinaceae (2)Brachyspira (5)Serpulina (6)

Cl. Epsilonproteobacteria

Ord. Campylobacterales

Campylobacteriaceae (4) Campylobacter (25)

Helicobacteraceae (4) Helicobacter (23)

Cl. DeltaproteobacteriaOrd. Desulfovibrionales

Desulfovibrionaceae (3) Lawsonia (1)

Cl. FusobacteriaOrd. Fusobacteriales

Fusobacteriaceae (7) Fusobacterium (20)

Cl. MollicutesOrd. Mycoplasmatales

Mycoplasmataceae (4)Mycoplasma (121)Eperythrozoon (5)Ureaplasma (7)

Cl. Chlamydiae Ord. Chlamydiales Chlamydiaceae (2)Chlamydia (5)Chlamydophila (6)

Clasificarea bacteriilor a fost realizat dup: George M. Garrity, Julia A. Bell, Timothy G. Lilburn Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. (rel. 5.0), 2004, J.P. Euzby - List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature, 2006.

18

ClaSIFICarEa PrInCIPalElOr baCtErII PatOgEnE DIn alIMEntE

Bacterii Gram negative:1. Salmonella2. Shigella3. Escherichia4. Yersinia5. Vibrio6. Campylobacter7. Aeromonas8. Brucella9. Plesiomonas

Bacterii Gram pozitive:1. Staphylococcus2. Bacillus cereus3. Bacillus anthracis4. Clostridium botulinum, Clostridium argentiensis, Clostridium perfringens5. Listeria monocytogenes6. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

19

CAPITOLUL 1rECOltarEa PrObElOr alIMEntarE

1.1. Noiuni introductive

Prin noiunea de prob se nelege orice produs sau material destinat examenului microbiologic.

Indiferent de natura probelor sau de tipul examenului solicitat recoltarea se efectueaz dup urmtoarele reguli:

- trimiterea probelor la laborator trebuie s se fac ct mai rapid i n condiii de asepsie, respectnd ct mai mult posibil condiiile de pstrare originale;

- fiecare prob se individualizeaz prin nscrierea pe banda de marcare de pe recipient a denumirii acesteia;

- este indicat s se recolteze cel puin 100 g/prob;- instrumentele de lucru reprezentate de linguri, pensule, spatule, foarfece din

oel inoxidabil, etc., se sterilizeaz prin autoclavare (este periculoas sterilizarea prin imersie n alcool sau la flacr);

- pentru probele lichide se pot utiliza recipieni ca: borcane de plastic, cni de metal etane, etc. (se evit folosirea recipienilor de sticl); probele solide se recolteaz n cutii, saci, sticle de plastic sau pachete sterile;

- probele sunt nsoite de un certificat n care se specific ora i data recoltrii, precum i a primirii acestora n laborator;

- recoltarea eantioanelor relativ mici dintr-o cantitate mare de alimente trebuie s fie ct mai uniform;

- trimiterea probelor la laborator se face n recipieni sterili, intaci;- probele refrigerate se transport la laborator n ghea la 0-4 C; nu trebuie

analizate la mai mult de 36 de ore de la recoltare; - n cazul probelor lichide se va recolta i o prob suplimentar pentru

controlul temperaturii.

recoltarea probelor de carne:carnea n carcase i semicarcase : se recolteaz dou cuburi de carne i

grsime, unul de la suprafa i altul din profunzime, cu latura de minimum 8-10 cm i un os lung;

organele : se recolteaz ntregi sau poriuni din acestea n pungi sau recipieni sterili n cantitate de minim 200 g;

carnea preambalat, carnea de pasre, specialiti de pasre : se recolteaz 1 % din numrul pachetelor care alctuiesc lotul, ns nu mai puin de 5 pachete;

carnea de lucru (din ntreprinderile productoare): se recolteaz o prob 20

de 500-1.000 g din fiecare lot dac acestea sunt uniforme n privina caracterelor organoleptice; n caz contrar lotul se mparte n 3 subloturi:

o cu caractere organoleptice normale;o cu uoare modificri organoleptice;o cu caractere organoleptice evident modificate.Din fiecare sublot se recolteaz o prob de 500-1.000 g.

carnea tocat : se recolteaz 200-300 g din fiecare ambalaj n proporie de 1% din numrul acestora (nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5 ambalaje);

preparate din carne : batoanele sau calupurile recoltate se secioneaz longitudinal realizndu-se examenul organoleptic; cele dou jumti constituie proba i contraproba; dintr-una din jumti se recolteaz (de la mijloc i de la capete) 300-800 g i se trimit la laborator;

recoltarea probelor de conserve: se face n funcie de mrimea lotului, astfel:

Mrimea lotului Numrul de recipieni recoltaiPn la 1.000 21.001-5.000 55.001-10.000 1010.001-50.000 2050.001-150.000 30

recoltarea semiconservelor : se recolteaz pe loturi n funcie de mrimea acestora, astfel:

o pn la 1.000 de recipiente se recolteaz 2 recipiente;o ntre 1.001-2.000 recipiente se recolteaz 4 recipiente;o ntre 2.001-3.000 recipiente se recolteaz 6 recipiente;o ntre 3.001-5.000 recipiente se recolteaz 8 recipiente.

recoltarea probelor de lapte: dac recoltarea se face n ferm se va ine cont i de igiena adpostului a mulgtorului i a animalului; recoltarea se face n recipieni sterili din fiecare sfert n parte eliminnd primele jeturi; pentru depistarea mamitelor streptococice recoltarea se va realiza de la nceputul mulsului; pentru tuberculoz de la sfritul mulsorii, iar pentru bruceloz de mijlocul mulsului;

n cazul produselor n ambalaje sub un kilogram proba va fi constituit din ambalajul original, iar n cazul celor peste un kilogram se recolteaz aseptic 250-500 ml de lapte.

recoltarea probelor de lapte praf : se efectueaz cu o sond steril, ndeprtndu-se stratul superficial pe o adncime de 5-10 cm; n cazul ambalajelor mici se recolteaz 1% din lot, iar a celor mari 10% din lot realizndu-se o prob medie de 250 g;

21

recoltarea probelor de lapte concentrat : se realizeaz din 5% din numrul ambalajelor care formeaz lotul; acesta este format din maximum 2.000 l de lapte concentrat pentru ambalajele mari (bidoane, butoaie) i maximum 3.000 l pentru cutii; recipienii se sterilizeaz prin flambare i se deschid cu un perforator steril; se recolteaz 25 g din care se cntresc aseptic 10 g; prima diluie se face cu citrat de sodiu 1,25%;

recoltarea probelor de smntn : lotul este format din maximum 500 kg (n cazul ambalajelor de desfacere) i maximum 3.000 kg (la ambalajele de transport); n cazul smntnii ambalate n bidoane se deschid 5% din numrul acestora i se recolteaz 250 g; n cazul ambalajelor de transport se recolteaz 1% din unitile de ambalaj;

recoltarea produselor lactate acide : din ambalajele mici se recolteaz 1%, iar din cele mari 10% (circa 500 ml), n recipieni sterili adecvai;

recoltarea probelor de unt: se face cu ajutorul unei sonde speciale att de la suprafa ct i din profunzime, recoltndu-se cte 200 g din care se face o prob medie;

recoltarea probelor de ngheat : se realizeaz pe loturi; lotul reprezint o arj de fabricaie din acest sortiment; examenul bacteriologic se realizeaz pe minimum 3 ambalaje;

recoltarea probelor de brnzeturi : se realizeaz cu cuitul, sonda sau se pot recolta buci ntregi; brnza telemea ambalat n butoaie: se recolteaz o bucat de la suprafa i o bucat din profunzime, precum i 200-300 ml de saramur; brnza proaspt de vaci se recolteaz prin deschiderea a 10% din ambalajele care formeaz lotul; dac ambalajele sunt mari (bidoane, tvi) se iau probe de la suprafa i din profunzime i se formeaz o prob medie din care se recolteaz 200-300 g, care se trimit la laborator; dac ambalajele sunt mici (pachete de 300 g) se recolteaz 2% din numrul unitilor de ambalaj;

Probele de pete: se recolteaz de la mijlocul i din partea inferioar a ambalajului cel puin cte 2 peti sau dou buci de pete; n cazul petilor peste 1 kg, se recolteaz o fie transversal de carne (200-500 g), care se ambaleaz n hrtie cerat, se eticheteaz i se sigileaz pstrndu-se n loc uscat, ntunecos i rece (maximum 8C); probele se supun analizei n maxim 12 ore de la recoltare; petele afumat (lot maxim 500 kg) se prelucreaz n acelai mod.

1.2. Ambalarea i expedierea probelor

Ambalarea se realizeaz corespunztor fiecrui tip de prob, se sigileaz i se individualizeaz prin etichetare, trimindu-se n cel mai rapid timp la laborator.

1.3. Primirea i prelucrarea probelor n laborator

- probele se nregistreaz, se verific i se stabilete conduita de lucru;

22

- se controleaz recipienii de recoltare, cum ar fi sacii sau sticlele de plastic, care trebuie s fie intacte;

- se eticheteaz corect fiecare prob i se individualizeaz;- este de dorit ca examinarea s se realizeze imediat dup primirea probelor; dac

acest lucru nu este posibil probele se pstreaz la frigider (probe perisabile, necongelate) sau la congelator (-20C) n cazul probelor congelate.

1.4. Examenul de laborator

Se realizeaz prin mbogirea, izolarea i identificarea agentului microbian presupus prin metode ct mai simple, precise i rapide.

Rezultatele obinute se consemneaz n registrele de diagnostic ale laboratorului pe baza crora se ntocmete buletinul de analiz.

1.5. Determinarea numrului total de germeni (NTG)

NTG reprezint un indicator microbiologic sanitar, care poate furniza informaii asupra strii de contaminare a produsului sau obiectului analizat.

Metoda culturilor n plci Petri pentru determinarea unitilor formatoare 1. de colonii (UFC).

Din materialul examinat se fac diluii zecimale astfel:la o cantitate de 50 g de prob se adaug 450 ml de tampon fosfat Butterfield

i se amestec bine ntr-un blender 2 minute; astfel se obine diluia 10-1;se folosesc pipete sterile, care se schimb la fiecare diluie, transfernd

10 ml din diluia 10-1 n diluia 10-2 i aa mai departe pn la ultima diluie n 90

ml de diluant; numrul diluiilor se stabilete n funcia de condiia microbiologic urmrit;

din diluiile executate se fac nsmnri n plci Petri introducnd cte 1 ml din fiecare diluie ntr-o plac; rezultate mai exacte se obin dac se nsmneaz cte 2 plci pentru fiecare diluie;

n fiecare plac se toarn apoi peste suspensie 20 ml de agar topit i rcit la 44-46C;

se omogenizeaz bine astfel nct bacteriile s fie repartizate uniform n mediul de agar, n vederea obinerii coloniilor izolate; se consider c o colonie izolat reprezint rezultatul multiplicrii unei singure celule bacteriene;

plcile nsmnate se pun la termostat la 35C, iar dup 48 2 ore se numr coloniile rezultate din fiecare diluie; se numr plcile cu un coninut ntre 25 i 225 de colonii;

pentru a afla numrul de germeni se nmulete numrul coloniilor existente ntr-o plac cu diluia respectiv; pentru obinerea unor rezultate mai precise se numr

23

coloniile din mai multe plci, se nmulete fiecare cifr aflat cu diluia respectiv, iar apoi se face media aritmetic; rezultatul se exprim prin UFC, care corespunde cu numrul coloniilor gsit pe unitatea de volum sau greutate din materialul examinat.

altE MEtODE aCCEPtatE

- metoda plcilor spiralate;- metoda gelului de pectin;- metoda filmelor rehidratabile uscate.

Metode indirecte pentru determinarea ntg

1. Metoda cu albastru de metilen.Principiul metodei: Se adaug o cantitate mic de albastru de metilen la proba

de lapte. Datorit aciunii oxidoreductoare a microorganismelor se va produce decolorarea laptelui. n funcie de intervalul de timp n care s-a produs decolorarea se apreciaz indirect NTG din lapte.

Materiale necesare. eprubete cu diametrul de 2 centrimetri; baie de ap electric sau termostat; soluie de albastru de metilen.

Tehnica de lucru: ntr-o eprubet steril se adaug 1 mililitru soluie de albastru de metilen. Se adaug 10 ml lapte din proba de analizat (nclzit n prealabil la 38-40C). Se omogenizeaz bine. Se introduce eprubeta n baie de ap sau n termostat la o temperatur de 38C.

Se urmrete decolorarea: dup 20 minute; dup 2 ore i dup 5 ore i jumtate.Determinarea se consider ncheiat, cnd ntreaga prob de lapte s-a decolorat.

n funcie de intervalul de timp, n care are loc decolorarea, laptele se poate mpri n patru clase de calitate:

2. Metoda cu resazurinPrincipiul metodei: Resazurina este o oxazon, care introdus n lapte determin

o coloraie albastr.Sub aciunea microorganismelor este redus n rezorufin de culoare roz-roiatic

i apoi n dehidrorezorufin, care este incolor.Materiale necesare:

eprubete sterile cu dop de cauciuc; pipete sterile de 1 ml i de 10 ml; resozurin, soluie apoas 0,05% (proaspt pregtit cu ap steril); baie electric sau termostat reglabil la 37C.

Tehnica de lucru: Se depune 1 ml de soluie de resazurin ntr-o eprubet steril. Se adaug 10 ml de lapte, din proba de analizat. Se nchide eprubeta cu un dop de

24

cauciuc, se omogenizeaz i se introduce n baie de ap sau n termostat la 37C. Dup o or, proba se omogenizeaz din nou i se apreciaz nuana de culoare, n funcie de care laptele se ncadreaz, n 4 grupe.

3. Proba catalazei.Cantitatea de catalaz din lapte variaz n funcie de ncrctura microbian

a acestuia i de coninutul n leucocite. Prin dozarea catalazei se poate aprecia att starea de sntate a glandei mamare, ct i condiiile de igien n care a fost recoltat, manipulat i pstrat laptele.

Principiul metodei: Se bazeaz pe proprietatea catalazei de a descompune apa oxigenat, elibernd oxigenul sub forma bulelor de gaz.

Materiale necesare: ap oxigenat, soluie 3%; catalazometru (dispozitiv Lobek).

1. Laptele cu un coninut normal de germeni pune n libertate oxigen, care este capabil s disloce mai puin de 1 ml ap.

2. Laptele cu un coninut mai mare de germeni (suspect) - elibereaz oxigen, care disloc 1- 3 ml ap.

3. Laptele cu germeni peste limita admis (necorespunztor) - elibereaz oxigen care disloc mai mul de 3 ml de ap.

25

26

DEtErMInarEa nUMRULUI TOTAL DE GERMENI (NTG)

1:10

(10-1)

10 ml

50 g aliment se amestec la

10.000-12.000 RPM pentru 2 minute

450 g diluant tampon fosfat Butterfield

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

1:100

(10-2)

1:1000

(10-3)

1:10000

(10-4)

1:100000

(10-5)

1:1000000

(10-6)

1. Se amestec proba alimentar ntr-un blenderrotativ de nalt vitez.

2. Se dilueaz omologatul de prob alimentar.

3. Se transfer din fiecare diluie, 1 ml, n cte 2 plci Petri sterile.

4. Se toarn 20 ml agar n plcile de numrare.

5. Se incubeaz la 35 grade Celsius pentru 48 de ore6. Se numr plcile ce conin ntre 25 i 250 de colonii i se nmulete numrul coloniilor dintr-o plac cu reciproca diluiei; NTG se exprim prin numrul de microorganisme/g aliment

DEtErMInarEa nUMRULUI TOTAL DE GERMENI (NTG)

1:10

(10-1)

10 ml




10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

1:100

(10-2)

1:1000

(10-3)

1:10000

(10-4)

1:100000

(10-5)

1:1000000

(10-6)



3. Se transfer din fiecare diluie, 1 ml, n cte 2 plci Petri sterile.

4. Se toarn 20 ml agar n plcile de numrare.

5. Se incubeaz la 35 grade Celsius pentru 48 de ore6. Se numr plcile ce conin ntre 25 i 250 de colonii i se nmulete numrul coloniilor dintr-o plac cu reciproca diluiei; NTG se exprim prin numrul de microorganisme/g aliment

(schem adaptat dup W. Andrews, 1992)

CAPITOLUL 2DEtErMInarEa tItrUlUI COlI I A

baCtErIIlOr COlIFOrME

Enterobacteriaceele sunt prezente n intestinul animalelor i al omului, iar fecalele conin peste 1010 per gram enterobacterii, de unde ajung n mediul ambiant (sol, ap, plante, animale). Sunt cunoscute ca fiind agenii etiologici ai sindromului diareic infecios.

Grupul coliformilor se limiteaz la bacterii care cresc n tractul gastrointestinal al omului i al animalelor i include 5 genuri: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Raoultella - adugat de curnd, formnd o parte din genul Klebsiella. Aceste bacterii prezint o mare importan pentru microbiologia alimentar deoarece reprezint unul din cei mai utilizai indicatori microbiologici sanitari care reflect condiiile de igien la prelucrarea i manipularea produselor, iar n multe situaii reflect modul de respectare al diferitelor tratamente termice (de exemplu, pasteurizare) aplicate diverselor produse. Separarea bacteriilor coliforme n cele de origine fecal i nefecal se face prin folosirea temperaturilor ridicate.

Prin definiie grupul coliformilor fecali conine bacili sau cocobacili Gram negativi, nesporogeni, aerobi i facultativ anaerobi, mobili prin flageli peritrichi sau imobili care fermenteaz lactoza cu producere de gaz i produc colonii nchise la culoare ce au suprafaa cu luciu metalic i reflex auriu-verzui n decurs de 48 de ore la 45,5C.

Din genul Enterobacter, speciile mai importante pentru microbiologia alimentar sunt: E. (Pantoea) agglomerans, care a fost transferat n genul Pantoea i E. sakazakii.

Citrobacter produce colonii tipice pigmentate n galben, fermenteaz lent lactoza i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Specia prevalent din alimente este C. freundii, care se gsete de obicei n legume i carnea proaspt.

Klebsiella cuprinde mai multe specii trecute de curnd n genul Raoultella: K. (Raoultella) terrigena, R. planticola, R. ornitinolytica, ce se izoleaz din sol, ap, plante dar i de la nivelul tubului digestiv. Contamineaz frecvent alimentele, de obicei n asociaie cu alte microorganisme, determinnd alterarea acestora.

Escherichia, ncadreaz specia E. coli, care este larg rspndit n natur i reprezint microflora dominant a intestinului gros, de unde prin intermediul fecalelor se elimin n mediul exterior contaminnd solul, apa, furajele, alimentele, etc. Tulpinile capabile de a provoca mbolnviri la om se situeaz ntr-una din cele 4 categorii de E. coli enteropatogen:

1. Tulpini enteropatogene (EPEC);2. Tulpini enterotoxigene (ETEC);3. Tulpini enterohemoragice (EHEC);4. Tulpini enteroinvazive (EIEC).

27

tehnica de lucru:Determinarea prezenei i a numrului de bacterii coliforme se poate efectua att

n medii lichide ct i pe medii solide, de izolare selectiv (fr mbogire).1. Se cntresc 50 g de prob ntr-un blender de nalt vitez. Se adaug 450

ml de fosfat tampon Butterfield i se omogenizeaz 2 minute la 10.000-12.000 rot/min. Astfel se obine diluia 10-1.

2. Toate diluiile zecimale se pregtesc cu 90 ml diluant + 10 ml din diluia anterioar. Diluiile pregtite depind de densitatea anticipat a coliformilor. Se omogenizeaz bine fiecare diluie.

3. Pentru testul prezumptiv se transfer cte 1 ml din fiecare diluie n cte 3 tuburi per diluie cu bulion LT (lauril-triptoz). Pipeta se ine n aa fel nct marginea sa inferioar s fie sprijinit de tub.

4. Se incubeaz tuburile 24-48 de ore, la 35C. Se examineaz la 24 de ore pentru producia de gaz n tubul Durham.

5. Se reincubeaz tuburile negative nc 24 de ore i se examineaz pentru a doua oar pentru producia de gaz.

6. Se efectueaz testul de confirmare pe toate tuburile prezumptiv pozitive (productoare de gaz). Se consider c bacteriile coliforme sunt prezente dac se observ att dezvoltarea bacterian ct i apariia gazelor n tubul de fermentare, iar n urma coloraiei Gram, la examinarea frotiului apar exclusiv bacili sau cocobacili Gram negativi. n acest caz, n funcie de diluiile pozitive se raporteaz prezena sau absena coliformilor la o anumit cantitate de produs. De exemplu: s-au confirmat bacterii coliforme n diluiile 10-1 , 10-2. Aceasta denot c bacteriile coliforme sunt prezente n 0,01 g prob, dar sunt absente n 0,001 g de prob.

2.1. Testul de confirmare pentru coliformii totali

1. Se agit uor fiecare tub cu mediul LT (lauril-triptoz), care elibereaz gaze i se transfer o ans din suspensie ntr-un tub cu mediu BGB (bulion cu bil verde-briliant 2%).

2. Se incubeaz tubul BGB 48 de ore la 35C. 3. Se examineaz pentru producia de gaz i se nregistreaz.4. Se consider reacie pozitiv atunci cnd prezena gazelor apare n cel puin

1/10 din nlimea tubului Durham.5. Se calculeaz numrul cel mai probabil de germeni (MPN = most probable

number) pe baza combinaiei unor tuburi LT (M47), cu eliberare de gaze confirmate de-a lungul a trei diluii consecutive. n funcie de numrul de eprubete pozitive, din fiecare diluie se raporteaz MPN per gram (ml) produs, conform tabelului Mc Crady. De exemplu: dac s-au confirmat bacterii coliforme n 3 eprubete cu diluia 10-1 , n dou eprubete cu diluia 10-2, i n dou eprubete cu diluia 10-3 , se va obine combinaia de 3 cifre 322, n dreptul creia se va citi din tabelul Mc Crady MPN-ul.

28

2.2. Testul de confirmare pentru coliformii fecali

1. Se agit uor fiecare tub LT care elibereaz gaze i se transfer o ans din fiecare suspensie n tubul cu mediu EC.

2. Tubul cu mediul EC se incubeaz 48 de ore la 45,5C. Examinarea produciei de gaz se face dup 24 de ore, iar dac testul este negativ se examineaz din nou dup 48 de ore.

3. Se calculeaz MPN pentru de coliformii fecali pe baza proporiei tuburilor confirmate productoare de gaz pe mediul EC, pentru 3 diluii consecutive.

2.3. Testul de confirmare pentru Escherichia coli

Se aplic o ans de suspensie din fiecare tub eliberator de gaz, cu mediul EC pe agar L-EMB (Levine eozin albastru de metilen) (M 49).

Se incubeaz plcile timp de 18-24 de ore la 35C.Se examineaz coloniile, iar cele tipice pentru E. coli au centrul ntunecat i

suprafaa cu sau fr luciu metalic.Se transfer 2 colonii tipice din fiecare plac cu agar L-EMB pe pante PCA

(plate count agar) (M 8) pentru testele morfologice i biochimice.Se incubeaz mediul nsmnat 18-24 de ore la 35C.Se recolteaz 2 colonii din fiecare plac.Se efectueaz coloraia Gram din fiecare cultur.Pentru toate culturile Gram negative cu bacili scuri sau cocobacili se urmrete

n continuare: producia de indol; testul Voges-Proskauer; testul roului metil, producia de gaz din lactoz.

Interpretarea reaciei: toate culturile care fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; sunt bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; i dau tipuri de IMViC de ++-- (biotipul 1) sau -+-- biotipul 2 sunt considerate a fi E. coli.

Se calculeaz MPN pe baza proporiei de tuburi cu mediu EC n 3 diluii succesive care s-au dovedit a fi E. coli.

2.4. Metoda MUG pentru numrarea rapid a lui E. coli din alimente refrigerate sau congelate

Acest test se bazeaz pe determinarea glucuronidazei, enzim posedat de majoritatea tulpinilor de E. coli spre deosebire de celelalte bacterii intestinale.

Substratul MUG (4-metilumbeliferil beta D-glucuronidaz) se ncorporeaz n bulionul LT. Tuburile inoculate se incubeaz n condiii specifice i se examineaz n lumina UV pentru prezena ca produs final a unei glucuronidaze fluorogene. Fluorescena n mediul LT-MUG (M 48) termolabil indic prezena lui E. coli.

29

2.5. Testul prezumptiv LT-MUG pentru E. coli

1. Se prepar probele alimentare dup cum s-a descris la metoda convenional.

2. Se prepar diluii zecimale ca la metoda convenional.3. Se inoculeaz 1 ml n trei tuburi LT-MUG pentru fiecare diluie.4. Se incubeaz tuburile 24 de ore la 35C i se examineaz: creterea, producia

de gaz i fluorescena. Fluorescena se examineaz la o lamp cu UV la ntuneric. Dac aceasta este albstruie testul este pozitiv.

2.6. Testul de confirmare a LT-MUG

1. Din fiecare tub fluorescent, se nsmneaz prin striere o ans pe agar L-EMB i se incubeaz 24 de ore la 35C.

2. Interpretare: toate culturile care devin fluorescente n mediul LT-MUG; fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; apar ca bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; dau tipurile ++-- (biotipul 1) sau -+-- (biotipul 2), sunt considerate a fi E. coli.

SPECIa I M v C

E. coli + + - -

E. aerogenes - - + +

Citrobacter sp. +/- + - +

K. pneumoniae +/- - + +

SPECIa Lactoz Sorbitol I vP Rou-metilPigment galben

Decarboxilaz

E. albertii - - - - + - +

E. blattae - - - - + - +

E. fergusonii - - + - + - +

E. vulneris -/+a - - - + -/+ +

E. hermannii -/+ - + - + + -

E. coli + + + - + - +

30

31

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr tOtalI



3. test prezump-tiv. Se incubeaz la 35C pentru 24-48 de ore

4. test de confir-mare.

Se incubeaz la 35C 48 de ore

5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz MPN din tabele.




90 ml diluant

Bulion lauril-triptoz

Bulion BGB 2%

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr tOtalI






5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz MPN din tabele.




90 ml diluant


Bulion BGB 2%


32

DEtErMInarEa lUI E. COLI

- tEStUl MUg -



3. test prezump-tiv. Se incubeaz la 35C pentru 24 de ore

4. nsmnarea tuburilor fluores-cente.

5. Reacia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.




90 ml diluant

Bulion lauril-triptoz - MUG

Tuburile EC gaz pozitive pentru coliformii fecali

fluorescent

nefluorescent

Agar Levine-EMB

DEtErMInarEa lUI E. COLI

- tEStUl MUg -



3. test prezump-tiv. Se incubeaz la 35C pentru 24 de ore

4. nsmnarea tuburilor fluores-cente.

5. Reacia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.




90 ml diluant

Bulion lauril-triptoz - MUG


fluorescent

nefluorescent

Agar Levine-EMB


33

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr FECalI I a lUI E. COLI MEtODa COnvEnIONAL






5. nsmnare n plci Petri pentru obinerea de colonii izolate6. Reacia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.




90 ml diluant


Mediu


Se transfer bu-lioanele LT gaz pozitive pe me-diul EC

DEtErMInarEa COlIFOrMIlOr FECalI I a lUI E. COLI MEtODa COnvEnIONAL






5. nsmnare n plci Petri pentru obinerea de colonii izolate6. Reacia IMViC E. coli: I +/-; M +; VP -; C -.




90 ml diluant


Mediu


Se transfer bu-lioanele LT gaz pozitive pe me-diul EC


CAPITOLUL 3IZOLAREA I IDENTIFICAREA SALMONELELOR

DIn alIMEntE DEtErMInarEa baCtErIIlOr DIn gEnUl SalMOnElla

3.1. Consideraii generale

Bacteriile din genul Salmonella au o rspndire universal, putnd afecta ntregul regn animal, inclusiv omul.

Toxiinfeciile alimentare produse de salmonele, din punct de vedere al frecvenei i al implicaiilor igienico-sanitare ocup primul loc n majoritatea rilor. Acestea apar mai frecvent n anotimpurile calde (mai-octombrie), cnd exist mai muli purttori umani i animali, temperatura fiind factor favorabil pentru dezvoltarea i multiplicarea germenilor.

Majoritatea salmonelelor care produc toxiinfecii alimentare la om, nu produc semne clinice la animale. Principalele rezervoare pentru infecia uman sunt reprezentate de psri, bovine, ovine i porcine.

La animale infecia este ntreinut de reciclarea deeurilor din abatoare ca hran pentru animale, transmiterea fecal-oral i contaminarea fecal a oulor.

Transmiterea la om are loc o dat cu introducerea carcaselor de carne, lapte nepasteurizat sau ou infectate n buctrii. Acestea se multiplic n alimente datorit condiiilor de igien necorespunztoare, cum ar fi: modul de preparare, contaminarea ncruciat a alimentelor deja preparate i depozitarea inadecvat.

Exist mai multe tipuri de epidemii produse de ctre salmonele la om:tipul surs punctiform, n care majoritatea cazurilor primare apar ntr-o

perioad de 12-72 ore de la consumul alimentului contaminat;tipul surs comun continu sau larg rspndit, n care alimentul

(medicamentul) contaminat este distribuit pe scar larg (epidemii rspndite n Marea Britanie prin salam i psti de fasole, consum de ou i carne de pui insuficient preparate).

epidemii cu transmitere interuman; se ntlnesc cel mai frecvent n instituii n care exist dificulti n meninerea igienei (spitale psihogeriatrice).

epidemii care ntrunesc caracteristicile tuturor celor trei tipuri descrise mai sus, ntlnite n spitale.

Salmonelele sunt bacili sau cocobacili mici, Gram negativi, mobili (cu excepia lui S. pullorum-gallinarum) nesporogeni i necapsulogeni, indistinci microscopic sau pe mediile de cultur de E. coli.

Exist peste 2400 de serotipuri de Salmonella, grupele majore fiind reprezentate de:

- grupul I S. enterica subsp. enterica;34

- grupul II S. enterica subsp. salamae;- grupul III S. enterica subsp. arizonae;- grupul III b S. enterica subsp. diarizonae;- grupul IV S. enterica subsp. houtenae;- grupul V S. enterica subsp. indica.

Grupul V a cptat statutul de specie, ca S. bongori. Aceste schimbri au avut loc pe baza hibridizrilor ADN-ARN i a electroforezei enzimatice multiloculare. Serovarurile se pot scrie cu liter mare. De exemplu: S. enterica serovar Typhimurium poate fi notat S. Typhimurium. Din punct de vedere epidemiologic, salmonelele pot fi plasate ntr-una din urmtoarele trei grupe:

1. Serotipuri monopatogene pentru om: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi C, care sunt agenii febrei tifoide i paratifoide.

2. Serovaruri adaptate gazdei (patogeni umani ce pot fi contactai din alimente). S. Gallinarum (carnea de pasre), S. Dublin (carnea de vit), S. Abortus-equi (cal), S. Abortus-ovis (oaie), S. cholerae-suis (carnea de porc).

3. Serovaruri inadaptate (fr gazd preferenial); patogeni pentru oameni i animale i includ majoritatea serovarurilor care produc toxiinfeciile alimentare.

3.2. Metoda de lucru

Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se face conform metodelor stabilite de standarde, din care menionm pe cea descris n ISO 6579/1995.

1. Prembogire neselectiv: se cntresc 25 grame de produs alimentar n 225 ml ap peptonat tamponat;

2. Se incubeaz la 35C, 24 de ore;3. mbogire selectiv: a) se transfer 0,1 ml cultur obinut n faza de

prembogire ntr-o eprubet care conine 10 ml de bulion tetrationat (M72); b) se transfer 1 ml cultur din mediul de prembogire

selectiv ntr-o eprubet cu 10 ml de bulion selenit cistin (SC).Numai n cazul amestecului de probe incubate care conin molute, se transfer

0,1 ml la 10 ml de mediu Rappaport-Vassiliadis (RV) (M59) i un alt mililitru la 10 ml de bulion TT.

4. Se incubeaz bulioanele la 35C, 24 de ore.5. Izolarea pe medii selective agarizate:

a) Se striaz cu ajutorul unei anse pe suprafaa unei plci Petri mari (140 mm), care conine primul mediu selectiv de izolare n trei plci cu agar BS (agar cu sulfit de bismut HE (agar Hekten enteric) (M43) i XLD (agar cu xiloz-lizin-dezoxicolat) (M69). Plcile cu sulfit de bismut se prepar cu o zi nainte i se pstreaz pn la nsmnare la ntuneric i la temperatura camerei.

35

Se repet nsmnarea cu 3 ml de bulion din cultura obinut n mediul Rappaport-Vasiliadis pe agar cu rou fenol i verde briliant Edel i Kampelmaker, pentru probele de molute.

b) Se procedeaz la fel i cu cel de-al doilea mediu de izolare selectiv SC (bulion selenit cistin) n vederea obinerii de colonii izolate.

Mediul BS este nalt selectiv, iar HE i XLD sunt moderat selective.6. Se incubeaz plcile la 35C, 24-48 ore.7. Se examineaz plcile pentru prezena unor colonii suspecte de a face parte

din genul Salmonella.a) Agar Hekten enteric (HE) (M43) coloniile tipice sunt albastre verzui

sau bleu cu sau fr centru negru; multe culturi de Salmonella pot produce colonii cu centre mari, negre, lucioase sau pot s apar sub forma unor colonii aproape complet negre; n mod atipic, cteva specii de Salmonella produc colonii galbene, cu sau fr centre negre.

b) Agar cu sulfit de bismut (BS) (M23) coloniile tipice de Salmonella pot fi maro, gri sau negre; uneori prezint luciu metalic; mediul din jurul coloniilor este, de obicei, la nceput cafeniu, dar poate deveni negru, o dat cu prelungirea incubaiei, producnd aa numitul efect de halou. Unele tulpini pot produce colonii verzi, mediul nconjurtor fiind slab negricios.

c) Agar cu xiloz-lizin-dezoxicolat (XLD) (M69) coloniile tipice sunt roz, cu sau fr centre negre; multe culturi de Salmonella pot avea centre mari, negre, lucioase sau colonii aproape complet negre; atipic, cteva specii de Salmonella pot produce colonii galbene, cu sau fr centre negre.

8. Confirmare: Selectarea coloniilor: se recolteaz din fiecare plac cu mediu selectiv de izolare

5 colonii caracteristice i se nsmneaz pe agar TSI (M73) i agar LI (lizin fier) (M74); se incubeaz mediile la 35C, 24 de ore, n cazul agarului TSI i 48 de ore la 35C (LI agar).

Agar TSI:Se nsmneaz suprafaa nclinat a agarului prin striere i poriunea dreapt

(baza) prin nepare; se incubeaz; se interpreteaz:a) Masa mediului (poriunea dreapt):

galben = denot fermentarea glucozei (G+);roie = nu are loc fermentarea glucozei (G-);neagr = la limita ntre poriunea dreapt i cea nclinat (H2S +

formare de hidrogen sulfurat);bule sau fisuri = formare de gaz din glucoz.

b) Suprafaa nclinat (panta):galben = fermenteaz lactoza i zaharoza;roie = lactoz i zaharoz negative;

36

Culturile tipice de Salmonella fermenteaz glucoza i nu fermenteaz lactoza i zaharoza:

panta (poriunea nclinat) de culoare roie (alcalin);baza (poriunea dreapt) galben (acid);cu formare de bule de gaz (spargerea mediului);formare de hidrogen sulfurat nnegrire (90% din cazuri).

n agarul LI, Salmonella produce o reacie alcalin, coloraie purpurie (violet) n poriunea dreapt a mediului. Se consider reacie negativ (acid) numai culoarea galben distinct n poriunea dreapt a mediului. Majoritatea salmonelelor produc H2S n agar LI.

Alte teste biochimice:1. Testul ureazei: Se inoculeaz cteva colonii prezumptiv pozitive de pe fiecare

pant de agar n tuburi cu bulion cu uree (M75). Se incubeaz 24 de ore la 35C.Reacie pozitiv: n urma nsmnrii unei bacterii care hidrolizeaz ureea

mediul iniial galben se coloreaz n rou, datorit virrii roului fenol n prezena amoniacului, metabolit rezultat din descompunerea ureei.

2. Mediul cu cianur de potasiu (KCN) (M58): Dac are loc creterea bacteriilor (indicat prin turbiditate) reacia este pozitiv. Majoritatea speciilor de Salmonella sunt negative la acest test.

3. Bulion cu malonat: Se inoculeaz 3 mililitri de cultur bacterian de 24 de ore prezumptiv pozitiv n bulion malonat (M76). Se incubeaz 48 de ore la 35C, dar se examineaz i dup 24 de ore. Dac testul este pozitiv mediul devine albastru, iar dac este negativ culoarea bulionului va rmne nemodificat.

4. Testul indolului reacie negativ-inel galben.5. Reacia Voges-Proskauer (M68) reacia pozitiv este indicat de apariia unei

culori roz, pn la rou n toat coloana mediului. Salmonelele dau reacii negative la acest test.

6. Testul roului metil majoritatea salmonelelor dau test pozitiv, indicat de culoarea roie, difuz a mediului.

Se consider ca nefiind Salmonella, culturile care dau rezultate pozitive la KCN i VP i rezultate negative la testul roului metil.

7. Agar cu citrat Simmons (M64): Test pozitiv: prezena creterii este nsoit de modificarea culorii mediului din verde n albastru; majoritatea culturilor de Salmonella sunt citrat-pozitive.

Confirmarea serologic:Punerea n eviden a antigenelor O, H i Vi ale salmonelelor se face prin reacia

de aglutinare pe lam cu serul corespunztor al coloniilor pure, dup eliminarea surselor autoaglutinabile.

Eliminarea surselor autoaglutinabile:Se aplic pe o lam de sticl bine splat soluie salin n care se disperseaz o

37

parte din coloana ce urmeaz a fi testat obinnd o suspensie omogen i tulbure. Se oscileaz lama n plan orizontal 30-60 secunde; se examineaz pe un fond ntunecat; dac bacteriile aglutineaz (se adun n grmezi) nseamn c sursa este autoaglutinabil i nu se mai supune ncercrilor ulterioare.

Punerea n eviden a antigenelor O:Se folosete o colonie pur neautoaglutinabil i se procedeaz ca mai sus, numai

c soluia salin se nlocuiete cu o pictur de antiser O.Test pozitiv: aglutinare n amestecul testat; absena aglutinrii n martorul salin.Reacia negativ nu exclude prezena unei specii a acestui gen, deoarece Ag O

poate fi mascat de Ag Vi de la suprafaa bacteriei (antigen de nveli), n aceast situaie fiind necesar aglutinarea rapid cu ser anti Vi. Aceast reacie se efectueaz n prezena unor martori constituii din suspensiile de antigen, la care se adaug ser fiziologic, ser normal i ser cunoscut pozitiv.

Aglutinarea cu seruri de grup O se folosete pentru stabilirea grupei serologice din care face parte tulpina supus analizei.

3.3. Sistemele microtest

Micrometodele (microtestele) reduc volumul substratului enzimatic i permit deseori o citire rapid ntre 4 i 6 ore pn la 18 ore de incubare.

Dup izolarea pe medii selective coloniile suspecte se pot identifica biochimic prin intermediul sistemelor microtest, folosind scheme, tabele sau sisteme codificate de ncadrare.

Sistemele microtest sunt cunoscute sub diverse denumiri comerciale. Pentru identificarea salmonelelor din alimente se va folosi oricare din cele 4 sisteme biochimice comerciale (API 20E, Enterotub II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID).

Pentru confirmare se recurge apoi la testul serologic somatic (O) i testul flagelar (H) sau testul flagelar Spicer-Edwards.

Se confirm a fi Salmonella acea cultur clasificat cu kit-urile biochimice comerciale ca prezumptiv, cnd aceasta este pozitiv la testul somatic (O) i testul flagelar (H).

38

39

IZOlarEa I IDEntIFICarEa

gEnUlUI SalMOnElla

1. Omologat alimentar

2. Prembogire

Incubare la 35C, 24 de ore

3. mbogire selectiv. Incubare la 35C, 24 de ore

4. nsmnare n plci Petri.

Incubare la 35C, 24-48 de ore

5. nsmnare pe mediul tSI i lI.

Incubare la 35C, 24 de ore (agar TSI) sau 48 de ore (agar

LI).

5. Confirmare biochimic i serologic

25 g aliment

225 ml mediu de prembogire

10 ml bulion selenit cistin

Agar TSI

10 ml bulion tetrationat

Pant alcalin (roie)

Baz acid (galben)

Baz alcalin(purpurie)

Agar lI Cu sau fr nnegrire (producia de H2S)

IZOlarEa I IDEntIFICarEa

gEnUlUI SalMOnElla

1. Omologat alimentar

2. Prembogire

Incubare la 35C, 24 de ore

3. mbogire selectiv. Incubare la 35C, 24 de ore

4. nsmnare n plci Petri.

Incubare la 35C, 24-48 de ore

5. nsmnare pe mediul tSI i lI.

Incubare la 35C, 24 de ore (agar TSI) sau 48 de ore (agar

LI).

5. Confirmare biochimic i serologic

25 g aliment

225 ml mediu de prembogire

10 ml bulion selenit cistin

Agar TSI

10 ml bulion tetrationat

Pant alcalin (roie)

Baz acid (galben)

Baz alcalin(purpurie)

Agar lI Cu sau fr nnegrire (producia de H2S)


40

Salmonella enterica.Microscopie electronic. Se remarc prezena flagelilor peritrichi

Salmonella Typhi - coloraie flagelar CDC

Salmonella sp. - Agar XLDCultur de 24 de ore. Zonele de culoare neagr reprezint depozite de H2S, n condiii alcaline Salmonella choleraesuis subsp. arizonae

(Salmonella Arizonae)Agar cu snge

41

Salmonella mediul Edel i Kampelmacher (colonii izolate)

Salmonella mediul TSI

(mediu politrop)

Salmonella TyphimuriumCultur pe agar Hektoen enteric (HE)

Formeaz colonii albastre verzui

Salmonella spp. Agar CSE (Chromogenic Salmonella Esterase)Dup 24 de ore de incubare la 37C sau la 42C, coloniile de Salmonella sp. apar colorate n viiniu, pe fond galben-transparent al mediului de cultur

Salmonella spp. Cultur pe agar SS (Salmonella-Shigella).

CAPITOLUL 4IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA

4.1. Caracterizare general

Shigeloza este o boal infecioas, care se rspndete cel mai frecvent de la o persoan la alta.

Categoria de populaie cea mai afectat este reprezentat de copiii mici inui n condiii de igien precar, aglomeraie, etc.

Boala se poate rspndi i prin ap i alimente contaminate. Alimentele se contamineaz de obicei, prin contactul cu minile.

Alimentele cel mai frecvent implicate n producerea infeciei sunt reprezentate de: salat, carne de pui, carne tocat, sandviuri, fructe i legume, alimente marine. Doza infecioas este de numai 10 bacterii.

Genul Shigella aparine familiei Enterobacteriaceae, ca i Salmonella i Escherichia. Genul cuprinde 4 specii Shi. dysenteriae (grupa A), Shi. flexneri (grupa B), Shi. boydii (grupa C), Shi sonnei (grupa D).

Cele 4 specii sunt plasate n grupe serologice, pe baza antigenelor somatice O. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, imobili, acapsulogeni, asporogeni, oxidaz negativi, produc acid din zaharuri, nu folosesc citraii ca unic surs de carbon, nu se dezvolt n prezena cianurii de potasiu, nu produc hidrogen sulfurat.

Tabel comparativ ntre Salmonella, Shigella i Escherichia

Genul Glucoz Mobilitate H2S Indol Citrat G+C mol %

Escherichia AG + (de obicei) - + (tipul 1) - 48-52Salmonella AG + (tipul 1) + - + 50-53Shigella A - - - - 49-53

Shigella dysenteriae este agentul patogen primar al dizenteriei bacilare clasice, iar celelalte 3 specii produc toxiinfecii alimentare la om.

Shigella este patogen, n mod natural pentru om i maimu. Are drept int plcile Peyer de la nivelul ileonului. Are loc un proces inflamator acut, cu dizenterie. Acest lucru este valabil n special pentru Shi. flexneri. Dintre toate speciile de Shigella, Shi sonnei cauzeaz diaree n majoritatea cazurilor.

Toxina Shiga acioneaz ca o citotoxin cu rol neurotoxic. Este implicat n producerea SUH (sindrom uro-hemoragic) i de cele mai multe ori se asociaz cu tulpinile EHEC de E. coli.

4.2. Izolarea i identificarea shigelelor din alimente

mbogirea la Shi. sonnei:Se cntrete aseptic o prob de 25 de grame n 225 ml de bulion Shigella cu

42

novobiocin 0,5 mg/ml.Amestecul se las 10 minute la temperatura camerei i se agit permanent, dup

care se toarn ntr-un balon Erlenmeyer steril de 500 ml.Balonul se incubeaz anaerob ntr-un sistem Gas Pak, n baie marin, la 44C,

timp de 20 de ore.Se omogenizeaz bine suspensia i se striaz n plci cu agar Mac Conkey. Se

incubeaz 20-48 de ore la 35C.

mbogirea altor specii de Shigella:Se procedeaz ca mai sus, dar se ncorporeaz o cantitate de novobiocin de 3

mg/ml i se incubeaz anaerob n baie marin la 42C.

Izolarea shigelelor:Se examineaz plcile cu agar Mac Conkey. Coloniile de Shigella apar roz palide

i translucide. Coloniile suspecte se nsmneaz n bulion cu glucoz, agar TSI, bulion cu lizin-decarboxilaz, agar pentru testarea mobilitii i tripton.

Se incubeaz la 35C, 20-48 de ore, dar se examineaz la 20 de ore. Se ndeprteaz toate culturile care prezint mobilitate, produc H2S, formeaz gaz, lizin-decarboxilaz, fermenteaz sucroza sau lactoza i produc indol.

Identificarea biochimic:Shigelele pot fi caracterizate biochimic astfel:

teste negative pentru: hidrogen sulfurat, ureaz, glucoz (gaz), mobilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin decarboxilaz (exceptnd Shi. sonnei), sucroz, adonitol, lactoz (2 zile), salicin, inozitol, cianur de potasiu, malonat, citrat, Voges-Proskauer;

teste pozitive pentru: manitol (excepie Shi. dysenteriae) i reacia roului metil.

Caracterizarea biochimic i serologic a genului Shigella

Substrat Pozitiv Negativ Reacia shigelelor

Glucoz (TSI) Baz galben Baz roie +

Glucoz (bulion cu brom-crezol purpur)

Culoare galben i/sau gaz

Culoare neschimbat/Fr gaz

+

Lactoz (TSI) Pant galben Pant roie -

Lactoz (bulion cu brom-crezol purpur)



-

Sucroz (TSI) Pant galben Pant roie -

Sucroz (bulion cu brom-crezol purpur)



-

43


Hidrogen sulfurat (TSI) nnegrire Fr nnegrire -

Ureaz Rou purpuriuFr schimbarea culorii

mediului-


Bulion cu lizindecarboxi-laz

Culoare purpurie Culoare galben -

Bulion cu ornitin decar-boxilaz

Culoare purpurie Culoare galben- (multe tulpini de Shi. sonnei sunt pozitive)

Indol Inel rou Inel galben -

Mobilitate Cretere difuz Fr cretere difuz -

Cianur de potasiu Turbiditate Fr turbiditate -

Malonat Culoare bleuFr schimbarea culorii

mediului-

Citrat Turbiditate Fr turbiditate -

Rou metilCuloare roie

difuzCuloare galben difuz +

Voges-Proskauer Culoare roz-rouFr schimbarea culorii

mediului-

Testul somatic polivalent Aglutinare Fr aglutinare +

Caracterizarea serologic:Se mparte placa Petri cu un creion de cear n 9 dreptunghiuri (3 x 1 cm). n

fiecare dreptunghi se pune cte o pictur dintr-o suspensie de cultur bacterian de pe agar cu infuzie de viel de 24 de ore n 3 ml de ser fiziologic. Se adaug apoi o pictur de antiser polivalent i ser fiziologic. Se amestec coninutul fiecrui dreptunghi cu un ac fin, avnd grij s nu se produc un amestec ntre dreptunghiuri. Se balanseaz placa Petri 3-4 minute pentru a se accelera aglutinarea.

Se citete gradul de aglutinare astfel: 0 = absena aglutinrii, pictura rmne dens i omogen;1+ = aglutinare abia decelabil;2+ = aglutinare cu limpezirea picturii 50%;3+ = aglutinare cu limpezirea picturii 75%;4+ = aglutinare cu limpezire total.

Se reexamineaz suspensia cu seruri monovalente din fiecare ser polivalent n care a avut loc o reacie pozitiv net (2+, 3+, 4+). n eventualitatea unei reacii negative, se nclzete suspensia n autoclav, 30 de minute, pentru a hidroliza antigenul capsular

44

care interfereaz. Se reexamineaz cu antiser polivalent i dac este pozitiv n serurile monovalente corespunztoare.

Dreptunghi Suspensie Antiserul polivalent Soluia salin

A A1 B C C1 C2 D A-D1 + +

2 + +

3 + +

4 + +

5 + +

6 + +

7 + +

8 + +9 + +

45

46

IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA

225 ml bulion Shigella cu novobiocin25 g aliment

Agar Mac Conkey

Agar TSI

Pant alcalin (roie)

Baz acid (galben); fr H2S

1. amestecul

probei alimentare cu mediul de mbogire

2. Decantarea supernatantului ntr-un balon

steril

3. Incubare

anaerob 20 de ore la 44C (Shi. Sonnei) sau la 42C

(celelalte specii)

4. nsmnare

n placa Petri. Incubare la 35C, 20-48 de ore

5. nsmnare

pe mediul TSI i alte teste biochimice

6. Confirmarea serologic

IDENTIFICAREA GENULUI SHIGELLA

225 ml bulion Shigella cu novobiocin25 g aliment

Agar Mac Conkey

Agar TSI

Pant alcalin (roie)

Baz acid (galben); fr H2S

1. amestecul

probei alimentare cu mediul de mbogire

2. Decantarea supernatantului ntr-un balon

steril

3. Incubare

anaerob 20 de ore la 44C (Shi. Sonnei) sau la 42C

(celelalte specii)

4. nsmnare

n placa Petri. Incubare la 35C, 20-48 de ore

5. nsmnare

pe mediul TSI i alte teste biochimice

6. Confirmarea serologic(schem adaptat dup

W. Andrews, 1992)

Shigella dysenteriae - coloraia Gram Sh

Manualul de microbiologia alimentelor.pdf

Documents

Transcript of Manualul de microbiologia alimentelor.pdf