MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ

LP. 4

MEDIILE DE CULTURĂ PENTRU BACTERII ŞI MICEŢI (CLASIFICARE, COMPOZIŢIE, MOD DE PREPARARE). TEHNICI DE IZOLARE A BACTERIILOR

ȘI MICEȚILOR DIN ALIMENTE PE MEDII DE CULTURĂ: ÎNSĂMÂNȚAREA ÎN MEDII LICHIDE, PE SUPRAFAȚA ȘI ÎN PROFUNZIMEA MEDIILOR SOLIDE.

MEDIILE DE CULTURĂ Un mediu de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv steril, care

permite dezvoltarea și studiul unui microb în afara nișei ecologice naturale.

Pentru a permite dezvoltarea bacteriilor, orice mediu de cultură trebuie să îndeplinească anumite condiții:

să conțină substanțele nutritive necesare metabolismului bacterian;

să aibă o anumită reacție (pH) în limitele căreia se poate dezvolta bacteria pe care dorim să o izolăm;

să corespundă particularităților fiziologice ale bacteriilor, ținând seama mai ales de tipul de respirație (aerob, anaerob, microaerofil);

să fie steril.În lucrările curente de bacteriologie se utilizează numeroase și

variate medii de cultură, care pot fi clasificate pe baza mai multor criterii.1. După consistență:

- medii lichide (bulionul nutritiv, apa peptonată)- medii solide (agarul sau geloza nutritivă),- medii semisolide (agarul moale);

2. După tipul respirator al bacteriilor: - medii pentru cultivarea bacteriilor aerobe (bullion nutritive, agar ); - - medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe (bullion cu ficat, geloza Veillon, bullion VL, bullion VF);

3. După compoziție:- medii naturale – cu o compoziție complexă, incomplet

definită, obținute din extracte de carne sau țesuturi vegetale;

- medii sintetice – cu o compoziție chimică bine cunoscută (soluții minerale, aminocizi, glucide simple), utilizate în studiile de metabolism în vederea testării posibilităților enzimatice ale bacteriilor;

4. După frecvența și scopul utilizării:A. medii uzuale – folosite în mod frecvent deoarece pe aceste medii se dezvoltă majoritatea bacteriilor;B. medii speciale , care, la rândul lor, pot fi:

-medii de îmbogățire - conțin substanțe care stimulează multiplicarea unor germeni aflați în număr foarte redus în materialele patologice din care dorim să-i izolăm (ex., selenitul pentru salmonele));

-medii selective* - conțin una sau mai multe substanțe (antiseptice, antibiotice, săruri biliare, NaCl etc.), care inhibă dezvoltarea speciilor bacteriene asociate cu bacteria pe care dorim să o izolăm;

-medii de diagnostic diferențial – permit creșterea diferențiată a unor bacterii și relevă anumite particularități metabolice semnificative pentru identificare.

*Medii selective pentru bacteriile coliforme- Bulion bilă-lactoză-verde briliant (BBLV) Simplu concentrat.

Se obţine din peptonă 10 g., lactoză 10g., bilă uscată de bou 20 g, verde briliant 0,0133 g sau 13,3 ml soluţie alcoolică 1%0, apă distilată 1000 ml, pH 7,3.

- Mediul cu lauril sulfat. Se prepară din: triptonă 20g, clorură de sodiu 5 g, lactoză 5 g, fosfat dipotasic 2,75 g, fosfat monopotasic 2,75 g, lauril sulfat de sodiu 0,1 g, apă distilată 1000 ml şi pH ajustat la 6,8.

- Mediul cu lactoză-eozină-albastru de metilen (GEAM, Levine) se prepară din peptonă 10 g, lactoză 10 g, fosfat dipotasic 2g, agar 15-20 g, eozină 0,4 g, albstru de metilen 0,065 g, apă distilată 1000 ml cu pH 7,1.

Interpretare:Escherichia coli- colonii de culoare neagră cu luciu metalic şi reflex verzuiAlte bacterii coliforme- colonii albastru închis, fără luciu metalic sau colonii atipice, opace, mucoase, roze cu centru gri-brunSalmonella-Shigella- colonii transparenteProteus- colonii izolate, neinvadante, opace, roze, uneori

mucoase cu centrul violet închis-Agar cu dezoxicolat şi lactoză se prepară din :peptonă 10g,

clorură de sodiu 5 g, citrat de sodiu 2 g, dezoxicolat de sodiu 0,5 g, lactoză 10 g, roşu neutru 0,03 g, agar 15-20 g, apă distilată 1000 ml, pH 7,3. Mediul are culoare roz-roşcat.

Interpretare: Escherichia coli- colonii roşii cu zone de precipitare

marginalăEnterobacter, Klebsiella- colonii pale, cu centru roşu şi zonă de precipitare marginalăSalmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas,- colonii incolore transparente

-Geloză VRBL (lactoză-bilă-cristal violet roşu neutru) se obţine din: peptonă 7g, extract de drojdie 3g, lactoză 10g, clorură de sodiu 5 g,

săruri biliare 1,5g, roşu neutru 0,03g, cristal violet 0,02 g, agar 12-18 g, apă 1000 ml. pH 7,4.

*Medii selective pentru Escherichia coli- Bulion Ec cu novobiocină se prepară din: peptonă 20g, săruri

biliare 1,5 g, sorbitol, 5 g, fosfat dipotasic 4 g, fosfat monopotasic 1,5 g, clorură de sodiu 5 g, apă distilată 100 ml. După dizo,varea ingredientelor se introduc 10 mg novobiocină, pH 6,9, se repartizează în eprubete cu tub de fermentaţie şi se autoclavează la 1100C timp de 20 min.

- Agarul Mac Conkey cu sorbitol este format din: peptonă 20g, sorbitol 10g, săruri bilioare 1,5 g, clorură de sodiu 5 g, roşu neutru 3 ml sol.1%, cristal violet 0,1 ml din sol. 1%, agar 15 g şi apă distilată 1000 ml. După adaugarea ingredientelor se ajustează la pH 7,1, se adaugă soluţiile de cristal violet şi roşu neutru.

Intrepretare: E.coli O157H7 este sorbitol negativă şi formează colinii incolore, iar tulpinile sorbitol pozitive formează colonii roz-roşii.C. medii de conservare – asigură conservarea

bacteriilor în laborator (ex., agarul moale).D. medii de transport – au o compoziție chimică care

permite menținerea nemodificată a raportului numeric între diferitele specii microbiene prezente într-o probă, în timpul transportului (ex., mediul Stuart).

E. medii politrope - permit testarea simultană a mai multor caractere metabolice (ex., mediile TSI, MIU, MILF).

*Medii selective pentru enterocociMedii de îmbogăţireBulion cu azidă şi glucoză: extract de carne 4,5 g, tripotonă 15 g,

glucoză 7,5g, clorură de sodiu 7,5 g, azidă de sodiu 0,2 g, apă distilată 1000 ml, pH 7,2, autoclavare 15 min la 1210C.

Medii selectiveAgar citrat-azidă de sodiu-bilă-esculină se prepară din: triptonă

17 g, peptonă 3 g, extract de drojdie 5 g, săruri biliare 10g, clorură de sodiu 5 g, citrat de sodiu 1g, esculină 1 g, citrat de fier amoniacal 0,50g, azidă de sodiu 0,25 g, agar 15 g, apă distilată 1000 ml, pH 7,0-7,2-*Medii selective pentru Salmonella

Medii de cultură uzuale pentru bacteriile aerobeBulionul din carne-

Mediul original se prepară din carne de bou sau de cal, mai rar carne de pasăre. La 500 g carne tocată se adaugă 1 000 ml apă. Se lasă la macerat o noapte la temperatura camerei, apoi se fierbe timp de 30 minute. După răcire, lichidul se decantează iar carnea se stoarce prin presare. Lichidul obținut se filtrează prin tifon și se completează cu apă la volumul inițial. Se adaugă apoi peptonă (10%o), și clorură de sodiu (5‰) și se ajustează pH-ul la 7,2-7,4 cu soluție de NaOH N/1. Se fierbe 15-20 minute și se filtrează din nou prin vată apoi prin hârtie de filtru. Lichidul

obținut se repartizează în flacoane de sticlă cu dop de vată sau înfiletat și se sterilizează prin autoclavare.

La ora actuală, maceratul de carne este substituit cu extractul de carne sub formă de pulbere purificată și standardizată, livrat de diferite firme internaționale (Merk, Difco, Bacto, Oxoid etc.), sau de institutele de produse biologice Pasteur și Cantacuzino. În acest caz pentru prepararea mediului se realizează un amestec din: - extract de carne (10 g),

- peptonă (10 g),- clorură de sodiu (5 g),apă distilată (1 000 ml),

Modul de preparare este același.

Agarul nutritiv sau gelozaEste un mediu solid care se prepară din bulion prin adăugarea

fibrelor sau pulberii de agar, o algă din mările Japoniei, care nu are valoare nutritivă dar are proprietatea de a asolidifica mediile lichide. Fibrele de agar se dizolvă la temperatura de 80-90ºC, formând un lichid vâscos care se solidifică la temperatura de 45ºC. Punctul de topire fiind diferit de cel de solidificare, conferă mediilor o serie de avantaje pentru bacteriologie.

Preparare: la 1 000 ml bulion se adaugă 17-30 g agar, de preferat sub formă de pulbere. Mediul repartizat în eprubete și sterilizat se solidifică în poziție înclinată (agar înclinat), sau dreaptă (agar drept). Adăugat în bulion în proporție de 0,1% se obține un mediu semisolid (agarul moale), utilizat pentru proba mobilității bacteriilor și pentru conservarea bacteriilor în laborator.

Mediile cu serSe prepară din medii uzuale (bulion, agar) la care se adaugă ser

normal, de obicei de cal, în proporție de 1/10. Pentru prepararea agarului cu ser, la mediul topit în prealabil și răcit la 45ºC, se adaugă serul, se omogenizează și se lasă să se solidifice în poziția dorită.

Agarul cu sângeSângele defibrinat se adaugă steril la agarul nutritiv, în proporție de

5-10%, după o prealabilă topire și răcirre a mediului la 40ºC. Mediile cu ser și sânge se utilizează pentru cultivatrea bacteriilor cu

anumite exigențe nutritive, care nu se dezvoltă pe mediile simple Medii uzuale pentru cultivarea bacteriilor anaerobe

Bulionul cu ficat (Tarozzi)Se fierbe ficatul (de cal, bou, cobai, sau iepure) se taie în fragmente

mici ce se introduc în tuburi cu 8-10 ml bulion simplu sau bulion glucozat 1%. Se sterilizează la 110ºC timp de 20 minute.

Bulionul VFMediul VF (de la inițialele cuvintelor în limba franceză viande =

carne; levure = levură (drojdie), are mediul de bază prepart din: peptonă triptică (10 g), - NaCl (5 g), - extract de carne de bou (3 g), - extract de drojdie (5 g),

- clorhidrat de cisteină (0,4 g), - apă (1.000 ml).

Se ajustează pH-ul la 7,2-7,4; se sterilizează prin autoclavare.Geloza VFCompoziție: - bulion VF (980 ml),

- agar (20 g).

Geloza VeillonCompoziție: - bulion simplu (1.000 ml),

- agar (8-10 g), - glucoză (5-10 g), - azotat de potasiu (1-2 g).

Se dizolvă glucoza și azotatul de potasiu în bulion, se adaugă agarul, se încălzește la autoclav, se filtrează prin vată, se repartizează în tuburi Weinberg (diametrul 0,8 -1 cm și înălțimea de 20-25 cm), astfel ca mediul să ocupe mai mult de jumătate din înălțimea tubului. Se sterilizează la 115ºC timp de 15 minute. Pentru solidificarea mediului, tubul se ține în poziție verticală.

Medii de cultură uzuale pentru miceţi

Mediul Sabouraud solid se prepară din 1000 ml apă distilată, 10 g

peptonă, 20 g glucoză şi 20 g agar de fibre. Se dizolvă peptona în 250 ml

apă la fierbere, se autoclavează 30 min. la 120oC şi se filtreză. Se

amestecă cele două soluţii filtrate, se completează cu apă până la 1000 ml

şi se adaugă agarul spălat. Se fierbe până la topirea agarului, se filtrează

prin tifon, se repartizează după necesităţi şi se sterilizează la 110oC timp

de 30 min. - pH final 5,8 - 6,2. Un mediu similar lichid se poate prepara din

aceleaşi ingrediente minus agarul. Aceste medii se utilizează pentru

izolarea şi cultivarea ciupercilor microscopice

Tehnici de izolare a bacteriilor și miceților din alimente pe medii de cultură: însămânțarea în medii lichide, pe suprafața și în profunzimea

mediilor solide

ÎNSĂMÂNȚAREA – este operațiunea de introducere într-un mediu de cultură lichid sau de depunere pe suprafața unui mediu solid, a unei cantități reduse de material patologic, în scopul izolării bacteriilor eventual prezente.

Această operațiune se execută în condiții de asepsie cât mai riguroasă, folosind instrumente sterile, recipiente cu medii de cultură sterile, sub protecția unei flăcări (bec de gaz, lampă cu alcool) sau a unei hote sterile. Însămânțarea se execută cu pipeta Pasteur sau cu acul de însămânțare.

TEHNICA ÎNSĂMÂNŢĂRII ÎN MEDII DE CULTURĂ LICHIDE

Tehnica insamantarii cu ansa bacteriologica. Ansa cu firul înroşit în flacară se introduce în recipientul ce conţine prelevatul, se răceşte alipind-o de peretele recipientului, apoi se ia o porţiune din produs. Se scoate dopul recipientului cu mediu şi se flambează gura acestuia. Materialul luat pe bucla ansei din prelevat este introdus în mediul din recipientul deschis sub protecţia flacării. Se descarcăansa pe peretele recipientului, agitând uşor lichidul, se flambează din nou gura recipientului şi dopul cu care apoi se astupă recipientul. După însămânţare, ansa se sterilizează din nou prin încălzire la roşu.

Tehnica însămânţării cu pipeta. Dacă se lucrează cu pipeta gradată, aceasta se scoate din ambalajul steril şi se introduce rapid în flacără atât capatul cât şi toată lungimea ei. Se controlează apoi răcirea ei prin flambare. Dacă se lucrează cu pipeta Pasteur, se rupe vârful efilat al pipetei, după care se flambează capătul. Pipeta flambata şi răcită se introduce în recipientul cu produsul prelevat şi se aspiră de la câteva picături până la 1 sau mai mulţi ml, in raport cu materialul de însămânţat şi cantitatea de mediu de cultura. Pipeta trebuie manipulată cu grijă pentru a nu uda dopul de vată. Materialul aspirat în pipetă se însămânţează în recipientul cu mediu nutritiv cu aceleaşi precauţiuni de flambare a gâtului recipientelor şi a dopurilor respective. Pipeta folosită se pune într-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirându-se din amestec până la aproximativ 1 cm sub dop.Tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descarcate direct în mediu, după care vor fi introduse în tub şi puse în galeata de infecte.

TEHNICA ÎNSĂMÂNȚĂRII PE SUPRAFAȚA MEDIILOR SOLIDE ÎN

PLĂCI PETRI

Tehnica însămânţării pe suprafaţă.

Însămânţarea pe suprafaţa mediilor solide se poate face cu ansa.

Când se însămânţează medii care au fost solidificate în tuburi, în poziţie

înclinată, se execută pe suprafaţa mediului mişcări în zig-zag, de la baza

către exterior, cu precauţia de a nu zgaria suprafaţa mediului. Când se

face însămânţarea unui mediu de cultură turnat în plăci Petri, materialul

de însămânţat se depune cu acul de însămânțare sau pipeta Pasteur pe

suprafața mediului și se diseminează în linii paralele în 4-5 sectoare, cu

acul de însămânțare sau cu spatula Drigalski (o pipetă Pasteur îndoită la

flacără).

În cazul mediilor solidificate în coloană dreaptă, însămânţarea se

face prin înţepare în profunzime.

Tehnica însămânţării prin încorporare. Se lichefiaza mediul prin

încalzire la 800 C, se răceşte la 50 0 C şi se introduce produsul de

însămânţat cu o pipetă sterilă. Se omogenizează prin uşoară rotire a

recipientului. Mediul astfel însămânţat se toarnă după caz, în plăci Petri

sterile sau se lasă ca atare în recipientul în care s-a facut însămânţarea.

După executarea însămânțărilor se notează pe tuburile sau placile

cu medii însămânțate, cu un creionul dermatograf sau marker, numărul de

înregistrare a probei și data însămânțării.

Mediile însămânțate se incubează la termostat, la o temperatură și

pentru o perioadă de timp variabilă, în funcție de specia microbiană

suspectă. Majoritatea bacteriilor patogene pentru animalele cu sânge cald

se multiplică optim la temperatura de 370 C, formând culturi în 24-48 ore

de incubație.

PARTICULARITĂȚI PRIVIND CULTIVAREA BACTERIILOR ANAEROBE

Bacteriile anaerobe și cele facultativ anaerobe se pot cultiva:

- în profunzimea mediilor anaerobe solide (gelloza Veillon, mediul

SPS, anaerobic agar etc.),repartizate în tuburi Weinberg;

- în medii anaerobe lichide (bulion cu ficat, bulion VF, bulion VL

etc.), care vor fi regenerate în prealabil prin fierbere 5-10 minute în baia

de apă, pentru eliminarea oxigenului dizolvat în mediu, iar după

însămânțare se vor acoperi cu un strat subțire de ulei de parafină

steril pentru a evita dizolvarea oxigenului din tub, în mediul însămânțat;

- pe suprafața mediilor solide repartizate în plăci Petri, care vor fi

incubate în anaerostat (incubator în care oxigenul este înlocuit cu gaze

inerte: azot, hidrogen, sau bioxid de carbon, în funcție de exigențele

bacteriei cultivate).

- pe suprafața mediilor solide repartizate în plăci Petri, anaerobioza

realizându-se prin fixarea pe fața internă a capacului plăcii a unui plic de

hârtie cu 2 g de amestec oxidoreducător (pirogalol (1 g), carbonat de

potasiu (1 g), talc (5 g) și etanșarea celor două părți ale plăcii Petri cu o

bandă adezivă, parafină sau agar.