Tehnica difuzimetrica Kirby Bauer:* Materiale necesare:-germenul de studiat (inocul),-geloza Mueller Hinton (valoarea nutritiva permite dezvoltarea majoritatii germenilor, nu contine inhibitori ai actiunii substantelor antimicrobiene),-substante antimicrobiene: antibiotice si chimioterapice (microcomprimate de 6 mm, impregnate cu anumite cantitati, diferite, de substanta antibacteriana activa,Principiul metodei:consecutiv depunerii de microcomprimate impregnate cuantibiotic pe suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc urmatoarele procese fizico chimice:- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei antimicrobiene active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce conditioneaza difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constantaa gradientului de concentratie, de la marginea discului spre periferie.Sensibilitatea bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii, din jurul microcomprimatului impregnat cu antibioticul de testat.!Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si constanta.*Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru:Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta diametrul zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.1. Mediul de cultura:geloza Mueller - Hinton-asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida,-nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni,-contine concentratii adecvate de Ca si Mg,-este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii (testarea sensibilitatii streptococilor beta hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, geloza Mueller- Hinton se suplimenteaza cu sange berbec 5- 10%),-pentru testarea sensibilitatii hemofililor, se utilizeaza pentru antibiograma un mediu special, care contine factori de crestere, X, V,-compozitie definita,-asigura reproductibilitate de la lot la lot,-compozitie standard si consistenta corespunzatoare,-pH: 7,2 7,4,-grosimea stratului de geloza: 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90 mm),2. Germenul de testat:-agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura,-contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta,-efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e o constanta dinainte previzibila,-se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea care au tendinta de a castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic,-antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile si contaminate cu un singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina),-antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul; stocarea indelungata duce la aparitia determinantilor de rezistenta.*Inoculul:- sa fie reprezentativ, preparat din 4 6 colonii identice,-marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (turbiditate standard: 0,5 unitati MacFarland),-insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii,-cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii diferite, pana la acoperirea uniforma a suprafetei mediului,-placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului inainte de depunerea microcomprimatelor,-daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura bacteriana uniform confluenta.3. Substante antimicrobiene:-sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul respectiv (simbolul denumirii antibioticului: A, TE, CIP, NOR etc, eventual incarcatura de antibiotic pe microcomprimat: 1g, 5g30 g),-conservarea microcomprimatelor: la adapost de lumina, caldura, umiditate,

-inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare termica,-interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit,-selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma:-2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite:-unul pentru germeni Gram pozitivi,-unul pentru germeni Gram negativi,-unul pentru infectii urinare,-set de microcomprimate pentru bacili Gram (-) izolati din infectii digestive,-asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni,-depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand usor fiecare microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu cultura sau cu ajutorul unui dispozitiv numit dispencer,-se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre marginile comprimatelor sau 30 mm distanta intre centrele lor,-pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.Placile de antibiograma se incubeaza la 37sC, timp de 18- 20 ore, in aerobioza, dupa care se efectueaza citirea.Placile cu mediu Mueller Hinton cu 5- 10 % sange de berbec, folosite pentru testarea sensibilitatii streptococilor, pneumocilor, meningococului etc, se incubeaza in atmosfera aeroba, suplimentata cu 5% CO2 (exicator cu lumanare sau plicuri geeneratoare de CO2).In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, alecarorantibioticesunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizareainfectiei.*Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor:-se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al puritatii si densitatii,-citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in mm, de 2-3 ori, in diferite directii, cu o rigla,-pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in lumina reflectata,-daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata, in lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.-exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI, prin incadrarea marimii diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/ S, intermediar/ I, rezistent/ R.-se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei germenilor la antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului CLSI 2008.*Se iau in consideratie:-colonii mari, bine dezvoltate, aparute in zona de inhibitie, colonii ce reprezinta mutante rezistente in cadrul unei populatii microbiene, predominant sensibile.-astfel de colonii se vor rerepica, identifica, retesta sensibilitatea la antibiotice.Control de calitate: tulpini de referinta Staphylococcus aureusATCC25923, E. coliATCC 25922, Pseudomonas aeruginosaATCC 27853.*Surse de eroare:-alt mediu decat geloza Mueller Hinton,-mediu necontrolat din punct de vedere al pH ului,-folosirea microcomprimatelor cu termen de valabilitate depasit,-inocul nestandardizat,-depasirea intervalelor de timp intre prepararea inoculului si insamantare, intre insamantare si aplicarea comprimatelor, intre aplicarea lor si incubare,-perioada de incubare prea scurta,-testarea pe culturi mixte, produse pluricontaminate, pe germeni cu dezvoltare lenta,-citire inexacta a diametrelor zonelor de inhibitie sau transcrierea lor eronata,-lipsa controlului de calitate, cu tulpini de referinta.