Influenta ultrasunetelorDefinirea si aplicatiile ultrasunetelorUltrasunetele sunt unde acustice cu frecventa cuprinsa intre 16 si 10 6 kHz, produse cu ajutorul unor emitatoare ultrasonic care convertesc energia primara, asigurata cu generatoarele de frecventa, in energie mecanica radianta. In present, sunt raportate tot mai multe utilizari ale ultrasunetelor in diferite aplicatii industrial din domeniul alimentelor. Evaluarea nedistructiva a calitatii interne si a defectelor latente pentru fructe si legume intregi; Imbunatatirea monitorizarii proceselor de procedure a alimentelor prin accelerarea difuziunii: - Masurarea texturii, vascozitatii si concentratiei multor alimente solide sau lichide; - Determinarea compozitiei oualelor, carnii, fructelor, legumelor, produselor lactate si a altor produse; - Masurarea consistentei, debitului si temperaturii pentru monitorizarea si controlul mai multor procese; Imbunatatirea unor procese cum sunt: - Curatirea suprafetelor; - Desicarea, uscarea si filtrarea; - Inactivarea microorganismelor si enzimelor; - Degazarea lichidelor; - Accelerarea transferului termic si a proceselor de extractive;

Din aceste exemple este evident ca tehnologia ultrasunetelor are multe aplicatii in industria alimentara , iar In viitor utilizarea se va intensifica.

Mecanismul inactivarii microbiene cu ultrasuneteInactivarea microorganismelor prin ultrasonare se produce prin trei mecanisme: - Cavitatie; - Incalzire locala; - Formarea de radicali liberi.

Cavitatia se produce la trecerea undelor ultrasonore printr-un lichid si consta in aparitia de bule de gaz.Cavitatia poate fi tranzitorie sau stabile, ceea ce afecteaza diferit microorganismele. Cavitatia tranzitorie se produce cand undele ultrasonore au frecventa redusa. In timpul cavitatiei tranzitorii, dimensiunea bulelor de gaz creste rapid in decursul a catorva cicluri oscilatorii. Bulele mari colapseaza, generand pesiuni locale foarte mari (pana la 100 MPa) si temperature mari (pana la 5000 K). Presiunile produse cand bulele colapseaza sunt capabile sa determine ruperea structurilor celulare, in timp ce temperaturile locale mari pot provoca deteriorari termice (ex: denaturarea proteinelor si enzimelor). Aplicarea de ultrasunete unui lichid poate conduce si la formarea de radicali liberi, care actioneaza asupra AND-ului, fragmentandu-l. Cavitatia stabila se produce ca urmare a oscilarii undelor ultrasonore cu frecventa ridicata, ceea ce determina formarea in lichid de bule de gaz fine. Pentru ca bulele sa-si mareasca dimensiunile este nevoie de mii de cicluri oscilatorii ale undelor ultrasonore. Printre factorii critici care influenteaza tratamentul cu ultrasunete se numara: frecventa si amplitudinea undelor ultrasonice, durata de expunere sau contact a microorganismelor la ultrasunete, tipul microorganismului si starea lui, volumul de produs alimentar supus tratamentului, compozitia produsului si temperatura de lucru. La utilizarea ultrasunetelor in combinatii cu alte tehnici trebuie sa se tina seama de toti acesti factori. Frecventa ultrasunetelor influenteaza marimea de gaz. La frecvente reduse, de pana la 20 kHz, bulele care se formeaza au dimensiuni mari, ceea ce face ca la colapsul lor sa fie pusa in libertate o cantitate mare de energie. La frecvente mai mari de 20 kHz formarea bulelor devine mai dificila si la frecvente mai mari, de peste 2,5 MHz, se formeaza bule cu dimensiuni mici (cavitatie stabila). Amplitudinea ultrasunetelor influenteaza intensitatea fenomenului de cavitatie. Daca e nevoie de o cavitatie mai intensa, atunci se utilizeaza o amplitudine mare. Intensitatea cu care colapseaza bulele depinde si de temperatura mediului in care se gasesc microorganismele, vascozitatea s si frecventa ultrasunetelor. Pe masura ce temperature creste, bulele de cavitatie se dezvolta mai rapid, dar intensitatea colapsurilor se reduce. Acest lucru are drept cauza cresterea presiunii de vapori. Efectul generat de cresterea temperaturii poate fi depasit prin aplicarea unei suprapresiuni in sistemul tratat. Combinarea presiunii cu ultrasunete si incalzire creste amplitudinea undelor ultrasonore si, implicit, eficienta inactivarii microbiene. Presiuni de pana la 200 kPa combinate cu ultrasunete cu frecventa de 20 Hz si o temperatura de 30o C au condus la descresterea timpului de reducere decimala (valoarea D) pana la 90% pentru mai multe microorganisme. Sensibilitatea microorganismelor la ultrasunete este diferita, unele fiind mai susceptibile decat altele. S-a demonstrate ca, in general, celulele cu dimensiuni mari sunt mai sensibile

decat cele cu dimensiuni mici, deoarece au o suprafata mai mare decat este supusa la presiunile inalte produse in timpul cavitatiei, ceea ce le face mai vulnerabile. Bacteriile cu forma sferica sunt mai rezistente la ultrasonare decat cele cilindrice, iar cele sub forma de spori sunt mai rezistente decat cele sub forma vegetative. In general, bacteriile cunoscute ca fiind termorezistente prezinta rezistente similar la ultrasunete. Tratamentul cu ultrasunete cu frecventa de 1 MHz asupra unei culture de Escherichia coli a evidentiat o rezistenta la ultrasunete mai mare in cazul celulelor aflate in faza stationara de crestere decat a celor aflate in faza exponential de crestere. Autorii nu au avut intentia de a reliza o tehnologie de conservare cu ultrasunete, ci de a investiga efactul ultrasunetelor asupra bacteriilor si , eventual, de a realize o metoda de tratare a apei potabile. Rezistenta microorganismelor la ultrasonare este mai mica in medii de laborator decat in alimente. Spre exemplu, in alimentele cu continut ridicat de grasime, gradul de omorare a microorganismelor este redus. Pentru a facilita penetrarea ultrasunetelor in produse vascoase, se prefer utilizarea de ultrasunete cu putere mare si frecventa joasa, deoarece nu sunt dispersate in solutie, asa cum se intampla cu ultrasunetele cu frecventa ridicata, cand are loc o reducere a intensitatii energiei lor.

Utilizarea ultrasunetelor pentru inactivarea microbianaUltrasunetele pot fi utilizate singure (ultrasonare), sau in combinatie cu alte procedee pentru omorarea microorganismelor din alimente, in special din cele lichide, in operatii denumite corespunzator: termosonare (combinarea incalzirii cu ultrasonare) si manotermosonare (combinarea presiunii, incalzirii si ultrasonarii).De asemenea ultrasunetele se mai pot utiliza in combinatie cu acidifierea sau cu tratamentele chimice.

UltrasonareaProduse de origine animala precum carnea de pasare si laptele au fost supuse tratamentului cu ultrasunete pentru inactivarea patogenilor enteric Gram negativi, in mediul lichid, permitand obtinerea urmatoarelor rezultate: reducerea populatiilor de Salmonella sp. cu circa 4-log in apa peptonata la un tratament cu ultrasunete timp de 10 minute; reducerea Salmonella sp. in lapte cu cacao cu doar 0,8-log in urma unui tratament cu ultrasunete timp de 30 de minute ceea ce a condus la concluzia ca laptele cu ciocolata asigura o protectie semnificativa fata de inactivarea microbiana. In figura 1. este prezentat efectul pre-ultrasonarii asupra inactivarii bacteriei Listeria monocytogenes in lapte UHT, la diferite frecvente ale undelor ultrasonore.

Fig. 1. Efectul tratamentului de pre-ultrasonare asupra bacteriei Listeria monocytogenes in lapte UHT o incalzire la 60 C: incalzire+20 kHz; incalzire+38 kHz; o incalzire+800 kHz

TermosonareaProcedeul combinarii ultrasunetelor cu caldura, la presiune atmosferica, in vederea inactivarii microorganismelor si enzimelor din alimente poarta denumirea de termosonare. La aplicarea lui, atat celulele vegetative ale microorganismelor, cat si sporii sunt inactivati cu viteze mai mari decat daca s-ar insuma viteza de inactivare determinate separat la actiunea temperaturii sau ultrasunetelor, deoarece intre cele doua tipuri de tratament apare un sirnegism. In tabelul 1 sunt prezentate valorile D pentru inactivarea unor bacterii prin tratament termic, ultrasonare si termoultrasonare. Valorile D pentru inactivarea unor bacterii cu ajutorul caldurii si al ultrasunetelor.Microorganism Bacillus subtilis B. subtilis B. licheniformis B. cereus Enterococcus faicium Salmonella Typhimurium Staphylococus aureus Temperatura oC 81,5 89,0 99,0 110 62 50 52,5 Valoarea D, min Termoultrasonare 149 22,9 2,2 1 1,8 30 7,3

Incalzire 257 39,2 5 12 11,2 50 19,5

Ultrasonare fara efect fara efect 30 fara efect -

Eficienta inactivarii microbiene prin termosonare decreste pe masura ce temperatura creste si devine inexistenta in momentul in care temperatura atinge punctul de fierbere a mediului. Acest lucru se explica prin faptul ca descreste intensitatea colapsurilor bulelor de gaz, cand presiunea de vapori a mediului lichid se apropie de presiunea statica(presiunea atmosferica). tratamentul cu ultrasunete de 20 kHz/160 W, combinat cu incalzire in domeniul 5...62oC, a permis inactivarea mai eficienta cu circa 1-log a bacteriilor Streptoccocus faicium si Streptoccocus durans sub forma de suspensie in solutie tampon de acid dimetilglutaric 0,1 M cu pH-ul 6.6, fata de aplicarea individuala a fiecarui tratament in parte. Desi nu au testat nici un sistem alimentar, autorii au propus combinarea pasteurizarii laptelui cu un tratament cu ultrasunete pentru reducerea temperaturii de pasteurizare si a duratei procedeului; reducerea cu 63% a valorii D pentru o suspensie de stapylococcus aureus in tampon fosfat 0,05 M (pH-ul 6,8) si cu 43% in lapte UHT in urma aplicarii unui tratament cu ultrasunete inalte si caldura (termo-ultrasonare) fata de tratamentul termic obisnuit; tratamentul cu ultrasunete a suspensiei de spori de Bacillius subtilis in apa distilata, glicerol si lapte nu a avut nici un efect asupra reducerii vizibilitatii suspensiei, in timp ce, in urma combinarii ultrsunetelor cu un tratament termic la temperaturi cuprinse in intervalul 70...95oC populatia de spori a fost redusa cu 70-99,9% (3-log ufc/mL) pentru suspensia in apa distilata, 63-73% (< 1-log ufc/mL) pentru suspensia in glicerol, respectiv 40-79% pentru suspensia in lapte. Efectul termoultrasonarii a fost diminuat dramatic la apropierea temperaturii la 100oC, mecanismul acestui fenomen nefiind clar. In conditiile de desfasurare a experimentului s-a stabilit o temperatura optima de 70oC.

ManotermosonareaManotermosonarea (MTS) incearca sa depaseasca descresterea intensitatii cu care are loc colapsul bulelor de gaz la temperaturi ridicate, fenomen incalzit in cazul termosonarii, prin cresterea presiunii statice. Acest lucru se bazeaza pe faptul ca energia de producere a colapsurilor este o functie de diferenta de presiune (presiune atmosferica-presiune de valori). Eficienta manotermosonarii poate fi exprimata ca raport intre viteza de inactivare a microorganismelor si a enzimelor prin MTS fata de viteza de inactivare a microorganismelor si enzimelor prin tratament termic realizat la aceeasi temperatura. Viteza de inactivare creste cu cresterea presiunii aplicate, pana la atingerea unei presiuni critice, la care cresterea energiei de producere a colapsurilor este contracarata de descresterea numarului de bule ce sufera

cavitatie. Aceeasi eficienta poate fi realizata la diferite temperaturi prin reglarea presiunii astfel incat diferenta de presiune sa ramana constanta. Astfel, pentru fiecare temperatura de tratare exista un optim de presiune ce poate fi aplicat. La fel ca in cazul tratamentelor termice, rezistenta microorganismelor si enzimelor la MTS se exprima prin valoarea de si respectiv constanta vitezei de inactivare. Dependenta de temperatura a reactiei de inactivare poate fi exprimata prin valoarea z (creste temperatura, exprimata in oC, necesara pentru a reduce valoarea D la 1/10 din valoarea initiala). Alternativ, dependenta de temperatura poate fi exprimata in termeni de energie de activare E a. Investigatiile sunt dificil de realizat deoarece geometria camerei de reactie are influenta semnificativa asupra magnitudinii efectului undelor ultrasonore. In tratarea sporilor prin MTS, efectul caldurii si cel al undelor sonore se combina sinergic, in timp ce la tratarea celulelor vegetative combinarea are loc doar cumulativ. Aceste efect a fost dovedit pentru Yersinia enterocolytica, Listeria monosytogenes si Aeromonas hydropila. Fac exceptie de la acest comportament microorganismele care au fost supuse in prelabil altor tratamente, cum ar fi tratamente care maresc rezistenta microorganismelor la MTS. Fata de tratamentele termice, MTS nu genereaza celule afectate dintre care unele vor fi capabile sa-si revina, ci va determina moartea tuturor celulelor afectate. Gradul de omorare a microorganismelor prin MTS creste cu presiunea si temperatura la o anumita amplitudine a ultrasunetelor, pana la 150 m. Contributia undelor ultrasonore la omorarea microorganismelor prin MTS nu pare sa fie legata de formarea de radicali liberi. Tratamentul cu ultrasunete combinat cu presiune si caldura pentru Yersinia enterocolitica si pentru sporii de Bacillus subtilis a evidentiat urmatoarele: - efectul ultrasunetelor, la temperatura si presiunea mediului ambiant, asupra Y. enterocolitica aflata in suspensia in tampon fosfat-citrat este nesemnificativ; - presiuni moderate de 600 KPa nu au afectat supravetuirea Y. enterocolitica la caldura; - la temperaturi mai mari de 58oC, cresterea presiunii nu modifica procesul de supravetuitori; - caldura si presiunea functioneaza independent, iar contributia individuala a caldurii si a ultrasunetelor la o anumita presiune asupra efectului total al manotermosonarii depinde in primul rand de tempertura. De asemenea, s-a observat ca incativarea nu este o simpla reactie inditiva a celor trei tipuri de tratament aplicate, pentru aflarea conditiilor optime fiind necesare numeroase incercari. - valorile inregistrate pentru Y. enterocolitica ATCC 9610 au fost: 1,39 min la 59 oC, 1,5 min pentru cea mai mare valoare a ultrasunetelor (amplitudine de 150 de m

la 20 de kHz) si 0,28 min pentru manosonicarea la 300 de KPa si 150m la 30oC (acest tratament fiind echivalent unei manotermosonicari la 63 oC); - un tratament de 12 min la 500 de KPa si 117 m la 20 kHz asupra unei suspensii de spori de B. subtilis ATCC 9372 in tampon fosfat citrat McIlvaine (pH 7,0) a condus la o reducere cu 99% a numarului initial de spori (o reducere de 2-log); - efectul manosonarii de distrugere a sporilor depinde de presiunea statica, amplitudinea undelor ultrasonice si temperatura tratamentului. La presiuni mai mari de KPa nu se mai inregistreaza nici o imbunatatire a inactivarii sporilor. - in domeniul de temperatura 70...90oC, combinatii de 20 kHz si 300 KPa timp de 6 min au avut un efect sinergic asupra inactivarii sporilor. In alte experimente, s-a constatat ca in timpul manotermosonarii, acidul dipicolinic si peptidele cu masa moleculara scazuta sunt eliberate din sporii de Bacillius stearothermophilus. In acest tratament sporii sunt supusi unor vibratii violente, ca urmare a intensitatii cu care se desfasoara fenomenul de cavitatie, ceea ce determina deteriorarea cortexului.

Combinarea ultrasonarii cu tratamentele chimiceSubstantele chimice, de tipul clorului, sunt utilizate pentru decontaminarea suprafetelor. In combinatie cu ultrasunetele, clorinarea devine mai eficienta. Acest lucru a fost demonstrat pentru bacterii din genul Salmonella prezente pe carcase de pui. Aplicarea unui tratament cu ultrasunete a determinat detasarea bacteriilor de pe suprafata carcaselor si a facilitat patrunderea clorului in celule, pentru a-si exercita efectul. Tratamentul cu ultrasunete pentru reducerea Salmonella de pe suprafata carnii de pasare a condus la o reducere cu 1-1,5-log numai cu ultrasunete, respectiv cu 2,5-4-log atunci cand ultrasunetele au fost combinate cu imersare in apa clorinata refrigerata.

Efectul ultrasonarii ci clorinarii asupra Salmonella de pe suprafata carnii de pasare

Tratament Fara tratament Ultrasonare 30 min Clorinare(clor rezidual 0,5 ppm)timp de 30 min Ultrasonare+clorinare

Reducerea log10 1,19 2,59 2,08 4,07

Ultrasunetele pot contribui si la obtinerea unei mai bune dispersii a celulelor bacteriene in suspensie, ceea ce le face mai susceptibile la actiunea agentilor de sanitizare. Acest lucru permite utilizarea de concetratii mai mici de sanitizanti sau dezinfectanti sau reducerea timpului de contact.

Perspectivele aplicarii ultrasunetelor la nivel industrialIn concluzie, ultrasunetele nu reprezinta o metoda eficienta de inactivare a microorganismelor in scopul conservarii daca sunt utilizate singure. Doar daca sunt utilizate in combinatie cu alte metode de conservare (ex. prezenta dezinfectantilor sau a conservantilor, presiunea static, iradierea , caldura, pulsurile electrice), ultrasunetele contribuie la imbunatatirea inactivarii microbiene in alimente. Pentru astfel de aplicatii sunt necesare cercetari suplimentare in faza de laborator, ceea ce face ca trecerea la aplicatii comerciale sa nu se poata face prea curand. De asemenea, trebuie avut in vedere si efectul posibil al ultrasunetelor asupra calitatii senzoriale si asupra proprietatilor termofizice(ex. vascozitatea) sau fizice (ex.marimea particulelor) ale alimentelor. Aceste observatii sunt valabile si pentru manotermosonare. Pana cand MTS sa poata fi aplicata la nivel industrial, este nevoie sa se continuie studiile de laborator. De exemplu, obtinerea mai multor date experimentale privind influenta geometriei camerelor destinate acestui tratament vor facilita modelarea produsului. Apoi este necesar sa se investigheze efectele MTS asupra continutului de nutriti din alimente. Se stie in prezent ca tratamentele MTS care inactiveaza pectinmetilesteraza din sucul de portocale nu afecteaza continutul de acid ascorbic al acestuia mai mult decat o face un simplu tratament termic . Trebuie studiat insa si efectul MTS asupra altor nutrienti labili, care includ tiamina, riboflavina si acidul folic in alimente cu compozitie diferita si cu pH diferit. De asemenea, sunt inca neinvestigate efectele MTS asupra proprietatilor senzoriale si functionale ale alimentelor, desi se stie ca in laptele supus MTS se produc modificari ale activitatii reninei, ceea ce prezinta avantaje la obtinerea unor produse lactate si dezavantaje la obtinerea altora. Tratamentele MTS capabile sa incativeze poligalacturonaza din sucul de tomate si pectinmetilesteraza din sucul de portocale nu au efecte negative asupra proprietatilor reologice ale acestor sucuri, dar nu se cunoaste efectul tratamentului asupra substantelor volatile. In prezent sunt realizate mai multe modele de echipamente ce pot sustine un tratament al alimentelor prin MTS, atat acelor care se comporta ca fluide newtoniene, cat si acelor nenewroniene. Caracteristicile de baza ale acestor modele ar putea fi validate pentru realizarea echipaentelor industriale. Caracteristicile geometrice ale unora dintre modele sunt excelente in ce priveste eficienta maxima a undelor ultrasonore, dar modelele opereaza la amplitudini mai joase decat cele utilizate in tratamentele MTS de pana acum. Controlul eficient al temperaturii si presiunii este necesar a fi asigurat pentru aplicarea industriala. Lucrurile stau asemanator si in domeniul biotehnologiei, unde utilizarea ultrasunetelor pentru extragerea componentelor celulare prin liza celulelor microbiene constituie o tehnica de laborator binecunoscuta (Skauen, 1976, FDA/CFSAN 2000), care permite dezintegrarea celulelor multor bacterii pentru obtinerea, eficienta si in conditii aseptice, de extracte enzimatice lipsite de celule.

In timp ce in conditii de laborator se poate atinge o eficienta maxima a lizei bacteriene, intru cat se lucreaza la scara mica, in sistem discontinuu, cu un control riguros al temperaturii prin mentinerea recipientului cu proba supusa ultrasonarii imersat in gheata, la scara industriala, tehnica ultrasonarii nu poate fi folosita cu o eficienta echivalenta din cauza controlului mai putin precis al factorilor care influenteaza ruperea structurarilor celulare.