I

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ

ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA

ŞCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

Genomica accidentului vascular cerebral ischemic.

Implicaţii în terapia celulară.

REZUMAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. univ. dr. Mogoanţă Laurenţiu

STUDENT DOCTORAND

Cojocaru Gabriel-Radu

CRAIOVA 2012

II

CUPRINS INTRODUCERE PARTEA I - STADIUL CUNOAŞTERII

1.Accidentul vascular cerebral ischemic-date generale 2.Fiziopatologia accidentului vascular cerebral ischemic

PARTEA II – CONTRIBUŢII PERSONALE

3.Scopul şi obiectivele lucrării

4.Material şi metode

5.Rezultate 6.Discuţii 7.Concluzii

BIBLIOGRAFIE

Cuvinte cheie: accident vascular cerebral, ischemie cerebrală, genomica accidentului vascular cerebral ischemic, terapie celulară

III

INTRODUCERE

Accidentul vascular cerebral (AVC) afectează în principal populaţia vârstnică

din ţările industrializate şi reprezintă una dintre cauzele importante de boală, pentru care nu avem încă în practica clinică un tratament specific. Din punct de vedere al costului social însă, accidentul vascular cerebral se situează pe primul loc.

Posibilitatea de înțelegere a principalelor procese moleculare și biochimice ce se succed în timpul ischemiei şi induc leziuni ale creierului a crescut în ultimii ani, dar capaciţăţile de tratare ale pacienţilor cu accident vascular cerebral sunt încă la un nivel destul de limitat.

Luând în considerare că majoritatea accidentelor vasculare cerebrale (AVC) afectează persoanele în vârstă, marea majoritate a victimelor accidentului vascular cerebral având peste 65 de ani şi cu sanse mai mici de recuperare, studiile experimentale axate pe accidente vasculare cerebrale, desfășurate mai degrabă pe șobolani vâstnici decât pe modelul de șobolan tânăr, ar putea fi optime pentru identificarea răspunsurilor celulare clinic relevante, precum și pentru identificarea intervențiilor benefice pentru pacientii în vârstă.

Studiul îşi propune să urmărească genele asociate sindromului neuropatic, stresului, tulburărilor de anxietate și depresiei (Acvr1c, Cort, Htr2b și Pnoc). Noi opțiuni terapeutice pentru șobolanii vârstnici pot include, de asemenea, Calcrl, Cyp11b1, Prcp, Cebpa, Cfd Gpnmb, Fcgr2b, Fcgr3a, Tnfrsf26, Adam 17 și Mmp14. O țintă neașteptată este enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A sintetaza 1 la șobolanii vârstnici, o enzimă-cheie în calea de sinteză a colesterolului.

Un tratament etapizat, multimodal la animalele vârstnice ar avea o probabiltate mai mare de a produce rezultate pozitive. O astfel de abordare terapeutică trebuie să se concentreze asupra refacerii țesutului, dar ar trebui de asemenea să abordeze și alte aspecte ale terapiei pacientului post-AVC, cum ar fi sindromul neuropatic, stresul, tulburările de anxietate, depresia, neurotransmisia și tensiunea arterială.

CAPITOLUL I - ACCIDENTUL VASCULAR CEREBRAL ISCHEMIC-

DATE GENERALE

Accidentul vascular cerebral este definit de către Organizaţia Mondială a Sănătății (OMS), drept "perturbarea rapidă a funcției cerebrale cu semne de dezvoltare focală (sau globală), cu simptomatologie care durează 24 de ore sau mai mult, sau care duce la moarte, de nici o altă cauză aparentă, altele decât cele de origine vasculară". Accidentul vascular cerebral se identifică încă ca o problemă majoră de sănătate la nivel mondial. În ţările industrializate, această problemă de sănătate reprezintă cauza primară de dezvoltare a unui handicap pe termen lung, şi a treia cauză de deces, primul loc fiind ocupat de către bolile de inimă, iar locul secund de către toate tipurile de cancer (Warlow et al., 2003).

Anual, la nivel mondial, accidentul vascular cerebral induce decesul unui număr foarte mare de persoane, fiind pierdute circa cinci milioane de vieţi, şi

IV

generează dizabilităţi severe unui număr egal de pacienţi (Lopez AD et al, 2006). Doar cinsprezece milioane de pacienţi reuşesc să supravieţuiască după apariţia şi dezvoltarea unui accident vasular cerebral (Lipton P et al, 1999).

Mortalitatea datorată accidentului vascular cerebral ischemic este cuprinsă între 20-30%. Dintre pacienţii care au reuşit să supravieţuiască accidentului vascular cerebral ischemic, o treime îşi îmbunătăţeşte simptomatologia în prima săptămână, la 40% simptomatologia rămâne neschimbată, iar la 20% are loc o deteriorare continuă a funcţiilor cerebrale pe parcursul primei săptămâni (Hankey, 2003).

CAPITOLUL II - FIZIOPATOLOGIA ACCIDENTULUI VASCULAR CEREBRAL

ISCHEMIC

Accidentul vascular cerebral este caracterizat prin debut brusc sau rapid, reprezentând o disfuncţie neurologică acută majoră, de origine vasculară, fiind caracterizat de apariţia simptomelor şi semnelor corespunzătoare ariei cerebrale ce a suferit întreruperea fluxului sangvin (Goldstein et al, 1989).

În general consecinţele ischemiei depind de mai mulţi factori, în principal aceştia fiind reprezentaţi de către starea anterioară a sitemului cardiovascular, de efectul recepţionării celulare a hipoxiei, de alimentarea cu sânge în teritoriile cerebrale şi nu în ultimul rând de viteza de instalare (Biagas K. 1999). Deşi creierul reprezintă doar o mica parte (2 %), comparativ cu greutatea totală a corpului, consumul acestuia de energie este mult disproporţionat, consumul de O2 atingând un procent important de 20 % din consumul total al organismului (Michiels C. 2004).

Fiziopatologia accidentului vascular cerebral implică, într-un grad mai mic sau mai mare, o succesiune importantă de procese şi evenimente definitorii, dintre care amintim: întrerupera barierei hemato-encefalice (BHE), epuizarea rezervelor celulare energetice, niveluri crescute de calciu intracelular, toxicitate prin implicare de radicali liberi, citotoxicitate mediată de către citokine, generarea de metaboliţi ai acidului arahidonic, activarea sistemului complement, activarea celulelor gliale şi infiltrarea cu leucocite (Woodruff TM et al, 2011).

CAPITOLUL III - SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Accidentul vascular cerebral este o afecțiune devastatoare, care afectează în

special persoanele vârstnice, pentru care nu există terapie eficientă în îmbunătățirea reabilitării neurale. Un mare beneficiu clinic poate rezulta din descifrarea și țintirea mecanismelor neurobiologice esențiale care stau la baza recuperării sistemului nervos central (SNC) post-AVC, atât din punct de vedere structural, cât și funcțional. Studiile pe animale de laborator privind AVC au identificat o varietate de intervenții cu efecte neuroprotectoare marcate, dar cele mai multe dintre aceste abordări nu au adus un beneficiu pacienţilor umani vârstnici ce au suferit un accident vascular cerebral, probabil pentru că astfel de terapii au fost dezvoltate pe modele de accident vascular cerebral folosind animale tinere. Într-adevăr, studiile recente privind AVC la animale experimentale vârstnice susţin că diferențele de vârstă ar putea avea o relevanță clinică importantă, atât pentru înțelegerea răspunsurilor celulare în AVC,

V

cât și pentru identificarea intervențiilor benefice (Lindner et al. 2003, Markus et al. 2005, Popa-Wagner et al. 2011). Totuşi, aceste studii, nu reușesc să explice în totalitate recuperarea mai bună a șobolanilor tineri, probabil pentru că au fost investigate doar un număr mic de evenimente genetice. Progresele recente în genomică și tehnologia ADN array ar putea genera o perspectivă cuprinzătoare asupra mecanismelor care stau la baza diferențelor dintre animalele vârstnice și cele tinere, în ceea ce privește viteza și gradul de reparare și regenerare al creierului după AVC.

Numeroase studii au utilizat aceste tehnici, cu scopul de a identifica noi ținte terapeutice pentru tratamentul AVC. Unele dintre aceste studii au evidențiat modificări în transcripția diverselor gene implicate în răspunsul la stres, inflamație, moarte celulară acută sau întârziată la șobolani tineri (Lu et al. 2003, Schmidt-Kastner et al. 2002), în timp ce un studiu mai recent a evidențiat o cale transcripțională implicată în apărarea și repararea țesuturilor cerebrale pe un model AVC la șoareci tineri (Tseveleki et al. 2010). O omisiune importantă a acestor studii este că ele nu includ animalele vârstnice. Importanța vârstei animalelor în răspunsul fiziologic la accident vascular cerebral este accentuată de un studiu recent care a identificat un transcriptom de regenerare specific vârstei care modulează diferențiat procesul de reorganizare a creierului după infarct cerebral la animalele tinere comparativ cu cele vârstnice (Li et al. 2010). Cu toate acestea, răspunsul genomic la accident vascular cerebral, nu se limitează la înmugurirea axonală, dar include, de asemenea procese fiziologice, metabolice, imunologice, apoptotice, proliferative, de dezvoltare, angiogeneză și de vindecare a plăgilor, care prezintă o importanță egală în reabilitarea neurologică.

În cadrul unui studiu menit să elucideze rolul unora dintre aceste procese suplimentare, s-au utilizate array-uri ADN personalizate care conțin gene implicate în semnalizarea din hipoxie, deteriorarea ADN-ului și apoptoză, răspunsul celular la leziuni, injurii și creștere axonală, diferențiere celulară, dendritogeneză și neurogeneză. S-a evidențiat că, desfășurarea, dependent de vârstă, a evenimentelor genetice în emisfera contralaterală, nedeteriorată post-accident vascular cerebral la șobolanii vârstnici, este diferită de cea observată la animalele tinere (Buga et al. 2008). Studiul actual extinde acest rezultate, profitând de evoluțiile recente din genomica șobolanului, efectuând analiza întregului genom transcriptomic al infarctului perilezional în fazele acută și de recuperare ce succed AVC.

Mai mult, prin extragerea de date și determinarea funcției fiecărei gene, în contextul fiziopatologic al accidentului vascular cerebral, am asociat 161 de gene, nou identificate, cu procese implicate în accident vascular cerebral, cum ar fi cele menționate mai sus.

CAPITOLUL IV - MATERIAL ŞI METODE Animalele utilizate în experienţe

Au fost utilizați treizeci (30) de șobolani tineri, cu vârsta cuprinsă între 3 şi 4 luni și patruzeci și cinci (45) de șoboani vârstnici, cu vârsta cuprinsă între 19 şi 20

VI

luni, de sex masculin, rasa Sprague-Dawley, născuți și crescuți în laborator. Cele două grupe de vârstă au fost împărțite aleator în grupuri de supraviețuire post-AVC de 3 zile și 14 zile. În plus, nouăsprezece (19) șobolani tineri (3 - 5 luni) și douăzeci și patru (24) vârstnici (18 - 20 luni) de sex masculin, rasa Sprague-Dawley, au fost folosiți ca martori. Greutatea acestora a variat între 290 - 360 g pentru șobolanii tineri și 520 - 600 g pentru șobolanii vârstnici. Șobolanii au fost ținuți în cuști standard (L=595mm x l=380mm x h=200mm), câte doi şobolani în fiecare cuşcă, talajul din interiorul cuştii fiind steril, schimbat la o perioadă fixă de două zile. Cuştile cu animale au fost ţinute într-un mediu controlat, la o temperatură de 22oC, umiditate 40-60% și lumină între orele 07.00-19.00, animalele având acces liber la hrană și apă. Metode utilizate în experimente

Ocluzia reversibilă a arterei cerebrale medii (OACM)

Infarctul cerebral a fost indus prin întreruperea transcraniană a fluxului de sânge prin ridicarea arterei cerebrale medii, cu un cârlig de tungsten. Optsprezece ore înainte de intervenția chirurgicală, șobolanii au fost privați de hrană. Apa a rămas disponibilă în orice moment. Artera cerebrală medie dreptă a fost ridicată cu un cârlig de tungsten atașat la un micromanipulator. Extracția ARN-ului și controlul calității ARN-ului

După ce țesutul a fost omogenizat, ARN total a fost extras din țesutul microdisecat utilizând reactivul TRIzol (Invitrogen life technologies, Karlsruhe, Germania). ADN-ul genomic a fost eliminat cu ajutorul Rneasy Plus Kit (Qiagen). ARN-ul purificat l-am folosit în etapele de cDNA arrays şi RT-PCR. Hibridizare microarray

Înainte de preprocesarea probei, integritatea ARN-ului a fost evaluată cu nanokitul ARN 6000 folosind instrumentul Bioanalyzer 2100 (Agilent, Böblingen, Germania). Valorile de integritate ARN au variat între 6,5 și 8,2. 200ng din fiecare probă au fost prelucrate cu kit de expresie a transcriptului complet (whole transcript - WT) (Ambion, Darmstadt, Germania), adică a fost amplificat ARN-ul prin revers-transcripție la ADNc dublu catenar și ulterior transcripție in vitro, urmată de o nouă rundă de revers-transcripție rezultând ADN monocatenar sens. Amestecurile de hibridizare au fost realizate după fragmentarea și etichetarea cu biotina a ADN-ului țintă conform protocolului GeneChip WT, kit de etichetare terminală (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Evaluarea Microarray-urilor

Înalta și constanta calitate a datelor obținute din microarray a fost asigurată prin inspecția vizuală a imaginilor scanate pentru descoperirea de artefacte de

VII

hibridizare și analiza corespondenței dintre datele microarray brute și cele normalizate. Normalizarea a fost efectuată prin metoda cuantilelor (Bolstad, 2003), iar corecția de fond și sumarul setului de valori au fost realizate cu Robust Microarray Average (RMA) [Irizarry, 2003]. PCR cantitativ în timp real

Pentru PCR cantitativ în timp real (qPCR), am sintetizat ADNc din fonduri mari (n = 19-24) de ARN total utilizând kitul de revers transcripție High-Capacity cDNA (Applied Biosystems, USA). qPCR a fost efectuat pe o placă cu pereți subțiri cu 96 de godeuri de 0.1 ml (Applied Biosystems), folosind sistemul One Step Plus (Applied Biosystems).

CAPITOLUL V - REZULTATE

După normalizarea datelor brute și sumarul setului de probe, am utilizat

metodologia empirică Baysian pentru a analiza valorile de expresie ale celor 28.826 seturi de transcripție privind expresia diferențială între probele post-AVC de la șobolani tineri și vârstnici și controalele lor respective. Aceasta a evidențiat un total de 1658 gene exprimate diferențiat cu un coeficient de multiplicare de minim doi (supra/subexprimare) a ratei de transcripție. Intensitățile seturilor de gene exprimate diferențiat din toate probele au fost grupate ierarhic aglomerativ (GIA), iar rezultatele au fost afișate ca un heat-map.

CAPITOLUL VI - DISCUŢII

În general, modelul de expresie genică sugerează puternic că răspunsul

creierului de șobolan vârstnic este calitativ, mai degrabă decât cantitativ, diferit față de șobolanul tânăr, și anume numărul total de gene reglate este comparabil între cele două grupe de vârstă, dar șobolanii vârstnici au avut mari dificultăți în montarea unui răspuns la AVC în timp util.

CAPITOLUL VII - CONCLUZII

În acestă lucrare am realizat o analiză transcriptomică la nivelul întregului genom a expresiei genelor post-AVC, la animalele tinere și vârstnice identificând 161 de gene noi, care sunt de interes pentru cercetarea AVC, precum și unele care pot fi ținte pentru dezvoltarea de noi terapii în AVC. Prin transcriptomică comparativă, am identificat 26 de noi obiective terapeutice care pot ajuta la stabilizarea organismelor vârstnice imediat după AVC și la facilitarea recuperării comportamentale și a țesuturilor după 2 săptămâni post-AVC. Am demonstrat că dendogramele de expresie genică ale șobolanilor naivi sunt clar delimitate față de cele ale șobolanilor post-AVC.

VIII

Rezultate studiului sprijină noțiunea de răspuns activ în AVC după 3 zile, la șobolanii tineri, echilibrat de un efect inhibitor asupra unui număr aproximativ similar de gene (circa 1.400), care se degradează în timp, astfel încât, în ziua 14 pot fi observate preponderent nivele scăzute de ARNm. Cele mai multe dintre modificările observate sunt răspunsuri active, o privire de ansamblu asupra expresiei genice sugerează existența unui anumit grup de gene cu expresie crescută (comparativ cu animalele naive) la 3 zile după AVC, precum și cu expresie redusă mai târziu (14 zile). Acest grup de gene sunt direct implicate în procesele ce cuprind vindecarea rănilor și formarea de țesut cicatricial, precum şi angiogeneza și remodelarea vasculară. Am identificat la animalele vârstnice mai multe schimbări unice în expresia genică în emisfera lezată: (i) o creștere importantă a numărului de gene tardiv supraexprimate și o creștere substanțială a numărului de gene persistent supraexprimate; (ii) o creștere a numărului de gene persistent subexprimate. Creierul afişează un răspuns întârziat la leziune la animalele bătrâne comparativ cu animalele tinere, argumet susţinut de numărul de gene subexprimate în faza tardivă a răspunsului la AVC, şi anume la 14 zile după accident. Având în vedere constatările noastre cum că AVC are impact asupra unei game largi de sisteme într-un mod dependent de vârstă, de la fiziologia SNC la regenerarea și plasticitatea SNC, şi cunoscând faptul că până în prezent, toate încercările, prin monoterapie, de a preveni sau diminua leziuni ale creierului în urma unui accident vascular cerebral au eșuat, considerăm ca ineficiente terapiile care vizează un singur sistem țintă. Rezultatele obtinute sugerează că un tratament etapizat, multimodal la animale vârstnice are o probabilate mai mare de a produce rezultate pozitive. O astfel de abordare terapeutică trebuie să se concentreze asupra refacerii tisulare, dar ar trebui să abordeze, de asemenea, alte aspecte ale terapiei pacientului post-AVC, cum ar fi sindromul neuropatic, stresul, tulburările de anxietate, depresia, neurotransmisia și tensiunea arterială. BIBLIOGRAFIE 1. Biagas K. Hypoxic-ischemic brain injury: advancements in the understanding of

mechanisms and potential avenues for therapy. (1999) Curr Opin Pediatr. Jun;11(3):223-238

2. Buga AM, Sascau M, Pisoschi C, Herndon JG, Kessler C and Popa-Wagner A (2008) The genomic response of the ipsilateral and contralateral cortex to stroke in aged rats. J Cell Mol Med 12:2731-2753.

3. Goldstein, M. , Barnett, H. J. M. , Orgogozo, J. M. , Sartorius, N. , Symon, L. , & Vereshchagin, N. V. (1989). Stroke—1989: Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke, 20 (10):1407–1431.

4. Hankey GJ. (2003) Long-term outcome after ischaemic stroke/transient ischaemic attack. Cerebrovasc Dis.;16 Suppl 1:14-149

5. Li F, Ravetch JV (2011) Inhibitory Fcγ receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333:1030-1034.

IX

6. Lindner MD, Gribkoff VK, Donlan NA and Jones TA (2003) Long-lasting functional disabilities in middle-aged rats with small cerebral infarcts. J Neurosci 23:10913-10922

7. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons, (1999),Physiol Rev 79: 1431-1568. 8. Lopez AD, Mathers CD, Ezzati M, Jamison DT, Murray CJ. (2006) Global and

regional burden of disease and risk factors, 2001: systematic analysis of population health data.Lancet. May 27;367(9524):1747-1757.

9. Lu A, Tang Y, Ran R, Clark JF, Aronow BJ and Sharp FR (2003) Genomics of the periinfarction cortex after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 23:786-810.

10. Markus TM, Tsai SY, Bollnow MR, Farrer RG, O'Brien TE, Kindler-Baumann DR, Rausch M, Rudin M, Wiessner C, Mir AK, Schwab ME and Kartje GL (2005) Recovery and brain reorganization after stroke in adult and aged rats. Ann Neurol 58:950-953.

11. Michiels C.Physiological and pathological responses to hypoxia (2004). Am J Pathol. Jun;164(6):1875-1882

12. Popa-Wagner A, Buga AM and Kokaia Z (2011) Perturbed cellular response to brain injury during aging. Ageing Res Rev 10:71-79.

13. Schmidt-Kastner R, Zhang B, Belayev L, Khoutorova L, Amin R, Busto R and Ginsberg MD (2002) DNA microarray analysis of cortical gene expression during early recirculation after focal brain ischemia in rat. Brain Res Mol Brain Res 108:81-93.

14. Tseveleki V, Rubio R, Vamvakas SS, White J, Taoufik E, Petit E, Quackenbush J and Probert L (2010) Comparative gene expression analysis in mouse models for multiple sclerosis, Alzheimer's disease and stroke for identifying commonly regulated and disease-specific gene changes. Genomics 96:82-91

15. Warlow C, Sudlow C, Dennis M, Wardlaw J, Sandercock P. Lancet. (2003) Stroke.;362(9391):1211-1224

16. Woodruff TM, Thundyil J, Tang SC, Sobey CG, Taylor SM, Arumugam TV. (2011) Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.Mol Neurodegener.;6(1):11