1

Spitalul Clinic de Urgenţă – Clinica de Chirurgie

Bucureşti - Calea Floreasca nr. 8, Sector 1, Tel. +4021 599 23 36 Şef de

Clinică: Prof. Dr. Mircea Beuran

RAPORTARE STIINTIFICA

RST - Raport stiintific si tehnic in extensor

Etapa 3: Functionalizarea nanoparticulelor de maghemita cu

biomarkeri si studiul in vivo al biodistributiei

Perioada de raportare: 21.12.2015-20.12.2016

Participanti: CO – Spitalul Clinic de Urgenta

P1 – Universitatea Politehnica din Bucuresti

P2 – Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Fizica Materialelor RA

P3 – Nuclear NDT Research & Services S.R.L.

Obiectivele fazei de executie :

Stabilizarea nanoparticulelor functionalizate în mediu fiziologic.

Proprietatile vibrationale ale structurii nanoparticulelor de maghemita folosite în

experimente clinice.

Caracterizarea nanoparticulelor de maghemita folosite în experimente clinice prin

analiza termica.

Studiu histopatologic privind influența nanoparticulelor de maghemită folosite in

experimente clinice asupra organelor soarecilor sanatosi in functie de concentratie si

timp de incubatie.

Studii in vivo privind toxicitatea nanoparticulelor de maghemită folosite in

experimente clinice

Grefarea unor agenti de directionare la suprafata nanoparticulelor de maghemita

folosite în experimente clinice.

Studiul structural si morfologic al nanoparticulelor de maghemita folosite în

experimente clinice dupa grefarea unor agenti de directionare.

Cresterea eficientei efectului terapeutic al medicatiei chimioterapice prin injectarea de

nanoparticule magnetice vectorizate la nivel local.

Studiul influenței câmpului magnetic asupra zonelor neoplazice către care au fost

direcționate nanoparticule de maghemită grefate cu agenti de directionare prin

aplicarea unui camp magnetic continuu.

Deplasari, vizite de lucru si stagii de perfectionare in laboratoarele colaboratorilor

straini pentru buna desfasurare a proiectului.

Diseminarea rezultatelor prin participarea la conferinte nationale si internationale.

Diseminarea rezultatelor prin trimiterea spre publicare a unui articol într-un jurnal ISI.

Raport de cercetare.

2

Rezumat

Nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier (γ-Fe2O3) au captat atentia cercetatorilor

datorita numeroaselor posibile aplicatii in domeniul biomedical si cel de diagnosticare.

Acoperirea γ-Fe2O3 cu diferite straturi de suprafata poate asigura o interfata intre miez si

mediul inconjurator. Scopul acestui studiu a fost de a evalua comportamentul in vivo al

nanoparticulelor de oxid de fier acoperite cu dextran (D-γ-Fe2O3) in suspensii apoase

functionalizate cu 5-Fluorouracil. Nanoparticulele SPION stabilizate cu dextran (D- γ-Fe2O3)

au fost sintetizate in solutii apoase printr-o metoda de co-precipitare. Suspensiile D-γ-Fe2O3

obtinute au fost functionalizate cu 5-Fluorouracil (γ-Fe2O3_5-FLU) si studiate din punct de

vedere fizico-chimic si biologic. Pentru studiile in vivo au fost utilizati soarecii nude.

Observarea in vivo a eficientei nanoparticule de maghemită grefate cu agenti antitumorali (5-

Fluorouracil) asupra zonelor neoplazice si influenta campului magnetic aplicat la soareci de

tip nude a reprezentat obiectivul principal al acestei etape. In urma studiilor histopatologice

realizate dupa tratarea zonelor neoplazice cu D-γ-Fe2O3_5-FLU si aplicarea unui camp

magnetic nu s-au inregistrat efecte secundare la nivelul organelor analizate.

1. Introducere

Nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier au captat atentia cercetatorilor in

ultimii ani datorita numeroaselor posibile aplicatii ale acestora in domeniul biomedical si cel

de diagnosticare [1-4]. Datorita proprietatilor magnetice deosebite, precum si a

biocompatibilitatii si non-toxicitatii acestora, SPIONs pot fi utilizate in imagistica

moleculara. Pe de alta parte, proprietatile specifice ale acestor nanoparticule le permit

acestora sa formeze legaturi cu o gama larga de medicamente, proteine, peptide, antibiotice,

polimeri, ADN, ARN, oligozaharide, etc [5-9]. Datorita faptului ca raportul suprafata/volum

creste odata cu scaderea dimensiunii, aceste particule faciliteaza conjugarea cu diferiti

markeri moleculari, putand interactiona la nivel molecular si celular. In general, aceste

nanoparticule sunt formate dintr-un miez magnetic alcatuit din maghemita (γ-Fe2O3) sau

magnetita (Fe3O4) incapsulat intr-un polimer biocompatibil precum dextranul sau sucroza [4-

11]. Acoperirea SPIONs cu un polimer previne agregarea acestora, iar gruparile functionale,

precum –NH2 sau –OH) ale polimerului permit conjugarea pe suprafata SPIONs cu compusi

bioactivi precum anticorpi sau diferite medicamente. Dimensiunea nanoparticulelor SPIONs

care formeaza miezul, precum si dimensiunea hidrodinamica a particulelor in mediul de

dispersie, aceasta incluzand miezul format din SPIONs si polimerul acoperitor au o

importanta majora pentru aplicatii in vivo [12-16]. Exista numeroase metode de sinteza

pentru obtinerea SPIONs cu diferite dimensiuni. Printre acestea se numara precipitarea

chimica [10,17-18], metodele la temperatura inalta [19], etc. Proprietatile magnetice ale

SPIONs sunt puternic influentate de raportul dintre suprafata si volum. Pentru a putea fi

utilizate ca sonde pentru RMN, SPIONs trebuie sa prezinta o magnetizare ridicata atunci cand

un camp magnetic extern este aplicat. De asemenea, trebuie sa prezinte o suprafata de

acoperire si o functionalitate bine dezvoltate [20]. Acoperirea SPIONs cu diferite straturi de

suprafata poate asigura o interfata intre miez si mediul inconjurator [21]. In anul 2004

Molday si Mackenzie au sintetizat pentru prima oara nanoparticule de oxid de fier acoperite

cu dextran [22].

Desi este cunoscut faptul ca pentru organismele vii fierul este esential deoarece este

necesar pentru numeroase procese metabolice, printre care se numara transportul de oxigen,

metabolizarea medicamentelor, sinteza AND-ului, productia de ATP , etc. [23], concentratia

de fier din celule trebuie sa fie foarte atent controlata datorita citotoxicitatii cauzate de

3

excesul de fier. Mai mult decat atat, in tratamentul anemiei determinate de deficienta de fier

sunt folosite substante pe baza de fier si zaharide, cum ar fi fier-dextran, fier-sucroza, fier-

polizaharide, etc. [24-25].

Scopul acestui studiu a fost acela de a investiga comportamentul in vivo al

nanoparticulelor de oxid de fier-dextran (D-γFe2O3) in suspensii apoase in urma injectarii

intraperitoneale. Injectarea intraperitoneala a fost aleasa ca metoda de administrare a

nanoparticulelor deoarece este cea mai frecvent folosita metoda de adminstrare a

medicamentelor, avand in vedere ca peritoneul ofera o suprafata mare a cavitatii abdominale.

Mai mult decat atat, potentialul toxicologic al D-γFe2O3 a fost evaluat la diferite intervale de

timp. Mai mult decat atat, investigatiile histologice au fost realizate la toate intervalele de

timp.

In aceasta lucrare au fost, de asemenea, raportate rezultatele obtinute prin intermediul

microscopiei electronice in transmisie (TEM) si al studiilor de imprastiere dinamica a luminii

(DLS), efectuate pe toate probele investigate. Pentru D-γFe2O3, dimensiunile medii ale

particulelor deduse din imaginile TEM au avut valori de aproximativ 7.5 ± 0.5 nm, in timp ce

diametrul hidrodinamic mediu dedus in urma anallizelor DLS a fost de 30 ± 0.5 nm.

2. Obtinerea si stabilizarea nanoparticulelor functionalizate în mediu fiziologic

Pentru obtinerea si stabilizarea nanoparticulelor de maghemita am avut nevoie de

clorura feroasa tetrahidrata (FeCl2·4H2O), clorura ferica hexahidrata (FeCl3·6H2O),

hidroxidul de sodiu (NaOH), dextranul (H(C6H10O5)xOH; m.w. ~ 40,000), acidul clorhidric

(HCl) si acidul percloric (HClO4) au fost achizitionate de la Merck. In timpul sintezei

nanoparticulelor a fost folosita apa distilata pentru clatirea clusterelor.

Clorura feroasa tetrahidrata (FeCl2·4H2O) a fost amestecata cu HCl 2M si cu clorura

ferica hexahidrata (FeCl3·6H2O) la o temperatura de 40oC, raportul Fe2+/ Fe3+ fiind ½.

Amestecul a fost ulterior adaugat intr-o solutie de dextran (30 g in 100 ml de apa) si 300 ml

de NaOH (2 mol/l) la temperatura ambientala si amestecat continuu timp de 30 de minute.

Solutia rezultata a fost incalzita la 90oC si amestecata continuu timp de o ora (200 rot/min).

Solutia de NaOH 5M a fost picurata pentru a mentine pH-ul la valoarea 11. Precipitatul a fost

apoi centrifugat si tratat periodic cu o solutie de acid percloric (3 mol/l) pana cand raportul

Fe2+/ Fe3+ din proba a fost de aproximativ 0.05 [11]. Dupa separarea prin centrifugare,

suspensia apoasa de nanoparticule de fier a fost dispersata in dextran (30 g in 100 ml de apa).

Solutia finala de D-γFe2O3 a fost incalzita la o temperatura de 90oC si a fost amestecata

continuu timp de o ora (200 rot/min). Solutia cu continut de D-γFe2O3 a fost spalata cu

ajutorul coloanelor magnetice. In final, s-a obtinut suspensia de D-γFe2O3.

3. Studii privind structura si stabilizarea solutiilor functionalizate cu 5-Florouracil pe

baza de oxid de fier acoperit cu dextran

Structura nanoparticulelor functionalizate a fost determinata prin studii de

microscopie electronica in transmisie (TEM) efectuate cu ajutorul unui microscop JOEL

200CX. Stabilitatea si dispersia solutiilor au fost analizate cu ajutorul unui aparat SZ-100

Nanoparticle Analyzer (Horiba) la o temperatura constanta de 25 ± 1 °C. Masuratorile de

difuzia luminii (DLS) si Potential Zeta ne-au dat informatii atat asupra diametrului

hidrodinamic al particulelor functionalizate cat si asupra dispersiei si stabilitatii in mediul

fiziologic.

Morfologia nanoparticulelor, difractia de electroni pe arie selectata (SAED) si

distributia de dimensiuni a D-γFe2O3 masurata din micrografiile TEM cu marire redusa sunt

4

prezentate in Figura 1. Figura 1A prezinta imaginea TEM obtinuta la marire redusa a D-

γFe2O3. Figura inserata (Figura 1B) este difractograma SAED realizata pe o zona cu un

numar mare de nanoparticule. Inelele din difractograma SAED pot fi indexate ca fiind

reflexiile 220, 311, 400, 422, 511 si 440 ale maghemitei cubice. Dimensiunea medie a D-

γFe2O3 monodisperse a fost de 7.5 ± 0.5 nm (Figura 1C). Dupa cum se poate observa din

micrografiile TEM este evident ca nanoparticulele sunt uniforme si au o forma sferica.

Figura 1 : Morfologia nanoparticulelor, difractia de electroni pe zona selectata (SAED) si

distributia de dimensiuni a D-γFe2O3 masurate din micrografiile TEM cu marire redusa. (A).

Micrografie TEM la marire mare (20 nm) ; (B). SAED pentru o regiune cu un numar mare

de nanoparticule ; (C). Distributia de dimensiuni a D-γFe2O3.

Imprastierea dinamica a luminii, cunoscuta sub denumirea de imprastiere cvasi-

elastica a luminii, a fost utilizata pentru a determina diametrul hidrodinamic si profilul

distributiei de dimensiuni (Figura 2) pentru suspensiile de D-γFe2O3 (nanoparticule de oxid

de fier acoperite cu dextran) si D-γFe2O3_5-FLU (nanoparticule de oxid de fier acoperite cu

dextran si functionalizate cu 5-Fluorouracil).

Figura 2 : Distributia de dimensiuni a D-γFe2O3 (stanga) si D-γFe2O3_5-FLU determinata

prin imprastierea dinamica a luminii (DLS).

Distributia intensitatii dimensiunilor de particule obtinute prin DLS pentru D-γFe2O3 a

evidentiat prezenta a doua populatii in timp ce in cazul D-γFe2O3_5-FLU a fost evidentiata o

singura populatie. Cea de-a doua populatie prezenta in solutiile D-γFe2O3 a fost reprezentata

de populatia agregata, cu continut de cateva zeci de particule care nu sunt semnificative

pentru cantitatea totala. Asadar, se poate afirma cu certitudine ca starea agregata de particule

a fost minima (Figura 2 stanga). Prima populatie evidentiaza particule cu dimensiuni

caracteristice unor particule solvatate (Figura 2 stanga). Diametrul mediu obtinut prin DLS

pentru D-γFe2O3 a fost de 10.3 ± 4.5 nm. D-γFe2O3_5-FLU observate prin DLS sunt

monodisperse in apa (Figura 2 dreapta) iar diametrul mediu obtinut prin DLS pentru D-

γFe2O3_5-FLU a fost de 8.5 ± 6.1 nm.

5

Potentialul zeta masurat pentru cele doua suspensii D-γFe2O3 si D-γFe2O3_5-FLU este

prezentat in Figura 3. Potentialul zeta este cel mai important indicator al stabilitatii

dispersiilor coloidale. Pentru particule la scara nanometrica, o valoare mare a potentialului

zeta indica o stabilitate a solutiilor. O valoare mare a potentialului zeta arata ca solutia va

rezista in timp agregarii. Nanoparticulele in solutie cu potential zeta ridicat (negativ sau

pozitiv) sunt stabilizate electric in timp ce dispersiile cu potential zeta scazut tind sa se

aglomereze sau sa precipite [26-27]. In Figura 3 se poate observa ca solutia de D-γFe2O3_5-

FLU prezinta o buna stabilitate in timp ce solutia D-γFe2O3 are o stabilitate moderata.

Figura 3 : Potentialul Zeta pentru D-γFe2O3 (stanga) si D-γFe2O3_5-FLU (dreapta).

4. Studii privind compozitia chimica si morfologia solutiilor functionalizate cu 5-

Fluorouracil pe baza de oxid de fier acoperit cu dextran

Compozitia chimica a probelor folosite in acest studiu a fost determinata prin masuratori

de GDOES (Glow Discharge Optical Emission Spectroscopy). Determinarea concentratiei de

ioni de fier a fost efectuata utilizand un spectrofotometru cu flacara si cuptor de grafit

Zeeman HITACHI Z-8100. Morfologia nanoparticulelor functionalizate a fost observata prin

microscopie electronica de baleiaj (MEB) utilizand un microscop Quanta Inspect F50 cuplat

cu un dispozitiv EDAX/2001 pentru analiza elementala.

Dupa cum se poate observa din Figura 4, suspensiile de fier acoperit cu dextran ce au

fost folosite pentru obtinerea solutiilor D-γFe2O3_5-FLU contin doar elementele constituente

ale oxidului de fier si dextranului. Elemente secundare care ar putea fi atribuite unor

impuritati nu au fost detectate. Ca urmare, putem afirma ca solutiile functionalizate cu 5-

Fluorouracil pe baza de oxid de fier acoperit cu dextran cu care au fost injectati soarecii nude

masculi prezinta puritate maxima.

Figura 4 : Elementele constituente ale D-γFe2O3 determinate prin masuratori GDOES.

6

Concentratiile de fier din solutiile functionalizate (D-γFe2O3 si D-γFe2O3_5-FLU)

obtinute din calculele efectuate in urma datelor experimentale obtinute din masuratorile de

AAS sunt prezentate in Tabelul 1.

Tabelul 1 : Valorile concentratiilor de fier pentru solutiile functionalizate

Solutie functionalizata Concentratie de fier

(mg/mL)

D-γFe2O3 4.2

D-γFe2O3_5-FLU 1.6

Studiul morfologiei probelor 5FLU, D-γFe2O3 si D-γFe2O3_5-FLU a fost realizat prin

microscopie electronica de baleiaj, rezultatele obtinute fiind prezentate in Figura 5.

Figura 5: Imagini MEB ale 5-FLU (A), D-γFe2O3 (B) si D-γFe2O3_5-FLU (C).

Investigatiile MEB au aratat faptul ca probele de 5-FLU prezinta o morfologie

omogena sub forma de fulgi organizati avand dimensiuni nanometrice (Figura 5A). Imaginile

MEB au evidentiat, de asemenea, faptul ca probele D-γFe2O3 prezinta o morfologie uniforma

cu particule de dimensiuni nanometrice si forme sferice (Figura 5B). Mai mult decat atat,

imaginea MEB corespunzatoare probei D-γFe2O3_5-FLU, pune in evidenta faptul ca

particulele de oxid de fier acoperite cu dextran (reprezentate prin sageti) au fost omogen si

uniform inglobate in 5-FLU si ca isi pastreaza atat dimensiunea nanometrica cat si forma

sferica (Figura 5C).

5. Studii ale proprietatile vibrationale ale structurii nanoparticulelor de maghemita

folosite în experimente clinice.

Proprietatile vibrationale ale nanoparticulelor magnetice functionalizate si utilizate in

experimente clinice au fost realizate prin spectroscopie in infrarosu cu transformata Fourier

pe solutii de γFe2O3, D-Fe2O3, γFe2O3_5- FLU si D-Fe2O3_5- FLU.

Prezenta gruparilor specifice oxidului de fier (in cazul nostru maghemita) în probele

studiate au fost puse in evidenta. Benzile ce apar in domeniul spectral 4000-1000 cm-1 sunt

caracteristice vibraţiilor legăturilor O-H. Benzile caracteristice vibraţiilor legăturilor O-H

apar la 3400 cm-1 şi 1600 cm-1. O bandă de vibraţie a reţelei oxidice (M-O) este observata la

640-580 cm-1. Banda de la 636 cm-1 corespunde vibraţiilor (Fe-O) din tetraedrii izolaţi

FeIIO4 în timp ce banda de la 570 cm-1 corespunde vibraţiilor (Fe-O) din octaedrii

condensaţi FeIIIO6. In Figura 6 este prezentat spectru obtinut pentru γFe2O3.

7

Figura 6 : Spectrele FTIR al nanoparticulelor de γFe2O3 in domeniul 4000-500 cm-1.

6. Caracterizarea nanoparticulelor de maghemita folosite in experimente clinice prin

analiza termica

Comportarea termică a pulberilor a fost studiată prin analiza termică diferentială si

analiza termică gravimetrică utilizand Shimatzu DTG-TA-50 si un analizor DTA 50 in

domeniul de temperatura 25-800oC si utilizand Al2O3 ca referinţa. Atat nanoparticulele de

maghemita cat si nanoparticulele de oxid de fier acoperite cu dextran au fost studiate din

punct de vedere al comportamentului termic. Rezultatele obtinute in urma acestor studii ne

dau informatii referitoare la transformarile ce au loc atunci cand temperatura creste. De

asemenea, in urma acestor studii se poate determina temperatura pana la care aceste

nanoparticule sunt stabile din punct de vedere structural. In Figura 7 sunt prezentate curbele

de analiza termogravimetrica, TGA (in rosu) si curbele de analiza termodiferentiala, DTA (in

negru) pentru maghemita si maghemita acoperita cu dextran (D-IONPs).

Figura 7 : Curbele TGA si DTA pentru maghemita (stanga) si D-γFe2O3 (dreapta).

Dupa cum se poate observa in Figura 7 in cazul maghemitei avem trei pierderi de

masa in timp ce pentru D-IONPs au fost evidentiate 4 pierderi de masa. Mai mult decat atat

cele doua probe analizate sunt stabile termica pana la temperatura de 268 oC (maghemita) si

263 oC (D-IONPs). Transformarea ce apare in jurul valorii de 91 oC pe curba DTA a D-

IONPs este datorata pierderii de apa si nu influenteaza stabilitatea materialului. Pe de alta

parte, transformarile care au loc la valori mai mari de 300 oC sunt nesemnificative pentru

aceasta aplicatie a nanopaticulelor magnetice. Atat functionalizatea cu agenti chimioterapici

cat si injectarea si aplicarea campului magnetic se realizeaza la temperaturi joase (sub 100 oC).

7. Studii nondistructive ale solutiilor functionalizate cu 5-Fluorouracil pe baza de oxid de

fier acoperit cu dextran

8

Studiile nondistructive ale solutiilor functionalizate cu 5-Fluorouracil pe baza de oxid

de fier acoperit cu dextran au fost realizate prin spectroscopie ultrasonica. Tehnicile cu

ultrasunete, ca instrument analitic, au revoluționat diagnoza medicală, dar aplicarea lor la

analiza materialelor s-a dezvoltat mai lent decât în medicină, atât din cauză că, pentru

obținerea unor rezoluții acceptabile, necesită instrumentație performantă la frecvente mai

ridicate, cât și datorită faptului că prelucrarea datelor necesită dezvoltarea unor modele

teoretice complexe și putere de calcul superioară.

Progrese recente în tehnicile digitale de achiziție de date, comandă/control al

instrumentației și creșterea semnificativă a vitezei și puterii de calcul ale calculatoarelor au

facut posibilă proiectarea și realizarea unor instrumente de laborator versatile cu aplicații ce

variază de la studiul metalelor, la al materialelor ceramice, polimerice, probelor de biologie

celulară și farmacologie. Amplitudinea deformațiilor oscilante asociate undelor ultrasonice de

interogație folosite în Spectroscopia Ultrasonică analitică sunt extrem de mici astfel că

analiza spectroscopică bazata pe unde ultrasonice este o tehnică nedistructivă.

Rezultatele obținute pe mediul de referință și, respectiv, pe 2 dintre soluțiile

investigate (γFe2O3_5- FLU si D-Fe2O3_5- FLU), pentru fiecare din cei 3 traductori de bandă

largă, in urma procesării datelor spectrale sunt prezentate in continuare. Cea mai mare

deplasare spre frecvențe joase a spectrelor s-a obținut pe proba P1 (D-Fe2O3_5- FLU), pentru

traductorul de 50MHz. Pentru traductorul de 10MHz, spectrele cele mai apropiate de referință

se obțin pentru P4 (γFe2O3_5- FLU).Conținutul spectral al pulsurilor ultrasonice în mediul de

referință (apă distilată) sunt situate în toate cazurile, la cele mai mari valori ale frecvenței

limitei superioare. Rezultatele spectrale obtinute in urma masuratorilor realizate folosint cei 3

traductori cu frecvente diferite sunt prezentate in Tabele 2-4.

Tabel 2: Rezultatele spectrale pentru traductorul : PANAMETRICS 10MHz

Code Peak Frequency Central Frequency Lower Frequency Upper Frequency Bandwidth

[MHz] [MHz] [MHz] [MHz] [%]

Ref-4 8.700 9.897 4.520 15.273 108.65

Ref-5 8.474 9.504 4.208 14.801 111.45

P1-2 6.544 7.001 3.380 10.622 103.44

P1-3 6.489 6.995 3.367 10.624 103.74

P4-2 8.396 9.202 4.253 14.152 107.57

P4-3 8.261 9.033 4.200 13.865 107.01

Tabelul 3: Rezultatele spectrale pentru traductorul : KRAUTKRAMER 25MHz

Code Peak Frequency Central Frequency Lower Frequency Upper Frequency Bandwidth

[MHz] [MHz] [MHz] [MHz] [%]

Ref-1 7.515 7.688 3.086 12.290 119.73

Ref-2 7.612 7.711 3.088 12.334 119.90

P1-1 5.744 5.905 2.240 9.570 124.13

P1-2 5.650 5.774 2.194 9.354 123.99

P4-1 6.907 7.093 2.792 11.394 121.28

P4-2 7.006 7.145 2.810 11.480 121.35

Tabelul 4: Rezultatele spectrale pentru traductorul : KRAUTKRAMER 50MHz

Code Peak Frequency Central Frequency Lower Frequency Upper Frequency Bandwidth

[MHz] [MHz] [MHz] [MHz] [%]

Ref-1 8.944 8.964 4.509 13.419 99.40

Ref-2 8.829 8.956 4.466 13.445 100.26

P1-1 5.374 5.538 1.746 9.329 136.94

P1-2 5.493 5.756 1.967 9.546 131.66

9

Code Peak Frequency Central Frequency Lower Frequency Upper Frequency Bandwidth

[MHz] [MHz] [MHz] [MHz] [%]

P4-2 7.344 8.141 3.326 12.955 118.28

P4-3 7.388 8.246 3.230 13.262 121.66

Domeniul variațiilor spectrale pentru soluțiile investigate se întinde pe mai mult de 3

MHz în ceea ce privește frecvența limitei superioară și centrală, pe când lărgimea de bandă se

menține relativ constantă pentru toate tipurile de soluții. Pentru toți traductorii de bandă largă,

în speță pentru toate pulsurile de intrare aplicate, nanoparticulele din proba P1 prezintă cele

mai mici valori ale frecvențelor superioare și inferioare. În același timp, nanoparticulele din

soluția P4, prezintă valori usor modificate.

8. Observarea in vivo a eficientei nanoparticulelor de maghemită grefate cu agenti de

directionare asupra zonelor neoplazice si influenta campului magnetic aplicat.

Pentru studiile in vivo au fost realizate suspensii de D-IONPs care au fost functionalizate

cu 5-FLU (B) si DION-FLU (C). Aplicarea campului magnetic asupra zonelor neoplazice a

fost realizata cu ajutorul unui instrument conceput si realizat de catre Nuclear NDT ce va fi

brevetat. O imagine a electromagnetului realizat in cadrul proiectului este prezentat in Figura

8. Mai mult, Figura 9 prezinta câmpul magnetic B (măsurat in Tesla) reprezentat ca grafic

3D. Săgețile dispuse circular și având același sens corespund curentului prin bobinele cu

spirele înfășurate în același sens.

Figura 8: O imagine a electromagnetului realizat in cadrul proiectului ce urmeaza a fi

brevetat.

Figura 9: Câmpul magnetic B (măsurat in Tesla) reprezentat ca grafic 3D. Săgețile dispuse

circular și având același sens corespund curentului prin bobinele cu spirele înfășurate în

același sens.

10

Soarecii nude masculi (cantarind aproximativ 25 g) au fost achizitionati de la

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare si Imunologie “Cantacuzino”, Bucuresti.

Femelele soarece nu au fost folosie in acest studiu datorita fluctuatiilor hormonale

(estrogen/progesterone) aparute pe perioada ciclului menstrual. Fluctuatiile acestor hormoni

pot influennta rezultatele analizelor de sange, modificand astfel rezultatele experimentului

[28]. Soarecii nude au fost tinuti in custi din otel inoxidabil (cate patru soareci nude in fiecare

cusca), avand acces liber la hrana si apa ad libitum. Soarecii nude au fost aclimatizati in

conditii de mediu controlate, avand temperature (22±2oC), luminozitatea (cicluri zi/noapte de

12 h) si umiditatea (60±10%) presetate. Inainte de inceperea experimentului soarecii au fost

tinuti in laborator timp de o saptamana pentru aclimatizare. Animalele au fost mentinute in

conditii speciale fara microorganisme, in conformitate cu normele internationale de ingrijire a

animalelor si cu ghidul NIH pentru ingrijire si folosirea animalelor de laborator.

Analiza hematologica si analiza biochimiei sangelui

Pentru analizele hematologice si cele de biochimie a sangelui, probele de sange au

fost recoltate din vena cozii soarecilor. Sangele a fost recoltat in microtuburi EDTA si pastrat

in frigider la temperature intre 2 si 8oC. Probele au fost analizate in 2 ore de la colectare. In

acest studiu au fost evaluati parametrii hematologici precum RBC, WBC, trombocite, Hct si

Hgb. Pe de alta parte, functia hepatica a fost evaluat prin AST si ALT. mai mult decat atat,

prin CRE si BUN a fost determinata nefrotoxicitatea. Toti parametrii au fost evaluati in

fiecare saptamana utilizand un Analizor Hematologic IDEXX VetAutoread.

Examinarea histologica

Analiza tolerabilitatii D-IONPs in timpul experimentelor in vivo pe termen

lung a fost realizata dupa ce fiecare soarece (n=10 soareci nude per grup) a fost injecatat cu 1

ml/kg de D-IONPs. Unul dintre grupuri a fost considerat etalon, soarecii nude ai acestui grup

nefiind injectati. Dupa injectarea intraperitoneala a D-IONPs, toxicitatea a fost evaluata pe

parcursul intregii perioade a experimentului. Pentru examenele histologice animalele au fost

eutanasiate. Examinari histologice au fost realizate pe tesuturi hepatice, renale si splenice.

Organele selectate au fost prelevate din soareci si fixate cu 10% formalina. Organele au fost

pregatite ca lamele de sticla acoperite cu parafina, colorate cu hematoxilina si eozina.

Modificarile morfologice au fost observate cu ajutorul unui microscop (Daffodil MCX100

Microscope by Micros, Austria) [29]. Greutatea corporala a fost determinata in fiecare

saptamana si examinari histologice au fost efectuate in fiecare saptamana, pe o perioada de o

luna. In Figura 10 este prezentat aspectul tumorii la 3 saptamani de la injectarea celulelor

tumorale H T29. Solutiile injectabile utilizate in cadrul acestui studiu au fost oxidul de fier

simplu (γFe2O3) si acoperit cu dextran (D-γFe2O3) cat si in prezenta 5-Fluorouracilului (5-

FLU). De asemenea au fost realizate studii in urma injectarii soarecilor cu solutii pe baza de

maghemita functionalizata cu 5-Fluorouracil (γFe2O3_5-FLU) si maghemita acoperita cu

dextran functionalizata cu 5-Fluorouracil (D-γFe2O3_5-FLU). Dupa injectarea intratumorala a

suspensiilor soarecii au fost introdusi intr-un electromagnet fabricat de partenerul P3 Nuclear

NDT Research & Services S.R.L. Tensiunile aplicate au fost de 9.5 V si 11.7 V iar timpul de

expunere a fost de 5 minute. In Figura 11 este prezentata aplicarea tintita a campului

magnetic asupra regiunii tumorale. Organele prelevate de la soarecii nude au fost conservate

in recipiente speciale, ulterior au fost fixate cu formaldehida 10%. Figura 12 prezinta

distribuția intensității câmpului magnetic H (A/m) în reprezentare 3D, pentru secțiunea xy

11

având cota z=50 mm. Câmpul magnetic este radial și simetric, fiind mai mare în centru și

scăzând către margini. In Figura 13 este prezentat aspectul macroscopic al rinichiului,

ficatului, si plamanului la 14 zile de la injectarea unei solutii de (γFe2O3_5-FLU) in timp ce

in Figura 14 este prezentat aspectul macroscopic al rinichiului ficatului, si plamanului la 14

zile de la injectarea unei solutii de D-γFe2O3_5-FLU. Aspectul macroscopic al rinichiului,

ficatului, si plamanului la 14 zile de la injectarea unei solutii de 5-FLU este prezentat in

Figura 15.

Figura 10 : Aspectul tumorii la 3 saptamani de la injectarea celulelor tumorale H T29.

Figura 11: Aplicarea tintita a campului magnetic asupra regiunii tumorale.

Figura 12 : Distribuția intensității câmpului magnetic H (A/m) în reprezentare 3D, pentru

secțiunea xy având cota z=50 mm. Câmpul magnetic este radial și simetric, fiind mai mare în

centru și scăzând către margini.

12

Figura 13: Aspectul macroscopic al rinichiului ,ficatului, si plamanului la 14 zile de la

injectarea unei solutii de (γFe2O3_5-FLU).

Figura 14 : Aspectul macroscopic al rinichiului ficatului, si plamanului la 14 zile de la

injectarea unei solutii de D-γFe2O3_5-FLU.

Figura 15. Aspectul macroscopic al rinichiului, ficatului, si plamanului la 14 zile de la

injectarea unei solutii de 5-FLU.

Dupa cum se poate observa in Figurile 16-18 prezentate de mai jos, in urma studiilor

realizate s-a constat ca in cazul rinichiului si ficatului dupa injectarea animalelor cu solutiile

de γFe2O3_5- FLU, D-γFe2O3_5- FLU si 5-FLU nu se constata aparitia determinarilor

secundare la examenul anatomopatologic efectuat pe tesutul prelevat la 14 zile de la

administrare solutiilor. Pe de alta parte, in cazul plamanului, dupa injectarea animalelor cu

solutii de γFe2O3_5-FU, D-γFe2O3_5-FU nu se constatat aparitia determinarilor secundare la

13

examenul anatomopatologic efectuat pe tesutul prelevat la 14 zile de la administrare solutiilor

in timp ce dupa administrarea 5-FLU au fost observate determinarilor secundare in urma

examenului anatomopatologic efectuat pe tesutul pulmonar prelevat la 14 zile de la

administrare.

Figurile 16 (A-B) prezinta tesut renal fara determinari secundare la 14 zile de la

injectarea animalelor cu solutii de γFe2O3_5- FLU si D-Fe2O3_5- FLU si aplicarea unui camp

magnetic cu intensitatea de 11,7 V. In Figurile 17 (A-B) este prezentat tesut hepatic fara

determinari secundare la 14 zile de la injectarea animalelor cu solutii de γFe2O3_5- FLU si

D-Fe2O3_5- FLU si aplicarea unui camp magnetic cu intensitatea de 11,7 V. Tesutul

pulmonar fara determinari secundare dupa injectarea injectarea animalelor cu solutii de

γFe2O3_5- FLU si D-Fe2O3_5- FLU si aplicarea unui camp magnetic cu intensitatea de 11,7

V este prezentat in Figura 18 (A-B).

Figura 16 : Tesut renal fara determinari secundare observat la 14 zile de la injectarea

animalelor cu solutii de γFe2O3_5- FLU (A) si D-Fe2O3_5- FLU (B) si aplicarea unui camp

magnetic cu intensitatea de 11,7 V.

Figura 17 : Tesut hepatic fara determinari secundare observat la 14 zile de la injectarea

animalelor cu solutii de γFe2O3_5- FLU (A) si D-Fe2O3_5- FLU (B) si aplicarea unui camp

magnetic cu intensitatea de 11,7 V.

14

Figura 18 : Tesut pulmonar fara determinari secundare observat la 14 zile de la injectarea

animalelor cu solutii de γFe2O3_5- FLU (A) si D-Fe2O3_5- FLU (B) si aplicarea unui camp

magnetic cu intensitatea de 11,7 V.

Etalonul, precum si animalele de laborator la care s-a administrat 5-Fluorouracil

simplu au avut un comportamen diferit, observandu-se diseminari secundare pulmonare.

Rezultatele obtinute in cadrul acestor experimente evidentiaza faptul ca efectul produs

de nanoparticulele γFe2O3_5- FLU si D-γFe2O3_5-FLU asupra tumorilor depinde de

substanta administrata si este influentata de prezenta campului magnetic. La animalele de

laborator la care au fost administrate solutii de γFe2O3_5- FLU si D-γFe2O3_5- FLU si care

au fost supusi unui camp magnetic nu au fost inregistrate determinari secundare la nivelul

organelor in comparatie cu animalele unde nu a fost administrat decat 5FU unde au fost

inregistrate determinari secundare la nivelul tesutului pulmonar.

10. Concluzii

Nanoparticulele pe baza de maghemita in solutie functionalizate cu 5-FLU, γFe2O3_5-

FLU si D-γFe2O3_5-FLU au fost obtinute printr-o metoda de co-precipitare adaptata in

laboratorul partenerului P2. Dupa cum s-a putut observa din micrografiile TEM

nanoparticulele sunt uniforme si au o forma sferica. Studiile DLS realizate au aratat ca starea

agregata de particule a fost minima. Diametrul mediu obtinut prin DLS pentru D-γFe2O3 a

fost de 10.3 ± 4.5 nm in timp ce diametrul mediu obtinut prin DLS pentru D-γFe2O3_5-FLU a

fost de 8.5 ± 6.1 nm. Pe de alta parte, studiile de potential zeta au aratat ca nanoparticulele in

solutie sunt stabilizate electric in timp. Stabilitatea acestor nanoparticule a fost de asemenea

observata si din studiile de analiza termica. Proprietatile vibrationale au pus in evidenta

legaturile specifice maghemitei, dextranului si 5-FLU. Mai mult decat atat, studiile de

spectroscopie ultrasonora realizate au aratat ca domeniul variațiilor spectrale pentru soluțiile

investigate se întinde pe mai mult de 3 MHz în ceea ce privește frecvența limitei superioară și

centrală, pe când lărgimea de bandă se menține relativ constantă pentru toate tipurile de

soluții.

Rezultatele in vivo ce au fost obtinute in cadrul acestor experimente au aratat ca

efectul produs de nanoparticulele γFe2O3_5- FLU si D-γFe2O3_5-FLU asupra tumorilor

depinde de substanta administrata si este influentata de prezenta campului magnetic. La

animalele de laborator la care au fost administrate solutii de γFe2O3_5- FLU si D-γFe2O3_5-

FLU si care au fost supuse unui camp magnetic nu au fost inregistrate determinari secundare

15

la nivelul organelor in timp ce in cazul animalelor carora li s-a administrat doar 5-FLU au

fost inregistrate determinari secundare la nivelul tesutului pulmonar.

Ca urmare a investigatiilor complexe realizate in cadrul acestei etape a proiectului

putem afirma ca materialele realizate au un efect benefic asupra starii de sanatate a

animalelor de laborator conducand la scaderea diamentrului tumorii si impiedica aparitia unor

determinari secundare la nivelul tesuturilor organelor analizate

Un alt obiectiv realizat in cadrul acestei etape a fost acela de a actualiza informatiile

ce se regasesc pe site-ul web al proiectului:http://www.infim.ro/ro/projects/studiul-prin-

imunofluorescenta-efectului-nanoparticulelor-de-oxid-de-fier-functionalizate.

Mai mult decat atat, pentru a avea informatii complexe asupra materialelor obtinute in

cadrul acestei etape, au fost realizate investigatii si caracterizari complexe, in cadrul

laboratoarele colaboratorilor straini (DLS, potential Zeta, GDOES si AAS). Rezultatele

obtinute in cadrul vizitelor de lucru efectuate au fost prezentate in cadrul acestui raportul

stiintific. De asemenea, o parte a acestor rezultate au fost publicate in jurnale cotate ISI

(subpunctul 11.2.) sau prezentate in cadrul unor conferinte internationale (subpunctul 11.1.).

11. Diseminarea rezultatelor cercetarilor realizate in cadrul acestei etape s-a facut

dupa cum urmeaza (in conformitate cu planul de realizare al proiectului)

11.1. Conferinte

1. “Sesiunea Anuala De Comunicari Stiintifice A Facultatii De Fizica”, 17 Iunie 2016.

In cadrul acestei conferinte a fost prezentata lucrarea : “Studies on in vivo toxicity of

glycerol- iron oxide nanoparticles”, autori : Daniela Predoi, Alina Mihaela Prodan,

Simona-Liliana Iconaru, Carmen Steluta Ciobanu, Cristina Liana Popa, Mircea

Beuran, Claudiu Stefan Turculet, Stefania Mariana Raita.

2. “5th Zing Polymer Chemistry Conference”, 04.08.2016 – 11.08.2016, Dublin

(Irlanda). In cadrul acestei conferinte a fost prezentata lucrarea (poster): “In vitro and

in vivo toxicity of glycerol coated iron oxide nanoparticles”, autori: A.M. Prodan,

S.L. Iconaru, M. Beuran, C.S. Ciobanu, C.L. Popa, C.S. Turculet, D. Predoi.

3. “8th Conference on "Times of Polymers (TOP) & Composites" 2016”, 19.06.2016-

23.06.2016, Ischia (Italia). In cadrul acestei conferinte a fost prezentata lucrarea

(poster): “Preliminary Ultrasound Studies on Magnetic Fluids Based on Iron Oxide

Nanoparticles”, autori: C.L. Popa, D. Predoi, M. Soare, C.C. Petre, M.V. Predoi.

4. “GD DAY”, 15.09.2016-16.09.2016, Paris (Franta). In cadrul acestei conferinte a fost

prezentata lucrarea (poster): “Evaluation Of Inhibitory Effect Of Glycerol-Iron Oxide

Layers On MRSA”, autori: S. L. Iconaru, C.L. Popa, C.S. Ciobanu, S. Gaiaschi, P.

Chapon, A.M. Prodan, M. Beuran, C. Turculet, D. Predoi.

11.2. Articole publicate in jurnale cotate ISI

1. C.L. Popa, A.M. Prodan, C.S. Ciobanu, D. Predoi, The tolerability of dextran-coated

iron oxide nanoparticles during in vivo observation of the rats, General Physiology

and Biophysics 2016, 35: 299–310. doi: 10.4149gpb_2016004.

2. A. Surugiu, E. Andronescu, C. Turculet, M. Beuran, M.L. Badea, F.M. Iordache, G.

Teleanu, M. Soare, A. M. Prodan, Antimicrobial Studies On Iron Oxide Nanoparticles

In A Silica Matrix, The Scientific Bulletin UPB, in press.

Bibliografie

16

[1]. Berry C. C., Curtis A. S. G. (2003): Functionalisation of magnetic nanoparticles for

applications in biomedicine. J. Phys. D. 36, R198–206 http://dx.doi.org/10.1088/0022-

3727/36/13/203.

[2]. Pankhurst Q. A., Connolly J., Jones S. K., Dobson J. (2003): Applications of magnetic

nanoparticles in biomedicine. J. Phys. D. 36 R167 http://dx.doi.org/10.1088/0022-

3727/36/13/201.

[3]. Tartaj P., Morales M. P., Veintemillas-Verdaguer S., Gonzalez-Carreno T., Serna C. J.

(2003): The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys.

D. 36, R182–197 http://dx.doi.org/10.1088/0022-3727/36/13/202.

[4]. Bautista M. C., Oscar Bomati M., Morales M. P., Serna C. J., Veintemillas-Verdaguer S.

(2005): Surface characterization of dextran-coated iron oxide nanoparticles prepared by laser

pyrolysis and coprecipitation. J. Magn. Mater. 293, 20–27

http://dx.doi.org/10.1016/j.jmmm.2005.01.038.

[5]. Kinsella J. M., Ivanisevic A. (2005): Enzymatic clipping of DNA wires coated with

magnetic nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 127, 3276–3277

http://dx.doi.org/10.1021/ja043865b.

[6]. Lee H., Lee E., Kim D. K., Jang N. K., Jeong Y. Y., Jon S. (2006): Antibiofouling

polymer-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential magnetic resonance

contrast agents for in vivo cancer imaging. J. Am. Chem. Soc. 128, 7383–7389

http://dx.doi.org/10.1021/ja061529k.

[7]. Yigit M. V., Mazumdar D., Lu Y. (2008): MRI detection of thrombin with aptamer

functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Bioconjugate Chem. 19, 412–417

http://dx.doi.org/10.1021/bc7003928.

[8]. Laurent S., Mahmoudi M. (2011): Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: promises

for diagnosis and treatment of cancer. Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. 2, 367–390.

[9]. Chen Z., Hong G., Hong G., Wang H., Welsher K., Tabakman M. S., Sherlock S. P.,

Robinson J. T., Liang Y., Dai H. (2012): Graphite-coated magnetic nanoparticle microarray

for fewcells enrichment and detection. ACS Nano 6, 10 94–1101

http://dx.doi.org/10.1021/nn2034692.

[10]. Predoi D., Valsangiacom C. M. (2007): Thermal studies of magnetic spinel iron oxide

in solution. J. Optoelectron. Adv. M. 9, 1797–1799.

[11]. Predoi D. (2007): A study on iron oxide nanoparticles coated with dextrin obtained by

coprecipitation. Dig. J. Nanomater. Bios. 2, 169–173.

[12]. Weissleder R., Hahn P. F., Stark D. D., Elizondo G., Saini S., Todd L. E., Wittenberg J.,

Ferrucci J. T. (1988): Superparamagnetic iron oxide: enhanced detection of focal splenic

tumors with MR imaging. Radiology 169, 399–403

http://dx.doi.org/10.1148/radiology.169.2.3174987.

[13]. Weissleder R., Elizondo G., Wittenberg J., Rabito C. A., Bengele H. H., Josephson L.

(1990): Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: characterization of a new class of contrast

agents for MR imaging. Radiology 175, 489–493

http://dx.doi.org/10.1148/radiology.175.2.2326474.

[14]. Shapiro E. M., Skrtic S., Koretsky A. P. (2005): Sizing it up: cellular MRI using

micron-sized iron oxide particles. Magn. Reson. Med. 53, 329–338

http://dx.doi.org/10.1002/mrm.20342.

[15]. Petri-Fink A., Hofmann H. (2007): Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

(SPIONs): from synthesis to in vivo studies – a summary of the synthesis, characterization, in

vitro, and in vivo investigations of SPIONs with particular focus on surface and colloidal

17

properties. IEEE. Trans. Nanobioscience 6, 289–297

http://dx.doi.org/10.1109/TNB.2007.908987.

[16]. Thorek D. L. J., Tsourkas A. (2008): Size, charge and concentration dependent uptake

of iron oxide particles by non-phagocytic cells. Biomaterials 29, 3583−3590

http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.05.015.

[17]. Huang C., Tang Z., Zhou Y., Zhou X., Jin Y., Li D., Yang Y., Zhou S. (2012): Magnetic

micelles as a potential platform for dual targeted drug delivery in cancer therapy. Int. J.

Pharm. 429, 113–122 http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpharm.2012.03.001.

[18]. Barick K. C., Singh S., Bahadur D., Lawande M. A., Patkar D. P., Hassan P. A. (2014):

Carboxyl decorated Fe3O4 nanoparticles for MRI diagnosis and localized hyperthermia. J.

Colloid. Interface Sci. 418, 120–125 http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2013.11.076.

[19]. Sun S., Zeng H. (2002): Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J. Am.

Chem. Soc. 124, 804–805 http://dx.doi.org/10.1021/ja026501x.

[20]. Jun Y. W, Seo J. W., Cheon J. (2008): Nanoscaling laws of magnetic nanoparticles and

their applicabilities in biomedical science. Acc. Chem. Res. 41, 179–189

http://dx.doi.org/10.1021/ar700121f.

[21]. Rochelle Arvizo R., De M., Rotello M. V. (2007): Proteins and nanoparticles: covalent

and noncovalent conjugates. In: Nanobiotechnology II: More Concepts and Applications.

(Eds. C. A. Mirkin and C. M. Niemeyer), Wiley-VCH, Weinheim, Germany

http://dx.doi.org/10.1002/9783527610389.ch4.

[22]. Paul K. G., Frigo T. B., Groman J. Y., Groman E. V. (2004): Synthesis of ultrasmall

superparamagnetic iron oxides using reduced polysaccharides. Bioconjug. Chem. 15, 394–

401 http://dx.doi.org/10.1021/bc034194u.

[23]. Crichton R. (2004): Inorganic Biochemistry of Iron Metabolism. John Wiley & Sons

Ltd, Ellis Horwood: Chichester, UK Easo S. L., Mohanan P. V. (2013): Dextran stabilized

iron oxide nanoparticles: Synthesis, characterization and in vitro studies. Carbohydr. Polym.

92, 726– 732 http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.09.098.

[24]. Hudson J. Q., Comstock T. J. (2001): Considerations for optimal iron use for anemia

due to chronic kidney disease. Clin. Ther. 23, 1637–1671 http://dx.doi.org/10.1016/S0149-

2918(01)80135-1.

[25]. Kane R. C. (2003): Intravenous iron replacement with sodium ferric gluconate complex

in sucrose for iron deficiency anemia in adults. Curr. Ther. Res. Clin. Exp. 64, 263–268

http://dx.doi.org/10.1016/S0011-393X(03)00038-9.

[26]. Greenwood, R; Kendall, K (1999). "Electroacoustic studies of moderately concentrated

colloidal suspensions". Journal of the European Ceramic Society. 19 (4): 479–488.

[27]. Hanaor, D.A.H.; Michelazzi, M.; Leonelli, C.; Sorrell, C.C. (2012). "The effects of

carboxylic acids on the aqueous dispersion and electrophoretic deposition of ZrO2". Journal

of the European Ceramic Society. 32 (1): 235–244. doi:10.1016/j.jeurceramsoc.2011.08.015.

[28]. Rando G., Wahli W. (2011): Sex differences in nuclear receptorregulated liver

metabolic pathways. Biochim. Biophys. Acta. 1812, 964–973

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbadis.2010.12.023.

[29]. Su B., Xiang S. L., Su J., Tang H. L., Liao Q. J., Zhou Y. J., Qi S. (2012): Diallyl

disulfide increases histone acetylation and P21WAF1 expression in human gastric cancer

cells in vivo and in vitro. Biochem. Pharmacol. 1, 1–10 http://dx.doi.org/10.4172/2167-

0501.1000106.