Efectuarea de cromatografie lichidă de înaltă performanță

8/13/2019 Efectuarea de cromatografie lichid de nalt performan

1/13

Efectuarea cromatografei de lichidede nalt performan

IntroducereCromatografiade lichide de nalt performan este de fapt o form extremde mbuntita a cromatografiei pe coloan. In loc casolventul sa fielsat s se

scurg printr -o coloan prin curgere liber, este forat prin presiuni ridicate de pn la 400 atmosfere.Acest lucru il face mult mai rapid.De asemenea, v permite s utilizai particule de dimensiuni mult mai mici pentrumaterialul de umplutura alcoloanei, care ofer o suprafamult mai mare pentruinteraciunea dintrefaza staionar i moleculele care curge pe lng ea. Acestlucru permite o mai bun separare a componentelor amestecului. Alt mbuntire major a cromatografiei pe coloan se refer la metodele de

detectare care pot fi utilizate. Aceste metode sunt foarte automatizate i extrem dsensibile.

Coloana i solventul Derutant, exist dou variante care se utilizeaz n HPLC n funcie de polaritatearelativ a solventului i faza staionar.

HPLC cu faz normal

Aceasta este, n esen,la fel can cromatografia n strat subire sau cromatografie pe coloan. Desi este descrisa ca fiind "normala", aceasta nu este cea mai comunform de HPLC. Coloana esteumplut cu particule minuscule de silice, iar solventul este hexanulnepolar , de exemplu. O coloan tipica are un diametru interior de 4,6 mm (sau poate fi mai mic ), i o lungime de la 150 la 250 mm. Compui polari din amestectrecuti prin coloanvor ramane mai mult timp lasilicele polar dect compuii nepolari. Prin urmare, cele non-polare vor trece mairepede prin coloan.

HPLC cu faz invers

n acest caz , dimensiunea coloanei este aceeai , dar silicea este modificata pentrua il facenepolar prin ataareade lanuri lungi de hidrocarburi la suprafaa ei- nmod obinuit , fie cu 8 sau 18 atomi de carbon n ele . Un solvent polar este utilizat- de exemplu , un amestec de ap i un alcool cum ar fi metanolul .


2/13

n acest caz , va exista o atracie puternic ntre solventul polar i moleculele polare din amestec fiind trecut prin coloan . Nu va fi la fel de multa atracie ntrelanurile de hidrocarburi ataate la silice ( faza staionar ) i moleculele polare dinsoluie. Prin urmare, moleculele polare din amestec vor petrece majoritateatimpului lor deplasandu-se cu solventul .Compui nepolari din amestec vor tinde s formeze atracii cu gruprilehidrocarbonate dincauza forelor de dispersie van der Waals . Ei vor fi , deasemenea, mai puin solubili n solventdin cauza necesitii de a rupe legturile dehidrogen . Prin urmare, ei petrec mai puin timp n soluie i acest lucru le vancetini drumul lor prin coloan . Asta nseamn c acummoleculele polare, vor trversa mai repede coloanaHPLC cu faz invers este cea mai comun form de HPLC.

O schem de flux pentru HPLC

Injectarea probei

Injectarea de proba este automatizata n ntregime , din cauza presiunilor implicate, nu este la fel ca n cromatografia de gaz

Timpul de retenie

Timpul necesar pentru un anumit compus de a traversa coloana pana la detectoreste cunoscut ca timpul de retenie . Acest timp este msurat din momentul n car proba este injectata panala punctul n care pe ecran se afieaz o nlime maximde vrf pentru acel compus .


3/13


4/13

Metanolul , de exemplu, absoarbe la lungimi de und sub 205 nm, i apa sub 190nm. Dac ai folosit un amestec de metanol i ap ca solvent, prin urmare, ar trebuis utilizai o lungime de und mai mare de 205 nm, pentru a evita valorile false dela solvent.

Interpretarea rezultatelor de la detector

Rezultatul va fi nregistrat ca o serie de varfuri - fiecare dintre ele reprezentnd uncompus n amestec trecut prin detectorul iabsorbind lumina UV . Atta timp ctai fost ateni pentru a controla condiiile de pe coloana , ati putea folosi timpii deretenie pentru a ajuta la identificarea compuilor prezeni- cu condiia , desigur ,c tu ( sau altcineva ) le-atimsurat deja pentru mostrele pure ale diferitelorcompui n conformitate cu aceste condiii identice .

Dar putei folosi , de asemenea, vrfurile ca o modalitate de msurare a cantitilorde compui prezeni . S presupunem c suntei interesatdespre un anumit compus, X.

Dac ai injectat o soluie care conine o cantitate pura,cunoscut de X n main ,nu numai ati putea nregistra timpul de retenie , darv-ati putea referi , deasemenea, suma de X la vrf ul la care a fost format .

Aria de subvrf este proporional cu cantitatea de X , care a trecut detectorul , iaraceast zon poate fi calculat automat de calculator . Zona msurata este prezentat n verde n diagrama.

Dac soluia de X a fost mai puin concentrata, suprafaa de sub varf va fi mai puina - dei timpul de retenie va fi la fel. De exemplu:


5/13

Asta nseamn c este posibil s se calibreze aparatul, astfel nct s poat fiutilizat pentru a gsi ct de multa substana este prezent- chiar i n cantitifoarte mici.

n diagram, suprafaa de subvarful pentruY este mai mic dect cea pentru X.Aceasta poate fi, deoarece este mai puinY dect X, dar ar putea fi in mod egal,deoarece absoarbe lumina UV la lungimea de und pe care o utilizai mai putindecat substanta X oface . Ar putea fi cantiti mari de Y prezent, dar n cazul n

care doar absoarbe slab, ar da doar un vrf mic.

Cuplarea HPLC la un spectrometru de mas

Cnd detectorul aratun vrf, o parte din ceea ce se trece prin detector la acelmoment poate fi deviat la un spectrometru de mas. Acolo se va da un model defragmentare, care poate fi comparat cu o baz de date computerizat de modelecunoscute. Asta nseamn c identitatile unor game largide compui pot fi gsitefr a fi nevoie s tiitimpurile lor de retenie.

C romatografie lichid de nalt performan

Scurt istoric i definiie

Cromatografie lichid a fost definitA la nceputul anilor 1900 de ctreun botanistrus , Mihail S. Tswett . Studiile sale de pionierat au fost concentrate asupracompuilor de separare [ pigmeni frunzelor ] , extrase din plante cu ajutorul unui

solvent , ntr-o coloan umplut cu particule . Tswetta umplut o coloan de sticl deschisacu particule . Dou materialespecifice, pe care le-a gsit utile au fost praf ul de creta [ carbonat de calciu ] ialumin . El a turnat proba lui [ extractul de solvent a frnzelor planteloromogenizate] n coloan i ia permis s treac n patul de particule . Aceasta a fosturmat de solvent pur . Cand proba a trecut n jos prin coloan de catre gravitaie ,


6/13

diferite benzi colorate au pututfi vzute separate , deoarece unele componente s-au micatmai repede dect altele . El a legat aceste benzi , diferit colorate separate pentru diferii compui care au fost cuprinse iniial n prob . El a creat o separareanalitic a acestor compui bazata pe puterea de atraciediferita a fiecarui compuschimic de a particulelor . Compuiicare au fost mai puternic atrasi de particule auncetinit , n timp ceali compui mai puternic atraside solvent s-au miscat mairepede . Acest proces poate fi descris dup cum urmeaz : compuii coninui neantions-au distribuit , Acest lucru face ca fiecare compus s se deplaseze cu ovitez diferit , crendu-se astfel o separare a compuilor .

Astzi , cromatografie lichid , n diferitele sale forme , a devenit una dintre celemai puternice instrumente dinchimie analitic .

Cromatografia lichid (CL) Tehnici

Cromatografia lichid poate fi realizat utiliznd tehnici plane [1 i 2] sau tehnicide coloan [Tehnica 3]. Cromatografie lichid pe coloan este cea mai puternicai

are cea mai mare capacitate pentru prob. n toate cazurile, proba trebuie mai ntis fie dizolvat ntr -un lichid care este apoi transportata fie pe, sau n, aparatulcromatografic.

Tehnica 1.Proba este identificata, i apoi curge printr -un strat subire de particulede cromatografie [faz staionar] fixata pe suprafaa unei plci de sticl [FiguraB]. Marginea de jos a plcii este plasat ntr -un solvent. Fluxul este creat prin


7/13

capilaritate ca solvent [faza mobil]ce difuzeaz n stratul de particule uscate i sedeplaseaz n sus pe placa de sticl. Aceast tehnic se numete cromatografie nstrat subire sau TLC.

Figura B: Cromatografie in strat subtire

Tehnica 2. n figura C, probele sunt identificate pe hrtie [faz staionar].Solventul[faz mobil] este apoi adugat la centrul spotului pentru a crea un fluxradial spre exterior. Aceasta este o form de cromatografie pe hrtie.[Cromatografie pe hrtie clasic este realizat ntr -o manier similar cu cea deTLC cu flux liniar.]


8/13

Figura C : hrtie cromatografic

Observai diferena de putere de separare pentru aceast hartie speciala ncomparaie cuplaca TLC . Inelul verde indic faptul c hrtia nu poate separacolorani galben i albastru unul de altul , dar s-ar putea separa acesti coloranti decolorantul rou . In imaginea de jos , o prob verde , alctuita din aceleiasicolorani galben i albastru , se aplic pe hrtie . Aa cumai prezis, hrtia nu poatesepara cei doi colorani . n mijloc , o prob de violet , format din colorani rou albastru , a fost aplicat pe hrtie . Ele sunt bine separate .

Tehnica 3 . In aceasta ,abordarea cea mai puternic ,eantionul trece printr -ocoloan sau un dispozitiv de cartu care conine particule corespunztoare [ fazstaionar ] . Aceste particule sunt numite materialul cromatografic . Solventul [faz mobil ] curge prin dispozitiv. n extracie n faz solid [ SPE ] , proba estencrcat in cartuu i fluxul de solvent poart proba prin dispozitiv . Ca i nexperimentul lui Tswett, compuii din eantion sunt apoi separati prin deplasareacu viteze diferite prin dispozitiv . Aici proba negru este ncrcata ntr-un cartu .Diferiti solveni sunt utilizati n fiecare etap pentru a crea separarea


9/13

Figura D-1: cromatografie pe coloan- Extracie de faz solid [SPE]

Componentele unui sistem de baz cromatografie lichid de naltperforman [ HPLC ] sunt prezentate n diagrama din figura simplu E.

Un rezervor deine solventul [ numitafaza mobil , din cauzaca se misca ] . O pomp de nalt presiune [ sistem de eliberare a solventului este utilizat pentru agenera i contor izeaza un debit specific de faz mobil , de obicei mililitri peminut . Un este capabil de a introduce proba n fluxul continuu de faz mobil care poarta proba n coloana de HPLC. Coloana conine materialul de umplerecromatografic necesarepentru a efectua separarea . Acest material de umplere senumete faza staionar , pentru c este inut n loc de hardware-ul de coloan .Este nevoie de un detector pentru a vedea benzile separate , deoarece acestea seelueaz din coloan HPLC [ cele mai multicompusi nu au nici o culoare , aa cnu le putem vedea cu ochii notri ] . Faza mobil iese dindetector i pot fi trimisela deeuri , sau colectate , dup cum se dorete . Cnd faza mobil conine o bandde compus separat , HPLC ofer posibilitatea de a colecta aceast fraciuneeluatului care conine acel compus purificat pentru studii ulterioare . Aceasta senumete cromatografie preparativ.Reinei c tuburile de presiune nalt i


10/13

accesorii sunt folosite pentru a interconecta pompa , injectorul , coloana , iarcomponentele detectorului pentru a forma tubul defaz mobil , eantionul , i pentru a separa benzile compuse .

Detectorul este conectat la calculator ,componenta a sistemului HPLC , carenregistreaz semnalul electric necesar pentru a genera cromatograma pe ecranulsu i de a identifica i cuantifica concentraia constituenilor eantionuli ( a sevedea figura F ) . Deoarece caracteristicile probelor combinate pot fi foarte diferit, au fost dezvoltate mai multe tipuri de detectoare . De exemplu , dac un compus poate absorbi lumina ultraviolet , se utilizeaz un detector UV absorban . Daccompusul prezint o fluorescen , se folosete un detector de fluorescen . Daccompusul nu are nici una din aceste caracteristici , un tip mai universal de detectoreste folosit , cum ar fi un detector de lumin evaporare- scattering [ ELSD ] .Abordarea cea mai puternic este de a folosi mai multe detectoare n serie . Deexemplu , un UV i / sau detector ELSD poate fi utilizat n combinaie cu unspectrometru de mas [ MS ] pentru a analiza rezultatele la separareacromatografic . Aceasta ofer , de la o singura injectie , informaii maicuprinztoare despre un analit . Practica de cuplare a unui spectrometru de mas l

un sistem HPLC se numete LC / MS .


11/13

Figura F.

Moduri de separare HPLC

In general , sunt trei caracteristici principale alecompui chimicicare pot fiutilizate pentru a crea separri HPLC .Acestea sunt :

Polaritatea

sarcina electrica

Dimensiunea molecular

n primul rnd , s lum n considerare polaritatea i cele dou moduri principalede separare care exploateaz aceast caracteristic : faza normal i cromatografin faz invers .

Separri bazate pe polaritate

O structura de molecula , activitatea, i caracteristicile fizico-chimice suntdeterminate de aranjamentul atomilor i legturile sale constitutive dintre ele . nt-o molecul , un aranjament specific al anumitor atomi , care este responsabil pentru proprietile speciale i reacii chimice previzibile se numete o grupare


12/13

funcional . Aceast structur determin adesea dac molecula este polar saunepolar . Moleculele organice sunt sortate n grupe n funcie de grupareafuncional principala. Folosind un mod de separare pe baza polaritii ,reteniacromatografic relativ a diferitelor tipuri de molecule este n mare msurdeterminat de natura i localizarea respectivelor grupri funcionale . Aa cum sarat n Figura P , clase de molecule pot fi comandate prin retenia lor relativ nt-o zon sau spectru de polaritate cromatografice de la o polaritate mare la nepolar

Separri pe baza de incarcare: Ion-cromatografie de schimb [IEC]

Pentru separri bazate pe polaritate, aa cumsunt atrase la fel pot pot fi respinse.In cromatografia de schimb ionic i alte separri bazate pe sarcin electric, reguleste inversat.Asa cum pot fi respinse, n timp ce opusii sunt atrasi unul decelalalt. Fazele staionare pentru separri de schimb de ioni sunt caracterizate prinnatura i puterea funciilor acide sau bazice de pe suprafata lor i tipurile de ioni pcare le atrage ile pstr eaza . Schimb de cationi este folosit pentru a pstra i de asepara ioni incarcati pozitiv pe o suprafa negativa. Invers, schimbtoarele deanioni este utilizat pentru a reine i a separa ionii negativi pe o suprafa pozitiva


13/13

Efectuarea de cromatografie lichidă de înaltă performanță

Documents

Transcript of Efectuarea de cromatografie lichidă de înaltă performanță