Div Cel Procariote

7/25/2019 Div Cel Procariote

1/39

1

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE BIOLOGIE I GEOLOGIE

CLONAREA I EXPRIMAREA UNOR GENE IMPLICATE NDIVIZIUNEA CELULAR LA PROCARIOTE

Rezumat

CONDUCTOR TIINIFIC:

ACAD. PROF. DR. OCTAVIAN POPESCU

DOCTORAND:MANU DOINA RAMONA

CLUJ-NAPOCA

2011


2/39

2

Cuprins

1. Introducere ..........................................................................................................................32. Premisele cercetarii ............................................................................................................ 43. Obiectivele cercetrii...44. Materiale i metode.............5 4.1.Amplificarea geneiftsZde laEscherichia coli K-12

iPseudomonas aeruginosa PAO1...54.2. Clonarea geneiftsZde laEscherichia colinvectorul pGEM-T ..64.3. Clonarea geneiftsZde laPseudomonas aeruginosanvectorul pTZ57R ...74.4.Clonarea genelorftsZEscherichia coliiftsZPseudomonas aeruginosa n vectorii de exprimare ...............................................84.5. Exprimarea i purificarea proteinelor FtsZ recombinate

de laEscherichia coliiPseudomonas aeruginosa.......................................................94.6. Obinerea anticorpilor anti-FtsZEscherichia colii anti-FtsZPseudomonas aeruginosa...........................................................................94.7. Analiza prin Western-blot a reactivitii ncruciate a serurilor imune cu proteinaFtsZ a celeilalte specii bacteriene i fa de actin i beta-tubulin10

5. Rezultate

5.1. Amplificarea geneiftsZ de laEscherichia coli K-12...........................................115.2. Clonarea geneiftsZde laEscherichia colin vectorul pGEM-T 125.3. Clonarea genei ftsZ de la Pseudomonas aeruginosan vectorul pTZ57R .135.4. Clonarea geneiftsZ Escherichia colin vectorii de exprimare..............................145.5. Clonarea geneiftsZPseudomonas aeruginosan vectorul de exprimare pET28a ................................................................................165.6. Exprimarea i purificarea proteinelor FtsZ recombinate ......................................175.7. Obinerea anticorpilor policlonali anti-FtsZ .........................................................19

5.8. Caracterizarea anticorpilor policlonali anti-FtsZ ..................................................21Analiza prin Western-blot a reactivitii ncruciate a FtsZ din cele douspecii bacteriene, i fade actin i beta-tubulin

6. Analizarea i discutarea rezultatelor ...............................................................................317. Concluzii .............................................................................................................................34

Bibliografie .................................................................................................................36


3/39


4/39

4

microtubulilor zonelor specializate asigur finalizarea citokinezei i separarea celulelor-fiice.[Hales i colab., 1999; Straight i Field, 2000; Guertin i colab., 2002; Pollard, 2010]

2. Premisele cercetrii

Componentele eseniale i conservate ale citoscheletului, implicate n diviziuneacelulelor bacteriene, pot fi privite ca noi structuri- int pentru ageni antibacterieni activi fade bacteriile patogene care au dezvoltat rezisten fa de ant ibioticele de uz frecvent. FtsZeste o protein cu un rol esenial n diviziunea celulelor procariote, care dei prezent n toatecelulele bacteriene, a cror gen ftsZ a fost studiat, este totui absent n mitocondriile

celulelor eucariote. Datorit evoluiei divergente a FtsZ i omologului su eucariot, tubulina,FtsZ poate fi considerat o int atractiv pentru ageni terapeutici cu spectru larg, dartoxicitate selectiv fa de patogenii bacterieni.

3. Obiectivele cercetrii

Principalul scop al cercetrii a fost evaluarea FtsZ ca protein cu rol central ndiviziunea celular a celulelor bacteriene, fiind vizate dou bacterii Gram-negative patogenela om, inelul citokinetic fiind considerat o posibil nou structur int susceptibil la terapiaantibacterian, iar FtsZ molecula prezumtiv ideal ca int pentru interaciunile cu ageni carear bloca citokineza celulelor bacteriene.

Obiectivul iniial a constat n amplificarea genei ftsZ din genomul Escherichia colitulpina K12 i a geneiftsZdin genomul Pseudomonas aeruginosa tulpina PAO1, n vedereaclonrii i supraexprimrii acestor gene.

Dup supraexprimarea proteinelor FtsZ Escherichia coli i FtsZ Pseudomonasaeruginosa, proteinele recombinate au fost izolate, purificate i utilizate pentru obinereaanticorpilor policonali antiftsZEscherichia colii antiftsZPseudomonas aeruginosa.

Aceti anticorpi au fost analizai sub aspectul caracteristicilor de specificitate, titru,afinitate, reactivitate specific i reactivitate ncruciat antigen FtsZ Escherichia coli-anticorpi antiftsZ Pseudomonas aeruginosa i antigen FtsZ Pseudomonas aeruginosa-antiftsZEscherichia coli.

S-a urmrit gradul de omologie ntre antigenii FtsZ Escherichia coli i FtsZPseudomonas aeruginosaprin aliniere de secvene, dar i la nivelul determinanilor antigenici

ai proteinelor din lizatele bacteriene, prin reacii imune ncruciate, avnd n vedere datele dinliteratur conform crora, gena ftsZeste o gen esenial, conservat n celulele procariote,


5/39

5

ceea ce ar conferi unor ageni bacterieni care interacioneaz specific FtsZ i inhibdiviziunea celular, un spectru larg de aciune.

Urmtorul obiectiv a fost analiza reactivitii ncruciate a FtsZ din cele douspecii bacteriene cu proteinele cele mai importante ale citoscheletului eucariot, actina i

tubulinele. Este cunoscut omologia de secven la nivelul situsului GTPazic a tubulinelor iFtsZ i rolul central al actinei n citokineza eucariotelor, proteina central n citokineza laprocariote fiind FtsZ. n acest scop, anticorpii antiftsZ Escherichia coli i antiftsZPseudomonas aeruginosa au fost utilizai ntr-un alt studiu de reactivitate ncruciat, de dataaceasta fa de antigenii actin i tubulin bovin. S-a urmrit apariia reaciilor imunencruciate ntre substratele actin i tubulin i anticorpii antiftsZ Escherichia coli iantiftsZPseudomonas aeruginosa.

Reactivitatea ncruciat ntre antigenii de origine eucariot i anticorpii antiftsZ a fostanalizat n scopul obinerii de date privind selectivitatea de aciune a unor anticorpi exclusivfa de antigeni bacterieni, fr afectarea structurilor celulelor eucariote ale organismului care

a suferit o infecie cuEscherichia colisauPseudomonas aeruginosa.

4. Materiale i metode

4.1.Amplificarea genei ftsZde la Escheri chia coli K-12

i Pseudomonas aerugi nosa PAO1

Pentru amplificarea geneiftsZ Escherichia coliau fost utilizate urmatoarele amorsesens i antisens:

FftsZEc 5GGCATATGTTTGAACCAATGGAACTTAC3

RftsZEc 5GTACTCGAGTTAATCAGCTTGCTTACGCAG3

Subliniat sunt prezentate situsurile pentru enzimele de restricie,NdeI n amorsa sensiXhoIn amorsa antisens. Aceste situsuri de restricie au fost incluse n secvena amorselori, n consecin, n secvena int amplificat n vederea obinerii capetelor coezive carefaciliteaz clonarea genei n vectorii de exprimare.

Pentru amplificarea genei ftsZ Pseudomonas aeruginosa PAO1 s-au utilizaturmtoarele amorse sens i antisens:

FftsZPs 5 GGCATATGTTTGAACTGGTCGATAAC 3

RftsZPs 5GTGAATTCTCAATCGGCCTGACGACG 3

Subliniat sunt prezentate situsurile pentru enzimele de restricie:NdeIn amorsa sensiEcoRIn cea antisens.


6/39


7/39

7

fost obinute peste noapte preculturi de 5 ml, din care a doua zi a fost izolat ADN plasmidicutilizndu-se GeneJetPlasmidMiniprep Kit de la Fermentas.

S-a fcut verificarea pe gel de agaroz a ADN-ului plasmidic purificat, care nprealabil a fost supus digestiei cu enzimele de restricie NdeI i XhoI. [Promega Technical

Manual pGEM

-T and pGEM

-T Easy Vector Systems; Sambrook i Russell, 2001; Ausubeli colab., 2003; Clark, 2005]O verificare definitiv a prezenei genei corecte n vector s-a realizat prin secvenierea

plasmidelor recombinate. Determinarea secvenelor de nucleotide a fragmentelor clonate s-arealizat cu ajutorul Analizorului Genetic ABI Prism 310, folosind BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), utiliznd primerii de secveniere pUC/M13complementari unor secvene din vectorul pGEM-T, din structura operonului lac, adiacenteinsertului. [MacBeath i colab., 2001; Ausubel i colab., 2003]

Dup verificare, vectorul pGEM-T cu genaftsZa fost supus digestiei cu enzimele derestricieNdeI siXhoI n vederea purificrii genei, pentru clonarea n vectorii de exprimare.

4.3.Clonareagenei ftsZde la Pseudomonas aeruginosan vectorul pTZ57R

GenaftsZ Pseudomonas aeruginosaamplificatprin PCR i purificat din gel cu un

kit NucleoSpinExtract II (Macherey-Nagel), a fost introdus n vectorul declonare pTZ57Rde la Fermentas. Aceast clonare a fost necesar pentru facilitarea secvenializrii genei, cti pentru reclonarea ei n vectorii de exprimare.

Kitul de clonare InsTAclone PCR Cloning Kit conine vectorul liniarizat care are la

capetele 5 o dideoxitimin liber. Vectorul pTZ57R este un vector mic (2886pb), are maimulte copii/celul, ceea ce permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic. Situsulde clonare al vectorului se afl n cadrul genei lacZ, ceea ce permite selecia moleculelorcorect recombinate pe mediu selectiv cu IPTG i X-Gal. Vectorul are gena pentru -lactamaz, n consecin confer celulelor transformate rezisten la ampicilin.[Sambrook iRussell, 2001] La ligarea vectorului cu produsul PCR au fost respectate indicaiile oferite de

productor (kit Instaclone PCR Cloning de la Fermentas). Ligarea s-a efectuat la 4C pestenoapte. Amestecul de ligare a fost utilizat pentru transformarea celulelor competente de

Escherichia coli XL1-Blue.Amestecul de transformare a fost

nsmnat pe mediu LB solid cu ampicilin(100mg/l). Pentru selecia coloniilor cu molecule corect recombinate, pe mediu s-a adugatIPTG i X-Gal. Din coloniile albe aprute n urma transformrii au fost efectuate mai multe

preculturi mici de 5ml suplimentate cu ampicilin (100mg/ml), care au fost incubate la 37Ccu agitare peste noapte. [Sambrook i Russell, 2001; Ausubel i colab., 2003; Nair, 2007]

Din acestea a fost purificat ADN plasmidic utiliznd kitul de purificare GeneJETPlasmid Miniprep Kit de la Fermentas.

Moleculele recombinate au fost verificate iniial n gel de agaroz 1%, dupdigestiaenzimatic a moleculelor recombinate.Verificarea definitiv a vectorilor recombinai s-aefectuat prin secvenializare cu un aparat Beckman Coulter CEQ8800, utiliznd kitul de

secvenializare recomandat de productor, GenomeLab DTCS Quick Start Kit. Pentru reaciade secvenializare s-au utilizat amorse M13, specifice vectorului pTZ57R. [Graham i Hill,


8/39

8

2001; Ausubel i colab., 2003] Plasmidele corect recombinate au fost supuse digestiei cuenzimele de restricie NdeI i EcoRI. [Sambrook i Russell, 2001; http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest]

Produii de digestie au fost separai n gel de agaroz 1% i apoi excizai i purificaicu kitul gel NucleoSpinExtract II Macherey-Nagel.

4.4.Clonarea genelor ftsZEscherichia coliiftsZPseudomonas aerugi nosan vectorii de exprimare

n scopul exprimrii ftsZ E.coli am selectat doi vectori de exprimare: pET21b ipET28b, iar pentru exprimareaftsZ Pseudomonas aeruginosaa fost utilizat pET28a.

Vectorul pET21b are o etichet opional de 6 histidine imediat dup situsul multiplu

de clonare, astfel proteinele recombinate exprimate vor avea aceast etichet la capatul lor C-terminal. Vectorul are o mrime de 5442 pb, conine promotorul bacteriofagului T7 i gena

pentru -lactamaz, care confer celulelor gazd de E.coli transformate rezisten laampicilin.

Vectorul pET28b are n structura sa dou etichete de 6 histidine, nainte i dupsitusul multiplu de clonare, astfel nct proteinele recombinate pot avea aceast etichet attla captul N-terminal ct i la captul C-terminal. Vectorul are o mrime de 5368 pb, conine

promotorul de la bacteriofagul T7 i gena pentru rezisten la kanamicin.Vectorul de exprimare pET28a are caracteristici comune vectorului pET 28b utilizat

pentru exprimarea ftsZ Escherichia coli: are n structura sa dou etichete de 6 histidine,nainte i dup situsul multiplu de clonare, astfel nct proteinele recombinate pot aveaaceast etichet att la captul N-terminal ct i la captul C-terminal, are o mrime de 5369

pb, conine promotorul de la bacteriofagul T7, care permite controlul exprimrii proteineiint i genapentru rezisten la kanamicin, care permite selecia bacteriilor transformate.Codonul stop nu a fost eliminat din genele ftsZ. Ca rezultat, o gen ce are codonul stopclonat n vectorul pET21b nu va avea eticheta de 6 histidine, iar aceeai gen clonat n

pET28a sau pET28b va avea aceast etichet doar la captul N-terminal. [Novagen pETSystem Manual ediia a 10-a, 2002]

Vectorul pGEM-T cu gena ftsZE.colia fost supus digestiei cu enzimele de restricieNdeI i XhoI. Vectorii pET21b i pET28b au fost supui digestiei cu aceleai enzime derestricie.

Vectorul pTZ57R cu gena ftsZ P.aeruginosa a fost supus digestiei cu enzimele derestricieNdeIiEcoRI,la fel i vectorul pET28a.

Produii de digestie au fost separai n gel de agaroz 1% i apoi excizai i purificaicu kitul gel NucleoSpinExtract II Macherey-Nagel.

Vectorii pET au fost apoi defosforilati cu fosfataz alcalin (shrimp), pentru a evitarecircularizarea eventualelor molecule digerate cu o singur enzim.[Sambrook i Russell,2001].

Moleculele de vector i insert au fost puse la ligare peste noapte la 16C. Pentru ligarea fragmentelor de ADN s-a folosit ADN ligaza de la bacteriofagul T4 (NEB).
http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigesthttp://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest


9/39

9

Moleculele recombinate obinute dup ligare au fost introduse prin electroporare ncelule deEscherichia colitulpina DH5. [Glover i Hames, 1995]

Din coloniile de pe mediu cu antibiotice (100mg/l ampicilin pentru pET21b i30mg/l kanamicin pentru pET28a i pET28b) au fost fcute peste noapte preculturi de 5 ml,

din care a doua zi a fost izolat ADN plasmidic.[Sambrook i Russell, 2001; Ausubel i colab.,2003; Novagen pET System Manual ediia a 10-a, 2002; http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/ broch_genejet_P19.pdf]

ADN plasmidic a fost analizat prin electroforez n gel de agaroz (1%).

4.5.Exprimarea i purificarea proteinelor FtsZ recombinatede la Escherichia colii Pseudomonas aerugi nosa

Vectorii recombinai pET28b- ftsZEscherichia coli i pET28a-ftsZ Pseudomonasaeruginosa au fost introduin celule de Escherichia colitulpina de exprimare BL21(DE3).Bacteriile transformate au fost nsmnate pe mediu solid cu kanamicin. Din coloniilecrescute pe plac au fost realizate preculturi n 5ml de mediu LB cu kanamicin, pestenoapte, la 37C.50 ml de mediu LB cu adaos de kanamic in (100 mg/l) au fost inoculai cutoate bacteriile de pe mediu solid, rezultate n urma transformrii.Cultura de bacterii a fostlasat s creasc pn la DO600nmde 0,8-0,1 i indus cu IPTG, la 37C. Celulele bacterieneau fost lizate prin sonicare. Lizatele bacteriene au fost clarificate i centrifugate. Lizatele isupernatantele au fost migrate pe geluri de poliacrilamid pentru verificarea exprimrii

proteinelor FtsZ recombinate mpreun cu un markeri de greutate molecular.Supernatantele au fost purificate prin tehnica de cromatografie de afinitate cu ioni

imobilizai pe coloan (proteinele FtsZ au fost purificatepe coloan cuNi2+, datorit eticheteide histidin de la captul N-terminal). Atomul de azot din imidazol va lega prin legturcoordinativ ionul metalic cu afinitate mai mare dect histidina. Imidazolul este n competiiecu proteina pentru ionii metalici, eluarea se poate face din acest motiv cu gradient deimidazol. [Ausubel i colab., 2003]

S-a determinat concentraia proteinelor prin metoda Bradford, dup purificarea pecoloan. [Mikkelsen i Cortn E, 2004] Pe baza acestor determinri s-au preparat probele

pentru electroforeza n gel de poliacrilamidpentru verificarea purificrii FtsZ Escherichiacoli, respectiv FtsZPseudomonas aeruginosa. [Popescu, 1990; Rosenberg, 2005]

4.6.Obinerea anticorpilor policlonali anti-FtsZ E. colii anti-FtsZ P. aeruginosa

Anticorpii policlonali antiFtsZ Escherichia coli i antiFtsZPseudomonas aeruginosa

au fost obinui prin imunizarea unor oareci BALB/c cu vrsta de 6 -8 sptmni i greutatede 20g. Tulpina de oareci provine de la Institutul Cantacuzino din Bucureti, iar ntreinerea


10/39


11/39

11

Duptratarea cu anticorpul primar, membrana se spaln tampon TBST, de dou ori, cte 10minute.

Complexele antigen-anticorp sunt detectate cu anticorpi secundari de tip antiIgGcuplai cu peroxidaz, n diluie care se tatoneaz (1/1000-1/10000). Diluiile anticorpilor

secundari anti-oarece cu care s-a lucrat au fost 1:1500 i 1:3000. Diluia anticorpilorsecundari se realizeaz n TBST cu BSA 1%. Incubarea dureaz 1h la temperatura camerei,cu agitare uoarpe un agitator orbital. Membrana se spalapoi n TBS/T, de dou ori, cte10 minute. Diluiile de anticorpi trebuie tatonate astfel nct detecia s fie optim.

Detecia s-a realizat colorimetric, prin adiia de substrat cromogen. Anticorpiisecundari fiind conjugai cu peroxidaz, substratul ales este 3,3diaminobenzidina (DAB ). Sedizolv o tablet de DAB (250 mg) n 10 ml de ap distilat, se adaug 10l peroxid dehidrogen 30% ise urmrete reacia de culoare.[Chiriac i colab., n curs de publicare] Seoprete reacia prin transferul membranei n ap distilat i uscare rapid. n cazul n care seobin benzi determinate de legri nespecifice,substratul se poate dilua.

5. Rezultate

5.1. Amplificarea genei ftsZ de la Escheri chia coli K-12

Produii de amplificare prin PCR ai genei ftsZ de la Escherichia coli au fost

vizualizai n gel de agaroz 1% (Fig.1). Dup cum se poate observa din imaginea gelului,fragmentul amplificat este de lungimea dorit, cantitatea de produs amplificat este mare, iarreacia este specific, fr alte amplificri nespecifice.

Figura 1.Produii de amplificare cu Ventpolimeraz ai genei ftsZ de la Escherichia coli . 1 i 2- 50 l din produii PCR

3- marker molecular (vector pQE60 digerat cuDraI)

1 2 3

1522

8591152


12/39

12

Produii de amplificare prin PCR ai genei ftsZ P.aeruginosa au fost de asemeneavizualizai n gel de agaroz 1% (Fig.2). Dup cum se poate observa din imaginea gelului,cantitatea de produs specific este mare i nu au avut loc amplificri nespecifice.

1185 pb

Figura 2.Produii de amplificare ai geneiftsZde laPseudomonas aeruginosa.1-3- gena amplificat

4marker molecular O'GeneRuler1kb Ladder Fermentas.

5.2. Clonarea genei ftsZde la Escherichia colin vectorul pGEM-T

Pentru verificarea prezenei genei n vector, un volum de 5 l din fiecare prob a fost

supus digestiei cu enzimele de restricieNdeI iXhoI. ADN plasmidic digerat a fost analizatcu ajutorul electroforezei n gel de agaroz (1%) (Fig.3)

Figura 3.Produii de digestie cuNdeIiXhoI ai ADN plasmidic recombinat1, 3, 5, 7ADN plasmidic; 2, 4, 6, 8aceleai probe de ADN plasmidic digerate cu

NdeI iXhoI; 9- marker (pQE60 supus digestiei cuDraI)

11521522

859692

339

1 2 3 4 5 6 7 8 9


13/39

13

O verificare definitiv a prezenei genei corecte n vector s-a realizat prin secveniereaplasmidelor recombinate, urmat de alinierea secvenei ftsZ Escherichia coli clonat npGEM-T cu secvene ftsZ Escherichia coli din bazele de date. Gena ftsZEscherichia coli

izolat i amplificat prin PCR i supus secvenierii are o secven de nucleotide identic cusecvena genei ftsZ Escherichia coli tulpina K-12, identificat n baze de date. Nu a fostidentificat nici un nucleotid modificat fa de secvena din bazele de date.

5.3. Clonarea genei ftsZ de la Pseudomonas aeruginosan

vectorul de clonare pTZ57R

Gena amplificat prin PCR i purificat din gel a fost introdus n vectorul de clonarepTZ57R de la Fermentas. Amestecul de ligare a fost utilizat la transformarea celulelorcompetente de Escherichia coli XL1blue. Amestecul de transformare a fost nsmnat pemediu LB solid cu ampicilin. Pentru selecia coloniilor cu molecule corect recombinate , s-aadugatpe mediu IPTG i X-Gal.

Din coloniile albe aprute n urma transformrii a fost purificat ADN plasmidic.Moleculele recombinate au fost verificate iniial prin digestie enzimatic a moleculelorrecombinate i apoi prin secveniere. Produii de digestie au fost analizai n gel deagaroz1%. Rezultatele acestei digestii sunt prezentate n Figura 4. Dup cum se poate observa dinimaginea gelului toate moleculele au fost recombinate, rezultnd dou fragmente, unul demrime mare (2886pb) ce corespunde vectorului liniarizat i fragmentul mai mic deaproximativ 1185pb ce corespunde geneiftsZ.

Figura 4.Digestia moleculelor recombinate pTZ57R-ftsZPs1marker molecular O'GeneRuler1kb Ladder Fermentas

2, 3 i 4-produi de digestie ADN plasmidic provenit din colonii diferite.

2886 pb

1185 pb


14/39

14

Verificarea definitiv a vectorilor recombinai s-a efectuat prin secveniere. S-aconstatat identitatea secvenei de nucleotide a genei ftsZ Pseudomonas aeruginosa izolat iamplificat prin PCR, clonat n pTZ57R cu cea a genei ftsZ Pseudomonas aeruginosatulpina PAO1 din baza de date NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

5.4. Clonarea genei f tsZ Escherichia colin vectorii de exprimare

Dup verificare, vectorul pGEM-TftsZE.coli a fost supus digestiei cu enzimele derestricieNdeI siXhoI n vederea purificrii genei. Produii de digestie au fost migrai pe gelde agaroz 1% i gena a fost excizat i purificat din gel pentru a fi clonat n vectorii deexprimare.

Figura 5.Digestia moleculei recombinate pGEM-TftsZE.coli.1- marker molecular de 1kpb (Invitrogen)2- vector recombinat pGEM-T digerat cu enzimele de restricie NdeIiXhoI.

n scopul exprimrii ftsZ E.coli au fost selectai 2 vectori de exprimare: pET21b i

pET28b. Vectorul pGEM-T cu genaftsZa fost digerat cu enzimele de restricieNdeI iXhoI.Vectorii pET21b i pET28b au fost supui digestiei cu aceleai enzime de restricie. Dupdigestia pGEM-ftsZEci pET28b, pET21b,s-a efectuat o verificare a produilor de digestiecu ajutorul electroforezei n gel de agaroz 1%, identificndu-se n gel benzilecorespunztoareftsZE.colii vectorilor de exprimare.

3003pb

1152pb
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


15/39


16/39

16

Figura 8.Verificarea prezenei genei ftsZ de laEscherichia coli(1152pb)n vectorul de exprimare pET21b dup digestie cuXhoIiNdeI.

1,3,5,7- pET21bftsZE.colinedigerat2,4,6,8-pET21b digerat (10l amestec de digestie)9- marker de mas molecular (vector pQE60 supus digestiei cuDraI)

5.5. Clonarea genei f tsZPseudomonas aerugi nosan vectorul de exprimare pET28a

Plasmidele corect recombinate au fost supuse digestiei cu enzimele de restricieNdeIi EcoRI. Produii de digestie au fost separai n gel de agaroz 1% i apoi excizai i

purificai. Produii de purificare au fost utilizain continuare la reclonarea genei n vectorul

de exprimare pET28a care a fost digerat cu aceleai enzime de restricie i purificat , apoi s-aefectuat ligarea ftsZPsn vectorul de exprimare pET28a. Amestecul de ligare a fost utilizat latransformarea celulelor competente de Escherichia coli DH5. Amestecul de transformarea fost nsmnat pe mediu LB solid cu kanamicin. Din coloniile aprute n urmatransformrii s-au efectuat mai multe preculturi suplimentate cu kanamicin, din care a fost

purificat ADN plasmidic Moleculele recombinate au fost verificate iniial prin digestieenzimatic. Produii de digestie au fost analizai n gel de agaroz 1%. Rezultatele acesteidigestii sunt prezentate n Figura 9 . Dup cum se poate observa din imaginea gelului toatemoleculele au fost recombinate, rezultnd dou fragmente, unul de mrime mare (53 69pb) ce

corespunde vectorului liniarizat i un fragment mai mic de 1185pb ce corespunde geneiftsZde laPseudomonas aeruginosa.

1522

859692

339

5368+1152

1152


17/39

17

Figura 9.Digestia moleculelor recombinate.1- marker molecular O'GeneRuler 1kb Ladder (Fermentas);2-7-produii de digestie ai vectorilor recombinai pET28a-fstZPscuenzimele de restricieNdeI iEcoRI.

5.6. Exprimarea i purificareaproteinelor FtsZ recombinate

Vectorii recombinaipET28b-ftsZE.coliau fost introduiprin electroporare n celuledeEscherichia colitulpina BL21(DE3), care este o tulpin de exprimare. Culturile de bacteriiau fost lasate s creasc pn la DO600nm de 0,8-1,0 i induse cu IPTG la 37C. Celulele

bacteriene au fost lizate prin sonicare. Lizatul bacterian a fost clarificat. S-a determinat

concentraia proteinelor prin metoda Bradford. Pe baza acestei determinri s-au preparatprobele pentru electroforeza n gel de poliacrilamid.

1 2 3

94

67

43

30

20,1

Figura 10.Exprimarea proteinei FtsZEscherichia coli n tulpinaE. coliBL21(DE3)1- marker molecular; 2- lizat bacterian; 3- supernatant cu proteina recombinat.

40kDa

1500 pb

1000 pb

5369pb

1185pb


18/39


19/39


20/39


21/39

21

5.8. Caracterizarea anticorpilor policlonali anti-FtsZ

Testarea concentraiilor optime de anticorpi primari (prin diluiile serurilorimune obinute prin imunizarea cu FtsZ Escheri chia coli, dup 16 sptmni de la

debutul imunizrii) i a concentraiilor optime de anticorpi secundari.

Figura 15. Analiza prin Western-blot a concentraiilor optime de anticorpi primari dinserurile imune ale grupuluiE.coli, obinute dup 16 sptmni de la nceperea imunizrii

0 Marker PageRuler Prestained ProteinLadder (Fermentas SM 0671)1: FtsZE.c. Anti FtsZE.c. (16 sptmni) 1/100 Anti-oarece 1/1500 ++++2: FtsZE.c. Anti FtsZE.c. (16 sptmni) 1/100 Anti-oarece 1/3000 +++3 : FtsZE.c. Anti FtsZE.c. (16 sptmni) 1/250 Anti- oarece1/1500 +4 : FtsZE.c. Anti FtsZE.c. (16 sptmni) 1/250 Anti-oarece 1/3000

La diluii de 1:100ale serurilor imune obinute dup 16 sptmni de la debutulimunizrii se observ benzi distincte determinate de legarea anticorpilor antiFtsZ lasubstratul specific.Combinaiile optime ale diluiilor anticorpilor primari din serurileimune cu diluiile anticorpilor secundari constatate: anticorpii primari antiFtsZ 1:100i anticorpii secundari 1:1500sau anticorpii primari

antiFtsZ 1:100i anticorpii secundari 1:3000, aspect care urmeaz s fie clarificat nexperimentele urmtoare.

M 1 2 3 4

Benzile de detecie alereactivitii specifice aleanticorpilor antiFtsZ fa desubstratul specific, la diluia de1:100a serurilor imune

95

72

55

43

34

26


22/39


23/39

23

Analiza reactivitii ncruciate ntre FtsZ ale celor dou specii de bacterii prinWestern-blot, cu seruri imune obinute dup 8 sptmni de la prima imunizare iulterior cu seruri imune obinute dup 16 i 32 de sptmni de la debutul imunizrii.

9572

55

43

34

26

Figura 17. Analiza prin Western-blot a reactivitii ncruciate a FtsZ de la E. coli iPseudomonas aeruginosa, prin incubarea substratului cu seruri imune obinute la8 sptmnide la debutul imunizrii.5 FTSZE.c. AntiE.c. 8 sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 ++++

8 FTSZE.c. AntiP.a. 8 sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +++ reactivitatencruciat

15 FTSZP.a AntiE.c. 8 sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +++ reactivitatencruciat

16 FTSZP.a AntiP.a. 8 sptmni 1/250 Anti-oarece1/3000 ++++

Se constat reactivitatea ncruciat a serului imun al fiecrui grup cu proteina celuilalt grup:anticorpii policlonali antiFtsZ Pseudomonas aeruginosaprezint reactivitate ncruciat cusubstratul FtsZ Escherichia coli (banda 8) i reacie imun pozitiv cu substratul specificFtsZ Escherichia coli (banda 5); anticorpii policlonali antiFtsZ Escherichia coli prezintreactivitate ncruciat cu substratul FtsZ Pseudomonas aeruginosai reacie imun pozitivcu substratul specific antiFtsZPseudomonas aeruginosa.

M 5 8 15 16

Benzile de detecie alereactivitii anticorpilorpoliclonali antiFtsZ fade substratul specific

Benzile de detecie alereactivitii ncruciateale anticorpilor antiFtsZfaa de FtsZ din cealaltspecie bacterian


24/39

24

72

55

43

34

26

Figura 18. Detecia prin Western-blot a reactivitii ncruciate a FtsZ de laEscherichia coli

i Pseudomonas aeruginosa cu seruri imune n diferite diluiiprovenite de la recoltriefectuate dup 16i 32 sptmnide la debutul imunizrii.

Markerul de mas molecular este SM 0671 de la Fermentas

1 FtsZE.c. Anti FtsZE.c. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 ++++

5 FtsZE.c. AntiFtsZP.a.16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 ++++reactivitatencruciat

11 FtsZP.a. Anti FtsZE.c.16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +++reactivitatencruciat

15 FtsZP.a. Anti FtsZP.a. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +++

8 FtsZE.c. Ser de control preimun (NMS)0 sptmni; 1/250

Anti-oarece 1/3000 - ser decontrol

preimun

9572

55

43

34

26

17

M 1 5 11 15 8 3 6 9 121618

Benzi de detecie areactivitiincruciate aleanticorpilor antiFtsZdin seruri imuneobinute dup32 de sptmnide la

debutul imunizrii.AnticorpiiantiFtsZP.aeruginosaprezint o scderevizibil a reacivitiincruciate (6 i 9)

Benzile de detecie areactivitiincruciate aanticorpilor antiFtsZ

din seruri imuneobinute dup16 sptmnide ladebutul imunizrii. Laaceeai concentraieoptim de anticorpi,reactivitateancruciat aantiFtsZPseudomonas

aeruginosaeste maimare dect a antiFtsZE.coli


25/39


26/39

26

Analiza prin Western-blot a reactivitii ncruciate a anticorpilor policlonali obinuifa de FtsZ Escherichia coli i FtsZ Pseudomonas aerugi nosacu actina

Figura 20. Analiza prin Western-blot a reactivitii anticorpilor policlonali antiFtsZ cuantigenii FtsZ i cu actina.

0 Marker PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas SM 1181)

1 FTSZE.c. AntiE.c. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +

2 FTSZE.c. AntiE.c 16sptmni 1/1000 Anti-oarece 1/3000 +

3 FTSZE.c. AntiP.a. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +reactivitatencruciat

4 FTSZE.c. AntiP.a. 16sptmni 1/1000 Anti-oarece 1/3000 +reactivitatencruciat

M 1 2 3 4 5 6 11 12 13 14 15 16 M 1A 2A 3A 4A

Reactivitatea ncruciat aanticorpilor antiFtsZPseudomonasaeruginosafade substratul FtsZEscherichiacolila diluii de 1:250(3) i1:1000 (4) a serurilor imune

Reactivitatea ncruciat aanticorpilor antiFtsZEscherichiacoli fa de substratul FtsZPseudomonas aeruginosa ladiluii de 1:250 (11) i 1:1000(12) a serurilor imune

Nu a fost detectatreactivitatea incruciata anticorpilor antiactinfaa deFtsZEscherichia coli

Nu a fost detectatreactivitatea incruciata anticorpilor antiactinfaa deFtsZPseudomonas.aeruginosa

Nu a fost detectat reactivitateancruciat a anticorpilor antiFtsZEscherichia coli cu substratulactin(1A) i a anticorpilorantiFtsZPseudomonas aeruginosacu substratul actin (2A).

70

55

35

25

15


27/39

27

5 FTSZE.c. Anticorpi monoclonali antiactin1/500

Anti-iepure 1/2000 - nu a fost detectatreactivitatencruciat

6 FTSZ E.c. NMS 0 sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 - ser preimun

11 FTSZP.a. AntiE.c. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 +reactivitatencruciat

12 FTSZP.a. AntiE.c. 16sptmni 1/1000 Anti-oarece 1/3000 +reactivitatencruciat

13 FTSZP.a. Anti FtsZP.a. 16sptmni1/250 Anti-oarece1/3000 +

14 FTSZP.a. AntiP.a. 16sptmni 1/1000 Anti-oarece 1/3000 +

15 FTSZP.a. Anti actin monoclonal Ab1/500

Anti-iepure 1/2000 - nu a fost detectatreactivitatencruciat

16 FTSZP.a. NMS 0 sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 - ser preimun

1A Actin AntiE.c. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 - nu a fost detectatreactivitateancruciat

2A Actin AntiP.a. 16sptmni 1/250 Anti-oarece 1/3000 - nu a fost detectatreactivitateancruciat

3A Actin Anticorpi monoclonali antiactin1/500

Anti-iepure 1/2000 +

4A Actin NMS 0sptmni 1/250 Anti-oarece1/3000 - ser preimun

Anticorpii antiFtsZ din serurile imune obinute dup 16 sptmni de la debutul imunizrii

determin apariia benzilor de reactivitate specific i ncruciat i la diluii mari aleserurilor, de 1:1000. Actina nu este recunoscut de anticorpii policlonali antiFtsZ nici laconcentraii mari ale acestora (diluii de 1:250 ale serurilor imune), iar anticorpii monoclonaliantiactin nu recunosc proteinele recombinate FtsZ.

Testarea reactivitii anticorpilor policlonali antiFtsZ n timpUlterior recoltrilor efectuate la 40 de sptmni de la prima imunizare, au fost

preparate diluii de 1:500 ale serurilor imune obinute ncepnd cu recoltarea din 19.12.2010.Anticorpii secundari au fost diluai n proporia de 1:3000.


28/39


29/39

29

Cea mai bun reactivitate o au anticorpii antiFtZ din serurile imune obinute prinrecoltri la 8-16 sptmni dup debutul imunizrii, rezultate care corespund cu dateleobinute la determinarea titrului de anticorpi din serurile imune prin tehnica ELISA.

Figura 22. Titrul de anticorpi n serurile obinute de la cele dou grupuri deoareci prin recoltri la 8, 16, 24, 32, 40 de sptmni de la prima imunizare.

Analiza prin Western-blot a reactivitii ncruciate a FtsZ cu actina i beta-tubulina

Figura 23. Analiza prin Western-blot a posibilei reactiviti ncruciate a anticorpilorantiFtsZ cu actina i -tubulina.

0 Marker PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas SM 1181)7. FtsZ E.c. AntiFtsZE.c.16 sptmni 1/500 Anti-oarece

1/3000+

8. FtsZE.c. Anticorpi antiactin monoclonali

1/500

Anti-iepure

1/2000

nu exist

reactivitatencruciat

0

sapt

8

sapt

16

sapt

24

sapt

32

sapt

40

saptE.coli 0,10 0,28 0,58 0,90 0,89 0,76

P.aeruginosa 0,08 0,27 0,52 0,89 0,87 0,78

0,000,100,200,300,400,500,600,700,800,901,00

DOla490nm

Anticorpii policlonali fade proteinele recombinate

M 7. 8. M 7 8 9 10 M 5A 6A 7A 16A M T14 T16 T18 T20 T15 T17 T19

70

55

35

25

15


30/39

30

7 FtsZP.a AntiFtsZE.c. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000

+

8 FtsZP.a AntiFtsZP.a. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000

+

9 FtsZP.a Anti actin monoclonal Ab1/500

Anti-iepure1/2000

nu existreactivitatencruciat

10 FtsZP.a NMS 0 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000

Ser preimun

5A Actin AntiFtsZE.c. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000


6A Actin AntiFtsZP.a. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000


7A Actin Anti actin monoclonal Ab1/500

Anti-iepure1/2000

+

16A Actin NMS 0 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000

ser preimun

T14 Tubulin AntiFtsZE.c. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000


T16 Tubulin AntiFtsZP.a. 16 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000


T18 Tubulin Anti actin monoclonal Ab1/500

Anti-iepure1/2000


T20 Tubulin NMS 0 sptmni 1/500 Anti-oarece1/3000

ser preimun

T15 Tubulin AntiFtsZE.c. 16 sptmni 1/100 Anti-oarece1/3000


T17 Tubulin AntiFtsZP.a. 16 sptmni 1/100 Anti-oarece1/3000


T19 Tubulin NMS 0 sptmni 1/100 Anti-oarece1/3000 ser preimun


31/39


32/39


33/39


34/39

34

7. Concluzii

1. Amorsele construite i condiiile de amplificare prin PCR selectate au asigurat

eficiena i specificitatea reaciei:produsul de amplificare a fost de lungimea dorit, fr nucleotide modificate fa

de secvenele genelor ftsZ E.coli i ftsZ P.aeruginosa din n baza de date NCBI,

eventualele erori nefiind dorite n secvenele genelor, condiie esenial pentru

obinerea proteinelor recombinate

nu au existat amplificri nespecifice

cantitatea de amplicon a fost suficient de mare, ceea ce a facilitat manipularea

ulterioar a secvenei amplificate i obinerea proteinelor recombinate FtsZEscherichia coli i FtsZPseudomonas aeruginosa

2. Proteinele recombinate FtsZ Escherichia coli i FtsZ Pseudomonas aeruginosa se

exprim solubil n celulele deEscherichia colitulpina BL21(DE3).

3. Alinierea secvenelor de aminoacizi ale proteinelor FtsZEscherichia coli i FtsZ

Pseudomonas aeruginosaa evideniat un grad ridicat de omologie al acestor secvenede 83,76%, ceea ce corespunde datelor din literatur conform crora ftsZeste o gen

esenial, conservat n speciile de bacterii.

4. oarecii imunizai cu proteine recombinate FtsZ au produs anticorpi policlonali la

numai 8 sptmni dup prima imunizare.Titrul i afinitatea anticorpilor policlonali

antiFtsZ obinui de noi sunt suficient de mari, astfel nct anticorpii au prezentat o

reacie pozitiv cu antigenii specifici, dup 8 sptmni de la prima imunizare.

5. Concentraia optim a anticorpilor policlonali antiFtsZ obinui de noi, utilizai ndeterminarea prin Western-blot a reactivitii lor specifice, corespunde unei diluii aserurilor imune de 1:500. La diluii mai mici, aparnumeroase benzi de detecie a unorlegri nespecifice.

6. Se constat reactivitatea ncruciat a FtsZ din cele dou specii de bacteriila 8 i la 16sptmni: anticorpii policlonali antiFtsZ Pseudomonas aeruginosa prezintreactivitate ncruciat cu substratul FtsZ Escherichia coli i anticorpii policlonali


35/39

35

antiFtsZ Escherichia coli prezint reactivitate ncruciat cu substratul FtsZPseudomonas aeruginosa.

7. Cea mai bun reactivitate o au anticorpii antiFtZ din serurile imune obinute prin

recoltri la 8-16 sptmni dup debutul imunizrii. Anticorpii antiFtsZ din serurileimune obinute dup 16 sptmni de la debutul imunizrii determin apariia benzilorde reactivitate specific i ncruciat i la diluii mari ale serurilor, de 1:1000.

8. Dup 32 de sptmni de la debutul imunizrii repetate, reactivitatea ncruciat aanticorpilor din serurile imune cu antigenele celeilalte specii bacteriene pare s scad.

9. Alinierea ntre secvenele de aminoacizi ale FtsZ Escherichia coli sau FtsZ

Pseudomonas aeruginosa cu secvenele de aminoacizi ale unor izotipuri tubuliniceumane, bovine sau murine din baza de date UniprotKB a artat o omologie desecven de 13,96% (TBB4 cu FtsZ E.coli) i de 13,51% (TBB4 cu FtsZ

Pseudomonas aeruginosa).

10. Actina i beta-tubulina eucariote nu sunt recunoscute de anticorpii policlonali antiFtsZ

Escherichia coli i antiFtsZ Pseudomonas aeruginosa. Anticorpii monoclonali

antiactin nu recunosc FtsZ Escherichia coli, FtsZ Pseudomonas aeruginosa i

tubulina.

11.

Anticorpii policlonali obinui prin inocularea FtsZ Escherichia coli i FtsZPseudomonas aeruginosa la oareci BALB/c au caracteristici de afinitate i dereactivitate care permit utilizarea lor n cercetare, n terapie antibacterian idiagnostic.

12. Reactivitatea ncruciat a proteinelor FtsZ din cele dou specii bacteriene deschide

posibilitatea evalurii reactivitii ncruciate a anticorpilor policlonali obinui de noicu proteinele FtsZ ale altor specii de bacterii. O reactivitate ncruciat extins, ntreFtsZ din celulele unui numr ct mai mare de specii bacteriene, ar oferi anticorpilo r

antiFtsZ calitile necesare pentru obinerea agenilor antibacterieni cu spectru larg.

13. Anticorpii policlonali anti-FtsZ Escherichia coli i anti-FtsZ Pseudomonas

aeruginosaprezint reactivitate ncruciat fa de proteine FtsZ ale altor specii, dar

nu recunosc actina i tubulinele eucariotei n consecin pot fi utilizai selectiv fa

de proteina citoscheletului bacterian, FtsZ, pentru c nu se leag i nu afecteaz

proteinele citoscheletului celulei gazd eucariote.


36/39


37/39

37

Erickson H.P.Atomic structures of tubulin and FtsZTrends Cell Biol. 8; 1998: 133-137.Erickson H.P.Evolution of the cytoskeleton Bioessays 29(7);2007: 668-677

Fu G., Huang T., Buss J., Coltharp C., Hensel Z., Xiao J.In Vivo Structure of theE. coli FtsZ-ring Revealed by Photoactivated Localization Microscopy (PALM)PLoSONE 5(9); 2010: e12680

Glover D.M., Hames B.D. Techniques for Transformation of Escherichia colicapitolul 1 nDNA cloning: a practical approach, vol.1, Core Techniques,pag.1-35,Oxford University Press, 1995

Gonzalez J.M., Velez M., Jimenez M., Alfonso C., Schuck P., Mingorance J.,Vicente M., Minton A.P., Rivas G. Cooperative behavior of Escherichia coli cell-

division protein FtsZ assembly involves the preferential cyclization of long single-stranded fibrils Proc Natl Acad Sci USA 102;2005: 18951900

Guertin D.A., Trautmann S., McCollum D. Cytokinesis in EukaryotesMicrobiolMol Biol Rev., 66(2);2002: 155178

Hales K.G., Bi E., Wu J.-Q., Adam J.C., Yu I.-C., Pringle J.R. Cytokinesis: an

emerging unified theory for eukaryotes?Curr Opin Cell Biol. 11;1999: 717725

Jeffrey E., Richard D.A., Dirk-Jan S.Cytokinesis in Bacteria Microbiol Mol BiolRev. 67(1);2003:52-65

Lwe J., Amos A.L. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZNature 391;1998: 203-206

Lwe J., van den Ent F., Amos A.L. Molecules of the Bacterial CytoskeletonAnnu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33;2004: 177-198

MacBeath J.R.E., Harvey S.S., Oldroyd N.J. Automated Fluorescent DNA

Sequencing on the ABI PRISM 377 capitolul 10 n Graham C.A., Hill A.J.M.Methods in Molecular Biology vol.167: DNA sequencing protocols, pag.119-153,Humana Press Incorporation, New Jersey, 2001

McDevitt D., Payne D.J., Holmes D.J., Rosenberg M.Novel targets for the futuredevelopment of antibacterial agents Journal of Applied Microbiology SymposiumSupplement 92; 2002: 28S34S

Mcpherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. Polymerase chain reaction: basicprinciples and automation capitolul 1 n PCR: a practical approach pag. 1-13,Oxford University Press, 1991

Mikkelsen S.R., Cortn E. Bioanalytical chemistry: capitolul1 SpectroscopicMethods for Matrix Characterization, subcapitolul Total protein-Bradford Method,JohnWiley&Sons Inc., New Jersey, 2004
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9695825&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9695825&dopt=Abstract


38/39

38

Mingorance J., Rivas G., Vlez M., Gmez-Puertas P., Vicente M. Strong FtsZ is

with the force: mechanisms to constrict bacteria. Trends Microbiol 18; 2010:348356Mukherjee A., Dai K., Lutkenhaus J.Escherichia coli cell division protein FtsZ isa guanine nucleotide binding protein Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90; 1993: 1053-

1057Nair A.J.Recombinant DNA Technology, seciunea 15.2.Tools of Recombinant DNATechnology:BlueWhite Screening, capitolul 15 n Principles of Biotechnology,

pag.631, Laxmi Publications Ltd., New Delhi, 2007

Pollard T.Mechanics of cytokinesis in eukaryotes Curr Opin Cell Biol. 22; 2010:5056

Popescu O.V.Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Ed. Tehnic,Bucureti, 1990.

Rosenberg I. M.Protein Analysis and Purification capitolul 4: ElectrophoreticTechniques, p. 55-65, Birkhuser, Boston, 2005

Sambrook J., Russell D.V. I n Vi tro Ampli fi cation of DNA by the Polimerase Chain Reactioncapitolul

8 nMolecular Cloning: A Laboratory Manual, ediia a III-a, vol.2, pag.8.1-8.29, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001

Gel Electrophoresis of DNA and Pulse-field Agarose Gel Electrophoresis

capitolul 5 n Molecular Cloning: A Laboratory Manual ed.a III-a, vol.1,pag.5.4-5.14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001

Expression of Cloned Genes in Escherichia coli seciunea Choosing aPromoter and Vector System, protocol1: Expression Vectors Containing anIPTG-inducible Promoter,capitolul 15 nMolecular Cloning: A Laboratory

Manual , ed.a III-a, vol.3, pag.15.14-15.20, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001

DNA ligases Information Panels din capitolul 1: Plasmids and TheirUsefulness in Molecular Cloning n Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, ed.a III-a, vol.1, pag.1.1.57-1.1.59, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001

Electroporation- Information Panel din capitolul1: Plasmids and TheirUsefulness in Molecular Cloning n Molecular Cloning: A Laboratory

Manualed.a III-a, vol.1, pag.1.1.62-1.1.63, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001 Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning seciuneaScrening for

Recombinant Plasmids capitolul 1 n Molecular Cloning: A LaboratoryManualed.a III-a, vol.1,pag.1.26-1.27, Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001

Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning seciuneaDephosphorylation of Plasmid DNA , capitolul 1 n Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, ed.a III-a, vol.1, pag. 1.93-1.97, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001

Straight A.F., Field C.M.Microtubules, membranes and cytokinesisCurr Biol. 10;2000: R760-R770.


39/39

Sun Q., Margolin W. FtsZ Dynamics during the Division Cycle of Live

Escherichia coliCellsJ.Bacteriol.180(8);1998:2050-2056Tengbjerg K., Haurum J.S. Polyclonals: A Third Generation of Antibody

Therapeutics IPT 20;2006: 46-49

Voskuil J.L.A., Westerbeek C.A.M., Wu C., Kolk H.J., Nanninga N. EpitopeMapping of Escherichia coli Cell Division Protein FtsZ with Monoclonal AntibodiesJ Bacteriol. vol.176(4);1994:1886-1893

Weiss S. D.Bacterial cell division and the septal ring. Mol Microbiol. 54(3);2004:588-597

http://ncbi.gov NCBI. Enterobacteriacae. Taxonomy browser NCBI. Pseudomonaceae.Taxonomy browser

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/introduction.html

http://www.neb.com T4 DNA ligase din www.neb.com/nebecomm/products/productM0202.asp

http://www.promega.com/tbs/: Promega Technical Manual pGEM-T and pGEM-TEasy Vector Systems

Novagen pET System Manual ediia a 10-a, 2002

http://www.fermentas.com

www.fermentas.com/en/tools/doubledigest www.fermentas.com/en/support/technical-reference/phage-plasmid-

dna/ptz57r www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/kits/k121-instaclone-

pcr-cloning www.fermentas.com/en/products/all/modifying-enzymes/ligases/el001-t4-

dna-ligase www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/broch_genejet_P19.

pdf (manual Gene Jet Plasmid Miniprep Kit- purificare plasmide dinpreculturi)

http:www.stratagene.com BL21(DE3) Competent Cells, BL21(DE3)pLysS Competent Cells and BL21

Competent Cells

http://www.mn-net.com/: PCR clean-up Gel extraction User Manual NucleoSpinExtract II

http://expasy.org UniprotKB

http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa clustalw.html
http://ncbi.gov/http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/introduction.htmlhttp://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/introduction.htmlhttp://www.neb.com/http://www.promega.com/http://www.fermentas.com/http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigesthttp://www.fermentas.com/en/support/technical-reference/phage-plasmid-dna/ptz57rhttp://www.fermentas.com/en/support/technical-reference/phage-plasmid-dna/ptz57rhttp://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/kits/k121-instaclone-pcr-cloninghttp://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/kits/k121-instaclone-pcr-cloninghttp://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/broch_genejet_P19.pdfhttp://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/broch_genejet_P19.pdfhttp://www.stratagene.com/http://www.mn-net.com/http://expasy.org/http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa%20clustalw.htmlhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa%20clustalw.htmlhttp://expasy.org/http://www.mn-net.com/http://www.stratagene.com/http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/broch_genejet_P19.pdfhttp://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/media_pdf/broch_genejet_P19.pdfhttp://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/kits/k121-instaclone-pcr-cloninghttp://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/kits/k121-instaclone-pcr-cloninghttp://www.fermentas.com/en/support/technical-reference/phage-plasmid-dna/ptz57rhttp://www.fermentas.com/en/support/technical-reference/phage-plasmid-dna/ptz57rhttp://www.fermentas.com/en/tools/doubledigesthttp://www.fermentas.com/http://www.promega.com/http://www.neb.com/http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/introduction.htmlhttp://ncbi.gov/

Div Cel Procariote

Documents

Transcript of Div Cel Procariote