Diminuarea emisiilor de metan ruminal prin controlul microorganismelor din rumen

Cuprins:

1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente în rumen2. Clasificarea speciilor metanogene Archaea3. Metode de inhibare a bacteriilor metanogene: utilizarea biotehnologiilor (vaccinare,

serumizare), furaje, aditivi...prezentare pe scurt4. folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg)

Concluzii

1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente în rumen

A. Facultativ anaerobe- speciile facultativ anaerobe izolate din rumen aparţin genurilor

Flavobacterium, Pseudomonas, Proteus şi Micrococcus.

1. Bacilii coliformi (Coliform bacilli)- aceştia nu par să aibe o importanţă deosebită pentru

rumen deoarece s-au găsit într-un număr mic în lichidul ruminal (103-106 per ml de lichid

ruminal la oi şi vaci şi într-un număr mai mare la viţei de 3 săptămâni). Hobson şi Mann au

găsit foarte puţini bacili coliformi folosind anticorpi fluorescenţi. Heald a sugerat că aceste

bacterii pot fi importante în procesul de fermentare a xilozei deoarece au fost izolate din

lichidul ruminal în prezenţa xilozei şi au început foarte repede să o fermenteze. Cele mai

multe specii de coliformi găsite în rumen aparţin speciei Escherichia coli dar au fost izolate şi

alte specii cum ar fi Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae.

E. coli este o bacterie facultativ anaerobă, gram negativă şi nonsporulată. Celulele sunt de

obicei sub formă de bastonaşe şi au aproximativ 2 microni în lungime şi 0,5 microni în

diametru. Bacteria produce acid lactic, succinic, etanol, acetat şi dioxid de carbon.

Fig.1 Escherchia coli (www.remedic.ro)

2. Bacili (Bacilli)- specii de bacili au fost izolate din rumen în număr foarte mic. Aceste

specii sunt B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. circulans. Se pare că aceste bacterii sunt

importante în digestia proteinelor.

3. Propionibacteria- Elseden a izolat tulpini de Propionibacteria care fermentează lactatul

din lichidul ruminal preluat de la oi şi vaci. Mai târziu, Gutierrez a izolat un număr mare de

bacterii proteolitice şi propionice din rumenul unor vaci dar şi din sol şi fân. Aceste bacterii

erau identice cu Corynebacterium acnes cu excepţia că produceau acid lactic.

4. Lactobacilli- Hungate şi colab. au observat că bacterii similare cu Lactobacillus brevis erau

prezente în rumenul unei oi care a fost furajată cu fân şi căreia i-a fost administrat 3 lb de

glucoză. Rodwell a izolat o tulpină de lactobacillus heterofermentativ de la o oaie furajată cu

grâu. Jensen şi colab. au izolat L. brevis, L. buchneri, L. fermenti, L. plantarum, L.

acidophilus şi L. casei de la o vacă furajată cu furaje grosiere. Perry şi Briggs au găsit mai

multe specii de Lactobacillus în rumenul viţeilor dar şi a vacilor mature. L. fermenti era

predominant la viţei furajaţi cu concentrate din fân, L. acidophilus era predominant la vaci

furajate cu concentrate din fân iar L. casei predomina la vaci furajate cu silozuri. Studiile au

arătat că lactobacilii capabili de creştere în condiţii aerobice pot fi de o importanţă funcţională

în rumen dar sub anumite condiţii. Cercetările realizate de Perry şi Briggs demonstrează că

lactobacilii sunt printre cele mai importante bacterii prezente în rumen chiar şi la animale care

sunt furajate cu furaje grosiere. Hobson şi Mann nu au putut demonstra prezenţa speciilor

brevis, fermenti sau acidophilus în lichidul ruminal preluat de la viţei sau oi furajaţi cu furaje

pentru adulţi. Totuşi, o specie de Lactobacillus a fost descoperită la viţei de 7-10 zile care au

avut o dietă bazată pe lapte.

Lactobacillus casei ( www.bioweb.usu.edu)

Chiar dacă Lactobacillus sp. sunt în general inofensive, există câteva excepţii care produc

edeme pulmonare acute şi anemie hemolitică.

5. Streptococci- acestea sunt probabil cele mai studiate şi izolate bacterii din rumen. Cea mai

repezentativă specie este S. Bovis, cu celule gram-pozitive, nemotile, cu formă oviodă până la

formă de coc, formează lanţuri, iar celulele bătrâne pot fi gram-negative. Sunt considerate

facultativ anaerobe, existând tulpini strict anaerobe dar şi tulpini aero-tolerante. Intr-un studiu,

Hungate a comparat caracteristicile a 27 de tulpini izolate din lichidul ruminal preluat de la

câteva vaci furajate cu fân şi concentrate. Numărul era de 0,2-140 de milioane per ml.

Gutierrez a arătat numărul de streptococi amilolitici, facultativ anaerobi creşte foarte mult la

vacile furajate cu cereale. Tulpinile acestor bacterii se asemănau cu S. bovis cu excepţia că

acestea nu aveau toleranţă la temperaturi ridicate, erau puternic gram-pozitive doar 4 sau 6

ore, şi reduceau nitraţii. S-a arătat că aceste culturi, la fel ca şi alte patru tulpini de S. bovis au

abilitatea de a se ataşa de de amidonul din cereale.

Dain şi colab. au arătat că mâzga produsă din sucroză (produsă de S. bovis) este o

polizaharidă care conţine glucoză şi arată că este nevoie de dioxid de carbon pentru

producerea ei când microorganismul este crescut în mediu aerob. Trei varietăţi de

Streptococcus bovis au fost descoperite prin folosirea de mâzgă, de fermentaţia manitolului şi

de reacţiile produse în mediul cu agar (sânge de cal) .

Ford şi cloab. au descoperit că nici una dintre cele 26 de tulpini de S. bovis nu are nevoie de

vitamina B când creşte în condiţii anaerobe, cu excepţia tiaminului care a stimulat creşterea a

5 tulpini. În mediu aerob, câteva tulpini au nevoie de acid nicotinic, biotin şi tiamin. S. bovis

este indubitabil implicat în degradarea amidonului şi a altor carbohidraţi solubili din rumen.

Deoarece S. bovis este capabil de producerea unei cantităţi foarte mare de acid lactic, ceea ce

poate duce la diferite boli la rumegaroarele care sunt furajate cu furaje bogate în amidon şi

zaharuri (acidoză, balonare), se recomanda o dietă pe bază de drojdie uscată, astfel acesta nu

este capabil să prolifereze foarte repede.

Alte specii de strptoccoci izolaţi dar găsite în număr mai mic în lichidul ruminal sunt: S.

liquefaciens, S. faecalis şi alte specii neclasificate.

S-au descoperit deasemenea, şi câteva specii de coci facultativ anaerobi care se pare că sunt

implicaţi în procesul de fermentaţie ruminal. Bauman şi Foster au găsit bacterii similare cu

cele din genul Pediococcus în diluaţia lichidului ruminal preluat de la vaci furajate cu cereale.

Câţiva cercetători au observat la microscop şi au izolat o grupare sarcina, gram-negativă din

lichidul ruminal de la oi. Mann a descoperit că sarcina este facultativ anaerobă, care

degradează glucoza şi creşte doar în apă peptonată. A fost numită Sarcina bakeri.

B. Anaerobe

1. Sporulate-cele mai multe studii realizate asupra bacteriilor sporulate, celulolitice, anaerobe

au dus la concluzia că acestea nu se dezvoltă în rumen. Bullen şi colab. au realizat că o specie

de clostridium, C. perfringens a fost foarte repede distrusă când a fost introdusă în rumen. O

altă concluzie care s-a desprins în urma studiilor afost aceea că bacteriile sporulate anaerobe

nu sunt la fel de importante ca şi cele nonsporulate pentru procesul de fermentaţie din rumen.

Totuşi câteva specii au fost caracterizate ca fiind semnificante. Acestea sunt: C. lochheadii, C.

longisporum, C. butyricum, C. sporegenes.

Clostridium perifringens (www.microbewiki.kenyon.edu)

2. Nonsporulate

a. Lactobacilli- Câţiva cercetători au izolat lactobacili anaerobi, homofermentativi din rumen

dar doar câteva specii au fost bine carcaterizate. Mann şi Oxford au descoperit tulpina unei

bacterii (Organismul 123) care produce acid lactic. Au considerat că este o varietate de

Lactobacillus lactis, strict anaerobă. Bryan şi colab. au descoperit aceaşi bacterie care

predomina la viţei de 3 şi 6 săpămâni dar nu a fost găsită şi la animale mai tinere, mai învârstă

sau mature. Mai târziu, cercetătorii au izolat o alta specie anaerobă care produce acid lactic

(grupul +R3), de la viţei de 3-6 săptămâni. Această specie diferă de celelalte specii studiate.

Alte specii izolate sunt: L. ruminis şi L. vitulinis.

b. Ramibacteria-Bryant şi colab. au izolat două specii gram-pozitive de bacterii care aparţin

genului Ramibacterium. Grupul +R1 a fost găsit printre bacteriile izolate de la un viţel de 1

săptămână. Acestă bacterie produce o cantitate mare de acid succinic şi cantităţi mai mici de

acid lactic în mediul cu glucoză. Deasemenea prezenta câteva similarităţi cu L. bifidus.

Cealaltă specie de Ramibacterium izolată din rumenul unor viţei era strict anaerobă, producea

acid lactic, acetic şi formic în mediul cu glucoză şi degrada lactoza.

c.Eubacteria- Bryant şi Burkery au izolat două grupuri de bacterii anaerobe şi gram-pozitive.

Grupul +SR-Ggxc a fost studiat în detaliu şi a fost plasat în genul Eubacterium. Aceste specii

produc gaz şi acid acetic, formic şi lactic în proporţii similare în mediul cu glucoză. Diferă de

unele specii prin faptul că nu produc acid butiric şi propionic sau amoniac şi de altele (E.

biforme şi E. aerofaciens) prin fermentaţia carbohidraţilor, lichefierea în gelatină, şi

producerea unei cantităţi mari de acizi graşi volatili. Celălalt grup izolat de Bryant şi Barkery,

grupul +CR-GXC a fost studiat prin mai multe metode. 20 de tulpini au fost izolate de la 8

vaci furjate diferit. Toate tulpinile erau nonmotile cu multe celule aproape cocoidale. Erau

aranjat în principal câte una, în perechi şi în lanţuri scurte, ocazional în lanţuri de 20 de celule.

Erau slab gram-pozitive în 16 ore de cultură iar multe celule nu reţineau cristalul violet.

Culturile mai bătrâne erau gram-negative. Coloniie de suprafaţă formate pe mediul cu agar

erau netede, convexe, translucide până la opace având diametrul de la 2 până la 4 mm după 3

zile de incubare. Toate tulpinile au crescut la 30-37 de grade C şi erau strict anaerobe. Nici o

tulpină nu a produs catalză sau indol, nu a lichefiat în gelatină, nu a hidrolizat celuloza sau

amidonul, nu a descompus glicerolul, manitolul sau lactoza. In urma studiile realizate pe

aceste două grupuri de Eubacteria s-a ajuns la concluzia că ultimul grup aparţine speciei E.

ruminantium.

d. Methanobacteria- producerea metanului este una dintre cele mai cunoscute recţii care se

petrece îm rumen. Culturile de Methanosarcinae, Methanobacterium formicicum şi de

Methanobacterium sohngenii au fost probail obţinute din culturi pure inoculate cu un volum

mare de lichid ruminal. Smith şi Hungate au realizat culturi de bacterii metanogene, anaerobe,

gram-pozitive, nonmotile din conţinutul ruminal de la vaci şi oi aflate în diferite locaţii

geografice. Puritatea unei tulpini a fost foarte evidenţiată prin faptul că utilza hidrogen şi acid

formic în formarea metanului. Tulpina a fost numită Methanobacterium ruminantium.

e. Lachnospirae- Bryant şi colab. au descris genul Lachnospirae ca şi bacterii anaerobe,

nonsporulate, slab gram-pozitive, care degradează glucoza şi produc cantităţi mari de etanol,

acid lactic, formic şi acetic. Specia L. multiparus produce o colonie filementoasă cu unele

celule aranjate în lanţuri lungi cu tendinţa de a se curba. Aceste caracteristici, dar şi reacţia

Gram, sugerează o relaţie cu ordinul Actinomycetales.

Acestă bacterie degradeză pectina, fiind gram-pozitivă, în formă de bastonaş curbat, lat de 0,5

microni şi cu o lungime de 2-4 microni. Pentru dezvoltare are nevoie de vitamine din

complexul B, cerinţa pentru acestea variind de la o tulpină la alta.

f. Cillobacteria- o singură tulpină izolată din conţinutul ruminal diluat de la o vacă furjată

natural pe păşune, care era anaerobă, gram-pozitivă a fost plasată genului Cillobacterium şi a

fost numită C. cellulosolvens. Diferă de alte specii ale genului prin degradarea celulozei şi

prin producerea de acid lactic homofermentativ.

g. Bacterioizi-acid succinic- bacteriile strict anaerobe, nonmotile, gram-negative care produc

o cantitate mare de acid succinic sunt printre cele mai importante bacterii prezente în rumen.

Trei specii aparţinând grupului au fost numite: B. succinogenes, B. amylophilus, B ruminicola.

Primul nume al bacteriei Bacterioides succinogenes nu este prea aproape filogenetic de

Bacterioides sp. şi de aceea a fost redenumit Fibrobacter succinigenes. Aceasta este cea mai

răspândită bacterie din rumen. La vacile furajate cu paie din grâu, F. succinogenes reprezintă

20% din totatul bacteriilor iar la cele furajate cu alte furaje, aceasta reprezintă numai 5%. În

unele studii a fost raportat că aceasta contribuie cu 5-6% din totalul procariotic 16S rRNA din

conţinutul rumenal al vacilor. La prima izolare, celulele sunt predominant sub formă de

bastonaş însă în cultură ele devin cocoidale sau sub formă de lămâie, cu diametrul între 0,8-

1,6 microni. De obicei celulele sunt singulare, dar se pot observa şi lanţuri scurte sau rozete.

Pentru creştere au nevoie de valerat sau izobutirat dra şi de biotină şi acidul p-aminobenzoic

(PABA). Este relativ rezistentă la antibioticele orale dra este sensibilă la metaboliţii secundari

ai plantelor. Are complexe de enzime fibrolitice şi este una dintre microorganismele care

degradează amidonul cristalin.

Bacterioides amylophilus- prin secvenţierea oligonucleotidică 16S r RNA, Stackenbrandt şi

Hippe au propus ca numele de Bacterioides amylophilus săa fie schimbat în Ruminobacter

amylophilus. Chiar dacă se observă destul de rar se spune că este responsabilă de digestia

amidonului. Degradarea amidonului nu necesită amilază extracelulară, moleculele din amidon

aderând la receptori celulari şi sunt transportate în celulă pentru hidroliză. R. amylophilus are

formă de bastonaş de la oval pâmă la lunguiţ. In câteva substraturi produce acid, fermenteză

glicogenul şi dextrinele. Produsele de fermentaţie sunt acetatul şi succinatul, iar dioxidul de

carbon şi amoniacul sunt esenţiale pentru creştere.

h. Bacterioide-acid butiric- Bryant a izolat din rumenul unor viţei bacterii anaerobe, gram-

negative, nonmotile sub formă de bastonaşe care produc gaz, acid butiric, acetic şi propionic

în mediul cu glucoză. Bacteriile aparţin genului Bacterioides dar puteau fi plasate şi genului

Sphaerophorus cu singura diferenţă dintre aceste genuri că Sphaerophorus spp. sunt mai

multe pleomorfice.

Doetsch şi colab. au descoperit nişte bacterii anaerobe, gram-negative, nonmotile, sub formă

de bastonaş care produceau acid butiric şi acetic dar şi acid lactic şi propionic în cantităţi mai

mici în descompunerea xilozei. Această bacterie a fost numită Bacterioides amylogenes.

Forma curbată a celulelor le face să fie asemănătoare cu bacteriile din genul Desulfovibrio dar

absenţa flagelilor şi faptul că nu reduce sulfat elimină această ipoteză.

i.Fusobacteria- Huhtanen şi Gall au descoperit un grup de bacterii gram-negative, anaerobice

sub formă de bastonaş îîtr-un conţinut ruminal diluat. Aceste bacterii produc acid, gaz şi un

miros urât în mediul cu glucoză. Aceste caracteristice indică faptul că bacteria face parte din

genul Fusobacterium. Bryant a izolat, deasemenea, o specie nonmotilă care aparţine genului

Fusobacterium din lichidul ruminal preluat de la viţei de 1 şi 3 săptămâni dar nu a gasit

bacterii asemănătoare la alte animale. Caracteristicile tulpinilor variau în producerea de indol,

lichefierea în gelatină, hidroliza amidonului, creşterea la 22 şi 45 grade Celsius, dar

caracteristicile morfologice şi fiziologice se asemănau. Acest grup era asemănător cu unele

tulpini de Fusobacterium fusiforme .

j.Butyrivibrio- într-un studiu realizat asupra bacteriilor celulolitice din rumen, Hungate a

izolat bacterii sub formă de bastonaş curbat, gram-negative care degradau o gamă variată de

carbohidraţi şi produceau dioxid de carbon, hidrogen, acid butiric şi formic. A fost stabilit că

bacteriile aparţin genului Butyrivibrio şi speciei B. fibrisolvens. Genul include bacterii

anaerobe, nonsporulate, gram-negative, având formă de bastonaş curbat care degradează

glucoza şi formează acid butiric. B.fibrisolvens este una dintre cele mai comune specii de

bacterii din rumen. Pe lângă rolul pe care îl are în degradrea granulelor

de amidon, ea degradează şi fibrele vegetale, mai ales a xilanelor datorită conţinutului de

xilanază. Are cea mai mare activitate metabolică putând utiliza glucide simple, amidon de

toate tipurile, polizaharide pectinice dar şi alţi polimeri necelulotici.

k. Succinivibrio- bacteriile care fac parte din acest gen sunt anaerobe, nonsporulate, gram-

negative, sub formă de bastonaş curbat, monotrihe, şi care produc o cantitate mare de acid

succinic. Bryant şi Small au studiat 7 tulpini preluate de la o vacă şi pe toate le-au inclus în

aceaşi specie, S. dextrinosolvens.

l. Desulfovibrio- în timpul unui studiu asupra bacteriilor din rumen care degradează lactoza,

Gutierrez a izolat bacterii gram-negative, sub formă de bastonaş curbat care produceau colonii

negre în prezenţa sulfatului feros. Deoarece au fost găsite în număr foarte mic nu s-au

considerat importante pentru rumen.

m. Selenomonas

Selenomonas ruminantium- se întâlnesc cel mai des la animale furajate cu seminţe de

cereale, acestea reprezentând 22-51% din numărul total de nicroorganismele viabile. Celulele

sunt gram-negative, curbate în formă de banană, bastonaşele având 0.9-1.1 microni şi 3-3.6

microni, iar motilitatea este rezultatul flagelilor (în număr de 6) aflaţi în mijlocul părţii

concave a celulelor. În unele condiţii, cum ar fi excesul de glucoză sau deficienţa de fosfor, se

poate observa pierderea de flageli şi o morfologie spiralată. Chiar dacă sunt strict anaerobe,

câteva tulpini de S. ruminantium sunt tolerante la cantităţi mici de oxigen şi cel puţin o tulpină

posedă oxidaza NADH solubilă, aceasta fiind capabilă de reducerea oxigenului la apă. În

ciuda faptului că are o structură celulară specifică pentru bacterii gram-negative, prezintă

asemănări în secvenţa 16S r ADN cu bacteria gram-pozitivă Clostridium. Cerinţele

nutriţionale depind de tulpină şi de sursa de energie, dar de obicei includ n-valeratul, dioxidul

de carbon şi vitaminele din complexul B. Tulpinile care utilizează lactatul au cerinţe crescute

pentru aminoacizi, în special pentru aspartat şi p-aminobenzoat. Chiar dacă nu pot să

degradeze pectinele sau xilanele, cele mai multe tulpini pot să utilizeze pentru creştere

produşii de descompunere ai acestor polimeri. Tulpina S. ruminantium HD4 utilizează

oligozaharide maltozice însă are o capacitate redusă pentru degradarea amidonului. În cultură,

unele tulpini pot să utilizeze amidonul solubil pentru creştere.

S. ruminantium produce cantităţi mici de hidrogen în cultură pură, dar adevărata

metanogeneză se desfăşoară în co-cultură cu metanogeni. (Henderson, 1980) O altă activitate

importantă a S. ruminatium este decarboxilarea succinatului la propionat. (Strobel şi Russel,

1991)

La S. ruminantium este evidenţiată prezenţa plasmidelor. Abilitatea de a utiliza lactatul este

transmisibilă, acest fapt fiind evidenţiat în câteva studii, chiar dacă plasmidele mari erau

prezente în tulpina donoare, acestea aparent nu erau transferate la receptori utilizatori de

lactat, mecanismeul de transfer rămânând necunoscut. Bacteria se poate găsi şi în alte

ecosisteme anaerobe şi are un rol important în formarea de granule în reactoare anaerobe.

n. Borrelia- Bryant a izolat câteva tulpini de microorganisme din lichidul ruminal colectat de

la oi şi vaci şi a studiat din punct de vedere fiziologic şi caracteristic o singură tulpină pe care

a plasat-o genului Borrelia. Microorganismul era strict anaerob, care avea nevoie de substanţe

necunoscute din rumen pentru a creşte. Fermentază glucoza şi în urma aestui proces se

formează o cantitate mare de acid succinic şi acetic şi o cantitate mai mică de acid lactic,

formic, etanol şi dioxid de carbon.

o. Succinimonas- Succinimonas amylolytica a fost izolată din lichidul ruminal de la vaci

furajate cu amestecuri de cereale.

3. Cocci

a. Peptostreptococci- P. Elsdenii-

b. Ruminococci- cele mai importante microorgansime din rumen aparţin cocilor anaerobi

celulolitici. Foarte mulţi au cercetat aceste microorgansime şi au stabilit ca genul

Ruminococci include bacterii gram-pozitive, nonmotile, nonsporulate, sub formă de coci

anaerobi, care fermenteză celuloza şi produc cantităţi mari de acid succinic. Cele trei tulpini

studiate au aparţinut speciei R. flavefacines. Aceştia sunt ruminococci care produc acid

succinic şi un pigment galben pe stratul de celuloză, fermentează celuloza şi celobioza. O a

doua specie, Ruminococcus albus include tulpini care nu produc acid succinic. Caracteristicile

acestei specii sunt variabile dar cele mai multe tulpini diferă prin producerea sau nu a

pigmentului galben. Celulele sunt singulare sau aranjate în perechi sunt gram-negative dar şi

gram-variabil, şi de obicei noniodofilice. Produşii de fermentaţie sunt hidrogenul, dioxidul de

carbon, etanol, acid acetic, acid formic şi acid lactic. (articol)

Celulele de R. albus şi R. flavefaciens prezintă protuberanţe când sunt crescute pe substrat de

perete celular de la plante şi absente la celulele crescute pe celobioză, ele putând reprezenta

complexe se enzime asemănătoare celulosomelor altor bacterii celulozolitice. (Miron şi colab.

,1989).

c. Veillonellae- folosind un mediu de lactat, Johns a izolat Veillonella alcalescens din

rumenul unei oi. Deoarece a fost găsită în număr mic (to 7.4 X 106 per ml,) microorganismul

nu prezintă importanţă pentru rumen.

Alte specii de bacterii întâlnite în rumen

Megasphaera elsdenii aparţine speciilor fermentative de lactat şi glucide din rumen şi intestin

dar poate fi întâlnită şi în intestinele omului şi porcului. Acest coc gram-negativ, fără

motilitate, întâlnit în perechi sau în lanţ pănă la 20 de bucăţi, poate să utilizeze atât

carbohidraţi cât şi acizi organici, fiind considerat unul dintre cele mai importante

microorganisme cu rol în catabolismul acidului lactic. (Hungate,1966)

Mitsoukella multiacidus, aparţinând iniţial speciei Bacterioides ruminicola a fost redenumită

deoarece aceste tulpini posedau citocrom b şi erau capabile să utilizeze hidrogen (Hendelson,

1980). Tulpinile au secvenţe asemănătoare cu cea 16S r ARN a Selenomonas ruminantium,

utilizează substraturi asemănătoare şi produc lactat. Celulele sunt sub formă de bastonaşe

drepte, gram-negative, fără flageli.

Anaerovibrio lipolytica- are două propietăţi importante, cum ar fi hidroliza lipidelor şi

utilizarea lactaţilor, aceste având importanţă ecologică. Hobson şi Mann au izolat-o de la oi

furajate cu turte din seminţe de in. În acelaşi timp, Slyter şi colab. au izolat-o în timpul

schimbării de la furaje concentrate, când utilizarea acidului lactic se măreşte în organism. A

mai fost izolată de la animale furajate cu furaje grosiere (Henderson, 1975)

Celulele au formă de bastonaşe bombate, gram negative de aproximativ 0,5 ori 1,2-3,6

microni, cu motilitate normală, dată de un singur flagel polar. Henderson a descris o bacterie

lipolitică asemănătoare cu A. lipolytica, însă flagelul era localizat pe parte concavă a celulei.

Substratele specifice utilizate sunt riboza, triacilgliceridele şi fosolipidele, fiind fermentaşi şi

câţiva aminoacizi. Cei mai importanţi produşi de fermentaţie depind de substrat. Glicerolul

este fermentat în propionat şi succinat şi în cantităţi mici în hidrogen şi lactat. Riboza şi

fructoza sunt fermentate în acetat, propionat şi dioxid de carbon cu cantităţi mici de succinat,

hidrogen şi lactat. DL-lactatul este fermentat deobicei în acetat, propionat şi dioxid de carbon

cu cantităţi mici de succinat şi hidrogen (Henderson, 1975). Bulele membranare eliberate de

la suprafaţa celulară reprezintă activitatea lipazică extracelulară.

Spirochetele

Microorganismele spiralate au fost observate de multe ori în compoziţia lichidului ruminal, în

special când bacteriile celulolitice au fost izolate şi studiate (Cheng şi colab., 1984). Stanton şi

Canale-Parola (1979) au calculat că Spirochetele se află în pondere de la 1 % până la 6% în

totalul viabil de lichid ruminal. Paster şi Canale-Parola (1982) au descris specii din rumen

formatoare de succinat şi etanol.

Spirochetele din rumen sunt treponeme, care formeză una sau şase grupuri filogetenice de

spirochete (Paster, 1991).

Treponema bryantii este gram-negativă, în formă de bastonaşe helicale cu lungimea tipică de

3-8 microni, cu flagl periplasmatic aflat la un capăt al celulei. Pentru creştere au nevoie de

dioxid de carbon, izobutirat, 2-metilbutirat şi vitamine din complexul B.

T. saccharophilum a fost izolată din lichidul ruminal de la o vacă de către Paster şi Canale-

Parola (1985). Sunt celule helicoidale, mari, late de până la 0,7 microni şi lungi de 20 microni,

cu un manunchi de flagele periplasmatice, care de obicei sunt în număr de 16.

Comunitatea Archaea din rumen

Comunităţile care aparţin domeniului Archaea din rumen contribuie la subunitatea 16S r RNA

cu aproximativ 0,3-3,3%. Archaea are specii care se găsesc în mai multe habitate, dar cele din

rumen sunt strict metanogene anaerobe. Multe specii metanogene pot creşte folosindu-se de

hidrogen şi deasemenea cu ajutorul lui reduc dioxidul de carbon la metan. Unele specii pot

creşte cu ajutorul unor grupări metil şi pot produce electroni care sunt folosiţi pentru

reducerea grupăriloe metil la metan. Alte specii pot creşte cu acetat, reducându-l la metan şi

dioxid de carbon.

În funcţionarea normală a rumenului, proteinele şi carbohidraţii reprezintă cea mai mare sursă

de hrană introdusă şi sunt fermetaţi de comunităţile bacteriene la acizi graşi volatili, metan,

dioxid de carbon şi hidrogen. Acizii graşi volatili sunt preluaţi de către pereţii rumenului şi

servesc ca sursă de carbon şi energie pentru rumegătoare.

Bacteriile metanogene din rumen se prind de particulele materiale, de protozoare şi se prind

de epiteliul rumenului. Aceste specii de bacterii metanogene se pare că au o rată de creştere

diferită din moment ce se eliberează din rumen treptat.

Bacteriile metanogene din rumen

Bacteriile metanogene au fost clasificate în 28 de genuri şi 113 specii dar mult mai multe specii se aşteaptă să fie în natură. Totuşi, foarte puţine specii au fost izolate din rumen, acestea fiind în număr de 7 specii: Methanobacterium formicicum, Methanobacterium

bryantii, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter millerae, Methanobrevibacter olleyae, Methanomicrobium mobile, şi Methanoculleus olentangyi. Deasemenea a fost izolată şi Methanosarcina spp. dar aceste bacterii nu sunt aşa numeroase în comunitatea Archaea.

Studiul microorganismelor metanogene din rumen, dar şi a întregului domeniu Archaea a fost realizat cu ajutorul tehnicilor PCR. Acestea au ajutat la definirea secveţei 16S r Rna de la Archaea iar apoi a urmat clonarea, folosind ca şi gazdă Escherichia coli. O evaluarea a grupurilor dominante de archaea din rumen poate fi realizată prin compararea secvenţelor şi a a genelor 16S r RNA.

2.Clasificarea speciilor metanogene Archaea

Studiile realizate asupra speciilor metanogene din rumen au fost separate în două categorii: studii privind numărul total de specii archaea şi studii privind protozoarele asociate cu archaea. (tabel 1). Pentru studiul comunităţilor archaea s-au realizat nouă studii, incluzând celulele libere, particulele asociate cu celule şi particule asociate cu alte microorganisme din rumen. Aceste 9 studii au fost divizate în 12 seturi de date care conţin 294 de secvenţe combinate folositoare, acestea reprezentând 1.026 de gene 16S r RNA clonate. Cinci alte studii se referă la protozoarele asociate cu archaea şi cuprind 187 de secvenţe care reprezintă 2.717 gene 16S r RNA clonate. Secvenţele de gene 16S r RNA au fost descărcate din baza de date GenBank într-o altă altă bază de date globală întreţinută cu ARB. (!) In plus, au fost incluse ca şi secveneţe de referinţă alte 138 de secvenţe de gene 16S r RNA preluate de la metanogene. Aceste secvenţe de referinţă aveau lungimea de 1.300 de nucleotide. În urma analizelor realizate asupra secvenţelor a rezultat o dendogramă (fig 1) care a permis alinierea finală a tuturor secvenţelor şi a clonelor asociate a microorganismelor archaea din rumen. (tabelul 2)

TABEL 1. Numărul de clone şi de secvenţe din studiu (sinteză)Obiect de studiu şi autor Nr. set de

dateNr. secvenţe Nr.

clone>870pb <800pb

Archaea în rumenShin et al. 1 104 0 104Skillman et al. 1 10 0 10Tajima et al. 1 8 0 23

Whitford et al. 1 41 0 41Wright et al. 3 43 la a 0 405Wright et al. 1 26 0 78Wright et al. 2 28 0 241

Wright et al. 1 14 0 104Yanagita et al. 1 0 20 20Protozoare asociate cu archaeaChagan et al. 1 0 8 91Irbis and Ushida 1 0 14 2.398Ohene-Adjei et al. 1 0 139 139

Regensbogenova et al. 1 11 9 20Tokura et al. 1 0 6 69

a- 26 de secvenţe adiţionale care reprezintă 328 de clone nu au fost incluse

Abundenţa comunităţii archaea în rumen

In urma analizei datelor din bazele de date, majoritatea speciilor archaea (92,3%) prezente în rumen pot fi repartizate în trei grupuri sau genuri. Acestea sunt Methanobrevibacter (61,6%), Methanomicrobium (14,9), şi un grup mare de specii neculturate plasate în clusterul C sau RCC (15,8%). Genul Methanobrevibacter este cel mai numeros din rumen iar secvenţele clonate se împart în două calde majore: o cladă definită de speciile M. gottschalkii, M. thaueri şi M. millerae acestea conţinând cele mai multe clone de Methanobrevibacter. Aceste grupuri formează clada M. gottschalkii. O altă cladă majoră este dată de M. ruminantium şi M. olleyae, conţinând 27,3% din totalul speciilor archaea din rumen. Acestea aparţin cladei M.ruminantium şi au fost găsite aproape în toate seturile de date (tabel2). Alte specii care aparţin genului Methanobrevibacter sunt M. smithii şi M. wolinii, dar aceste specii sunt rare.

Speciile care aparţin altor grupuri de metanogene printre care Methanimicrococcus spp., Methanosphaera spp. şi Methanobacterium spp. au apărut în seturile de date în abundenţă mică. Două grupuri de archaea neculturate, care aparţin grupului Qld26 şi cladei Crenarchaeota au fost deasemenea găsite. Grupul Qld26 conţine secvenţele CSIRO-Qld26 şi Ven-04 ale 16S r RNA şi 9 secveneţe asociate cu particule mari din rumen, detectate de Shin şi colab. Caracteristicile fiziologice ale acestor grupuri nu sunt cunoscute.

Variaţiile în compoziţia secvenţelor la majoritatea cladelor sunt foarte mari. Cele mai multe variaţii apar la M. gottshalkii din cauza erorilor de secvenţiere şi a diversităţii genetice a tulpinilor de Methanobrevibacter spp. Alte variaţii majore apar şi la alte subgrupuri, cum ar fi: Methanomicrobium, Methanosphaera, Qlde 26, Methanomicrococcus şi majoritatea la M. ruminantium. Grupul RCC prezintă variaţii considerabile în tipurile de secvenţe. Diferenţa de 3% a secvenţelor 16S r RNA de la procariote este foarte des folosită ca şi indicator de separare a două tulpini. Dacă diferenţa este mai mică de 3% nu se poate folosi secevenţa genică 16S r RNA pentru a putea determina care tulpini aparţin aceleaşi specii şi care nu. Dighe şi colab. susţin că o diferenţă de 2 % la secvenţa genică 16S r RNA corelată cu similarităţile de 70% a hibridării ADN-ADN de la Methanobrevibacter poate fi folosită pentru a separa secvenţele în două specii. Speciile care aparţin cladei Methanobrevibacter au diferenţe de 3 % la secveneţele genice 16S r RNA iar decizia de a separa mai multe specii s-a bazat pe diferenţele multiple în genom. Totuşi, bazându-se pe diferenţele prezente la rezultatele hibridării ADN-ADN poate exista un număr mai mare de specii care aparţin genului Methanobrevibacter sau chiar un număr mic (aproximativ patru). Analiza detaliată a genomului poate susţine crae interpretare este corectă, deşi sfârţitul analizei depinde foarte mult de definirea speciilor procariote, în special dacă genomul formeză genotipuri. Este mult mai important să se detremine câte grupuri funcţionale fac parte din aceste clade şi care sunt diferenţele biochimice şi ecologice.

TABELUL 2Clada Detectarea în conţinutul

total ruminalDetectarea în protozoarele asociate cu archaea

Mean%

Maxim%

Nr. set de date(n 12)

Mean%

Maxim%

Nr. set de date(n 5)

Methanomicrobium 14,9 85,6 4 20,1 80,0 3Methanimicrococcus 2,4 14,6 3 4,0 20,0 1M. gottschalkii 33,6 81,2 10 42,9 98,6 3M. smithii 0,1 0,8 1 0 ND la

c0

M. ruminantium 27,3 60,0 10 12,5 62,6 1M. wolinii 0,1 1,0 1 2,6 12,8 1AlteMethanobrevibacter

0,5 5,6 1 0,6 2,9 1

Methanosphaera 3,7 26,8 5 1,9 4,0 4Methanobacterium 0,2 2,9 1 0,4 1,1 2RCC 15,8 80,8 5 15,1 74,1 2Qld26 1,3 8,7 3 0 ND 0Crenarchaeota 0,2 2,9 1 0 ND 0

Alte metode de identificare

Probe de ARN au fost utilizate pentru a analiza comunitatea archaea din rumen, folosind hibridarea şi nu extragerea de ARN sau a hibridării fluorescente in situ (FISH). Aceste studii au ca rezultat faptul că membrii familiei Methanobacteriaceae (care include Methanobrevibacter spp., Methanobacterium spp. Şi Methanosphaera spp.) erau membrii dominanţi ai comunităţii archaea din rumen (30-99%). Membrii ordinului Methanomicrobiales sunt cei mai puţini (0-54%) iar membrii ordinului Methanosarcinales apar foarte rar (2-3%). Separarea genelor 16S r RNA în gelul electroforetic amplificate prin PCR confirmă prezenţa în număr mare a speciilor de M. ruminantium, M. gottschalkii şi a grupului RCC în lichidul ruminal preluat de la oi şi vaci furajate pe păşune. Deasemenea s-au descoperit şi membrii ai Methanimicrococcus şi Methanosphaera. Abundenţa speciilor se asemăna cu cea din bazele de date globale. Specii de Methanococcales nu au fost determinate.Tatsuoka şi colab. şi Denman şi colab. au evidenţiat prezenţa genei metil-coenzima M reductaza (mcrA) în rumenul vacilor. Această enzima şi gena ei sunt buni evidenţiatori ai metanogenezei în rumen. În ambele studii, genele mcrA de la Methanobrevibacter spp. au dominat librăriile şi au fost generate cu ajutorul prime-rilor care au ca ţintă secvenţele mcrA. Denman şi colab. au descoperit şi un grup de secvenţe mcrA care aparţineau unui grup nedefinit de archaea care a fost deasemenea descoperit şi de Luton. Nu este cunoscut dacă aceste secvenţe sunt derivate din unul dintre grupurile nedefinite de archaea detectate în librăriile 16S r RNA. În cele două studii relizate nu au fost găsite gene mcrA pentru Methanococcales.

Bacteriile metanogene care au fost găsite în rumen aparţin cladei majore din bazele de date globale, cu excepţia speciilor de Methanosarcina şi a Methanoculleus olentangyi. Izolarea unui microorgansim dintr-un mediu anume indică prezenţa acestuia în acel mediu în timpul recoltării, dar dacă abundenţa acestuia este cuantificată, nu este posibil să se declare semnificaţia numerică pe care microorganismul o are în comunitatea din care a fost preluat. Cu ajutorul secvenţei 16S r RNA se pot detecta populaţiile mari. Se poate considera faptul că Methanosarcina spp. şi Methanoculleus spp. au fost găsite în probele preluate din rumen dar nu par să aibe o semnificaţie numerică pentru comunitatea archaea din rumern.

Structura comunităţii Archaea

Structura comunităţii Archaea variază în funcţie de specie, de dietă sau de metodele de extragere de AND şi de primerii PCR folosiţi. Două studii au fost realizate cu ajutorul aceloraşi metode de extragere AND şi au folosit aceeaşi primeri PCR. Deasemenea au evaluat diversitatea Archaea din rumenul oilor. Comunitatea Archaea din rumenul acestor oi (crescute la Centrul de Cercetare CSIRO Yalanbee din vestul Australiei) era dominată de M. gottschalkii (75,3%) şi de M. ruminantium (19,5%). In contrast, un studiu realizat pe oi din Queensland, Australia a evidenţiat prezenţa cladei RCC (80,8%), a M. gottschalkii (9 %) şi a cladei de Methanomicrobium (7,7 %). Aceste diferenţe mari apărute între comunităţi pot fi din cauza dietei, mediului, sănătăţii animalelor, genotipului şi a vârstei. Alte studii realizate de Shin şi Tajima au evidenţiat dominanţa speciilor de Methanomicrobium (85,6%, respectiv 60,9%) în rumenul unor vaci. Witford, în urma unor studii a realizat că speciile de Methanosphaera (26,8%) şi de Methanomicrococcus (14,6%) erau speciile abundente în rumenul vacilor iar speciile dominante aparţineau de Methanobrevibacter (58,5%). Wright şi colab. au descoperit, în urma unor studii realizate în Canada asupra unor vaci furajate cu loturi, că speciile dominante de archaea aparţin grupurilor Methanobrevibacter (50-51,9%) şi a grupului RCC (37,8-50%).

Wright a realizat un studiu în urma căruia s-a stabilit că dieta animalelor are un efect asupra compoziţiei comunităţii metanogene din rumen. Trei grupuri de oi au fost furajate diferit cu treo diete: păşune, ovăz şi lucernă. A rezultat o variaţie a cladelor de Archaea în aceste trei cohorte. Se cunoaşte faptul că dieta afectează compoziţia bacteriană din rumen, dar se aşteaptă ca bacteriile să intercţioneze mai mult cu furajul din moment ce îl folosesc ca şi substrat de energie. Majoritatea speciilor Archaea din rumen folosesc hidrogenul şi formatul ca şi sursă de energie, acestea fiind formate în timpul primei fermentaţii a furajului de către bacteriile ruminale, fungi şi protozoare. Dieta poate avea un efect major asupra metanogenezei datorită schimbării pH-ului care poate afecta direct activitatea metanogenezei.

Abundenţa speciilor Archaea asociate cu protozoareleBazându-se pe analiza librăriilor de clone, majoritatea protozoarelor asociate cu archaea (93,8%) pot fi amplasate grupurilor dominante, adică genurilor Methanobrevibacter şi Methanomicrobium şi a grupului RCC. (tabel 2)

Rolul în rumenDintre cele 11 clade de Archaea detectate, 9 utilizează hidrogenul în metanogeneză. Acestea aparţin genurilor Methanobrevibacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, Methanospaera şi Methanomicrococcus. Nu este clar cum acestea coexistă în rumen, dar se pare că există diferenţe în abundenţa lor în diferite studii, acest lucru indicând o influenţă dată de specia animalului şi de hrană. Speciile archaea din rumen deasemenea interacţioneză cu protozoare, cu alte bacterii şi cu fungi. Fiziologia speciilor cladei Qld26 şi a grupului C din clada RCC nu este cunoscută. Deoarece clada Qld26 se aseamănă cu speciile de Methanobrevibacter, Methanobacetrium şi Methanosphaera acestea pot fi utilizatoare de hidrogen. Grupul C din clada RCC a fost descoperit şi în tractul digestiv dar şi în alte medii anaerobe. Clada RCC a fost etichetată ca fiind parte din grupul metanogenelor dar sunt foarte puţine dovezi care să evidenţieze acest lucru.

Limitarea activităţii metanogenezei în rumenul animalelor domestice poate avea rezultate pozitive asupra productivităţii animalelor dacă procesul de fermentaţie nu este afectat direct. Aceste strategii de limitare a cantităţii de metan pot fi efectuate numai după cunoaşterea comunităţilor de bacterii, în special a celor metanogene din rumen.

4.Folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg) + Avian (IgY) anti-methanogen antibodies for reducing ruminal methane production: in vitro assessment of their

effects (experimentele lui Cook-am gasit doar abstractul)

Oul de găină este cea mai mare celulă cunoscută care provine ditr-o singură diviziune celulară şi care este compusă din substanţe importante pentru viaţă (nutrienţi, proteine, lipide, carbohidraţi şi alţi compuşi biologici). Când un ou fertilizat este ţinut la o temperatură de 37 de grade Celsius pentru 21 de zile eclozează. Totuşi, acest mediu optim pentru ecloziune este şi un mediu optim pentru creşterea bacteriilor şi a virusurilor (Mujo Kim et al., 2000).

Se cunoaşte foarte bine faptul că albuşul şi gălbenuşul oului au proprietăţi antibacteriale şi antivirale. În cadrul imunologiei, anticorpii pe bază de ou au devenit forate studiaţi. Imunizarea pasivă, orală cu anticorpi pe bază de ou are efecte asupra infecţiilor gastrointestinale.

Anticorpii se referă câteodată la imunoglobuline (Igs) şi sunt găsiţi în fluidele umorale (sânge, salivă, lapte) ale vertebratelor. La oameni sunt cunoscute cinci clase de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) care sunt distincte în structură şi funcţie. Animalele produc anticorpi IgG aproape pentru toţi antigenii (bacterii, virusuri, proteine). Acestă imunitate umorală este un sistem biologic de apărare stabilit în evoluţia animalelor. Păsările prezintă trei tipuri de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM) care sunt transferate de către pasăre la ouăle sale. IgA şi IgM sunt secretate împreună cu alte proteine şi fac parte din albuş iar IgG este transferat prin membrana gălbenuşului în gălbenuş în perioada de maturare. Anticorpii IgG din ou au o iminitate pasivă deoarece anticorpii originari de la găină sunt folosiţi pentru protecţia puilor de unele boli. Anticorpii IgG de la gaină sunt găsiţi în sângele puilor iar anticorpii IgA şi IgM

sunt prezenţi în tracul digestiv (Mujo Kim et al., 2000).gg Yolk Antibody

Anticorpii IgY sunt folosiţi în mai multe câmpuri de cercetare, imunizare şi diagnosticare. Deasemena sunt folosiţi şi în modularea microflorei intestinale sau ruminale pentru a reduce

cantitatea de metan şi a formării acidozei ruminale (Christopher et al., -Keep bacteria under control: Dietary modulation of gut microflora in farm animals by use of hen egg yolk antibodies)

S-au realizat foarte multe studii cu privire la diferenţele structurale dintre anticorpii IgG mamalieni şi cei aviari. Printre aceste diferenţe se numără: greutatea moleculară a IgG aviar (1,8 ori 10 la a 4) este mai mare decât greutatea moleculară a IgG mamalieni (1,5,ori 10 la 4); punctul izoelectric este mai mic la IgG aviar decât cel al IgG-ului; IgG aviar nu se asociază cu complemenţii mamiferi; IgG aviar nu se leagă de proteina A de la Staphylococcus sau cu un factor reumatoid din sânge. Bazându-se pe aceste diferenţe, IgG provenit din galbenuşul de ou se numeşte IgY (Mujo Kim et al., 2000).