CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

Ca rezultat al metabolismului de sinteză, bacteriile cresc prin formarea de noi constituenţi celulari, după care se multiplică. Creşterea şi multiplicarea bacteriană prezintă anumite particularităţi, ca urmare a intensităţii deosebite a metabolismului bacterian şi a reglării lui perfecte. Studiul creşterii şi multiplicării bacteriene este important din punct de vedere teoretic, pentru a explica dinamica, mecanismul şi factorii care influenţează aceste procese, dar şi din punct de vedere practic, pentru utilizarea eficientă a bacteriilor în biotehnologie (pentru obţinerea de biomasă, produşi de fermentaţie, produşi secundari de metabolism). Creşterea bacteriilor Creşterea bacteriilor reprezintă mărirea coordonată a tuturor constituenţilor celulari. Ea este rezultatul sintezei specifice şi echilibrate, pornind de la substanţele nutritive din mediu, a unor compuşi de bază, care sunt ulterior asamblaţi pentru a forma copii fidele ale constituenţilor celulari. Specificitatea creşterii este determinată de intervenţia unor mecanisme de control genetic. Procesul creşterii depinde de natura şi concentraţia substanţelor nutritive din mediu, precum şi de aprovizionarea continuă a celulei cu energia necesară reacţiilor de sinteză. Mărirea masei totale a celulei bacteriene nu reflectă întotdeauna creşterea normală a celulei, deoarece ea poate rezulta prin sinteza şi acumularea de substanţe de rezervă, care nu sunt specifice creşterii sau prin sporirea accentuată a conţinutului în apă.

Creşterea celulei bacteriene se realizează prin adăugarea de constituenţi noi la peretele celular rigid, care are loc în moduri diferite:

- polar; - bipolar; - ecuatorial, în zona septului de diviziune; - intercalar, prin intususcepţiune, în zone specifice de creştere; - prin depunere pe suprafaţa internă a peretelui celular.

Creşterea bacteriilor se realizează prin depunerea de substanţe noi uni-, bi- sau tridimensional. De obicei creşterea bacteriilor cilindrice se face în sensul axului longitudinal, iar celulele sferice cresc în sensul celor trei dimensiuni.

Creşterea bacteriilor nu se face la infinit, ci doar până la un moment critic, în care creşterea este întreruptă şi este urmată de diviziunea celulară. Mecanismul întreruperii procesului de creştere nu este pe deplin cunoscut. Se admite ipoteza că activitatea normală a celulei bacteriene este urmarea unui raport echilibrat între volumul celulei bacteriene (care reflectă masa celulară ce consumă nutrienţii şi produce cataboliţi) şi suprafaţa celulei (aria prin care se realizează schimburile cu mediul extracelular, care constau în absorbţia nutrienţilor şi eliminarea unor produşi de catabolism). În cursul creşterii celulei, acest raport echilibrat se modifică în sensul diminuării suprafeţei (care creşte cu o rată pătratică, în timp ce volumul creşte cu o rată cubică), astfel încât aportul de substanţe nutritive devine insuficient şi inadecvat necesităţilor metabolice ale celulei. Se ajunge astfel la momentul critic, ce declanşează diviziunea celulară, care restabileşte raportul echilibrat între suprafaţa şi volumul celulei bacteriene.

Multiplicarea bacteriilor Multiplicarea bacteriilor se realizează prin patru mecanisme: diviziune directă

(simplă), înmugurire, fragmentare şi prin producerea de spori. 1) Diviziunea directă (izomorfă) Este forma cea mai răspândită şi cea mai bine cunoscută de multiplicare a

bacteriilor. Ea constă în scindarea celulei mamă, ajunsă la punctul critic de creştere, în două celule fiice surori, cel mai adesea identice.

La bacteriile cilindrice şi spiralate diviziunea se face într-un plan transversal, perpendicular pe axul longitudinal al celulei, şi numai excepţional, la unii spirili, se realizează după un plan longitudinal. Cocii se divid după unul, două sau trei planuri, perpendiculare unul pe celălalt, făcând posibilă gruparea celulelor în diplococi, tetradă, sarcină.

În general, diviziunea evoluează în trei etape distincte: - formarea unei membrane ce separă protoplaştii ce vor forma celulele fiice; - sinteza peretelui celular pe suprafaţa membranei respective sau formarea unui sept

transversal prin creşterea spre interior a peretelui celular periferic; - separarea celulelor rezultate în urma diviziunii.

Exceptând situaţiile anormale, (care se finalizează cu formarea unor minicelule sferice, lipsite de ADN, ca urmare a localizării anormale a situsului de diviziune), bacteriile fără nucleu apar extrem de rar. Acest fapt sugerează existenţa unei legături obligatorii între replicarea ADN-ului şi diviziunea celulei, precum şi existenţa unui mecanism de control, care permite ca diviziunea să aibă loc doar atunci când în celula mamă există doi nuclei noi, care vor fi separaţi în cele două celule fiice.

În procesul de diviziune celulară are loc întâi replicarea ADN-ului, apoi formarea septului de diviziune. Această corelaţie a fost studiată la Escherichia coli, la care timpul de apariţie a unei noi generaţii este de 45 minute.

- timpul 0 – informaţia genetică este reprezentată de un singur cromozom bacterian; - timpul 18 min. – ADN-ul cromozomal este parţial replicat; - timpul 20 min. – începe migrarea celor doi cromozomi obţinuţi prin replicare

către extremităţile celulei; - timpul 25 min. – segregarea informaţiei genetice a avut deja loc, cresc membrana

plasmatică şi peretele celular în spaţiul dintre cele două molecule de ADN; - timpul 30 min. – începe formarea septului transversal de diviziune; - 35 – 38 min. – cele două celule fiice, fiecare cu câte un nucleosom propriu, sunt

în situaţia de a se separa; - timpul 45 min. – are loc separarea celor două celule fiice nou formate.

Cercetările ulterioare ale corelaţiei dintre replicarea ADN-ului bacterian şi ritmul de diviziune au scos în evidenţă particularităţi ale acestui fenomen. Acestea se referă la acumularea unei proteine iniţiator, capabilă să declanşeze ciclul de replicare a cromozomului, într-un ritm care depinde de condiţiile de mediu, dar şi la faptul că în general timpul de replicare a cromozomului este fix, la Escherichia coli durând 20 minute.

Dinamica procesului de multiplicare bacteriană în culturi Culturile bacteriene sunt de două tipuri: continue şi discontinue. Culturile continue sunt cele în care mediul de cultură este reînnoit permanent cu

o anumită rată, o parte din masa bacteriană formată fiind îndepărtată în acelaşi timp din cultură, cu aceeaşi rată. Aceste culturi se realizează în aparate speciale şi asigură o concentraţe constantă de celule în cultură (după principiul turbidostatului) şi o concentraţie constantă a substanţelor chimice din mediu (după principiul chemostatului).

Culturile discontinue sunt cele obţinute într-un mediu de cultură neînnoit, în vase închise. Se pot realiza în două variante: culturi asincrone şi culturi sincrone. Culturile sincrone sunt cele în care majoritatea bacteriilor se multiplică în acelaşi timp. Culturile asincrone sunt cele în care bacteriile se multiplică în momente diferite.

Culturile obţinute în laborator în mod curent sunt culturi discontinue asincrone. Acestea prezintă următoarele particularităţi:

� mediul de cultură nu este reînnoit pe timpul cultivării, fiind într-un volum fix pe întreaga durată a obţinerii culturii;

� compoziţia chimică a mediului se schimbă pe parcursul formării culturii (substanţele nutritive sunt consumate, se acumulează produşi de catabolism, se modifică pH-ul, );

� numărul de celule viabile este variabil, la început crescând progresiv, ulterior scăzând datorită îmbătrânirii şi morţii celulelor;

� ritmul de diviziune este inegal, la început, când populaţia bacteriană este tânără şi condiţiile de mediu sunt optime, fiind mai mare, ulterior scăzând;

� vârsta celulelor bacteriene este diferită; � numărul de generaţii este limitat, datorită condiţiilor de mediu fixe. Procesul multiplicării bacteriilor în culturi discontinue asincrone evoluează în

câteva faze succesive:

- faza de lag (de latenţă, de creştere bacteriană 0) este cuprinsă între momentul iniţierii culturii şi începerea multiplicării bacteriene; numele ei vine de la to lag (engl.) = a întârzia; numărul celulelor bacteriene din inoculul iniţial rămâne relativ neschimbat; deşi considerată fază de latenţă, este în realitate o fază activă, în care celulele se pregătesc pentru multiplicarea ce va urma (îşi refac structurile şi sistemele enzimatice necesare, cresc în dimensiuni, prezintă un metabolism intens). Această fază are o durată diferită în funcţie de vârsta inoculului folosit: dacă inoculul provine dintr-o cultură tânără, faza de latenţă este scurtă; dacă inoculul provine dintr-o cultură mai veche sau aflată în condiţii de mediu total diferite de mediul cel nou, faza de latenţă este de mai lungă durată, celulele fiind într-o fază activă de adaptare la noile condiţii de cultivare.

- faza de accelerare constă în iniţierea multiplicării bacteriene într-un ritm progresiv, care determină şi numele fazei;

- faza de creştere logaritmică (exponenţială) este faza în care multiplicarea se realizează cu un ritm constant şi maxim, populaţia bacteriană practic dublându-se la fiecare diviziune; celulele au o mărime uniformă, mai mare decât a celulelor normale, caracteristice speciei, cu citoplasmă omogenă, bogată în ARN, cu sinteze proteice intense, fără materiale de rezervă. Acest stadiu corespunde celulelor bacteriene tinere, potrivite pentru cercetarea de laborator;

- faza de încetinire este aceea în care ritmul de multiplicare este încetinit, datorită condiţiilor de mediu. Unul dintre factorii nutritivi esenţiali din mediul de cultură devine limitant, fiind epuizat treptat şi devenind insuficient;

- faza staţionară a creşterii este caracterizată printr-un număr de celule viabile maxim şi constant pentru o perioadă de timp care depinde de specia bacteriană; se consideră că în timp ce unele celule bacteriene mor, dispariţia lor este compensată de multiplicarea lentă a altor celule, astfel încât, în ansamblu, numărul de celule viabile este acelaşi. Această fază corespunde celulelor bacteriene mature, cu morfologie considerată normală, tipică unei specii date; celulele din această fază se folosesc pentru coloraţii. Spre sfârşitul fazei staţionare încep să apară primele incluzii bacteriene, vacuole şi chiar spori;

- faza de început al declinului este aceea în care numărul celulelor viabile începe să scadă ca rezultat al morţii unora dintre celule; ulterior scade şi densitatea celulară, deoarece intervin procese de autoliză, produse de enzime proteolitice endogene;

- faza de declin şi moarte celulară este faza în care se intensifică reducerea numărului de celule viabile şi fenomenele de autoliză bacteriană; este foarte variabilă ca durată, de la 24 – 48 ore până la săptămâni şi chiar luni de zile; celulele bacteriene au o morfologie alterată, apar forme filamentoase, spiralate, ramificate, necaracteristice speciei; celulele au afinitate pentru coloranţii acizi, conţin substanţe de rezervă, se întâlnesc mulţi spori.

Viteza de multiplicare a celulelor bacteriene se măsoară prin durata unei generaţii şi se numeşte timp de generaţie. El este intervalul de timp scurs între două diviziuni succesive. În general, acest timp este mai mic la bacterii decât la macroorganisme, existând bacterii care se multiplică foarte rapid (Bacillus subtilis – 9-10 minute), altele mai puţin rapid (Lactobacillus – 100 minute), iar altele foarte lent (Mycobacterium

tuberculosis – 1600 minute).

Deşi au un potenţial imens de multiplicare, bacteriile nu şi-l realizează în practică,

întrucât intervin factori de mediu nefavorabili, ce limitează acumularea unui număr imens de celule bacteriene. De exemplu, în condiţii aerobe obişnuite de cultură în laborator, numărul maxim de celule care se acumulează este de 200 milioane de celule/ml mediu. În condiţii de agitare, care favorizează aerarea şi contactul celulelor cu nutrienţii, se paote atinge un număr de 5 miliarde celule/ml.

Un coc cu o greutate de 5x10-13 g, cu un timp de generaţie de 20 minute, poate determina după 132 de diviziuni formarea unei mase celulare cu greutatea de 6x1027g.

2) Multiplicarea prin înmugurire

Înmugurirea reprezintă o modalitate particulară de reproducere, care constă în separarea a două celule asimetrice, ca rezultat al formării de către celula mamă a unei protuberanţe locale mai mici decât ea. Aceasta creează un spaţiu nou, în care vor migra constituenţii noii celule sau în care constituenţii vor fi sintetizaţi de novo (din nou). Bacteriile care înmuguresc prezintă o mare diversitate taxonomică şi sunt mai puţin cunoscute. Ele pot fi fototrofe sau chemotrofe; cele mai studiate aparţin genurilor de bacterii prostecate: Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas etc., dar aparţin şi genurilor de bacterii care nu sunt prostecate: Nitrobacter, Pasteuria etc. Formarea unei celule noi de către o bacterie poate fi cu adevărat un proces de înmugurire dacă se îndeplinesc 3 criterii fundamentale:

1) criteriul morfologic: celula nouă trebuie să fie mult mai mică decât celula mamă şi să rămână temporar ca atare (mică) şi după separare; spre deosebire de diviziunea directă binară în care celula mamă se divide în două celule fiice identice şi celula mamă dispare, în înmugurire celula mamă formează o celulă fiică mai mică şi fiecare îşi păstrează identitatea de-a lungul generaţiei; în multe cazuri, mugurele poate fi deosebit morfologic de celula mamă, de exemplu, la genul Pasteuria, mugurele este mobil, în timp ce celula mamă e imobilă.

2) criteriul de dezvoltare: înmugurirea reprezintă un caz particular de creştere a peretelui celulei parentale prin slăbirea lui localizată, urmată de o creştere numai într-o zonă foarte limitată, spre deosebire de diviziunea directă binară, care e precedată de o creştere a peretelui şi a membranei celulare ce duce la mărirea lungimii şi a diametrului celulei; în cazul înmuguririi, învelişurile celulare sunt integral sintetizate de novo, astfel că nici un constituent parental din peretele celular nu e încorporat în mugure.

Diferenţa dintre diviziunea directă (a) şi înmugurire (b):

celula mamă celule fiice a) → → → →→ Materialul peretelui celular e distribuit egal celor două celule fiice. b) → → 3) criteriul funcţional: mugurele trebuie să reprezinte singurul mod de formare a unei

celule noi la specia respectivă. Apariţia mugurilor poate fi localizată unipolar sau bipolar.

În înmugurire, celula mamă reţine integral subunităţile peretelui celular original, iar mugurele e acoperit cu material nou sintetizat. Simetria e menţinută în raport cu axul longitudinal, nu însă şi cu axul transversal. Iniţial mugurii sunt foarte mici, sferici, apoi cresc în diametru ca urmare a creşterii peretelui celular până ajung la dimensiunea celulei mamă. În acest proces şi celula mamă şi celula fiică îmbătrânesc progresiv.

3) Multiplicarea prin fragmentare

E o formă de reproducere vegetativă, observată la multe actinomicete, cum sunt cele din genul Nocardia, Actinomyces. În prima parte a ciclului celular are loc o creştere activă a masei celulare, sub forma unui miceliu, fără creşterea numărului de celule viabile. Ulterior, în faza staţionară a creşterii, în care masa celulară rămâne constantă, miceliul e supus unei fragmentări multiple, cu formarea unor septuri transversale, obţinându-se structuri cilindrice. Primul sept transversal apare aproape de mijlocul hifei şi progresează secvenţial de-a lungul filamentului spre extremităţi. Urmează apoi eliberarea unor celule cilindrice, scurte, egale, cu extremităţile tăiate drept şi care vor începe să crească şi să dea naştere unui miceliu.

Deşi procesele de formare a septurilor transversale şi de segregare a genomului sunt destul de bine coordonate, spre sfârşitul fazei de fragmentare apar unele fragmente lipsite de nucleosom, neviabile, datorită formării premature a septurilor, înainte de segregarea materialului genetic.

4) Multiplicarea prin spori Actinomicetele care au un miceliu nesegmentat se reproduc de obicei prin formare de exospori (spori de dispersare, de propagare). Fenomenul a fost mai bine studiat la Streptomyces coelicolor. Sporii sunt de tip asexuat, dispuşi de regulă pe hifele aeriene, în lanţuri de diferite lungimi, sau în vezicule sporale numite sporangi. Unele hife prezintă o teacă externă fibroasă, care le înveleşte începând cu extremitatea liberă, pe toată lungimea lor. Învelişul celular este format din peretele hifei, acoperit de teaca

fibroasă. În anumite puncte ale peretelui hifei începe formarea septumului sporal prin depunerea în hifa aeriană a unui disc inelar cu grosime dublă. Prin creşterea acestui disc paralel cu peretele hifei începe formarea peretelui viitorului spor. Sporii se rotunjesc, se separă, se maturează, vezicula sporală se rupe şi eliberează sporii formaţi.

PARTICULARITĂŢI ALE METABOLISMULUI BACTERIAN

Metabolismul reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice prin intermediul cărora microorganismele preiau din mediu energie şi nutrienţi, pe care îi folosesc în activităţile lor fundamentale. Aceşti nutrienţi reprezintă elemente esenţiale pentru viaţa celulei şi se numesc elemente biogene. Substanţele pot fi folosite ca atare sau sub o formă mai mult sau mai puţin complexă. Caracteristic pentru metabolismul bacterian este reglarea lui perfectă, supusă legii economiei şi optimalităţii. Aceste principii asigură desfăşurarea perfect reglată, corelată a activităţii celulare, astfel încât beneficiul pentru celula bacteriană să fie maxim. Substanţele din mediu sunt folosite în 4 scopuri fundamentale:

- producerea de energie; - sinteza de constituenţi celulari; - creşterea celulei şi desfăşurarea normală a activităţilor ei fiziologice; - producerea de metaboliţi, unii dintre ei utili pentru om. Metabolismul bacterian se realizează printr-o serie de căi metabolice, reprezentate

de secvenţe de reacţii chimice catalizate de enzime. Sunt două direcţii fundamentale de evoluţie a acestor căi: • degradarea substanţelor nutritive preluate din mediu, cu eliberare treptată de energie

(deoarece o eliberare bruscă de energie este dăunătoare celulei bacteriene, ducând la distrugerea ei);

• folosirea energiei eliberate în procesele de biosinteză a constituenţilor celulari (cale diametral opusă celei dintâi); excesul de energie se acumulează în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP, ce reprezintă “acumulatorul universal de energie”.

Se cunosc 4 tipuri de căi metabolice: căile catabolice (catabolismul), căile anabolice (anabolismul), căile amfibolice şi căile anaplerotice. a) Căile catabolice reprezintă ansamblul căilor biochimice prin care se realizează

degradarea nutrienţilor preluaţi din mediu, cu eliberare de energie. Reacţiile catabolice se desfăşoară în trei faze succesive: 1) macromoleculele nutrienţilor sunt degradate până la subunităţile lor de construcţie

(ex. proteinele până la aminoacizi), cu eliberarea aproximativ a 1% din energia nutrienţilor, care se pierde sub formă de căldură;

2) moleculele rezultate în prima fază sunt degradate în continuare, cu formarea unui număr limitat de molecule mai mici, ce reprezintă compuşi intermediari ai căii centrale; numărul acestor compuşi intermediari este diferit în funcţie de bacterie, putând ajunge la maxim 12; în această etapă se eliberează aproximativ 1/3 din energia existentă în compuşii respectivi;

3) cea de a treia fază este diferită în funcţie de natura reacţiilor metabolice; în aerobioză reacţiile evoluează cu metabolizarea completă a compuşilor intermediari până la CO2 şi H2O, cu eliberare masivă de energie, care este apoi înmagazinată în ATP; în anaerobioză reacţiile evoluează după modelul reacţiilor fermentative, caz în care eliberarea de energie este redusă.

b) Căile anabolice se desfăşoară în sensul utilizării compuşilor intermediari ai căii centrale în vederea sintezei de constituenţi proprii celulei bacteriene, proces care evoluează în faze succesive. În cursul proceselor de anabolism se sintetizează macromolecule de depozit, adică polimeri uniformi, formaţi prin legarea unor monomeri în lanţuri de diferite dimensiuni (într-o primă fază monomeri, într-o a doua fază, numită diataxie, subunităţile constituite în prima fază fiind aşezate într-o ordine riguroasă, dictată exact de informaţia genetică din genom).

c) Căile amfibolice sunt reprezentate de căile metabolice centrale, care îndeplinesc în acelaşi timp două funcţii: de eliberare de energie şi de furnizare a unor precursori necesari biosintezei. Căile catabolice şi cele anabolice se desfăşoară simultan în celula bacteriană. Caracterul amfibolic este reprezentat de faptul că la anumite nivele energia eliberată este utilizată la biosinteze, iar la alte nivele intermediare se menţine calea catabolică ce duce la degradarea compuşilor intermediari.

d) Căile anaplerotice sunt cunoscute sub denumirea de căi auxiliare sau de reaprovizionare, deoarece compuşii intermediari ai căilor centrale sunt în permanenţă îndepărtaţi din celulă, pe de o parte în cursul degradării progresive enzimatice, cu eliberare de energie, în catabolism, iar pe de altă parte prin utilizarea lor în diferite biosinteze ce au loc în celulă. Pentru buna funcţionare a acestor căi metabolice este necesară o reaprovizionare permanentă cu intermediarii respectivi. În urma epuizării materialului de la care s-a pornit, calea metabolică este frecvent reaprovizionată cu diferite substanţe provenite din alte căi metabolice, catalizate enzimatic, ce se desfăşoară simultan în celula bacteriană. Căile metabolice auxiliare asigură astfel completarea deficitului căilor metabolice principale, prin aprovizionarea cu diverşi compuşi şi permit funcţionarea îndelungată a acestora.

Particularităţi ale metabolismului bacterian Dacă iniţial se considera greşit că bacteriile, având o structură simplă, au doar un

metabolism rudimentar, cercetările moderne au demonstrat caracterul remarcabil de asemănător al căilor centrale ale metabolismului la toate formele de viaţă. Microorganismele îşi realizează activităţile metabolice prin mecanisme similare cu cele implicate în metabolismul organismelor superioare.

Natura şi diversitatea nutrienţilor folosiţi în metabolismul bacterian Microorganismele prezintă o capacitate unică de degradare a unor substanţe

complexe din mediu şi de a sintetiza anumiţi metaboliţi, unii folositori omului. Luate ca grup, bacteriile sunt cele mai omnivore organisme din natură. Îşi pot

realiza metabolismul folosind numeroase şi diverse surse de substanţe nutritive, începând cu azotul molecular şi sulful, până la cele mai complexe substanţe organice (se pot dezvolta pe diferite soluţii de acizi: oxalic, formic, sulfuric, pe substraturi cu fenoli, proteine, ţiţei; pot degrada asfaltul, masele plastice, cauciucul, lemnul, parafinele, chiar şi unele substanţe antibiotice). Aceste particularităţi explică faptul că, deşi în natură au fost depuse numeroase produse de uzură şi de excreţie, cadavre, reziduuri, acestea nu s-au acumulat, pentru că au fost descompuse de către microorganisme şi reintroduse în circuitul elementelor biogene. În acelaşi timp, există unele microorganisme care pot utiliza doar un număr limitat de nutrienţi (microorganismele celulozolitice au nevoie absolută de prezenţa celulozei în mediul nutritiv; nitratbacteriile au nevoie de nitriţi în mediu, iar unele bacterii patogene au nevoie de sânge în mediul de cultură).

Plasticitatea metabolismului microorganismelor Bacteriile au capacitatea de a folosi alternativ diferite surse de azot şi de carbon,

în funcţie de condiţiile de mediu. Se adaptează, deci, la tipul şi cantitatea de nutrienţi existenţi în mediu. S-a demonstrat că multe bacterii considerate ca autotrofe (capabile să folosească substanţele anorganice din mediu) pot utiliza uneori substanţele organice cu complexitate diferită din mediu. Unele microorganisme heterotrofe (organotrofe) au capacitatea de a se adapta la utilizarea compuşilor anorganici din mediu, atunci când substanţele organice lipsesc.

Diversitatea mecanismelor enzimatice şi a produşilor de metabolism Diversitatea căilor metabolice se manifestă în metabolismul bacterian prin

existenţa unor căi alternative care pot fi folosite pentru un anumit compus. În funcţie de condiţiile de mediu şi cele intracelulare, celula bacteriană poate opta pentru una dintre căile prin care un anumit substrat poate fi degradat (de exemplu glucoza poate fi degradată prin trei căi metabolice diferite).

Intensitatea deosebită a metabolismului bacterian Metabolismul bacterian se caracterizează printr-o intensitate excepţională în

raport cu activităţile omoloage de la organismele superioare. Astfel, activitatea respiratorie a unui gram de bacterii aerobe (greutate uscată) este de câteva sute de ori mai intensă decât cea a omului. Potenţialul metabolic al microorganismelor din cei 25 cm superficiali ai solului de pe o suprafaţă de un hectar este echivalent cu acela pentru câteva zeci de mii de oameni. Un gram de bacterii lactice hidrolizează circa 15000 g lactoză/oră. Pentru a atinge un asemenea nivel de activitate metabolică, organismul uman ar avea nevoie de mai multe mii de tone de alimente pe oră.

Metabolismul bacterian deosebit de intens este corelat cu o multiplicare rapidă a microorganismelor, cu producerea unei mari cantităţi de biomasă. În acest sens, un exemplu dat de UNESCO se referă la această capacitate extraordinară de sinteză a bacteriilor: - la bovine un organism de 500 kg fabrică în condiţii normale în 24 ore aproximativ 1/2

kg de proteine; - în condiţii de mediu favorabile, 500 kg de masă bacteriană sintetizează în 24 ore 5–50

tone de proteine. Aceste date sunt numai teoretice, pentru că în diferite condiţii concrete de mediu

se împiedică realizarea acestui uriaş potenţial de replicare. Metabolismul bacterian deosebit de intens, unic în lumea vie, este urmarea faptului că celula bacteriană prezintă o suprafaţă foarte mare raportată la volumul şi greutatea ei, favorizând schimbul intens de substanţe între celule şi mediu.

După Luria şi Stanier, ar exista o regulă conform căreia în natură viteza metabolismului ar fi invers proporţională cu mărimea organismului.

Transportul substanţelor prin membrana celulei bacteriene

Membrana plasmatică reprezintă o barieră care asigură transportul selectiv al substanţelor de la exteriorul la interiorul celulei bacteriene şi invers. Este denumită şi “barieră osmotică de permeabilitate”. Principalele mecanisme de transport prin membrana plasmatică bacteriană sunt:

1) difuzia pasivă este un tip de transport nespecific, reprezintă o trecere lentă a substanţelor de la exteriorul la interiorul celulei bacteriene şi invers, fără consum de energie. Trecerea este determinată de concentraţie, se realizează de la o concentraţie mare la o concentraţie mică; difuzia se opreşte când concentraţia se egalizează. Prin difuzie pasivă sunt transportate: apa, O2, CO2, acizii graşi, substanţele liposolubile.

2) mecanisme de transport cu participarea unui transportor specific (carrier) – transportorul specific este situat în membrana plasmatică şi este o proteină cu greutate moleculară între 30000 – 50000 daltoni, cu rolul de a fixa o anumită substanţă şi de a o transporta, traversând membrana plasmatică. Sunt 3 tipuri de astfel de mecanisme: a) difuzia facilitată se desfăşoară fără consum de energie şi este determinată de

gradientul de concentraţie, dar se realizează cu ajutorul unei proteine transportor (carrier). Trecerea se realizează de la o concentraţie mare la o concentraţie mică, până se produce un echilibru al concentraţiilor de o parte şi de cealaltă a membranei. Proteina transportor are rolul de a mări viteza de difuzie a substanţei în raport cu difuzia pasivă.

b) transportul activ este un proces specific, care se realizează cu consum de energie. Se poate realiza împotriva gradientului de concentraţie, de la o concentraţie mică la o concentraţie mare. Astfel se produce o acumulare de substanţă în celula bacteriană, care poate depăşi de câteva mii de ori cantitatea din mediul extern. Proteina transportor prezintă un situs de legare specific pentru substanţele respective.

c) translocarea în grup se realizează cu consum de energie şi cu participarea sistemului enzimatic fosfo-transferazic; substanţa transportată suferă o modificare chimică la trecerea prin membrană, astfel că substanţa din interiorul celulei diferă de cea iniţială ce exista în mediu; prin acest mecanism se pot transporta: adenina, hexozele (glucoză, fructoză).

Tipuri de respiraţie microbiană După comportarea faţă de oxigenul atmosferic, se pot descrie 4 tipuri de microorganisme: • microorganisme strict aerobe, care au ca tip de respiraţie celulară respiraţia aerobă;

pentru a se dezvolta, aceste microorganisme au nevoie de oxigen molecular, folosindu-l ca acceptor final de electroni;

Ex.: Bacillus subtilis, Azotobacter sp., Mycobacterium tuberculosis, microalgele, majoritatea protozoarelor

• microorganisme strict anaerobe, care nu se pot dezvolta în prezenţa oxigenului; ele au nevoie de condiţii de anaerobioză şi ca tip de respiraţie celulară au fermentaţia sau respiraţia anaerobă; Ex.: Clostridium tetani, Lactobacillus sp., Desulfovibrio sp.

• microorganisme anaerobe, facultativ aerobe, care au în general un metabolism de tip anaerob, dar pot trăi şi în prezenţa oxigenului molecular, caz în care prezintă un metabolism aerob; tipul de respiraţie celulară este diferit, în funcţie de prezenţa sau absenţa oxigenului (respiraţie anaerobă sau aerobă);

Ex.: Escherichia coli, Streptoccoccus sp., Staphylococcus sp., Saccharomyces

cerevisiae

• microorganisme microaerofile, care au nevoie de o cantitate de oxigen mai mică decât în atmosferă pentru a se dezvolta, concentraţiile mari de oxigen fiind nocive pentru ele; tipul de respiraţie celulară este o respiraţie cu tendinţă spre fermentaţie. Ex.: Leptospira sp., Spirochaeta sp., Thiospirillum sp.

Tipuri de nutriţie la microorganisme

Criteriile după care se poate caracteriza nutriţia microorganismelor sunt: � natura sursei de carbon şi azot şi capacitatea de sinteză a metaboliţilor esenţiali, în

funcţie de care microorganismele pot avea nutriţie: * autotrofă * heterotrofă

� sursa de energie, în funcţie de care microorganismele pot avea nutriţie: * fototrofă * chemotrofă. Autotrofia este capacitatea de sinteză a tuturor metaboliţilor esenţiali pornind de

la substanţe anorganice simple ca sursă de carbon şi azot (CO2, NH3, NO3-, NO2

-). Heterotrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţi esenţiali pornind de la

substanţe organice preformate. Bacteriile heterotrofe se pot dezvolta doar în prezenţa unor substanţe organice, care joacă rol de sursă de carbon şi azot.

Fototrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţii esenţiali cu ajutorul energiei luminoase; este caracteristică microorganismelor fotosintetizante (fototrofe), capabile de fotosinteză. După natura donatorilor de protoni sau electroni, microorganismele fototrofe se împart în:

- microorganisme fotolitotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe anorganice oxidabile (H2O, H2S, S, H2); se numesc şi fotoautotrofe;

- microorganisme fotoorganotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe organice oxidabile; se numesc şi fotoheterotrofe;

Chemotrofia este capacitatea de a sintetiza metaboliţii esenţiali cu ajutorul energiei chimice înmagazinată în legăturile chimice ale substanţelor. Sursa de energie este reprezentată în acest caz de energia chimică eliberată din reacţiile de oxido-reducere. Microorganismele chemotrofe se numesc şi chemosintetizante, sunt capabile de chemosinteză. După natura donatorilor de protoni sau electroni, microorganismele chemotrofe se împart în:

- microorganisme chemolitotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe anorganice oxidabile; se numesc şi chemoautotrofe;

- microorganisme chemoorganotrofe – care folosesc ca donor de protoni sau electroni substanţe organice oxidabile; se numesc şi chemoheterotrofe.

Pe baza acestor clasificări, nutriţia microorganismelor poate fi:

Nr. cr.

Tip de nutriţie Sursă de energie

Sursă de carbon şi

azot

Donator de protoni sau electroni

Exemple

1 Fotolito- autotrofă

Radiaţia luminoasă

Subst. anorg. (CO2,NH3)

Substanţe anorganice (H2O,H2S,S,H2)

Cianobacterii Bacterii sulfuroase roşii şi verzi

2 Fotoorgano- heterotrofă

Radiaţia luminoasă

Substanţe organice

Substanţe organice

Bacterii sulfuroase roşii

3 Chemolito- autotrofă

Oxidarea substanţelor anorganice

Subst. anorg. (CO2,NH3)

Substanţe anorganice (NH3,H2S,S,H2)

Bacterii nitrificatoare Bacterii sulfoxidante Hidrogenbacterii

4 Chemoorgano- heterotrofă

Oxidarea substanţelor organice

Substanţe organice

Substanţe organice

Majoritatea microorganismelor (bacterii, drojdii, mucegaiuri, protozoare)

ACŢIUNEA FACTORILOR FIZICI, CHIMICI ŞI BIOLOGICI ASUPRA BACTERIILOR

Factorii fizici şi chimici din mediu influenţează în mod semnificativ bacteriile, a

căror activitate biologică este maximă atunci când condiţiile de mediu sunt optime. Efectele factorilor fizici şi chimici pot fi de stimulare sau de inhibare a activităţii bacteriene, în funcţie de intensitatea şi durata acţiunii lor.

ACŢIUNEA FACTORILOR FIZICI

Este deosebit de importantă cunoaşterea acţiunii diferiţilor factori fizici asupra bacteriilor, deoarece aceasta stă la baza utilizării metodelor de sterilizare.

1. Temperatura influenţează în mod decisiv viaţa bacteriilor, deoarece reacţiile enzimatice din celule se desfăşoară optim la anumite temperaturi.

Temperatura de dezvoltare a bacteriilor (în general între -5 şi 80ºC) este cuprinsă între o temperatură minimă şi una maximă, cu un optim mai apropiat de temperatura maximă decât de cea minimă. La microorganismele stenoterme domeniul temperaturii de dezvoltare este mai restrâns, iar la cele euriterme este mai mare. Bacteriile pot fi încadrate, în funcţie de preferinţele lor pentru temperatură (care sunt rezultatul adaptării la mediu), în trei categorii: criofile sau psihrofile (preferă temperaturile scăzute), mezofile (se dezvoltă la temperaturi de 10 - 45ºC) şi termofile

(a căror temperatură maximă de creştere ar fi de 110 - 150ºC). La temperatura minimă de dezvoltare rata metabolismului este foarte scăzută,

încetând practic transportul substanţelor dizolvate prin membrane. La temperatura optimă dezvoltarea populaţiilor de microorganisme are loc cu o rată maximă, pentru fiecare activitate fiziologică a celulei existând însă un alt optim de temperatură. La temperatura maximă de dezvoltare multiplicarea bacteriilor încă mai este posibilă, dar încetează la temperaturi superioare acesteia.

Metodele de sterilizare prin căldură duc la coagularea şi denaturarea proteinelor celulare bacteriene şi a lipidelor membranare, la inactivarea enzimelor şi chiar la carbonizarea materialului celular bacterian; ele utilizează:

- căldura umedă, la temperaturi: - sub 100ºC - pasteurizarea joasă şi înaltă, tindalizarea, - la 100ºC – fierberea, - peste 100ºC – autoclavarea, - căldura uscată utilizează temperaturi mai înalte decât cea umedă, deoarece

puterea de penetrare a materialului biologic este mai scăzută: - încălzirea la roşu - flambarea - incinerarea - sterilizarea cu aer cald la etuvă. Tratamentul termic nu are efect cumulativ asupra celulelor bacteriene. Mediul în

care acestea se găsesc influenţează rezistenţa la căldură: moartea bacteriilor survine mai rapid la pH acid, dar soluţiile concentrate de glucide, proteine, lipide şi mediul uscat măresc rezistenţa bacteriilor la temperatură. Sporii bacterieni sunt mult mai rezistenţi la căldură decât celulele vegetative, datorită particularităţilor chimice (concentraţii mari de ioni de Ca2+ şi apă legată, acid dipicolinic) şi structurale.

Sensibilitatea microorganismelor faţă de acţiunea nocivă a temperaturilor înalte se poate aprecia prin determinarea punctului termic letal (temperatura la care sunt distruse toate celulele dintr-o suspensie în 10 minute) şi a timpului termic letal (durata de expunere la o temperatură dată, necesară pentru a omorî toate celulele unei suspensii bacteriene).

Temperaturile scăzute au în general efect bacteriostatic, reacţiile chimice încetinesc şi multiplicarea este stopată. Congelarea lentă la temperaturi mai mari de -21,3ºC are efecte bactericide, deoarece se formează intracelular cristale de gheaţă şi proteinele se denaturează. Congelarea bruscă la -70ºC conservă bacteriile prin solidificarea apei fără formare de cristale. Liofilizarea (criodesicarea) este o metodă de congelare bruscă însoţită de deshidratare în vid. Dacă o suspensie bacteriană este conservată astfel într-un mediu protector, poate fi păstrată multă vreme în fiole închise.

2. Presiunea osmotică din celulele bacteriene, datorită substanţelor dizolvate reţinute în interior de membrana cu permeabilitate selectivă, este mai mare comparativ cu mediul extracelular. Bacteriile suportă relativ bine variaţiile de la mediul izotonic, dacă acestea intervin lent, deoarece se adaptează la stresul osmotic prin mecanisme active (de exemplu, în mediu hipertonic în citoplasmă se acumulează substanţe osmoprotectoare, compatibile cu metabolismul celular chiar la concentraţii mari). În caz contrar, efectul poate fi letal, bacteriile suferind o plasmoliză în mediu hiperton şi o plasmoptiză în mediu hipoton.

Bacteriile care preferă o presiune osmotică extracelulară mai mare decât cea intracelulară sunt numite zaharofile (se dezvoltă pe medii bogate în zaharuri) sau halofile (se dezvoltă pe medii bogate în săruri, facultativ sau obligat).

3. Presiunea hidrostatică este diferită în mări şi oceane, în funcţie de adâncime. Microorganismele care cresc la presiuni hidrostatice mari sunt barotolerante şi barofile. Unele dintre ele sunt stenobare, altele euribare.

4. Radiaţiile electromagnetice sunt fenomene ondulatorii şi fascicule discontinue de energie; ele includ: - radiaţiile hertziene (undele radio)

- radiaţiile infraroşii

- radiaţiile spectrului vizibil - radiaţiile ultraviolete

- radiaţiile X

- radiaţiile gamma.

Radiaţiile cu lungime de undă mai mare de 12000Å nu produc modificări substanţelor de care sunt absorbite. Cele cu lungime de undă între 2000 şi 12000Å produc modificări fotochimice moleculelor de care sunt absorbite. Radiaţiile cu lungime de undă sub 2000Å (X, gamma, cosmice) determină ionizarea moleculelor pe care le întâlnesc. Iradierea poate avea asupra celulelor efect letal sau mutagen.

Radiaţiile luminoase acţionează asupra celulelor prin reacţii fotochimice cu componentele celulare (procesul de fotosinteză şi cel de fototaxie). Lumina solară este bactericidă (datorită ultravioletelor şi încălzirii celulelor), dar lumina vizibilă determină şi efecte specifice.

Fotosensibilizarea este fenomenul de amplificare a efectului biologic al radiaţiilor

luminoase, ca urmare a prezenţei în mediul extracelular a unor substanţe care se activează la lumină (de exemplu colorantul fluorescent albastru de metilen, în prezenţa căruia lumina vizibilă puternică denaturează proteinele, omorând bacteriile şi inactivând virusurile).

Fotoprotecţia este rezultatul acţiunii antagoniste a radiaţiei luminoase faţă de o iradiere simultană cu ultraviolete, modificările celulare caracteristice acestora din urmă fiind atenuate prin expunerea simultană la cele dintâi.

Fotoreactivarea este fenomenul de revenire la normal a unor celule expuse în prealabil la ultraviolete, sub acţiunea luminii vizibile.

Fotooxidarea este procesul prin care energia luminoasă cu lungime de undă mai mare decât a radiaţiilor ultraviolete este absorbită de unii compuşi chimici ai celulei, determinând oxidarea letală a unor molecule vitale, în prezenţa oxigenului atmosferic.

Radiaţiile ultraviolete în doze mari au efect letal asupra bacteriilor. Cele cu lungime de undă între 230 - 280nm produc modificări profunde, ireversibile, fiind cele mai active din punct de vedere biologic. Ele sunt utilizate pentru sterilizare, cu eficienţă mică datorită posibilităţii de fotoreactivare.

5. Radiaţiile corpusculare (alfa - atomi de He, care nu se folosesc pentru sterilizare, beta - electroni cu energie înaltă, protonii) sunt ionizante, ca şi radiaţiile X şi gamma, ducând la ruperea catenelor de ADN şi încetarea diviziunii celulare. Comparativ cu macroorganismele, microorganismele sunt mai rezistente la iradiere. Razele X moi au un efect bactericid intens, pe când cele tari, ca şi radiaţiile alfa şi beta, mai puţin absorbite, au un efect antimicrobian mai atenuat.

6. Laserul (light amplification by stimulated emission of radiation = amplificarea luminii prin emisie stimulată de radiaţii) este un fascicul concentrat de cuante luminoase, generat de obicei într-un cristal de rubin în care atomii de crom sunt excitaţi prin modificarea stării energetice sub acţiunea luminii. Spre deosebire de lumina incandescentă a becului electric, cu lumina dispersată în radiaţii cu lungimi de undă diferite, laserul emite o lumină sub forma unui fascicul de radiaţii cu o lungime de undă uniformă, între 300 – 900 nm. Acţiunea laserului asupra microorganismelor este aceea de distrugere instantanee (acţionează intens, localizat, cu o cantitate enormă de energie pe o suprafaţă infimă).

7. Ultrasunetele produc moartea celulelor bacteriene prin ruperea pereţilor celulari şi creşterea temperaturii la 50 - 80ºC. Vibraţiile sonice cu frecvenţă relativ joasă, dar cu intensitate mare sunt mai eficiente decât cele cu intensitate mică şi frecvenţă înaltă. Infrasunetele şi sunetele percepute de urechea umană (între 16 - 1600 herzi) nu au efect asupra microorganismelor.

Liza bacteriilor se datorează fenomenului de cavitaţie, pereţii celulari fiind intens bombardaţi de bule foarte mici de gaz formate în lichidul de suspensie ca rezultat al vibraţiilor cu frecvenţă înaltă (ultrasonice şi hipersonice).

ACŢIUNEA FACTORILOR CHIMICI

Substanţele chimice pot exercita asupra bacteriilor mai multe efecte: - favorizarea dezvoltării şi multiplicării celulelor, prin aport de substanţe nutritive

(îndeplinind rol de sursă de azot, de carbon, de energie sau factor de creştere), - efect bacteriostatic, prin inhibarea reversibilă a multiplicării celulare, - efect bactericid, prin modificări ireversibile, incompatibile cu viaţa celulelor.

Aceeaşi substanţă, în funcţie de concentraţie, poate îndeplini roluri diferite: la concentraţii foarte mici de substanţă nutritivă în mediu, creşterea bacteriană este slabă, dar se intensifică pe măsură ce creşte concentraţia substanţei, până la un nivel prag, după care rata de creştere a populaţiei celulare nu mai depinde de creşterea concentraţiei substanţei. Când concentraţia substanţei a atins limita de toleranţă pentru celulă, creşterea celulară este inhibată, iar peste acest nivel substanţa devine bactericidă.

Substanţele chimice cu acţiune antimicrobiană pot fi încadrate în categoria antisepticelor (care pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase, au toxicitate relativ mică şi concentraţii relativ mici, nefiind nocive pentru celulele organismului gazdă) sau a dezinfectantelor (care pot fi utilizate numai pe suporturi neanimate, au acţiune bactericidă puternică). Atât antisepticele, cât şi dezinfectantele au acţiune antibacteriană nespecifică şi neselectivă, producând alterarea directă a substanţei vii, exercitând efecte atât asupra celulei bacteriene, cât şi a celulelor organismului gazdă, pe când antibioticele şi chimioterapicele au acţiune antibacteriană selectivă şi specifică.

Mecanismele prin care substanţele antimicrobiene acţionează asupra bacteriilor: ♦ denaturarea proteinelor (efect în general bactericid): acizii tari, bazele tari, alcoolii, ♦ oxidarea grupărilor chimice libere ale enzimelor: KMnO4, H2O2, ♦ halogenarea grupărilor chimice libere ale enzimelor, ♦ reducerea grupărilor active ale proteinelor: formaldehida, glutaraldehida, oxidul de

etilen, ♦ interferenţa cu grupările active ale proteinelor: metale grele (Hg, Ag), ♦ lezarea membranelor celulare, cu alterări ale permeabilităţii: detergenţii, săpunurile ♦ alterarea acizilor nucleici: coloranţii bazici, derivaţii de acridină (ex.: rivanol).

Antibioticele sunt substanţe cu efect antimicrobian sintetizate de către microorganisme (în special mucegaiuri - Penicillium, dar şi actinomicete - Streptomyces şi alte bacterii - Bacillus), iar chimioterapicele sunt substanţe cu efect similar cu al antibioticelor, dar obţinute prin sinteză sau semisinteză chimică. Mecanismele lor de acţiune asupra bacteriilor sunt foarte variate:

� inhibă sinteza peretelui celular (betalactaminele, vancomicina) � inhibă sinteza proteinelor la nivel ribozomal (aminoglicozidele, cloramfenicolul,

macrolidele) � modifică permeabilitatea membranei plasmatice (colistinul, vancomicina) � interferă cu funcţiile acizilor nucleici (rifampicina, metronidazolul, acidul

nalidixic, cotrimoxazolul). Microorganismele pot prezenta rezistenţă la acţiunea antibioticelor, naturală

(totală, caracteristică tuturor indivizilor speciei, determinată genetic) sau dobândită (prin transfer extracromozomial - prin conjugare, prin transducţie fagică, prin transformare sau, mai rar, cromozomial de la o bacterie la alta, orizontal sau vertical). Poate fi monovalentă (faţă de un singur antibiotic) sau plurivalentă. Se poate manifesta direct sau încrucişat (când o bacterie este rezistentă faţă de antibiotice înrudite). După ritmul de instalare, rezistenţa bacteriilor la antibiotice poate fi: de tip rapid (tip streptomicină), de tip

intermediar (tip eritromicină), de tip lent (tip penicilină) sau foarte lent (tip vancomicină). Pot avea loc mutaţii spontane sau induse care să ducă la apariţia mutantelor rezistente la antibiotice.

Mecanismele biochimice ale rezistenţei la antibiotice presupun: - producerea de enzime inactivatoare - scăderea permeabilităţii bacteriei pentru antibiotice - producerea de enzime modificate, care anulează acţiunea antibioticului la nivelul

enzimei ţintă - alterarea ţintei intracelulare, care devine de nerecunoscut pentru antibiotic - creşterea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulând inhibarea competitivă a

sulfamidelor - pomparea activă în exterior a substratului.

RELAŢII ECOLOGICE ÎNTRE MICROORGANISME ŞI MACROORGANISME

A. Interacţiunile dintre populaţiile de microorganisme

În majoritatea habitatelor naturale se găsesc asociaţii heterogene de

microorganisme, numărul speciilor fiind dependent de complexitatea şi diversitatea chimică a substanţelor nutritive.

Interacţiunile dintre microorganisme se pot clasifica pe baza mai multor criterii (Starr şi Chatergee, 1972):

- după localizare şi modul de existenţă în raport cu altele (comensalism, simbioză, parazitism, prădare); - după rezultatul asocierii (neutralism, mutualism, antagonism); - după gradul de dependenţă a asociaţiei (accidentală, facultativă sau obligatorie). Unele interacţiuni sunt pozitive (benefice), altele sunt negative, unele sunt

benefice pentru un partener şi dăunătoare pentru celălalt, iar altele sunt indiferente.

Interacţiunile posibile între populaţiile a două specii de microorganisme (G. Zarnea, 1994, adaptat după Odum, 1971)

Tipuri de interacţiune Specia Natura generală a interacţiunii A B

Neutralism 0 0 Nici una din populaţiile asociaţiei nu este afectată

Comensalism + 0 Populaţia A comensală beneficiază, cea asociată B nu este afectată

Protocooperare + + Interacţiune neobligatorie, bilateral benefică Mutualism + + Interacţiune obligatorie, bilateral benefică Competiţie prin interferenţă directă

- - Fiecare dintre cele două specii o poate inhiba direct pe cealaltă

Competiţie prin utilizarea nutrienţilor

- - Fiecare dintre cele două specii o poate afecta pe cealaltă prin consumarea unui nutrient

puţin abundent Amensalism - 0 Populaţia A este inhibată, cealaltă este

neafectată Parazitism + - Populaţia A, cu dimensiuni mai mici,

parazitează populaţia B Prădare + - Populaţia prădătoare A atacă populaţia gazdă

B 1. Neutralismul este o asociere puţin probabilă în mediile naturale, lipsită de

influenţe reciproce, favorizată de mediile cu condiţii restrictive, care permit creşterea microorganismelor cu o rată minimă şi care nu intră în competiţie pentru nutrienţi.

2. Interacţiunile pozitive Interacţiunile pozitive sunt relaţii de tip cooperant, care măresc rata de creştere a

microorganismelor asociate şi se produc chiar şi între celulele aceleiaşi specii. Ele sunt foarte importante în mediile naturale.

a. Comensalismul - se disting două categorii de microorganisme comensale: - ectocomensale – situate pe suprafaţa altor microorganisme, plante sau animale, fixate de obicei prin structuri specializate (fimbrii, iar la Caulobacter crampon); - endocomensale, prezente în tubul digestiv al animalelor.

b. Protocooperarea - de exemplu, Azotobacter fixează N2 utilizând substanţe organice simple pe care le furnizează alte microorganisme, care hidrolizează substanţele complexe.

c. Sinergismul - formă de protocooperare între două sau mai multe tipuri de microorganisme prezente într-un mediu, ce pot avea activităţi foarte diferite, calitativ sau cantitativ faţă de activităţile însumate ale aceloraşi specii cultivate separat în mediul respectiv; de exemplu, E. coli şi Streptococcus faecalis produc putresceina din arginină, numai dacă sunt cultivate împreună, nu şi dacă sunt cultivate separat.

d. Mutualismul - asociaţie reciproc benefică, cu diferite grade de asociere.

3. Interacţiunile negative Interacţiunile negative sunt prezente în special la densităţi populaţionale mari de

microorganisme şi afectează viteza de creştere a uneia dintre cele două populaţii, datorită competiţiei pentru un substrat nutritiv, producerii de compuşi toxici, cu efect nociv pentru cealaltă specie, acumulării de produşi de metabolism cu efect inhibitor pentru cealaltă specie.

a. Competiţia - rezultatul diversităţii microorganismelor, a căror dezvoltare depinde de fondul comun de resurse din mediu; avantajează microorganismul cu o rată mai mare de creştere, care are o eficienţă superioară de utilizare a nutrienţilor limitanţi; se realizează indirect (efectul negativ al unui organism asupra altuia este rezultat al epuizării unei surse nutritive din mediu); factorii abiotici influenţează competiţia, care poate fi: - interspecifică, bacteriile din mediile naturale sunt mai bine adaptate decât cele

alohtone; - intraspecifică, între tulpinile aceleiaşi specii.

b. Amensalismul - interacţiune frecventă în comunităţile cu densităţi populaţionale mari, reprezentat prin producerea de către o specie de microorganisme a unor substanţe solubile organice sau anorganice care afectează negativ creşterea altor microorganisme asociate din mediu; este o interacţiune unidirecţională.

c. Parazitismul - relaţia în care un organism se hrăneşte cu celulele, ţesuturile sau lichidele altui organism, care poate suferi prejudicii mai mult sau mai puţin severe; interacţiunea are uneori un grad înalt de specificitate, alteori paraziţii au un spectru larg de gazde; relaţia parazit – gazdă variază: - ectoparazitism

- parazitism intracelular obligat sau facultativ, ca rezultat al unei adaptări complexe a parazitului la mediul celulei gazdă, însoţit de pierderea capacităţii de a trăi extracelular; paraziţii intracelulari de obicei au genomuri mai mici, prin pierderea genelor neesenţiale pentru celulă; supravieţuirea parazitului în celula gazdă este consecinţa uneia dintre următoarele strategii:

• infectarea unei celule fără lizosomi (protozoarul Plasmodium infectează eritrocitul matur);

• rezistenţa la enzimele lizosomale (Coxiella burnetti); • evadarea din fagosom rapid după pătrunderea în celulă (Rickettsia mooseri); • împiedicarea fuziunii fagolizosomale (Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia,

Legionella pneumophila); - parazitism absolut (virusuri – celulă gazdă).

d. Prădarea - interrelaţie în care un organism mai viguros (prădătorul) atacă un alt organism (prada); se soldează cu distrugerea parţială a prăzii urmată de utilizarea constituenţilor ca material nutritiv, distrugerea totală sau moartea rapidă a prăzii (dacă e unicelulară).

e. Antagonismul (antibioza) - determinat de acţiunea unor substanţe produse de anumite microorganisme, cu efect inhibitor sau letal pentru alte microorganisme; poate fi: - nespecific, determinat de eliberarea în mediu de către bacteria antagonistă a unor

substanţe cu acţiune toxică neselectivă (acizi, alcooli), similară dezinfectantelor şi antisepticelor, manifestată atât asupra altor bacterii, cât şi asupra organismului gazdă;

- specific, reprezentat de activitatea antimicrobiană a unor produse de metabolism microbian, netoxice pentru organismele superioare, dar active în concentraţii mici asupra altor microorganisme; aceste substanţe sunt de tip antibiotice (utilizate în terapie, cu toxicitate selectivă pentru specii diferite filogenetic de specia producătoare) sau de tip bacteriocine (fără utilizare în terapie, cu toxicitate selectivă faţă de tulpini din aceeaşi specie sau faţă de specii foarte înrudite; pot fi colicine, piocine, enterocine).

Simbioza În sens strict, simbioza reprezintă coabitarea de lungă durată a unor organisme

diferite, care trăiesc în relaţii spaţiale directe, beneficiind reciproc din interacţiunile lor, caz în care simbioza ar corespunde mutualismului. În sens mai larg, simbioza defineşte viaţa împreună a unor organisme diferite, indiferent dacă asocierea lor are efect benefic sau dăunător asupra unuia sau ambilor parteneri, mergând până la imposibilitatea speciilor asociate de a se dezvolta independent. Simbiozele stau la baza echilibrului normal în nişa ecologică reprezentată de colon, de care depinde starea de sănătate a organismului.

� în funcţie de localizarea microorganismelor simbionte se disting: - ectosimbioze; - endosimbioze � în funcţie de gradul de dependenţă se disting: - simbioze facultative; - simbioze ecologic obligate - simbioze efectiv obligate sau ereditare � în funcţie de natura relaţiei se disting: - simbioze mutualiste, în care adaptarea ambelor organisme este superioară fiind

împreună decât atunci când trăiesc separat; - simbioze parazitare, când unul dintre parteneri este mai adaptat în asociaţie decât

separat.

B. Relaţiile microorganism – gazdă

Relaţiile dintre microorganisme şi organismul gazdă se pot stabili încă din viaţa intrauterină (în acest caz este o situaţie patologică), dar relaţiile operaţionale se stabilesc din perioada postnatală, prin colonizare saprofitică sau agresiune din partea patogenilor.

Microorganismele care se localizează pe tegument şi majoritatea mucoaselor vor constitui microbiota normală a organismului, cu rol deosebit de important în apărarea acestuia faţă de invaziile microbiene ulterioare, prin competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi sau receptori de pe suprafaţa celulelor gazdă, prin sinteza de bacteriocine, acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi, stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată şi prin stimularea continuă a sistemului imun pentru exprimarea constantă, la un nivel scăzut, a moleculelor complexului major de histocompatibilitate clasa a II-a de pe macrofage şi alte celule prezentatoare de antigen.

Unele dintre microorganismele din microbiota normală a organismului uman se află în relaţii de simbioză cu acesta (de ex. unii coliformi intestinali), dar majoritatea sunt comensale, microorganismele depinzând nutriţional de gazdă, fără să determine prejudicii acesteia. Echilibrul multora dintre microorganismele din organismul uman este destul de instabil, fiind modificat de diferiţi factori interni sau externi, astfel încât microorganisme condiţionat patogene din microbiota normală pot avea la un moment dat activitate patogenă (de exemplu Streptococcus pneumoniae). Numai în situaţii în care microorganismele se dezvoltă evident în detrimentul gazdei se poate vorbi de parazitism tipic, unele microorganisme fiind obligatoriu parazite (Mycobacterium leprae,

Treponema pallidum), altele facultativ parazite (Clostridium tetani, Salmonella typhi).

TIPURI PARTICULARE DE BACTERII. RICKETTSII, CHLAMIDII, MYCOPLASME, CIANOBACTERII

RICKETTSIILE

Rickettsiile formează un grup mic de bacterii parazite obligatoriu intracelular, care produc boli grave la om şi animale în urma transmiterii prin înţepăturile insectelor. Există şi rickettsii nepatogene, care se dezvoltă în organismul unor insecte gazdă (acarieni). Iniţial rickettsiile au fost considerate microorganisme intermediare între virusuri şi bacterii. Ulterior s-a stabilit că au organizare de tip celular procariot şi o structură internă caracteristică bacteriilor. Rickettsiile sunt bacterii pleomorfe, populaţia bacteriană prezentând celule cu forme variate. Celula tipică are formă de bacil, cu un diametru de 0,3 - 0,7µm şi lungime de 1,5 - 2 µm. Alte celule au formă de coci izolaţi sau în perechi, de cocobacili sau forme filamentoase. Sunt Gram negative şi se colorează greu cu coloranţi de anilină, colorându-se în albastru prin metoda Giemsa. Au structură asemănătoare bacteriilor Gram negative, peretele celular având o grosime de până la 100 nm, iar membrana citoplasmatică fiind trilamelară. La suprafaţa peretelui celular se găseşte o microcapsulă, care în organismul gazdă are rol de antigen. Peretele celular conţine acid muramic şi acid diaminopimelic. În compoziţia lor chimică intră proteine, glucide, acizi nucleici, vitamine, săruri minerale. ADN-ul se găseşte în cantitate relativ mică, aproximativ 200 - 400 gene. Multiplicarea rickettsiilor se realizează prin diviziune simplă, transversală, de obicei în citoplasma celulelor gazdă. Există însă şi specii de rickettsii care se multiplică în nucleul celulelor gazdă. Diviziunile lor se succed la aproximativ 8 ore. Rickettsiile sunt adaptate la un parazitism obligatoriu, nu se dezvoltă în afara mediului celular şi sunt sensibile la factorii de mediu. Celulele de rickettsii sunt strict dependente de celula gazdă, având un echipament enzimatic simplificat, care nu le permite un metabolism cu toate etapele de degradare a substanţelor şi nici cu toate etapele de biosinteză a componentelor celulare. Ele pot sintetiza molecule mici, enzime necesare pentru producerea de energie, dar componentele macromoleculare şi unele coenzime sunt preluate din celula gazdă. De aceea membrana rickettsiilor prezintă o permeabilitate mai mare decât a bacteriilor ce trăiesc în afara celulelor gazdă, fapt ce explică şi imposibilitatea creşterii lor în laborator pe medii artificiale. Rickettsiile sunt omorâte de antiseptice obişnuite (fenol, formol), de căldura umedă (30 minute la 56°C) şi de antibiotice cu spectru larg (tetraciclină, cloramfenicol, rifampicină).

Rickettsiile produc toxine cu efect letal pentru şoarece, la care determină leziuni vasculare generalizate şi moartea în câteva ore. În organismul uman rickettsiile au tropism pentru celulele epiteliale ale vaselor de sânge, în special capilare, cu modificări ale permeabilităţii vasculare. Microorganismele se multiplică în celulele endoteliului vaselor sangvine mici; celulele se umflă, se necrozează şi vasele se rup. Rickettsiile patogene pentru om şi animale sunt transmise de la om la om sau de la animal la om de către vectori (păduchi, purici, căpuşe).

CHLAMIDIILE

Chlamidiile sunt organisme procariote care parazitează obligatoriu celulele eucariote, producând infecţii la om şi animale. Datorită parazitismului intracelular, au fost iniţial considerate virusuri de mari dimensiuni. Chlamidiile îşi păstrează însă structura celulară de tip procariot pe parcursul întregului ciclu de viaţă, prezentând structură celulară şi ambele tipuri de acizi nucleici (atât ADN, cât şi ARN). Chlamidiile sunt bacterii de dimensiuni mici (0,5 - 1µ), imobile, care au un ciclu de dezvoltare caracteristic.

Prezintă o formă extracelulară stabilă, infectantă, cu viaţă latentă, care pătrunde în citoplasma celulei gazdă prin fagocitoză, după o prealabilă legare electrostatică de suprafaţa celulară. Formele extracelulare se numesc corpi elementari, au un raport ADN:ARN de 1:1. În citoplasma celulei gazdă corpii elementari formează structuri vegetative numite corpi reticulaţi, cu un raport ADN:ARN de 3:1 şi dimensiuni de 0,5-1µm, care prin diviziune dau noi corpi elementari, ce reiniţiază ciclul de infecţie. Corpii elementari au formă de bacterii cocoide, cu dimensiuni de 1,5 - 3µm. Peretele celular este similar ca structură şi compoziţie chimică cu cel al bacteriilor Gram negative. În citoplasmă prezintă ribozomi, nucleosomul reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenar circular închis, ARN, enzime care intervin în metabolism. Chlamidiile sunt incapabile să producă compuşi macroergici de tipul ATP, pentru stocarea şi utilizarea energiei, de aceea sunt paraziţi energetici. Nu se colorează prin metoda Gram. Parazitul intracelular utilizează metaboliţii celulei gazdă, intră în competiţie cu aceasta pentru aminoacizi şi sintetizează metaboliţi toxici, care duc la lezarea membranei celulei gazdă şi la eliberarea corpilor elementari.

În laborator, chlamidiile se cultivă pe ouă embrionate de găină în vârstă de 6 - 7 zile, intravitelin, dar şi pe culturi de celule pulmonare de şoarece. Diagnosticul de laborator se stabileşte prin metode imunologice şi bacteriologice. Deoarece bacteriile se pot transmite prin aerosoli, trebuie luate măsuri de prevenire a infecţiilor cu chlamidii în laborator.

MICOPLASMELE

Micoplasmele reprezintă un grup de procariote mici (0,2 – 0,5µ), variate ca formă, lipsite de perete celular, delimitate numai de membrana plasmatică lipoproteică. Formează grupul Mollicutes. Sunt cele mai mici şi mai primitive organisme capabile de creştere autonomă pe medii acelulare inerte. Sunt larg răspândite în natură, mai ales ca saprobionţi. Sunt prezente în organismul animal (pe mucoasa bucală şi cea genitală), în plante, fungi, ape de canal. Pot produce la om afecţiuni respiratorii şi urogenitale, iar la animale pot determina boli grave. La plante se cunosc peste 40 de boli produse de micoplasme, la citrice, cartof, dud. Sunt frecvent prezente în culturile de celule utilizate în laborator în virusologie, unde pot produce modificări de ordin genetic (li s-a atribuit un rol în malignizarea celulelor animale in vitro).

Micoplasmele prezintă mai multe tipuri morfologice: sferice, cocoidale, diplococi, filamentoase, miceliene ramificate. Sunt bacterii Gram negative, dar se pun în evidenţă mai uşor prin coloraţii de tip Giemsa. Ultrastructura lor cuprinde membrana plasmatică lipoproteică, tristratificată, cu grosimea de 10 nm, materialul nuclear alcătuit din ADN dublu catenar, cu aproximativ 600 - 1000 gene, ribozomi de tip 70S. Au un genom simplificat, care este în corelaţie cu structura lor. Pe medii semisolide cu proteine formează colonii foarte mici, cu aspect caracteristic de „ou prăjit”. Multiplicarea lor se pare că se poate realiza atât prin diviziune directă, cât şi prin înmugurire şi fragmentare. Sunt bacterii sensibile la cloramfenicol, tetraciclină, dar sunt rezistente la acţiunea penicilinei. CIANOBACTERIILE

Cianobacteriile sunt organisme foarte vechi, din precambrianul timpuriu. După unele ipoteze, evoluţia lor endosimbiontă a dus la apariţia predecesorilor cloroplastelor şi la apariţia celulelor vegetale. Reprezintă cea mai mare, mai diversă şi mai larg răspândită grupă de bacterii fotosintetizante.

Sunt microorganisme cu organizare de tip procariot, care posedă un aparat fotosintetic similar din punct de vedere molecular, structural şi funcţional cu cel din cloroplastele celulelor eucariote. Cianobacteriile au formă sferică sau bacilară, cu dimensiuni cuprinse între 1 şi 10µm . Se prezintă ca celule izolate ori ca asociaţii coloniale sau filamentoase. Peretele celular are o structură tipică bacteriilor Gram negative şi este frecvent acoperit de o teacă gelatinoasă polizaharidică sau fibroasă. Nucleosomul este reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenară circulară, cu dimensiuni variabile. Diversitatea lor structurală este însoţită de o diversitate genetică, reflectată de valorile G+C (35 - 71%) şi dimensiunile genomului (care poate avea o greutate moleculară între 1,6 x 109 – 8,6 x 109 Da). Cea mai mare parte din protoplast este ocupată de componentele aparatului fotosintetic, localizate într-o serie de saci membranoşi turtiţi, paraleli, numiţi tilacoizi, care sunt sediul pigmenţilor fotosintetizanţi. Cianobacteriile conţin în citoplasmă granule de polifosfaţi, glicogen şi cianoficină. Granulele de cianoficină sunt mari (cu diametrul de 1µm), refringente, alcătuite din lanţuri polipeptidice mari, ramificate, care au la bază acidul aspartic şi arginina. Ele sunt caracteristice cianobacteriilor. Cianobacteriile constituie un grup relativ uniform de bacterii, deoarece toate sunt autotrofe, rareori necesită factori de creştere, asimilarea CO2 se face prin ciclul Calvin Benson, cu formarea de depozite de glicogen ca material intracelular de rezervă. Multe cianobacterii sunt obligat fotoautotrofe, fiind incapabile să crească la întuneric. Rata de creştere la întuneric a celor care sunt capabile de aceasta este foarte mică în raport cu creşterea la lumină.

Anabaena

Nostoc

Nodularia

VIRUSURILE

Virusurile reprezintă o categorie specifică de agenţi infecţioşi, fundamental diferiţi, structural şi funcţional, de oricare dintre organismele cunoscute. Din cauza dificultăţilor de observare, cultivare şi studiere, foarte multă vreme au fost analizate prin prisma unor caractere evidente: filtrabilitatea, dimensiunile foarte mici, parazitismul obligatoriu intracelular, inactivarea prin căldură. Aceste caractere s-au dovedit a nu fi definitorii în raport cu alţi agenţi infecţioşi, fapt care explică încadrarea greşită şi absurdă a bacteriilor mici filtrabile, parazite obligatorii intracelular, ca intermediari între bacteriile adevărate şi virusuri. Primele date referitoare la natura şi caracterele specifice ale unor boli virale sunt foarte vechi, fiind consemnate în China antică (anul 2500 î.e.n., despre variola umană) sau în lucrările lui Aristotel (despre turbare). În 1886 Mayer a demonstrat transmisibilitatea mozaicului tutunului prin frecarea plantelor sănătoase cu plante bolnave şi inactivarea principiului infecţios prin tratament cu alcool sau prin încălzire la 80°C. El a considerat că boala este produsă de un "ferment organizat".

În 1898 Beijerink confirmă multiplicarea şi transmisibilitatea în serie a agentului patogen al mozaicului tutunului, dar şi rezistenţa sa îndelungată în frunzele uscate de tutun şi difuzibilitatea lui în agar. El ajunge la concluzia că agentul patogen nu este nici microorganism, nici toxină, ci o substanţă moleculară specială solubilă, capabilă să se multiplice în celulele gazdă dacă este încorporată în citoplasma acestora. El îl numeşte "contagium vivum fluidum". Toate aceste date, reconsiderate astăzi, au dus la concluzia că Beijerink este descoperitorul virusurilor, deoarece el este primul care a intuit natura lor deosebită de a celorlalţi agenţi patogeni.

Recunoaşterea ştiinţifică a virusurilor ca entităţi particulare se datorează lui Andre Lwoff, care în 1953 şi în 1981 a încercat să stabilească ansamblul caracterelor originale ale lumii virusurilor, descriind deosebirea dintre virus şi non-virus.

DEFINIREA CONCEPTULUI DE VIRUS Caracterele discriminatorii ale virusurilor şi bacteriilor

Nr. crt.

Caracterul VIRUSURI PROCARIOTE

1 Tipul de organizare organizare acelulară organizare celulară de tip procariot

2 Unitatea de structură şi funcţie

virionul celula bacteriană

3 Stări posibile de existenţă

virionul - particula virală matură, completă, infecţioasă, formă în care virusul se găseşte la sfârşitul procesului de replicare în celula gazdă şi este eliberat în mediul exterior virusul vegetativ - genomul viral aflat liber în celula gazdă, pregătit de replicare provirusul - genomul viral integrat în genomul celulei gazdă

celula bacteriană vegetativă, capabilă de creştere şi replicare sporul bacterian, formă facultativă de rezistenţă

4 Structura internă virionul cuprinde: - constituenţi esenţiali - genomul viral - capsida virală - constituenţi accesorii: peplosul Genomul şi capsida alcătuiesc împreună nucleocapsida, caracteristică virusurilor nude, neacoperite. Genomul e reprezentat de o moleculă de acid nucleic, fie ADN, fie ARN, cu o greutate moleculară diferită de la un virus la altul. Molecula de acid nucleic este monocatenară sau bicatenară, lineară sau circulară, dispusă helical, împachetată pentru a forma o structură compactă. Genomul viral poartă informaţia genetică necesară pentru propria replicare şi pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul sintezei de constituenţi virali. Acidul nucleic viral determină infecţiozitatea virusurilor. Capsida este învelişul proteic ce acoperă şi protejează genomul viral. Este alcătuită din unităţi morfologice de natură proteică, numite capsomere. Peplosul este un înveliş extern prezent la virusurile acoperite, cu nivel complex de organizare, cu rolul de a păstra stabilitatea nucleocapsidei şi de a favoriza fixarea virionului pe celula gazdă. E alcătuit dintr-un dublu strat lipidic, în care sunt implantate formaţiuni de natură glicoproteică, numite spicule. Spiculele pot fi prismatice alungite (de exemplu hemaglutininele) sau în formă de ciupercă (de exemplu neuraminidazele).

celula bacteriană cuprinde: - perete celular - membrană - citoplasmă - nucleoid - ribozomi - vacuole - incluzii - spori - capsulă - flageli

5 Simetria la nivel molecular

simetrie constantă a aranjării moleculelor proteice în capsidă: - helicală - icosaedrică - binară (mixtă)

lipseşte o simetrie moleculară

6 Compoziţia chimică - acizii nucleici - proteinele

- fie ADN (la dezoxiribovirusuri) - fie ARN (la ribovirusuri) - virusurile mici au în structura capsidei un număr fix de molecule proteice de acelaşi fel; virusurile complexe au în capsidă mai multe tipuri diferite de molecule proteice, dar numărul este limitat şi fix; rolul proteinelor virale este structural şi în mod excepţional enzimatic; O consecinţă a numărului fix de proteine este dispunerea lor simetrică în capsidă, într-un mod unic.

- ADN în genomul bacterian - ARN în citoplasmă - bacteriile au un potenţial de aprox. 3-4 mii de proteine diferite, cu rol structural sau enzimatic. Numărul lor este variabil, randamentul sintezei de proteine fiind inegal, funcţie de importanţa proteinei pentru celula bacteriană.

- glucidele şi lipidele - echipamentul enzimatic

- virusurile nu au glucide şi lipide, cu excepţia unor proteine glicozilate; uneori sunt prezente în învelişul extern, provenind de la celula gazdă în care s-au replicat, deoarece peplosul nu este codificat de genomul viral - virusurile sunt lipsite de echipament enzimatic, neputând să îşi sintetizeze constituenţii, să producă energie şi să utilizeze resursele mediului; nu se pot cultiva pe medii acelulare; Uneori virusurile prezintă enzime cu rol în replicarea genomului viral, în favorizarea pătrunderii virusului în celulă sau a eliberării din celula gazdă.

- glucidele şi lipidele sunt prezente în mod constant în structura bacteriilor - bacteriile au în mod constant un echipament enzimatic cu grad diferit de complexitate, în funcţie de nutriţia bacteriilor; este mai complex la bacteriile autotrofe, se simplifică la cele heterotrofe şi la bacteriile parazite obligatoriu intracelular

7 Proprietăţile biologice

Virusurile nu au capacitatea de a produce energie cu potenţial înalt (ATP), nu fac sinteza independentă a constituenţilor proprii, nu au capacitatea de a creşte şi de a se divide. Se reproduc obligatoriu în celula gazdă vie, pornind exclusiv de la genomul viral.

Bacteriile au un metabolism energetic propriu, chiar şi când sunt parazite intracelular; au capacitatea de a creşte până la un punct critic urmat de diviziune. Multiplicarea PK porneşte de la ansamblul integrat al constituenţilor celulari.

8 Utilizarea sistemelor structurale şi biochimice ale gazdei în cursul parazitismului intracelular

Virusurile utilizează sistemele enzimatice, ARN de transfer şi ribozomii gazdei.

Bacteriile nu utilizează sistemele enzimatice ale gazdei, ci pe cele proprii.

9 Parazitismul absolut Pentru virusuri este constant şi obligatoriu. În celulele infectate cu virusuri, metabolismul celular suferă modificări esenţiale, fiind deviat în sensul sintezei constituenţilor virali, pornind de la informaţia genetică străină, adusă de genomul viral în celulă. Procesele de sinteză celulară continuă cel puţin un timp, deoarece metaboliţii esenţiali celulari sunt necesari în sinteza de constituenţi virali. Competiţia dintre virus şi celula gazdă are loc la nivelul diataxiei (producerea de constituenţi): diataxia celulară este blocată sau diminuată sub acţiunea unor constituenţi proteici virali din capsidă sau peplos, iar diataxia virală este activă.

La bacterii parazitismul nu este absolut.

10 Multiplicarea virusurilor

Multiplicarea virusurilor se realizează prin replicare virală (replicarea informaţiei genetice virale, sinteza componentelor virale, asamblarea particulelor).

Bacteriile se multiplică prin diviziune directă, fragmentare, înmugurire, prin spori.

MORFOLOGIA VIRUSURILOR

Descrierea morfologică şi dimensiunile unui virus se raportează la virion, particulă virală matură, unitate integrată de structură şi funcţie. Din punct de vedere morfologic se disting mai multe tipuri de virioni:

- virioni de formă cilindrică alungită, adică de bastonaş rigid (VMT) sau flexibil (bacteriofagii filamentoşi) - virioni de formă sferică (izodiametrică, de exemplu virusul poliomielitei din Familia Picornaviridae) sau sferoidală (virusurile gripale, adenovirusurile, herpesvirusurile) - virioni de formă paralelipipedică (poxvirusurile) - virioni cu formă de cartuş (virusul rabic, din Familia Rhabdoviridae) - virioni în formă de cireaşă cu coadă sau mormoloc (bacteriofagii T par); - virusuri de forma cifrei 6 (virusul Ebola).

(http://learnsomescience.com/microbiology/viruses-viroids-and-prions/)

Virusurile au dimensiuni submicroscopice:

- cele mai mari au 240 – 300nm (orthopoxvirusurile), la limita de rezoluţie a microscopiei optice;

- cele mai mici (enterovirusurile), au sub 30nm diametru. - bacteriofagii cei mai mari ating 200nm.

MODELUL GENERAL DE STRUCTURĂ VIRALĂ

Virionii posedă doi constituenţi esenţiali şi definitorii: genomul şi capsida, care alcătuiesc împreună nucleocapsida virusurilor nude, fără înveliş extern (poliovirusul, reovirusurile, adenovirusurile).

Virusurile se deosebesc prin:

o natura moleculei de acid nucleic din genom: � ADN, pentru dezoxiribovirusuri (adenovirusurile, poxvirusurile,

herpesvirusurile, papovavirusurile); � ARN, pentru ribovirusuri (virusurile gripale, paragripale, virusul rujeolic,

virusul rabic, poliovirusul, VMT). o structura genomului, care este variată:

o monocatenară sau dublu catenară, o lineară sau circulară, o genom segmentat, în aceeaşi capsidă sau capside diferite.

Majoritatea virusurilor infecţioase pentru om, animale şi plante sunt ribovirusuri.

În virion genomul ribovirusurilor este asociat cu nucleoproteine şi cu proteine de replicare, dar se disociază de nucleopreoteine când ajunge în citoplasma celulei gazdă. Majoritatea ribovirusurilor au ca genom o moleculă de ARN monocatenar de polaritate:

- pozitivă (care funcţionează ca ARNm şi este tradusă în proteine fără o transcriere prealabilă);

- negativă (care nu este tradusă direct, ci este transcrisă mai întâi în ARNm). Numai reovirusurile au genom ARN dublu catenar. Genomul dezoxiribovirusurilor este complexat cu proteine atât în starea

împachetată în virion, cât şi ca genom liber în citoplasma celulei gazdă. La virusurile infecţioase pentru celulele animale informaţia genetică are caracter

discontinuu, ca şi a gazdelor lor. Moleculele de ADN monocatenar, lineare sau circulare, au o tendinţă accentuată

de a se plia, formând bucle dublu catenare în ac de păr, ori de câte ori secvenţele de baze permit formarea unui număr semnificativ de perechi, reunite prin intermediul punţilor de hidrogen, formând o moleculă compactă.

Genomul viral dublu catenar poate fi linear sau circular închis, cu diferite grade de supraspiralizare şi de condensare. Gradul de pliere a moleculei depinde de prezenţa ionilor: ionii de Na+ favorizează predominanţa formei monocatenare, cu foarte puţine bucle, datorită acţiunii de respingere a grupărilor fosfat cu sarcină negativă.

Unele virusuri au informaţia genetică sub formă de segmente multiple încapsidate într-o capsidă comună sau în capside diferite, caz în care infecţia se poate produce numai când în organismul gazdă pătrund toate capsidele ce poartă informaţia genetică necesară replicării virale. Avantajul genomului segmentat constă în aceea că mesajele genetice mai mici sunt mai uşor replicate şi transmise în celula eucariotă animală sau vegetală, putând fi traduse simultan, facilitând procesul de replicare virală. Segmentarea genomului viral reprezintă un avantaj pentru supravieţuirea virusurilor în natură, fiind o adaptare la celula eucariotă animală sau vegetală. Pentru virusurile cu genom segmentat repartizat în mai multe capside, faptul pare dezavantajos pentru iniţierea replicării, aceasta necesitând prezenţa tuturor segmentelor genomice încapsidate separat. În realitate în plantele infectate există cantităţi imense de particule virale, care asigură şansa transmiterii tuturor tipurilor de virioni cu informaţia genetică virală complementară.

Dintre virusurile ARN infecţioase pentru om şi animale pot fi amintite: virusul gripal cu 8 segmente de ARN monocatenar, reovirusurile cu 10 segmente de ARN dublu catenar, arenavirusurile cu 2 segmente de ARN inegale.

În cazul virusului gripal există în natură mai multe variante, în funcţie de specia de animal pe care o poate îmbolnăvi. Segmentele de ARN monocatenar sunt specifice pentru fiecare variantă, determinând o mare variabilitate a virusului gripal, cu dobândirea de noi caracteristici în urma unei pseudorecombinări (într-o coinfecţie cu variante diferite de virus gripal, segmente genomice provenind de la variante diferite se pot recombina). Diversitatea virusului gripal poate sta la baza producerii de epidemii şi pandemii grave la om.

Unele virusuri ARN patogene pentru plante au genomul încapsidat în capside diferite şi infecţia se poate produce numai dacă în organismul gazdă pătrund toate capsidele ce poartă informaţia genetică necesară replicării virale. De exemplu virusul mozaicului lucernei (alfalfavirus - AAV) are genomul repartizat în 4 tipuri de virioni: trei au formă de bastonaş şi au câte o moleculă de ARN şi unul are formă elipsoidală şi conţine două segmente de ARN. Una dintre particularităţile virusurilor este aceea că fac economie de informaţie genetică. Această economie este necesară datorită dimensiunilor mici ale virusurilor şi se realizează pe mai multe căi: la virusurile mici capsida virală este formată dintr-un singur

tip de proteine dispuse simetric, a căror sinteză este asigurată de o genă sau de puţine gene; virusurile pot utiliza unele proteine din celula gazdă pentru efectuarea unor funcţii virale; virusurile cu un genom defectiv (care nu au în structura genomului lor genele necesare pentru codificarea proteinelor din capsidă) utilizează informaţie genetică furnizată de alte virusuri (virusuri helper), asociate cu cele defective, care suplinesc deficienţele virusului principal, determinând o sinteză în exces de capsomere. De exemplu, virusul sarcomului Rous are capacitatea de a produce transformarea malignă a unor celule animale, dar nu se poate replica decât în asociere cu virusul leucemiei murine, care îi furnizează informaţia genetică necesară sintezei proteinelor capsidale. În acest fel, virusul defectiv poate avea capside diferite, în funcţie de virusul helper, dar îşi păstrează informaţia sa genetică.

Unele polipeptide capsidale îndeplinesc în acelaşi timp funcţii structurale şi

funcţii de reglare în procesul de replicare virală. Aceeaşi informaţie genică poate fi

folosită în mai multe cadre de citire (citire defazată, care are o altă semnificaţie genică) în procesul de translaţie, cu producerea a două sau mai multe polipeptide sub controlul aceluiaşi determinant genetic.

Greutatea moleculară a virusurilor variază de la 1,2 - 1,8x106Da în cazul virusurilor mici (virusurile paragripale), la 2,5x106Da în cazul adenovirusurilor, până la 200x106Da în cazul virusurilor mari (poxvirusurile). Dimensiunile genomului ribovirusurilor sunt relativ uniforme, cel mai mare genom fiind cel al reovirusurilor (15x106Da). Genomul dezoxiribovirusurilor variază ca dimensiune mai mult, între 106Da (virusul hepatitei B) şi 185x106Da (avipoxvirusul).

Numărul de gene virale variază de la 3 la 160, iar compoziţia în baze (G + C) este cuprinsă între 35 - 58%. Coeficientul G + C% are semnificaţie pentru taxonomia virusurilor. În general, virusurile cu potenţial oncogen au un coeficient G + C% mai apropiat de cel al celulelor mamiferelor, care este de aproximativ 40%. Grupul adenovirusurilor cuprinde virusuri:

- neoncogene, cu coeficient G + C 58%, - slab oncogene cu coeficient G + C 52%, - oncogene cu coeficient G + C 48%.

Genomul viral conţine informaţia genetică necesară desfăşurării ciclului de replicare în celula gazdă sensibilă: pentru replicarea genomului, pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul de constituenţi virali, pentru sinteza proteinelor structurale şi de reglare, pentru asamblarea şi eliberarea din celula gazdă a virionilor nou formaţi. Genomul viral asigură potenţialul de variabilitate a virusurilor şi infecţiozitatea acestora.

Genomul dezoxiribovirusurilor animale (cu excepţia celor din grupul Pox), precum şi genomul bacteriofagului λ se pot integra periodic în genomul celulei gazdă. Informaţia genetică pentru integrare şi menţinerea ei este furnizată de genomul viral. Unele virusuri animale capabile de integrare în genomul celulei gazdă produc concomitent transformarea malignă a celulei (virusurile oncogene).

Virusurile oncogene cu genom ARN (din grupul oncornavirusurilor, în care sunt incluse şi HIV I, HIV II) se integrează prin intermediul transcrierii ARN viral în ADN dublu catenar, acesta din urmă integrându-se în genomul celulei gazdă. Aceste virusuri ARN produc enzima numită reverstranscriptază, care este o ADN polimerază ARN - dependentă, capabilă să sintetizeze ADN pe matriţă de ARN.

Capsida virală este un înveliş proteic, cu o structură diferenţiată în funcţie de tipul de virus. Unitatea structurală a capsidei este capsomera, care este alcătuită dintr-un lanţ polipeptidic sau un agregat de catene polipeptidice identice sau diferite. Capsomerele sunt cele mai mici unităţi structurale vizibile la microscopul electronic. În funcţie de dispunerea capsomerelor, virusurile prezintă trei tipuri de simetrie: helicală (helicoidală), icosaedrică, mixtă (binară). La virusurile cu simetrie helicală capsomerele sunt formate dintr-un singur polipeptid (sunt monomere), reprezentând atât unitatea morfologică, cât şi unitatea structurală a capsidei. La virusurile cu simetrie icosaedrică, capsomerele sunt alcătuite din mai multe tipuri de proteine (sunt oligomere), ele reprezentând numai unitatea morfologică a capsidei, alcătuită din mai multe unităţi structurale. Capsomerele pot fi pentoni (conţin 5 subunităţi de structură, sunt pentamere) sau hexoni (conţin 6 unităţi de structură, sunt hexamere). Rolul capsidei virale este acela de a proteja materialul genetic viral de degradarea produsă de nucleazele celulare, de a contribui la fixarea şi pătrunderea virusului în celula gazdă, de a determina spectrul de gazdă a virusului prin specificitatea interacţiunii capsidei virale cu receptorii specifici complementari prezenţi pe suprafaţa celulei gazdă. Capsida virală conţine determinanţi antigenici responsabili de producerea răspunsului imun în organismele infectate. Învelişul extern (peplosul) este derivat din membrana celulară când virusul părăseşte prin înmugurire celula gazdă în care s-a replicat. Este o structură accesorie, caracteristică virusurilor "acoperite". În structura peplosului intră un dublu strat fosfolipidic provenit din membrana celulară, în care sunt implantate proteine proprii celulei gazdă şi proteine specific virale, codificate de genomul viral. Lipidele din învelişul extern sunt diferite, în funcţie de celulele în care s-a replicat virusul.

La nivelul peplosului se găsesc formaţiuni de natură glicoproteică, numite spicule, de formă prismatică sau de buton, care sunt codificate de genomul viral. Proteina din componenţa spiculelor este de natură cert virală, glicozilarea fiind efectuată de celula gazdă în timpul parcurgerii drumului intracelular de la locul de sinteză până la suprafaţa celulei de către proteina virală. Semnificaţia biologică a capsidei şi a peplosului Capsida virală este o structură ce protejează genomul viral şi participă la infectarea celulei gazdă. Învelişul extern consolidează funcţiile capsidei, asigurând stabilitatea nucleocapsidei, iar spiculele favorizează faza de adsorbţie a virusurilor pe celula gazdă şi pătrunderea acestora în celulă. În componenţa virusurilor intră 3 tipuri de proteine:

♦ proteinele capsidale, cu greutate moleculară de 12 - 110 kdal; la cele mai multe virusuri ele sunt identice, la altele sunt diferite;

♦ proteine interne, situate în interiorul nucleocapsidei virale, alcătuind împreună cu acidul nucleic viral corpul central (nucleoidul viral); rolul lor este de a menţine genomul viral în formă condensată;

♦ proteine cu rol enzimatic, prezente la unele virusuri animale; existenţa acestor enzime nu infirmă faptul că virusurile nu au echipament enzimatic de biosinteză, ele având rol în replicarea genomului viral.

Exemple: � ARN-polimeraza poxvirusurilor şi a virusului gripal este o transcriptază ce

sintetizează ARN pe matriţă de ADN; � neuraminidaza virusului gripal, localizată la nivelul spiculelor din învelişul

extern, degradează mucoproteinele şi receptorii celulari de la nivelul căilor respiratorii ale animalelor, favorizând infecţia virală;

� reverstranscriptaza este o ADN polimerază ARN - dependentă prezentă la virusurile ARN oncogene (HIV, retrovirusuri).

MULTIPLICAREA VIRUSURILOR

Multiplicarea virusurilor (replicarea virală) are loc exclusiv în celula gazdă vie, care le furnizează materialul de construcţie (aminoacizi, baze nucleice, polizaharide) şi dispozitivul celular de biosinteză (ribozomi, sisteme generatoare de energie, ARNt). Această comportare corespunde parazitismului absolut pe care virusurile îl exercită asupra celulei gazdă.

Replicarea decurge într-o serie de etape succesive: - Adsorbţia şi fixarea reversibilă a virusurilor pe celulă este o consecinţă a

ciocnirilor întâmplătoare între virusuri şi celulă, rezultate din mişcarea browniană a celulelor. Este un proces nespecific, reversibil, determinat de atracţia ionică, eficienţa procesului fiind dependentă de numărul de virioni din suspensia virală (cu cât numărul de virioni este mai mare, cu atât creşte eficienţa procesului de adsorbţie). Uneori sunt necesare milioane de ciocniri pentru un singur virion.

- Ataşarea sau fixarea ireversibilă a virusurilor pe celulă este un proces ireversibil, datorat diferitelor grade de specificitate a fixării virusului pe celula gazdă; este determinat de complementaritatea geometrică şi electrostatică între structurile de pe suprafaţa virusurilor şi receptorii specifici de virus de pe suprafaţa celulelor, care recunosc aceste structuri. Cea mai mare specificitate de fixare există între bacteriofag şi bacterie, cea mai mică între virusul vegetal şi celula vegetală (aceasta nu are receptori pentru virus).

Celulele vegetale nu au receptori de virus pe suprafaţa lor. Virusurile plantelor nu pot adera la suprafaţa peretelui celulozic al celulei vegetale. Nu pot străbate această barieră decât dacă integritatea peretelui celular a fost afectată prin leziuni mecanice. Infectarea celulelor vegetale necesită cantităţi mari de virus, dar odată realizată infecţia, aceasta va duce la o multiplicare virală intensă.

La extrema cealaltă se situează relaţia bacteriofag – bacterie gazdă, unde există un înalt grad de specificitate a interacţiunii gazdă – parazit. Bacteriofagii au structuri complexe, cu ajutorul cărora se fixează pe receptorii de pe suprafaţa celulelor gazdă. Receptorii celulari au o pronunţată complementaritate geometrică şi biochimică faţă de structura fagului şi deci o specificitate crescută.

Virusurile animale ocupă o poziţie intermediară în ceea ce priveşte specificitatea interacţiunii cu celula gazdă, fixarea fiind mai puţin specifică şi eficientă decât în cazul bacteriofagilor, dar mai specifică decât în cazul virusurilor vegetale. Unele virusuri animale necesită prezenţa unor receptori specifici pe suprafaţa celulelor gazdă pentru a se putea fixa, prezentând un citotropism pronunţat, cu consecinţe majore pentru patogenitate.

De exemplu poliovirusul se fixează numai pe celule de om şi de maimuţă. Fiind un enterovirus, în celula gazdă are specificitate de fixare pentru celulele epiteliale din mucoasa intestinală, infecţia cu poliovirus realizându-se pe cale digestivă. De asemenea, poliovirusul prezintă un citotropism pronunţat pentru motoneuronii din coanele anterioare ale măduvei spinării, în urma fixării de receptorii specifici de pe suprafaţa acestor celule. Distrugerea motoneuronilor duce la paralizii ale muşchilor striaţi.

In vitro, poliovirusul poate infecta şi alte tipuri de celule (de exemplu, celule renale de maimuţă), diferite de cele ale epiteliului intestinal şi de motoneuronii medulari. In vitro suprafaţa celulelor respective este modificată din cauza condiţiilor de cultivare, fapt care duce la “demascarea” unor receptori celulari normali, care erau în stare ascunsă. Receptorii de virus sunt constituenţi normali de pe suprafaţa celulelor animale, cu o configuraţie structurală anume, de care virusurile se leagă în mod specific. Specificitatea virusurilor este conferită de o micromoleculă sau de mai multe molecule existente la nivelul virionului. Definirea receptorului celular de virus este dificilă, deoarece particula virală este un ligand de dimensiuni mari, care interacţionează cu o suprafaţă mare a celulei, unde se găsesc molecule de legare specifice şi nespecifice. Unele virusuri se pot lega de receptori diferiţi pe tipuri diferite de celule. Virusurile învelite se leagă de receptorii celulari prin glicoproteinele peplosului. Structurile de fixare pe celula gazdă ale virusurilor nude cu simetrie icosaedrică sunt situate în vârfurile icosaedrului, fiind polipeptide ale capsidei sau proteine fibrilare proeminente în vertexuri. Receptorii celulari specifici pentru aceste structuri sunt încă necunoscuţi.

Celulele organismelor animale au receptori pentru un număr mare de agenţi infecţioşi, fiind aproximativ 10000–100000/cel. Ei îndeplinesc funcţii celulare normale.

- Pătrunderea virusurilor în celulă se face diferit: virusurile animale pătrund integral prin endocitoză (viropexie) sau fuziune; virusurile vegetale pătrund prin leziunile mecanice ale peretelui celular; bacteriofagii îşi injectează genomul în interiorul celulei bacteriene.

Virusurile animale pătrund în celulele receptive ca virioni integrali. Există două mecanisme fundamentale de pătrundere a virusurilor în celulele animale: endocitoza şi fuziunea.

Endocitoza este mecanismul predominant, ca rezultat al interacţiunii virion – receptor de pe suprafaţa celulei gazdă. Este un proces activ de ingestie celulară, analog pinocitozei. Endocitoza implică o strânsă potrivire între conturul virionului şi membrana celulară, care se realizează progresiv, prin recunoaşterea virion – receptor celular iniţial la nivelul unor puncte de fixare, urmată de o unire treptată prin mecanismul de fermoar, ce asigură adaptarea riguroasă la membrana. Acest mecanism este întâlnit la toate virusurile nude, dar şi la virusul gripal şi la poxvirusuri.

Legarea iniţială a virionului de receptorii celulari generează un semnal care declanşează emiterea unor pseudopode prin activarea proteinelor contractile intracelulare. Membrana celulară alunecă pe suprafaţa virionului, procesul continuând până când se formează o vacuolă de endocitoză, numită pinosom, virionul întreg ajungând în celulă, învelit de vezicula derivată din membrana plasmatică. Membrana celulară se reface după formarea pinosomului. Pereţii veziculei citoplasmatice se dezintegrează ulterior, eliberând virionul în celulă.

Fuziunea suprafeţei virusului cu membrana celulară la zona de contact are drept urmare dizolvarea învelişului viral şi formarea unui canal la nivelul peretelui celular, care permite trecerea virionului în citoplasmă. Este întâlnită la virusurile învelite şi este dependentă de glicoproteinele existente în învelişul extern viral.

Cele două mecanisme nu se exclud. Există virusuri care folosesc ambele căi de pătrundere în celula gazdă. În cazuri particulare intervin şi alte mecanisme.

- Decapsidarea şi eclipsa reprezintă eliberarea genomului viral de învelişul proteic. Învelişul extern este dezintegrat, capsida este descompusă până la capsomere, componentele rezultate trec în rezerva celulară şi sunt folosite de celulă la sintezele ulterioare. La sfârşitul perioadei de decapsidare virusul se găseşte sub formă de genom viral liber în celulă (virus vegetativ), stare în care poate fi transcris, tradus, replicat.

La unele virusuri (enterovirusuri) decapsidarea se face chiar la nivelul membranei celulare. La alte virusuri decapsidarea se realizează în citoplasmă, după integrarea virusului în celulă, sub acţiunea diferitelor enzime celulare.

Perioada în care genomul viral este eliberat de învelişul proteic a fost descrisă iniţial ca o fază de dispariţie a virusului, numită fază de eclipsă, deoarece virusul infecţios nu mai putea fi evidenţiat la microscopul electronic. În realitate el există în celulă, dar este doar greu de detectat. Această fază de decapsidare are o durată variabilă, în funcţie de tipul de virus (poliovirusurile 1- 2 ore, papovavirusurile 12 – 14 ore).

- Migrarea intracelulară până la locul de replicare se poate face direct (transmembranar) sau indirect prin structuri canaliculare preformate.

După pătrunderea în celulă, virusurile se deplasează la locul de replicare. Cele care se multiplică în citoplasmă ajung la destinaţie direct, imediat ce trec prin membrana citoplasmatică. Cele care au o parte a ciclului de replicare în nucleu (de exemplu adenovirusurile, herpesvirusurile, papovavirusurile, virusul gripal) necesită un transfer rapid de la periferia celulei până în nucleu.

Nu se cunosc foarte exact mecanismele acestor deplasări intracelulare. Teoretic, ele pot avea loc direct, transmembranar, trecând prin membranele intracitoplasmatice care se interpun în calea lor sau indirect, prin structuri canaliculare preformate existente în celulă. Ambele căi de deplasare presupun că aceasta este vectorială, nu este întâmplătoare.

La virusurile care se replică în nucleu procesul de replicare durează mai mult

(http://micro.magnet.fsu.edu/cells/endosomes/endosomes.html)

- Sinteza proteinelor timpurii se realizează pornind de la genomurile virale

infectante (iniţiale), sub controlul genelor precoce din genomul viral. Are loc transcrierea genelor precoce şi traducerea informaţiei genetice la proteine,

care sunt numite proteine timpurii sau precoce. Acestea sunt necesare în cantităţi mici, deoarece în general sunt proteine enzimatice, care pot relua de mai multe ori ciclul de activitate. Sinteza proteinelor timpurii se face pornind de la genomurile iniţiale, infectante.

Proteinele timpurii sunt: - proteine de reglare, care inhibă sinteza de ADN, ARN, proteine specifice

celulei gazdă, modificând specificitatea sistemului de replicare, transcriere şi traducere şi deviind astfel metabolismul celulei gazdă în sensul sintezei de constituenţi virali;

- proteine enzimatice de tipul ADN-polimeraze, ARN-polimeraze, nucleaze, ligaze, care participă la procesul de replicare virală;

- proteine de matrice, care au rolul de a delimita matricea în care va avea loc replicarea acidului nucleic viral şi morfogeneza virală, în cazul unor virusuri.

- Etapa de replicare a genomului viral este o etapă complexă, în funcţie de structura genomului viral. Sunt cel puţin 6 clase diferite de replicare a genomului viral. În urma acestei faze rezultă mii de genomuri virale progene.

- Biosinteza proteinelor tardive se realizează pornind de la genomurile replicate (progene), nu de la cele parentale; se sintetizează în număr mare, deoarece vor constitui viitoarele virusuri mature. Setul de gene tardive este transcris numai de la genomurile progene; se face mai întâi transcrierea unui ARN premesager, prin procesare se îndepărtează intronii, se sudează exonii, iar ARNm matur rezultat este tradus la proteine. Proteinele tardive sunt de 4 tipuri:

- proteine structurale, categorie majoră, care intră în constituţia virionilor; - proteine de reglare, care controlează expresia genelor timpurii şi a celor

pentru sinteza proteinelor structurale, astfel încât acestea sunt sintetizate în cantitate suficientă;

- proteine de morfogeneză (eşafodaj) în cazul virusurilor cu structură complexă, formând structuri temporare pe care se aşază capsomerele;

- proteine care facilitează eliberarea virusurilor din celulele infectate. - Morfogeneza virală reprezintă procesul prin care diferitele molecule virale

acumulate în celulă sunt asamblate în virioni maturi fie prin autoasamblare, fie prin depunerea simetrică a acestora pe suprafaţa unor proteine de morfogeneză.

Replicarea şi morfogeneza virusurilor sunt procese intracelulare, care au loc fie în citoplasmă, fie în nucleu, în funcţie de tipul de virus.

Ribovirusurile se replică în citoplasmă, cu excepţia virusului gripal, la care nucleocapsida se formează în nucleu, hemaglutininele în citoplasmă, iar învelişul extern provine din membrana citoplasmatică a celulei gazdă, odată cu eliberarea virionului prin înmugurire din aceasta.

Genomul dezoxiribovirusurilor este replicat şi transcris în nucleu, iar sinteza proteinelor se realizează integral în citoplasmă. În cazul virusurilor ADN care sunt asamblate în nucleu (herpesvirusuri, papovavirusuri, adenovirusuri), proteinele virale sintetizate în citoplasmă sunt transportate în nucleu, unde are loc morfogeneza. Excepţie fac poxvirusurile, a căror replicare şi morfogeneză se realizează în citoplasmă.

- Eliberarea virusurilor din celulă este explozivă sau prin înmugurire. Eliberarea explozivă este caracteristică în special celulelor bacteriene infectate cu

bacteriofagi şi duce la liza celulelor în momentul eliberării virusurilor progene. Celula bacteriană este profund alterată, peretele celular nu rezistă la modificările produse şi celula explodează, eliberând zeci de mii de fagi progeni.

Eliberarea prin înmugurire (prin exocitoză) este caracteristică virusurilor învelite; într-o primă fază, virusurile determină sinteza de spicule virale. Aceste glicoproteine sunt apoi transportate spre suprafaţa membranei celulare. În zonele în care s-au depus glicoproteinele virale, în anumite zone ale suprafeţei interne a membranei celulare, se depune o proteină specială, specific virală, numită proteină de membrană, de matrice, proteină M. Zonele respective au fost numite petice, iar nucleocapsidele virale din citoplasmă se leagă de acestea. Ulterior, membrana celulară se bombează ca sub acţiunea unei presiuni interne, apare un început de mugure care continuă să se mărească spre exterior şi apoi are loc separarea mugurelui respectiv şi desprinderea lui de celula gazdă. Virusul este astfel delimitat de învelişul extern provenit din membrana celulară (cu fosfolipide şi proteine caracteristice gazdei, dar cu spicule caracteristice virusului).

Procesul de înmugurire continuă atâta timp cât celula mai conţine virioni, putându-se forma câte 5- 6 muguri în acelaşi timp. Este asigurată refacerea celulei după desprinderea mugurilor, celula gazdă fiind menţinută în stare viabilă până se eliberează toţi virionii formaţi.

(http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/influenza.php)

BACTERIOFAGII

Bacteriofagii sunt virusuri adaptate să paraziteze celula bacteriană şi prin multiplicare produc liza acesteia. Ei au fost descoperiţi în 1915 de către Twort şi redescoperiţi apoi în 1917 de către d’ Herelle, acesta din urmă denumindu-i bacteriofagi (“mâncători de bacterii”). Bordet şi Ciucă au descoperit fenomenul de lizogenie, de integrare a genomului fagic în genomul bacteriei gazdă, fapt care determină o stare de echilibru între fagul infectant şi bacteria infectată. Structura fagilor e diferită de la un grup de bacteriofagi la altul, unii au forma unor capside mici, cu simetrie icosaedrică (de exemplu fagul ØX174), alţii prezintă formă filamentoasă, cu simetrie helicală (fagul M13), iar alţi bacteriofagi au formă de cireaşă cu coadă, prezentând o coadă complexă, scurtă sau lungă, rigidă sau flexibilă.

Morfologia fagului T4 Fagul T4 prezintă un cap în care se găseşte informaţia genetică virală reprezentată de o moleculă de ADN dublu catenar linear şi o coadă cu structură complexă, între cap şi coadă adaptarea simetriei fiind realizată de un gât. Capul fagului are un contur hexagonal bipiramidal, cu simetrie icosaedrică (icosaedrul este un poliedru regulat cu 20 de feţe triunghiuri echilaterale, cu 30 de muchii numite creste şi 12 vârfuri numite vertexuri). Cele două prisme terminale se găsesc una faţă de cealaltă într-o poziţie corespunzând unei rotaţii de 30˚, astfel încât capul fagului este o antiprismă hexagonală bipiramidală. Gâtul fagului este o structură simplă, de forma unui cilindru, cu funcţie de adaptor de simetrie întere cap (simetrie icosaedrică) şi coadă (simetrie helicală). La nivelul său se găseşte un guler de forma unei plăci hexagonale, care prezintă central o perforaţie prin care trece gâtul. Pe faţa inferioară a gulerului se găsesc situsuri la nivelul cărora se prind extremităţile fibrelor cozii. Coada fagului prezintă în partea centrală un cilindru axial, gol la interior, cu o lungime mult mai mare decât teaca cozii, cu rolul de a perfora peretele celular al celulei pe care o infectează. Teaca acoperă cilindrul axial şi este alcătuită din 144 de capsomere, dispuse pe 24 de şiruri paralele, cu o simetrie helicală. Coada fagului este contractilă. Când bacteriofagul se fixează pe o celulă bacteriană, extremitatea distală a fibrelor cozii se desprinde de faţa inferioară a gulerului, iar coada se strânge şi se îngroaşă, eliberând cilindrul axial pe o porţiune mai mare. Contracţia se realizează prin modificarea poziţiei capsomerelor din teacă, ele se apropie între ele pe verticală şi se îndepărtează pe orizontală. La baza cozii se găseşte placa bazală, care are o structură asemănătoare cu gulerul, cu contur hexagonal, dar nu este perforată la mijloc. De zona centrală se leagă 6 punţi care se îndreaptă către cele 6 unghiuri ale plăcii. Ele dau posibilitatea plăcii să îşi modifice forma când se leagă de celula bacteriană. Pe faţa inferioară a plăcii bazale, la fiecare unghi se găseşte câte un cârlig, la nivelul căruia se leagă cele 6 fibre ale cozii. Fibrele cozii sunt alcătuite din câte 4 segmente identice. Când extremitatea fibrelor este legată de faţa inferioară a gulerului, în jurul tecii cozii se formează un înveliş extern al cozii. În faza premergătoare fixării fagului de celula bacteriană, fibrele se desprind de guler şi au aspectul unor picioare de păianjen.

Genomul fagului T4 este reprezentat de o moleculă de ADN dublu catenară, lineară, cu o lungime de aproximativ 200 de gene. În interiorul capului se găsesc şi o proteină internă (aproximativ 1000 molecule), un polipeptid acid (aproximativ 3000 molecule), spermidină (aproximativ 3000 - 4000 molecule) şi putresceină (aproximativ 6000 molecule).

Fagul lambda Organizarea genomului fagului lambda (λ)

Genomul fagului λ este format dintr-o moleculă de ADN dublu catenară, care în capul fagului este lineară, dar se circularizează în celula bacteriană. Are o greutate moleculară de 31x106 Dal, care ar corespunde unei lungimi de aproximativ 50 Kpb. Dacă, în general, o proteină a procariotelor este codificată de 1 Kpb, acest genom codifică aproximativ 50 de proteine. Genomul fagului λ prezintă la extremităţi cozi monocatenare, formate din 12 dezoxiribonucleotide, care sunt complementare. Cozile monocatenare formează porţiunile cos (cohesive ends): cos L (la stânga) şi cos R (la dreapta). Aceste prelungiri permit circularizarea genomului fagic (cercul Hershey) atunci când este injectat în celula gazdă. Prin unirea celor două capete coezive se formează situsul cos.

Genomul fagului λ cuprinde mai multe gene, fiind organizat pe module funcţionale. El se poate exprima în procente (%) sau în kiloperechi de baze: - porţiunea cos L - o porţiune de 20 Kpb, care cuprinde:

- modulul cu gene care codifică proteinele capului: A, W, B, C, D, E - modulul cu gene pentru proteinele de împachetare: F1, F2 - modulul cu gene care codifică proteinele cozii: H, G, M, L, K, I, J

- un modul de aproximativ 10 Kpb, notată b2, dispensabil pentru ciclul de replicare fagică, al cărui rol nu este cunoscut - modulul pentru integrarea genomului fagic în cromozomul celulei bacteriene gazdă, care cuprinde: - situsul att (attachement site), complementar unui situs din cromozomul bacterian, care permite unirea genomului fagic cu cel bacterian - gena int, care codifică o proteină responsabilă de integrarea ADN fagic în cromozomul bacterian, numită integrază - gena xis, care codifică o enzimă responsabilă de excizia genomului fagic din cromozomul bacterian, sub acţiunea factorilor inductori

- modulul responsabil de recombinare, cu genele Exo β şi Exo γ - modulul cu gene care codifică proteine de reglare: C III (la acest nivel fiind situaţi şi promotorul şi operatorul L, POL), N, C I (la acest nivel fiind situaţi şi promotorul şi operatorul R, POR) - modulul cu gene implicate în replicarea genomului: O, P - modulul cu gene implicate în liza celulei gazdă: Q, S, R - porţiunea cos R.

Relaţia bacteriofag – bacterie

O celulă bacteriană normală îşi desfăşoară metabolismul într-un mod perfect ordonat. Activităţile sale sunt coordonate armonios, conform principiului optimalităţii, care asigură o foarte mare eficienţă în sinteza constituenţilor celulari, deci în creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Este o ordine biologică normală, asigurată de informaţia genetică nucleosomală, ce coordonează ansamblul activităţilor celulare prin acţiunea genelor reglatoare. În momentul în care în celula bacteriană pătrunde o informaţie genetică străină, spre exemplu cea a unui bacteriofag, există mai multe posibilităţi de evoluţie: 1. Restricţia: Această situaţie echivalează cu dominanţa bacteriei asupra genomului fagic, fiind un fenomen de apărare a celulei bacteriene, echivalent cu starea de imunitate a organismelor superioare. Bacteria recunoaşte informaţia genetică străină şi, prin intermediul unor enzime specifice, numite endonucleaze de restricţie sau restrictaze, clivează informaţia străină în fragmente de dimensiuni variabile, introducându-le apoi în rezerva celulară de baze azotate, zaharuri şi acid fosforic. 2. Starea de relativ echilibru: În această situaţie informaţia genetică fagică este integrată în structura genetică a celulei bacteriene, devenind astfel un provirus (profag). Genomul fagic integrat în "cromozomul" celulei bacteriene se comportă ca şi genele cromozomale, fiind replicat odată cu acestea, iar procesul de replicare a fagului este represat (blocat). Ordinea biologică bacteriană coordonează activitatea celulei în această stare de relativ echilibru. Integrarea ADN-ului fagic în ADN-ul bacteriei gazdă corespunde stării de lizogenie. Sub acţiunea unor factori inductori (fizici sau chimici), în anumite condiţii, apare fenomenul de inducţie fagică, ce constă în excizarea (desprinderea) genomului fagic din "cromozomul" bacterian, urmată de replicarea ADN-ului fagic, sinteză de proteine fagice, asamblarea componentelor în particule fagice mature şi liza celulei gazdă.

3. Dominaţia ordinei virale: În această situaţie, care corespunde ciclului litic, genomul fagic reuşeşte să perturbe activitatea bacteriană, determinând celula gazdă să asigure sinteza constituenţilor virali (să asigure replicarea genomului fagic şi sinteza proteinelor fagice), după care are loc asamblarea acestora în particule fagice mature şi liza celulei bacteriene gazdă. Pentru a realiza sinteza de componente fagice, este necesar, într-o primă fază, ca starea fiziologică a celulei să nu fie profund alterată. Foarte multe dintre activităţile celulei, deşi controlate de informaţia virală, decurg normal.

Când virusul se găseşte în cea mai mare cantitate în celulă, starea acesteia este profund alterată, ducând la liză celulară. Această fază corespunde perioadei în care are loc asamblarea moleculelor nou sintetizate specifice virusului, care se găsesc sub controlul genomului viral şi se numeşte faza de diataxie. Virusul este deci multiplicat de către celula gazdă. Această stare de dominaţie virală asupra celulei gazdă corespunde stării de parazitism absolut specific virusurilor, care nu trebuie confundat cu parazitismul unor bacterii patogene asupra celulelor eucariote. Bacteria parazită intracelular găseşte în celula gazdă protecţie faţă de condiţiile de mediu înconjurător, nutrienţii necesari metabolismului lor, dar îşi păstrează tot timpul integritatea structurală şi funcţională, cresc, ajung în punctul critic şi apoi se divid. Multiplicarea lor începe de la ansamblul integrat al structurilor lor, la proces participând toate componentele celulare. Virusul oferă celulei gazdă doar informaţia genetică ce deviază activitatea celulei în sensul sintezei de componente virale. Între un bacteriofag şi bacteria infectată pot exista două tipuri de relaţii: � între un fag virulent şi o bacterie sensibilă are loc o relaţie de tip litic, care duce la

distrugerea celulei gazdă, numită şi celulă permisivă; liza celulei bacteriene gazdă duce la eliberarea de tip exploziv a particulelor virale; relaţia este caracteristică fagilor din seria Tpar;

� între un fag temperat şi o bacterie sensibilă relaţia poate avea două căi de evoluţie: � infecţia productivă, care determină liza celulei gazdă, desfăşurându-se ciclul litic;

în urma multiplicării fagului în celulă are loc distrugerea celulei, cu eliberarea particulelor virale; Ciclul litic de replicare în cazul bacteriofagului λ constă în transcrierea

informaţiei genetice a modulelor responsabile de sinteza proteinelor capului, de împachetare, de sinteza proteinelor cozii, de replicare a ADN şi de liza celulară.

• în ciclul litic, gena C I din zona de reglare, responsabilă de sinteza unui represor, este blocată; • funcţionează gena N I, responsabilă de sinteza unui inductor de natură proteică, ce

acţionează asupra celor doi promotori, determinând începerea transcrierii spre dreapta pe o catenă şi spre stânga pe cealaltă. Astfel se transcriu genele Exo β şi Exo γ, precum şi genele O, P, Q, S, R, A, W, B, C, D, E; • după transcriere se sintetizează proteinele corespunzătoare, are loc replicarea

genomului fagic, asamblarea componentelor în particule fagice mature şi eliberarea bacteriofagilor din celula gazdă.

� evoluţia spre lizogenizare, cu desfăşurarea ciclului lizogen; genomul fagic pătruns în celulă se integrează în genomul celulei gazdă, devenind profag; se instalează faza de toleranţă a celulei bacteriene faţă de profag, care se replică odată cu cromozomul bacterian. Acest tip de evoluţie este întâlnit la bacteriofagul λ. În infecţia cu bacteriofagul λ,

etapele sunt: faza de adsorbţie iniţială, relativ lipsită de specificitate, în care fagul vine în contact cu celula bacteriană gazdă prin intermediul fibrelor cozii; adsorbţia ireversibilă, care este specifică şi se desfăşoară prin intermediul cârligelor cozii (legătura se face între bacteriofag şi receptorii de pe suprafaţa celulelor bacteriene, mai precis de la nivelul peretelui celular şi acizilor teichoici la bacteriile Gram pozitive şi de la nivelul membranei externe la bacteriile Gram negative, ori de la nivelul capsulei bacteriene sau

flagelilor); infectarea celulei prin injectarea genomului fagic (teaca cozii se contractă, cilindrul axial al cozii străbate peretele celular, ADN-ul fagului trece în celulă împreună cu proteinele legate ionic de acesta; structura proteică a fagului rămâne la exterirul celulei); integrarea genomului viral în genomul celulei bacteriene infectate; la iniţierea ciclului litic are loc excizia genomului fagic, replicarea acestuia şi liza celulei bacteriene gazdă.

În ciclul lizogen gena reglatoare C I este funcţională, este transcrisă şi duce la sinteza unei proteine represor, care blochează promotorii POR şi POL, blocând astfel transcrierea genelor responsabile de sinteza proteinelor structurale, de maturare, de replicarea ADN şi de liza celulară. Este represat astfel ciclul litic.

• de la nivelul unui alt promotor începe transcrierea genelor din modulul de integrare a ADN fagic în ADN-ul celulei bacteriene gazdă;

• are loc transcrierea şi apoi sinteza integrazei, enzimă codificată de gena int, care duce la integrarea ADN-ului fagic în ADN-ul bacterian;

• integrarea fagului se realizează cu ajutorul situsului att, care se prinde de situsul de ataşare de la nivelul ADN-ului bacterian. Situsul att fagic (POP’) prezintă o zonă centrală O de aproximativ 15 pb, complementară unui fragment O din situsul att bacterian.

• la bacterii, situsul att bacterian (BOB’) este situat între genele gal (pentru sinteza galactozei) şi bio (pentru sinteza biotinei);

• ca urmare a acţiunii integrazei codificată de gena int fagică, are loc o recombinare de tip crossing – over între situsul att fagic şi situsul att bacterian prin zona O. În acest fel, ADN-ul fagic este integrat în ADN-ul bacteriei gazdă. Evoluţia spre ciclul litic sau spre lizogenie depinde de starea fiziologică a celulei

bacteriene infectate, care influenţează funcţionarea sau nefuncţionarea unei gene reglatoare din genomul fagic. Starea de lizogenie nu este permanentă, ci sub influenţa unor agenţi inductori (factori fizici: temperatura, radiaţii U.V. sau ionizante; factori chimici) profagul trece din starea integrată în stare de genom vegetativ, liber în celula gazdă, prin excizia din genomul bacterian (inducţie fagică). Se iniţiază astfel ciclul de replicare fagică, ce duce la liza celulei bacteriene gazdă.

Sub acţiunea factorilor inductori se sintetizează produsul genei xis. Genomul fagului λ se poate exciza corect, refăcând informaţia genetică iniţială

sau incorect, încorporând un fragment de ADN bacterian aflat în imediata apropiere a situsului att. O parte din ADN-ul fagic va rămâne în acest caz integrat, deoarece în învelişul proteic al fagului se va încorpora un fragment cu dimensiuni exacte.

Dacă un astfel de ADN fagic excizat incorect ajunge într-o altă celulă bacteriană şi se integrează în cursul ciclului lizogenic, transferă informaţia genetică bacteriană preluată de la gazda anterioară (proces de transfer de material genetic numit transducţie fagică).

Fagul cu informaţia genetică incompletă are nevoie de prezenţa unor fagi normali pentru a se elibera din celula gazdă şi pentru a pătrunde în altă celulă bacteriană.

AGENŢII INFECŢIOŞI SUBVIRALI

Agenţii infecţioşi subvirali sunt de dimensiuni mult mai mici decât virusurile, sunt foarte patogeni şi determină boli grave la plante şi animale. Ei sunt reprezentaţi de viroizi, virusoizi, virino şi prioni. Viroizii Viroizii reprezintă o categorie specială de agenţi infecţioşi subvirali, patogeni exclusiv pentru plante, caracterizaţi printr-un genom alcătuit din ARN pur, fără capsidă proteică şi fără stadiul de virion. Informaţia genetică este foarte mică, dar sunt capabili de replicare în celula gazdă infectată. Viroizii au fost descoperiţi accidental în 1971 de către Diener, care încerca să caracterizeze agentul etiologic al bolii tuberculilor fusiformi la cartof. Viroizii poartă numele maladiei pe care o determină, de exemplu: viroidul tuberculilor fusiformi la cartof, viroidul nanismului şi marmorării clorotice a crizantemelor, viroidul nanismului hameiului. La microscopul electronic viroizii apar ca structuri lineare, ca nişte bastonaşe uşor curbate, cu lungimea de 50 nm şi grosimea de 2 – 2,5 nm, izolate sau în grupuri compacte, cu o greutate moleculară de 75 – 125 kDa. Pe lângă structurile lineare au fost detectate şi molecule circulare de 100 nm. Viroidul tuberculilor fusiformi la cartof este alcătuit dintr-o moleculă circulară de ARN, închisă covalent, cu 359 ribonucleotide (68% - 244 nucleotide - dintre ele fiind legate perechi, celelalte apărând ca zone monocatenare, fiind neperechi). Rezultă astfel o structură în ac de păr, cu anumite constrângeri topologice, molecula suferind o pliere tridimensională. ARN viroidal este lipsit de capacitate de codificare, datorită absenţei situsurilor de legare ribozomală, de aceea replicarea sa este total dependentă de celula gazdă. Unii autori consideră că este o moleculă care se replică autocatalitic, numindu-se şi ARN-

replicază. Replicarea viroizilor are loc în nucleul celulelor gazdă. Într-o celulă infectată se găsesc între 200 şi 10000 viroizi/celulă. Transmiterea viroizilor se face pe orizontală de la plantele bolnave la cele sănătoase, obişnuit pe cale mecanică, sau pe verticală prin polenul plantelor infectate. Infectarea ţesuturilor plantei cu viroizi duce la variaţii cantitative importante ale proteinelor normale, fiind probabil însoţite de perturbări ale mecanismelor de reglare a exprimării anumitor gene în celulă. Scade cantitatea de gibereline şi au loc tulburări de crştere.

Virusoizii Virusoizii sunt molecule mici de ARN monocatenar, circulare, covalent închise, incluse în stare fizic autonomă în capsida unor virusuri fitopatogene cu genom linear segmentat sau integrate în genomul viral. Spre deosebire de viroizi, genomul lor este încapsidat şi incapabil să infecteze plantele sensibile în absenţa virusului helper. Au fost descrişi la o varietate de mozaic marmorat al tutunului. Uneori se comportă ca molecule de ARN satelit, nefiind implicaţi în replicare. Replicarea lor se realizează în citoplasma celulei gazdă şi nu are loc în absenţa virusului helper. În unele cazuri, prezenţa lor asociată este obligatorie pentru producerea infecţiei.

Virino Sub această denumire a fost descris un agent infecţios subviral alcătuit dintr-o moleculă mică de acid nucleic asociată cu o proteină codificată de celula gazdă. El poartă informaţia genetică necesară pentru propria replicare, dar nu codifică sinteza unor proteine capsidale. Probabil are rol în reglarea activităţii celuleor infectate.

Prionii (proteine infectante) În 1967, radiologul Alper şi colaboratorii săi au raportat despre un agent infecţios

foarte rezistent la tratamentele care în mod normal distrugeau acizii nucleici, responsabil de transmiterea bolii scrapie. În acelaşi an, pornind de la sugestia că acest agent infecţios ar putea fi o proteină cu o abilitate surprinzătoare de autoreplicare în organismul gazdă, Griffith a formulat ipoteza proteinei infecţioase (protein-only hypothesis). Cercetările ulterioare nu au dus la descoperirea vreunui virus sau vreunui acid nucleic asociat cu acest agent infecţios.

În 1980 Stanley Prusiner a studiat evoluţia unor boli grave la animale şi om şi a găsit că agentul patogen era o moleculă de proteină infecţioasă. El a introdus în biologia moleculară termenul de prion cu semnificaţia de proteină infecţioasă.

Prionii, cunoscuţi anterior ca protovirinae, virusuri lente, virusuri convenţionale, reprezintă o categorie de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutate moleculară de 27000 – 30000 Da, unici prin rezistenţa lor la toate procedeele de inactivare care degradează acizii nucleici.

Prelucrarea însă a produsului patologic prin tratamente care degradează proteinele suprimă şi capacitatea infectantă a produsului.

Prionul e format exclusiv dintr-o moleculă de proteină care se replică în organismul gazdă în momentul în care e introdusă în gazda respectivă.

Bolile prionice produse de aceşti agenţi infecţioşi de origine pur proteică au fost considerate drept boli pseudoinfecţioase, comparativ cu bolile infecţioase clasice, ale căror agenţi etiologici sunt microorganisme ce conţin acizi nucleici. Principalele caracteristici ale bolilor prionice sunt:

- afectarea sistemului nervos central, cu producerea de encefalopatii spongiforme;

- perioada de incubaţie foarte lungă, de la câteva luni la 37 – 40 de ani; - evoluţia lentă, progresivă, letală; - proteina celulară normală (PrPc) din celula neuronală ar interacţiona, în cazul

unei infecţii prionice, cu izoforma ei infecţioasă (PrPres, rezistentă la proteinaza K), suferind o modificare conformaţională patologică.

Absenţa timp îndelungat a oricărui semn clinic şi lipsa totală a vreunui răspuns inflamator au constituit impedimente majore pentru găsirea unor posibilităţi de diagnostic precoce al acestor boli.

Au fost descrise, până în 1985, 3 boli prionicela om şi 3 la animale: - la om: - boala Kuru - boala Creutzfeldt - Jakob - sindromul Gerstmann – Sträussler – Scheinker - la animale: - scrapia (tramblanta oilor şi caprelor) - encefalopatia speciilor de cervicide - encefalopatia transmisibilă a nurcilor.

În 1986 au fost semnalate în Anglia primele 63 de cazuri de encefalită spongiformă la bovine (ESB); ulterior au fost semnalate şi la alte specii (de bovidee sălbatice şi felide sălbatice captive, pisici domestice) cazuri de encefalită spongiformă scrapie – like.

În prezent se cunosc 12 boli prionice, 6 descrise la animale şi 6 la om. Scrapia (tramblanta ovinelor) Scrapia este o boală endemică, întâlnită în mod natural la capre şi oi, care se

transmite maternal şi orizontal. Această boală, cunoscută în Anglia de mai bine de 200 de ani, e răspândită în toată lumea, mai puţin în Noua Zeelandă şi Australia (unde este eradicată). Boala devine evidentă numai atunci când agentul infecţios a ajuns la nivelul SNC. Animalele prezintă la început tremurături ale corpului, urmate de prurit foarte accentuat al pielii, ulterior apar tulburări legate de lezarea cerebelului (mers în zig-zag); fenomenul se accentuează până la paralizia şi moartea animalelor. Boala se agravează progresiv prin distrugerea neuronilor animalelor.

În cazul în care se confirmă anatomopatologic diagnosticul de scrapie chiar la un singur animal din turmă, se sacrifică întreaga turmă prin incinerare şi se autoclavează obligatoriu carcasele la 132 - 135˚C minim 20 minute.

Boala nu se poate preveni prin vaccinare. Agentul etiologic este rezistent la dezinfectanţii obişnuiţi. Pământul contaminat rămâne infecţios mult timp. Reziduurile animale de la oi pot fi şi ele infecţioase. În omogenatele de creier provenit de la oi bolnave de scrapie s-au izolat şi purificat 2 izoforme de proteine foarte apropiate între ele:

- o proteină prionică, - o proteină normală, celulară. Proteina prionică celulară purificată, inoculată la animale de laborator, nu este

capabilă să producă boala. Proteina prionică propriu – zisă are toate particularităţile unui agent infecţios. Izolată în stare pură şi inoculată la animale de laborator, după o perioadă de incubaţie declanşează boala.

Encefalita spongiformă bovină

Această boală a devenit o problemă europeană din cauza consecinţelor ei foarte grave pe plan mondial. A fost evidenţiată o legătură între agentul etiologic al encefalopatiei spongiforme bovine şi sindromul Creutzfeldt – Jakob la om.

Apariţia cazurilor de infecţie prionică la oameni în urma consumului de carne de vită infectată a arătat că proteinele prionice bovine pot traversa bariera de speice, aşa cum se presupune că s-a întâmplat şi în cazul transmiterii agentului etiologic al scrapiei la bovine. Au existat ipoteze conform cărora agentul prionic s-ar putea transmite şi prin lapte sau encefalopatia spongiformă bovină ar putea să apară spontan la bovine.

Se consideră că perioada de incubaţie a bolii este de aproximativ 10 ani, iar durata medie a bolii de 14 ani.

Boala Kuru

A fost descrisă exclusiv la populaţia tribului Fore din Papua – Noua Guinee. Boala începe cu o febră puternică, dureri articulare, dificultăţi în mers, cu lipsă în coordonarea mişcărilor (anarhice, neregulate) urmate de demenţă şi moarte. S-a concluzionat că boala se transmite pe cale orală datorită unor obiceiuri de canibalism ritual. Numărul bolnavilor la acest trib e în scădere de la an la an şi bolnavii sunt mai bătrâni decât cei din anii anteriori.

Perioada de incubaţie este de aproximativ 30 ani, boala fiind asociată cu leziuni la nivelul sistemului extrapiramidal, cu mişcări anormale, rigiditate, evoluţie spre demenţă şi moarte. În majoritatea cazurilor a fost descrisă vacuolizarea neuronilor şi proliferarea celulelor astrogliale.

Sindromul Jacob – Creutsfeld (CJ)

Această boală are o frecvenţă de 1 la un milion şi apare în jurul vârstei de 60 de ani, manifestându-se prin mişcări anormale, rigiditate, tulburări psihice de tip demenţial. Poate să apară sporadic, ereditar – familial sau prin infecţie exogenă, descriindu-se: � Boala CJ sporadică a fost descrisă la toate vârstele adulte, dar nu la copil (au fost

descrise cazuri cu o mare frecvenţă la vârste între 70 – 79 de ani. La vârste de peste 80 de ani apar de obicei alte tipuri de demenţă (boala Alzheimer, demenţa vasculară de origine genetică); boala este mai frecventă la populaţia albă decât la cea neagră, la femei decât la bărbaţi; media de viaţă este de aproximativ 7 luni, incidenţa bolii şi mortalitatea fiind asemănătoare în toate ţările europene;

� Boala CJ genetică (ereditară, familială) se pare că ar fi posibilă prin mutaţii punctiforme sau inserţionale.

Sindromul Gerstmann – Straussler – Scheinker (GSS)

Este o varietate naturală a sindromului CJ, caracterizată prin instalarea precoce a incapacităţii de coordonare a mişcărilor, prin leziuni cerebeloase şi demenţă.

GENETICA BACTERIANĂ

Genomul bacterian include două categorii de determinanţi genetici: � determinanţi esenţiali, reprezentaţi de nucleosomul bacterian (genofor, lineom,

nucleoid); � determinanţi accesorii, neesenţiali, care pot lipsi din celulă fără a afecta viabilitatea

acesteia, reprezentaţi de elementele genetice extracromozomale (EGE): plasmidele, secvenţele de inserţie, transpozonii, la care se adaugă bacteriofagii cu capacitate de inserţie în genomul celulei gazdă.

Nucleosomul bacterian

Nucleosomul bacterian poartă în structura sa întreaga informaţie genetică necesară pentru existenţa unei celule bacteriene, adică setul de gene care codifică arhitectura celulei bacteriene, asigură metabolismul energetic şi de biosinteză al celulei, gene care sunt necesare creşterii şi diviziunii celulare, precum şi reglării diferitelor activităţi celulare. Este alcătuit dintr-o moleculă de ADN dublu catenară circulară, covalent închisă (ccc), dispusă helicoidal. Această moleculă, lipsită de membrană nucleară, conţine la E. coli 4,1x106 perechi de baze, ce codifică 3 – 4000 de gene, dintre care aproximativ 1500 au fost cartate deja. Dintre ele, 90% sunt gene structurale, ce codifică sinteza unor proteine (enzimatice sau structurale), iar 10% sunt gene implicate în reglarea şi iniţierea funcţiilor genelor structurale. Genele reglatoare controlează activitatea genelor structurale prin intermediul produşilor lor de sinteză. În general, genele sunt aşezate în structura cromozomului într-o anumită ordine, existând o corelaţie între ordinea genelor în genom şi cea a enzimelor codificate de ele, care intră în acţiune în calea metabolică respectivă. Sunt însă şi gene care codifică sinteza unor enzime la unele enterobacterii, care sunt dispuse în genom în altă ordine decât cea în care intră în acţiune enzimele în calea metabolică. De exemplu, pentru asigurarea sintezei histidinei sunt necesare 10 enzime, codificate de 10 gene. Ordinea acestor gene în cromozom nu corespunde cu ordinea în care intră în acţiune enzimele codificate.

Operonii sunt unităţi funcţionale de reglare, alcătuite dintr-un grup de gene structurale, care codifică de regulă o anumită cale metabolică, reglate de o singură genă de reglare. În general, organizarea unui operon este următoarea: o Regiunea operator (O) este un segment de ADN cromozomal din structura

operonului, cu rol de receptor de semnal. El înregistrează prezenţa substanţelor cu funcţie de represor sau de inductor din mediu şi asigură funcţionarea coordonată a operonului.

o Regiunea promotor (P) sau iniţiator este fragmentul de ADN cromozomal din structura operonului adiacent regiunii operator. Are funcţia de iniţiere a transcrierii operonului, care duce la sinteza unui ARNm policistronic. La acest nivel are loc legarea enzimei efectoare, ARN-polimeraza.

o Gena de reglare (GR) controlează activitatea genelor structurale (A ... F), determinând sinteza unei proteine represor, care se leagă reversibil de regiunea operator, blocându-i activitatea. Este blocată iniţierea transcrierii genelor structurale de la nivelul promotorului. Când proteina represor se detaşează de operator, acesta este activ şi permite iniţierea transcrierii genelor operonului respectiv.

Celulele bacteriene prezintă şi un al doilea sistem de reglare, numit reglon. Reglonul este un sistem de reglare format din mai multe gene structurale necesare unei anumite căi metabolice, dispersate în structura cromozomului bacterian, dar care funcţionează ca o unitate, deoarece sunt controlate de o singură genă de reglare.

Pentru aprecierea cantităţii de ADN bacterian se foloseşte termenul de echivalent genomic, care este cantitatea de ADN corespunzătoare cromozomului bacterian, adică structurii normale a celulei bacteriene, care este de tip haploid. O celulă bacteriană poate conţine între 1 şi 5 echivalenţi genomici, atunci când celula creşte într-un mediu foarte bogat în substanţe nutritive. Viteza de creştere a celulelor într-un astfel de mediu este foarte mare, dar viteza de replicare este constantă, astfel încât, la un moment dat, în celulă intervine o dereglare a replicării. Unele gene, aflate în apropierea originii replicării, se găsesc în celulă în mai multe exemplare şi are loc astfel o creştere a cantităţii de ADN.

Plasmidele Plasmidele sunt molecule citoplasmatice de ADN dublu catenar helicoidal,

separate spaţial de cromozomul bacterian. Au dimensiuni mult mai mici decât cromozomul bacterian şi de aceea sunt numite şi minicromozomi. Dimensiunile lor sunt cuprinse între 1 - 100x106 dal. Plasmidele au caracter de replicon, fiind capabile de o replicare fizic independentă de cea a nucleosomului, dar sub controlul acestuia.

Poartă în structura lor o informaţie genetică diferită de cea a cromozomului bacterian, neesenţială pentru bacterie. Bacteriile pot dobândi sau pierde plasmidele fără ca viabilitatea lor să fie afectată.

Au fost izolate peste 1000 de plasmide diferite, prezente în mod natural atât la bacteriile Gram pozitive, cât şi la bacteriile Gram negative. La Escherichia coli au fost identificate aproximativ 270 de plasmide diferite.

Plasmidele bacteriene se pot clasifica după mai multe criterii: a) după caracterul fenotipic nou pe care îl conferă bacteriilor în care se

găsesc: - plasmide F (fertility, plasmide de sex) - plasmide R (determină rezistenţa la antibiotice) - plasmide Col (determină sinteza unor antibiotice speciale, numite colicine).

b) după capacitatea plasmidei de a iniţia procesul de conjugare: - plasmide conjugative (conjugon, transferon, plasmide infecţioase, self-transmisibile); ele determină transfer de ADN prin conjugare; operonul tra (de transfer) conferă celulelor care poartă aceste plasmide caracter de celule donor, care transferă informaţie genetică celulelor receptoare, lipsite de aceste plasmide. În această categorie intră factorul F, plasmidele Ent (care determină sinteză de enterotoxine), unele plasmide de tip R şi Col. - plasmide non - conjugative (nonself-transmisibile), care nu posedă setul de gene implicat în iniţierea transferului de ADN prin conjugare, dar posedă genele necesare propriei replicări. În această categorie intră unele plasmide Col şi unii factori R.

c) după capacitatea plasmidelor de a se integra în cromozomul celulei gazdă: - plasmide integrabile, care se numesc şi plasmide cu funcţii episomale (episom = corp adăugat), notate INT+. Ele pot exista în celula gazdă sub două forme alternative:

� forma autonomă, neintegrată, în care plasmidele sunt fizic independente de cromozomul bacterian, fiind libere în citoplasmă,

� forma integrată în genomul celulei gazdă. Când trec din starea integrată în starea autonomă excizia plasmidelor se poate face corect sau eronat. Într-o excizie eronată plasmida poate prelua o parte din genele cromozomiale.

- plasmide neintegrabile, incapabile de integrare în cromozomul celulei gazde, care există numai în stare autonomă în celula gazdă. Se notează INT-. În această categorie intră unii factori Col şi factorul F' (derivat al plasmidei F integrate, care prin excizie eronată a captat un fragment de ADN cromozomial).

d) după proprietăţile de compatibilitate specifice, care limitează coexistenţa în aceeaşi celulă a plasmidelor înrudite. Pe această bază plasmidele se împart în mai multe grupe de incompatibilitate. La bacteriile Gram negative au fost identificate peste 25 de grupe de incompatibilitate ale diferitelor plasmide. În general, un membru al uni grup de incompatibilitate nu poate coexista într-o celulă bacteriană cu oricare alt membru al grupului respectiv (grup format din plasmide identice sau înrudite). Un membru al unui grup de incompatibilitate poate însă coexista stabil cu membrii unui grup de incompatibilitate diferit. Explicaţia probabilă a acestui fapt este competiţia plasmidelor înrudite pentru situsul de legare la unele structuri membranare, situs care nu are capacitatea de a reţine mai multe plasmide de acelaşi tip. Este posibil ca o plasmidă stabilită în celula bacteriană să determine sinteza unui represor cu activitate specifică, ce împiedică localizarea altor plasmide identice sau înrudite.

e) după controlul cromozomului bacterian asupra replicării plasmidelor: - plasmide care se replică sub control absolut; controlul absolut este eficient atunci când plasmida este integrată în cromozomul bacterian şi replicarea ei se realizează odată cu genele cromozomiale; sub control absolut se află plasmidele cu funcţii episomale; - plasmide care se replică sub control riguros sau stringent, prezente în puţine copii/celulă (1 - 3); cromozomul bacterian nu lasă plasmidele să invadeze bacteria cu un număr mare de copii. Aceste plasmide sunt în general plasmide conjugative, prezintă o greutate moleculară mare (peste 62 Mdal) şi nu sunt multiplicabile în prezenţă de cloramfenicol; - plasmide care se replică sub control relaxat, prezente în celula bacteriană într-un număr mare de copii/celulă (peste 40). În general sunt plasmide non - conjugative, au greutate moleculară mică (4 - 10 Mdal), sunt multiplicabile în prezenţă de cloramfenicol. Cloramfenicolul inhibă sinteza proteică şi replicarea ADN cromozomial, dar replicarea ADN-ului plasmidial nu este inhibată, putându-se acumula până la 3000 de copii/celulă, aproape 50% din masa celulară. Astfel de plasmide sunt adecvate pentru studii de inginerie genetică. Structura moleculară a plasmidelor este reprezentată de cele trei forme moleculare: circulară covalent închisă (ccc), circulară deschisă (co) şi lineară. Replicarea plasmidelor, care sunt molecule de ADN dublu catenare, se face începând de la originea replicării (ori) şi continuă la unele plasmide secvenţial unidirecţional, iar la altele bidirecţional. Eliminarea plasmidelor din celula bacteriană (vindecarea celulelor de plasmide, curring) se poate realiza pe două căi:

- eliminarea spontană se realizează fără intervenţia vreunui agent din mediu; fenomenul este legat probabil de segregarea sau nu a plasmidelor în cursul diviziunii celulare bacteriene, astfel încât unele celule fiice sunt lipsite de plasmide, altele au plasmide; - eliminarea indusă se realizează prin tratarea celulelor bacteriene cu anumite substanţe, care interferă cu multiplicarea sau segregarea plasmidelor, fără a avea efect asupra celulelor gazdă: acriflavină, rifampicină, acridinoranj. Detergenţii şi substanţele tensioactive distrug situsul membranar de legare a plasmidelor şi împiedică segregarea. Rifampicina pare să interfereze direct cu replicarea plasmidelor.

Funcţiile plasmidelor sunt multiple: 1) Funcţia de conjugon (transferon) conferă celulei purtătoare caracter de celulă ♂, donoare de informaţie genetică, funcţie care este condiţionată de prezenţa operonului tra în genomul plasmidei. 2) Funcţia de rezistenţă multiplă la antibiotice (ampicilină, streptomicină, tetraciclină, kanamicină, cloramfenicol, sulfamide) conferă bacteriei purtătoare rezistenţă la concentraţii letale de antibiotice. De exemplu, la Escherichia coli, unele gene pentru sinteza de betalactamaze se găsesc localizate pe plasmide. 3) Funcţia de rezistenţă la metale grele (Hg, Cd, Pb, Bi) determină folosirea bacteriilor care deţin aceste plasmide pentru concentrarea metalelor grele din diferite medii naturale. 4) Funcţia de rezistenţă la UV 5) Funcţia de mărire a virulenţei este caracteristică plasmidelor de virulenţă, care poartă gene producătoare de enterotoxine, mărind patogenitatea respectivelor bacterii (de exemplu, la Escherichia coli şi la Clostridium tetani, gena pentru producerea toxinei e localizată pe o plasmidă; la Escherichia coli enterohemoragică gena pentru sinteza hemolizinei este localizată pe plasmida Hly). 6) Funcţia de a metaboliza anumite substraturi poate fi determinată de asemenea de gene localizate pe plasmide. De exemplu, la Proteus mirabilis gena pentru metabolizarea lactozei este localizată pe o plasmidă; Lactobacillus sp. prezintă genele responsabile de fermentaţia lactică localizate plasmidial. 7) Funcţia de utilizare a substanţelor xenobiotice (xenos = străin) conferă bacteriilor respective capacitatea de a supravieţui în medii ce conţin substanţe greu de degradat în condiţii normale: fenol, camfor, hidrocarburi complexe din structura ţiţeiului. Genele care determină sinteza enzimelor ce intervin în degradarea acestor substanţe sunt localizate plasmidial. Prin tehnici de inginerie genetică s-a reuşit obţinerea unor celule bacteriene ce conţin mai multe plasmide diferite, cu rol în degradarea hidrocarburilor din petrol. Aceste bacterii pot fi utilizate pentru depoluarea mediului marin de ţiţei (cazul "mareelor negre") prin transformarea lui în masă celulară. 8) Funcţia de codificare a unor structuri anatomice bacteriene, de exemplu pilii de sex, vacuolele cu gaz (la specii de Halobacterium, pentru deplasarea către lumină). 9) Funcţia de producere a bacteriocinelor, substanţe cu rol antibacterian. 10) Funcţia de sinteză a unor substanţe antibiotice, de exemplu la unele actinomicete sinteza cloramfenicolului este codificată de gene plasmidiale. 11) Funcţia de inducere de tumori la plante, care este caracteristică plasmidei Ti de la Agrobacterium tumefaciens. 12) Funcţia de sinteză a unor enzime de restricţie, de exemplu la Escherichia coli genele care determină sinteza enzimei EcoRI sunt situate plasmidial.

Plasmidele criptice nu au efect aparent asupra fenotipului celulelor gazdă. Este posibil ca ele să poarte doar informaţia genetică necesară propriei replicări sau să codifice unele funcţii ce nu au fost încă evidenţiate. Semnificaţia biologică a plasmidelor Prezenţa plasmidelor în celula bacteriană poate avea rol benefic, ce decurge chiar din capacitatea bacteriei de a primi odată cu plasmida un material genetic de aproximativ 5 - 10 gene. Bacteriile purtătoare de plasmide au avantaje metabolice, o mai bună capacitate de adaptare şi rezistenţă la condiţii diverse de mediu. De aici posibilitatea ca ele să înlocuiască bacteriile normale, lipsite de plasmide, într-un anumit habitat. Plasmidele reprezintă o sursă de variabilitate foarte importantă pentru celulele bacteriene. Au un rol important în evoluţia bacteriilor, aşa cum a fost demonstrat în cazul procesului de conjugare, care poate avea loc nu numai intra-, ci şi interspecific şi chiar intergeneric. S-a evidenţiat posibilitatea conjugării chiar între Escherichia coli şi Saccharomyces cerevisiae (1989). Plasmidele pot contribui la mărirea virulenţei şi patogenităţii bacteriilor prin unii determinanţi genetici de virulenţă sau toxigeneză. Plasmidele conferă celulelor bacteriene gazdă capacitatea de a rezista la factori nefavorabili creşterii şi multiplicării lor în organismul pe care îl infectează. Existenţa plasmidelor poate fi interpretată ca o strategie a celulelor bacteriene de a realiza o capacitate de adaptare în natură, fără ca ele să îşi încarce permanent genomul cu gene necesare doar în condiţii speciale. În mediile naturale, când plasmidele sunt prezente numai în câteva celule din populaţia bacteriană prezentă, ele se vor replica doar în acele puţine celule. În condiţiile unui mediu modificat, plasmidele se transmit rapid în toate celulele din populaţia bacteriană respectivă. Mobilitatea extremă a plasmidelor, capacitatea lor de a se integra în cromozomul bacterian şi de fi pierdute prin vindecare bacteriană (curing) reprezintă o realitate demonstrată ca atare în condiţii de laborator. În mediul natural lucrurile se petrec oarecum diferit, deoarece într-o populaţie imensă apar multe interacţiuni care pot atenua acest flux de material genetic, ritmul de multiplicare a celulelor bacteriene fiind mult mai mic. De exemplu, în condiţii de laborator o diviziune se poate produce în aproximativ 20 de minute, în intestin la aproximativ 60 de minute, iar în sol la aproximativ 240 de minute pentru aceeaşi bacterie. Utilizări practice ale plasmidelor

Deoarece sunt structuri genetice capabile să înglobeze un anumit număr de gene, să se integreze şi să se desprindă din cromozomul bacterian, plasmidele sunt folosite în ingineria genetică. Ele reprezintă un vehicul ideal de transport al genelor de la o celulă bacteriană la alta sau chiar în celule de altă origine. Un astfel de vehicul (vector) este capabil să transmită şi gene străine de cele bacteriene, de exemplu gene de natură vegetală sau animală, care se pot exprima în celula bacteriană (numite gene pasager). Se folosesc în general plasmide non-conjugative (pentru a se evita răspândirea lor necontrolată prin conjugare în populaţia bacteriană), cu dimensiuni mici, aflate sub un control relaxat exercitat de cromozomul bacterian, multiplicabile în prezenţă de cloramfenicol.

Elementele genetice transpozabile ale bacteriilor (EGT) Sunt entităţi genetice cu limite structurale foarte bine precizate, sub forma unor

segmente specifice de ADN, care se pot integra repetat în mai multe zone ale unui genom, sau chiar în genomuri diferite existente în aceeaşi celulă.

Astfel de entităţi au fost descrise la virusuri, bacterii, levuri, la porumb, la Drosophyla şi la Trypanosoma.

Pentru elementele genetice transpozabile au fost propuse numeroase denumiri, printre care: elemente mobile, gene călătoare, gene care sar, gene hoinare, vagabonzi genetici. Sunt secvenţe de ADN care îşi menţin integritatea fizică, structurală şi genetică şi care pot fi translocate de la o poziţie la alta pe acelaşi genom sau pe alte genomuri intracelular.

În categoria EGT se încadrează: - secvenţele de inserţie - transpozonii - bacteriofagii λ şi Mu.

1) Secvenţele de inserţie (SI) sunt de mai multe tipuri. Ele au fost descrise pentru

prima dată la E. coli de către Heinz Saedler (1967). Sunt secvenţe mici de ADN, specifice, cu lungimea de 800 – 1400 pb şi nu conţin nici o genă cunoscută purtătoare a unei funcţii fenotipice noi pentru celula purtătoare.

Secvenţele de inserţie au capacitatea de a se mobiliza şi de a se integra repetat în acelaşi genom sau în genomuri diferite intracelular. Inserţia unei secvenţe de inserţie într-o genă suprimă funcţia respectivei gene, producând astfel o mutaţie. Toate secvenţele de inserţie prezintă o regiune centrală flancată la ambele extremităţi de secvenţe mai scurte, terminale, repetate fie în ordine directă, fie în ordine inversă (SRI). De exemplu: - Elementul SI1 de la E. coli are o lungime de 800 pb şi conţine o secvenţă centrală de 720 pb,

ce codifică o enzimă numită traspozază, iar la extremităţi secvenţe repetate în ordine inversă (SRI) cu o lungime de 24 pb.

- Elementul SI2 de la E. coli conţine o secvenţă centrală de 1250 pb, flancată de segmente de câte 20 pb (SRI) repetate în ordine inversă.

Numărul secvenţelor de inserţie variază de la o specie la alta (la E. coli au fost descrise în nucleosom 8 copii ale SI1, 5 copii ale SI2, 3 copii ale SI3; au fost descrise secvenţe de inserţie şi în plasmidele F şi R de la E. coli; la Shigella sp. secvenţa SI1 se găseşte în aproximativ 40 de copii).

2) Transpozonii (Tn) Transpozonii reprezintă o secvenţă specifică de ADN cu potenţial de transpoziţie,

care include 5 – 6 gene structurale, delimitate la extremităţi de secvenţe de inserţie. Conferă bacteriei purtătoare funcţii noi, datorită genelor structurale: gene de rezistenţă la antibiotice (ampicilină, streptomicină, cloramfenicol, tetraciclină, kanamicină, sulfamide), gene de rezistenţă la metale grele (Hg), gene responsabile de producerea de enterotoxine.

SRI SRI gene structurale SRI SRI SI SI Tn

Transpozonii nu se găsesc în citoplasmă în stare autonomă, ci numai inseraţi într-un genom.

Transpoziţia constă în integrarea sau inserţia într-un genom a unui element genetic transpozabil provenit din aceeaşi moleculă de ADN sau din altă moleculă de ADN prezentă în celulă.

Procesul de transpoziţie are următoarele caracteristici: - transpoziţia nu constă într-un schimb de material genetic, ci într-o adiţie de ADN; - transpoziţia unui EGT la un nou situs (care denotă caracterul invadant al EGT) nu

duce la pierderea EGT-ului situat la situsul originar, deoarece la noul situs se va insera o copie, transpoziţia fiind întotdeauna însoţită de replicare;

- EGT se pot insera într-un număr mare de situsuri în genomul bacterian, nucleosomal sau plasmidial; se pare că există însă zone favorabile pentru inserţia transpozonilor;

- EGT sunt răspunzătoare de o serie de modificări genetice, deoarece determină mutaţii, deleţii, inversii, adică fenomene de instabilitate genetică. 3) Bacteriofagii λ şi Mu îndeplinesc şi ei funcţia de transpoziţie.

Semnificaţia biologică a elementelor genetice transpozabile � Inserţia EGT poate influenţa activitatea celulelor bacteriene, putând fi sursa

unor perturbări în exprimarea calitativă şi cantitativă a genelor. � Inserţia EGT poate crea gene noi prin fuziunea genelor din cromozom cu

genele din EGT, dacă sensul de citire coincide. � După inserţie, EGT pot funcţiona ca un „comutator” biologic, capabil să

blocheze sau să declanşeze expresia genelor apropiate. � Au fost descrise EGT şi la eucariote, dar în număr limitat. De exemplu

tripanosomele au în zona inactivă a genomului lor aproximativ 100 de gene capabile să codifice sinteza unor glicoproteine de înveliş diferite, evitând astfel reacţiile de apărare ale organismului gazdă.

MECANISME DE TRANSFER DE MATERIAL GENETIC LA BACTERII

Transferul de material genetic la bacterii asigură schimbul de informaţie genetică între două celule bacteriene diferite. Informaţia genetică trebuie să părăsească una dintre celule şi să pătrundă în cea de a doua. Există cel puţin 10 mecanisme de transfer de material genetic la bacterii, unele dintre ele fiind variante ale aceluiaşi proces.

Transformarea bacteriană Reprezintă transferul de informaţie genetică realizat prin intermediul unui fragment de ADN total al bacteriei donatoare, extras prin procedee chimice sau eliberat prin liza celulei. Celula donatoare este celula bacteriană de la care provine fragmentul de ADN, iar celula receptoare este cea care captează acest fragment. Fragmentul de ADN exogen, pătruns în celula receptoare, poate înlocui printr-un proces de recombinare genetică (crossing - over) o secvenţă nucleotidică omoloagă din genomul celulei receptoare. Dacă segmentul astfel integrat diferă de cel înlocuit, celula purtătoare va dobândi un caracter fenotipic nou, care va fi exprimat. În laborator au fost realizate transformări genetice: - homospecifice (între tulpini bacteriene aparţinând aceleiaşi specii); - heterospecifice (între specii diferite ale aceluiaşi gen); - intergenerice (între specii din genuri diferite).

Transformarea genetică este condiţionată de: � proprietăţile fizice ale ADN-ului donor:

♦ moleculele de ADN transformant trebuie să prezinte o structură dublu catenară; ♦ moleculele de ADN transformant trebuie să aibă o dimensiune minimă de 1x106 Da,

eficienţa transformării fiind maximă pentru fragmente cu dimensiuni între 5x106 şi 2x107 Da;

♦ frecvenţa transformărilor este influenţată de concentraţia de ADN din mediu, fiind necesară o concentraţie minimă de 1 x 10-5 µg/ml. � proprietăţile celulei receptoare:

♦ pentru a putea fi transformate, celulele receptoare trebuie să se găsească într-o stare fiziologică specială, numită stare de competenţă, care este o stare temporară, cu durata de aproximativ 15 minute, controlată genetic, asociată cu faza de creştere exponenţială a celulei (fie la începutul acesteia, ca la Rhizobium, fie la sfârşitul ei, ca la Bacillus subtilis);

♦ pe suprafaţa celulei receptoare trebuie să se găsească un antigen de competenţă, reprezentat de un polipeptid cu greutate moleculară mică;

♦ la nivelul peretelui celular trebuie să aibă loc modificări importante, care constau în „demascarea” enzimatică a unor receptori de ADN.

Fazele procesului de transformare bacteriană: � faza de apariţie a stării de competenţă fiziologică a celulei receptoare; la bacteriile

la care această stare lipseşte în mod fiziologic, ea poate fi indusă artificial în laborator prin tratarea celulelor bacteriene cu o soluţie de CaCl2 (Mandel, Higa, 1970) sau un amestec CaCl2 + MgCl2 (0,02M) la rece, pentru a facilita transformarea;

� faza de adsorbţie şi legare reversibilă a moleculei de ADN exogen la nivelul unor receptori specifici ai celulei receptoare, al căror număr este variabil chiar şi la aceeaşi specie;

� faza de legare ireversibilă a ADN-ului de celula bacteriană, capătul anterior al moleculei de ADN găsindu-se în spaţiul periplasmic legat de o moleculă de proteină (proteină de legare);

� faza de înglobare a ADN-ului transformant în celula bacteriană receptoare; molecula de ADN exogen:

o poate fi distrusă în celula bacteriană de enzimele de restricţie proprii celulei, iar produşii rezultaţi să fie folosiţi ca sursă de dezoxiribonucleotide

o se poate integra în cromozomul celulei bacteriene gazdă prin recombinare genetică, iar informaţia genetică nouă adusă de ea să fie exprimată fenotipic.

Semnificaţia biologică a transformării Deşi este un proces descoperit în laborator, numeroase date pledează pentru

existenţa sa în condiţii naturale, în medii cu populaţii bacteriene heterogene şi dense. ADN-ul eliberat prin autoliză celulară, liză celulară produsă de fagi sau prin acţiunea unor antibiotice poate pătrunde în celulele competente transformându-le, iar după recombinare acestea să exprime caractere fenotipice noi.

Transformarea acţionează în natură ca un mecanism sexual primitiv, prin care unele bacterii ar putea „moşteni” gene de la alte bacterii, ducând la formarea unor clone bacteriene noi, cu genomuri modificate, mai bine adaptate condiţiilor de mediu.

Conjugarea bacteriană Reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie donatoare la una receptoare, realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe şi condiţionat de prezenţa în celula receptoare a unui element genetic specializat, cu funcţie de plasmidă de sex sau conjugon. Conjugarea este un mecanism de transfer de material genetic frecvent întâlnit la bacteriile Gram negative (Escherichia, Salmonella, Shigella) şi mai puţin frecvent la cele Gram pozitive. Acest proces a fost descoperit de către Ledeberg în 1946 la tulpini de E. coli. În natură conjugarea este frecventă în populaţiile bacteriene dense, cu mai mult de 107 celule/ml, care asigură uşor contacte intercelulare. Conjugarea are loc uşor intraspecific, dar poate avea loc şi interspecific sau chiar intergeneric.

Fazele procesului de conjugare bacteriană: � faza de formare a cuplurilor de perechi specific, vizibile la microscopul electronic,

instabile la o agitare uşoară; faza implică legarea extremităţii libere a pilului de sex de la celula donatoare F+ (de tip ♂) de un receptor celular situat pe suprafaţa bacteriei acceptoare F- (♀);

� în a doua fază cele două celule sunt aduse într-un contact strâns perete la perete, dar şi acest contact este fragil şi se desface prin forţe uşoare de agitare;

� faza de formare a unor contacte stabile între pereţii celor două celule, cu formarea de perechi eficiente, rezistente la agitări uşoare.

Conjugarea între bacterii F+ şi bacterii F- După formarea cuplului de conjugare apare o incizie monocatenară în structura

plasmidei F de sex, produsă de o endonuclează. Semnalul care declanşează această

incizie este determinat de interacţiunea dintre extremitatea liberă a pilului şi suprafaţa liberă a celulei receptoare. ADN-ul este transferat în formă monocatenară, începând cu extremitatea 5’. Prin sinteză se reface plasmida cu ADN dublu catenar atât în celula donoare, cât şi în cea receptoare. Proporţia de celule F- scade rapid într-o popuzlaţie bacteriană.

Conjugarea între bacterii Hfr şi şi bacterii F- Bacteriile Hfr, considerate „supermascul”, prezintă plasmida F integrată în cromozomul celulei donoare, într-o regiune pentru care plasmida are o afinitate specială. Factorul f integrat îşi pierde capacitatea de a se replica autonom, fiind replicat pasiv odată cu genele cromozomiale, încetând să mai fie infecţios. Integrarea factorului F duce la ruperea cromozomului bacterian în timpul conjugării şi la transferul ADN-ului cromozomal cu o eficienţă foarte mare, factorul F fiind întotdeauna porţiunea terminală a cromozomului angajat în transfer în cursul conjugării.

Transducţia fagică

Este procesul prin care un fragment de nucleosom bacterian e transferat de la o celulă bacteriană la alta prin intermediul unor fagi temperaţi. Fagii temperaţi sunt fagii care pot prezenta 2 moduri de viaţă: ciclul litic, însoţit de eliberarea fagilor din celulă şi starea de lizogenie.

Fenomenul a fost descris în 1951 de către Zinder şi Lederberg, care au demonstrat că fagul P22 a acţionat ca vector în transferul de gene bacteriene de la o tulpină de Salmonella typhi la altă tulpină. Acelaşi fenomen de transducţie s-a descris şi la fagul λ de la E. coli.

Fenomenul de transducţie fagică se desfăşoară prin 3 mecanisme: - transducţie specializată; - transducţie generalizată; - transducţie abortivă (incompletă).

Transducţia fagică specializată (localizată sau restrictivă) Este caracteristică fagilor transductori de tipul λ, care au proprietatea de a

transfera eficient un număr limitat de gene şi anume cele situate în imediata apropiere a situsului de legare a profagului în nucleosomul bacterian.

Ex.: Fagul λ la E. coli se integrează doar între genele gal şi bio. Capacitatea fagului λ de a transmite gene cromozomale la alte bacterii nu e întâmplătoare. Nu poate fi extinsă la orice genă şi e limitată doar la genele gal şi bio. Genomul fagului λ integrat în nucleosomul bacteriei între genele gal şi bio (care determină sinteza galactozei, respectiv a biotinei) poate fi excizat din genom fie prin excizie corectă şi se reface fagul λ, fie eronat formând un genom hibrid (ADN fagic + o parte din informaţia bacteriană adiacentă locului de integrare). Există astfel două posibilităţi: � dacă genomul fagului λ a preluat prin excizie eronată gena gal, fagul λ va avea

această genă şi se va numi λgal+;

� dacă genomul fagului λ a preluat gena bio, fagul λ se va numi λbio+.

O porţiune din genomul fagic rămâne pe nucleosomul bacteriei şi fagii transductori sunt defectivi, adică le lipseşte un anumit segment din structura lor. Eliberarea fagilor transductori din celulă (ei singuri fiind incapabili de replicare şi liză) se realizează cu ajutorul altor particule fagice normale, numite fagi helper, prezente în aceeaşi celulă şi care au genomul complet.

După ce genomul fagului transductor a pătruns într-o altă celulă bacteriană receptoare, evoluţia sa ulterioară e diferită: a) poate fi degradat de către sistemele enzimatice ale gazdei ca un material străin celulei

(sub acţiunea enzimelor de restricţie); b) se poate integra în nucleosomul bacterian la un situs specific, cu o frecvenţă mică

(1:10-5) printr-un proces de recombinare; celula bacteriană dobândeşte astfel un fenotip nou, ca urmare a genei nucleosomale aduse de fagul transductor.

Fagul λ e folosit în ingineria genetică (tehnologia ADN recombinat) ca vector pentru a încorpora gene utile şi pentru a le transfera la bacteriile receptoare, obţinând noi fenotipuri bacteriene, importante din punct de vedere economic. De asemenea, este mult folosit la obţinerea de bănci de gene (toate genele unui genom eucariot pot fi clonate pe bacterii).

Transducţia fagică generalizată (nelimitată, nerestrictivă) Este caracteristică pentru fagul P1 de la E. coli, fagul P22 de la Salmonella, fagul

SP10 de la Bacillus subtilis. Infecţia cu fagii respectivi determină o fragmentare a nucleosomului bacterian al celulei gazdă în segmente de ADN cu o lungime similară ADN-ului fagic şi există posibilitatea ca orice fragment din genomul bacteriei să fie încorporat în structura unui virion (se face o încorporare accidentală a unui fragment de nucleosom). De multe ori, mulţi fagi maturi conţin astfel doar gene bacteriene, purtând numele de pseudovirioni.

Pe lângă aceste fragmente pot fi incluse însă şi mici fragmente libere de genom viral. Este un mecanism de împachetare eronată în baza căruia, atunci când se produce asamblarea particulelor virale, majoritatea particulelor virale înglobează genomuri fagice, dar un număr mic de capside înglobează gene nucleosomale. Având gene nucleosomale, fagii nu se pot replica. Fragmentele cromozomale nu pot fi transmise la alte celule bacteriene decât în prezenţa unor fagi helper care suplinesc funcţiile ce lipsesc particulelor pseudovirale. După infecţia unei celule bacteriene receptoare cu un fag de transducţie generalizată, genele cromozomale sunt introduse în citoplasma celulei receptoare şi se recombină cu nucleosomul celulei respective, care primeşte astfel determinanţi genetici de la celula donoare.

Transducţia abortivă Corespunde situaţiei în care ADN-ul transductor pătruns în celula bacteriană

receptoare nu reuşeşte să se integreze stabil în nucleosomul acesteia; totuşi el e funcţional şi îşi exprimă genele pe care le poartă (ADN-ul respectiv e transcris în ARNm şi tradus).

Celula bacteriană devine astfel diploidă pentru segmentul respectiv de cromozom. Acest segment transferat nu e replicat odată cu cromozomul şi, în momentul diviziunii celulei bacteriene transduse, el e transmis unilateral linear numai la una dintre celulele fiice.

În cursul dezvoltării culturii bacteriene, segmentul de ADN transdus e diluat progresiv în populaţia bacteriană, deoarece la fiecare diviziune numai o singură celulă are segmentul respectiv.

Fenomenul a fost studiat în cazul mobilităţii la Salmonella. Bacteriile imobile (fla-) devin mobile (fla+) dacă primesc gena respectivă fla. În cazul transducţiei abortive, bacteriile fla- primesc gena fla, devin fla+, dar la fiecare diviziune celulele mobile formează o celulă soră mobilă fla- (care va forma o clonă fla-) şi o celulă soră rămâne fla+.