TOXICOLOGIE ORGANIC Sem. II 2014 2015

Lector dr. Adriana Urd

Curs 6. Biotransformarea compuilor organici prin reacii metabolice (continuare). Reacii din faza a II-a

Reacii din faza a II-a Reaciile de biotransformare din faza a II-a includ glucuronidarea, sulfonarea (mai

cunoscut ca sulfatare), acetilarea, metilarea, conjugarea cu glutation (sinteza acidului mercapturic) i conjugarea cu aminoacizi (cum sunt glicina, taurina i acidul glutamic). Cofactorii (compui chimici ne-proteinici, necesari pentru desfurarea reaciilor enzimatice) pentru aceste reacii, prezentai mai jos, reactioneaz cu grupele funcionale care sunt prezente n xenobiotic sau care sunt introduse/expuse n timpul fazei I a biotransformrii (gruparea funcional care reacioneaz cu compusul xenobiotic sau care este transferat acestuia este scris cu albastru). Cu excepia metilrii i acetilrii, reaciile de biotransformare din faza a II-a conduc la o cretere puternic a hidrofilicitii compusului, astfel nct promoteaz mult excreia compuilor strini.

Reaciile din faza a II-a decurg n general mult mai rapid dect reaciile din faza I, cum sunt cele catalizate de citocromul P450. De aceea, viteza de eliminare a compuilor xenobiotici a cror excreie depinde de biotransformarea cu citocrom P450 urmat de conjugare n faza a II-a este determinat de prima etap (reacia cu citocrom P450).

Acid uridin-5-difosfo--D-glucuronic

(UDP-acid glucuronic)

3-fosfoadenozin-5-fosfosulfat (PAPS)

Acetil coenzima A

S-adenozilmetionin (SAM)

O

Glucuronidare Sulfatare

(sulfonare)

Acetilare Metilare

2

Glutation

Taurin Glutamin

Glucuronidarea

Glucuronidarea este o cale major de biotransformare a compuilor xenobiotici n speciile de mamifere, cu excepia felinelor. Glucuronidarea necesit prezena cofactorului difosfat de uridin-acid glucuronic (UDP-acid glucuronic), iar reacia este catalizat de o enzim din grupul tranferazelor, localizat n ficat i n alte esuturi (rinichi, intestin, piele etc.).

Centrul la care se produce glucuronidarea este n general un heteroatom nucleofil bogat

n electroni (O, N sau S). De aceea, substraturile pentru glucuronidare conin grupe funcionale cum sunt alcoolii alifatici i fenolii (care formeaz esteri O-glucuronide), acizii carboxilici (care formeaz esteri O-glucuronide), aminele aromatice i alifatice primare i secundare (care formeaz N-glucuronide), i grupele tiol (care formeaz S-glucuronide). Pe lng numeroi compui xenobiotici, substraturile pentru glucuronidare includ mai muli compui endogeni (care au originea n organismele vii) cum sunt bilirubina, hormonii steroidieni i cei tiroidieni.

4-amino-bifenil N-glucuronid

Compuii conjugai cu glucuronid ai xenobioticelor i compuilor endogeni sunt polari, solubili n ap i pot fi eliminai din corp n urin sau n bil. Modul de excreie (urinar sau biliar) depinde de mrimea intermediarului metabolit rezultat n faza I.

Gruparea acid carboxilic a acidului glucuronic, care este ionizat la pH fiziologic, ajut excreia deoarece (1) mrete solubilitatea n ap a compusului xenobiotic i (2) este recunoscut de sistemele de transport anionic renale i biliare, ceea ce permite glucoronidelor s fie excretate n urin i bil.

Sulfatarea

Muli dintre compuii xenobiotici i endogeni care sufer O-glucuronidare pot s fie transformai i prin conjugare cu sulfat. Conjugarea cu sulfat produce n general un ester al acidului sulfuric foarte solubil n ap. Reacia este catalizat de enzime numite sulfotransferaze, prezente n general n ficat, rinichi, tractul GI etc. Cofactorul pentru reacie este 3-fosfoadenozin-5-fosfosulfat (PAPS), a crui structur a fost prezentat anterior. Conjugarea cu sulfat a alcoolilor alifatici i a fenolilor, R OH, decurge astfel:

Conjugarea cu glutation

Acid -glutamic Cistein Glicin

Conjugarea cu aminoacizi

Transferaz

Glicin

3

Conjugarea cu sulfat implic transferul unei grupe sulfonat (SO3), nu sulfat (SO4), de la PAPS la compusul xenobiotic. Termenii utilizai n mod obinuit, sulfatare i conjugare cu sulfat vor fi utilizai n continuare, dei sulfonare i conjugare cu sulfonat sunt mai coreci. Sulfatarea nu este limitat la fenoli i alcooli alifatici (care sunt deseori produi n faza I de biotransformare), dei acetia reprezint grupul cel mai numeros de substraturi pentru sulfotransferaze. Anumite amine aromatice, cum sunt anilina i 2-aminonaftalina, pot suferi conjugare cu sulfat la sulfamaii corespunztori.

Exemple de compui xenobiotici i endogeni care sunt sulfatai fr biotransformare prealabil de enzimele din faza I: alcooli primari (etanol, polietilen glicoli), alcooli secundari (2-butanol, colesterol), fenoli (fenol, naftol), amine alifatice i aromatice (anilina, 2-aminonaftalina). Un numr i mai mare de compui xenobiotici sunt sulfatai dup ce grupul hidroxil este expus sau introdus n timpul fazei I a biotransformrii.

Acizii carboxilici pot fi conjugai cu acid glucuronic, dar nu cu sulfat. Totui, mai muli acizi carboxilici (cum sunt acidul benzoic, acidul naftilacetic, acidul salicilic etc.) sunt inhibitori

pentru sulfotransferaze, deoarece se leag de enzim dar nu pot iniia atacul nucleofil asupra PAPS.

Compuii rezultai prin conjugarea cu sulfat a xenobioticelor sunt excretai majoritar n urin.

Sursa principal de sulfat necesar pentru sinteza PAPS provine din cistein, printr-o secven complex de oxidare. Deoarece concentraia de cistein liber este limitat, concentraiile celulare de PAPS (~ 75 M) sunt mult mai mici dect cele de UDP-acid glucuronic (~ 350 M) i glutation (~ 10 mM). Concentraia mic de PAPS limiteaz capacitatea de sulfatare a compuilor xenobiotici. n general, sulfatarea este o cale cu afinitate mare, dar capacitate mic de conjugare a compuilor xenobiotici, n timp ce glucuronidarea este o cale cu afinitate sczut, dar capacitate mare.

Activitatea ridicat a sulfotransferazelor la feline compenseaz capacitatea lor sczut de a conjuga compui xenobiotici cu acid glucuronic.

n general, sulfatarea este o metod eficient de micorare a efectului toxic al compuilor xenobiotici. Exist cazuri, ns, n care sulfatarea mrete toxicitatea acestora, deoarece anumii compui conjugai cu sulfat sunt instabili chimic i se pot degrada cu formarea unor specii reactive electrofile.

Metilarea

Metilarea este o cale comun, dar minor, de biotransformare a compuilor xenobiotici i este catalizat de enzime numite transferaze. Metilarea difer de cele mai multe dintre reaciile din faza a II-a, deoarece n general micoreaz solubilitatea n ap a compuilor xenobiotici i mascheaz grupele funcionale care pot fi conjugate de alte enzime din faza a II-a. O excepie de la aceast regul este N-metilarea compuilor care produc ioni de amoniu cuaternari, solubili n ap i excretai rapid.

Cofactorul pentru metilare este S-adenozilmetionina (SAM), a crei structur a fost prezentat mai sus. Grupa metil legat de ionul sulfoniu n SAM este transferat compuilor xenobiotici i endogeni prin atacul nucleofil al unui heteroatom bogat n electroni (O, N sau

PA PA

4

S). n consecin, grupele funcionale implicate n reaciile de metilare sunt fenoli, amine alifatice i aromatice i tioli. Metalele pot fi i ele metilate. Mercurul anorganic i arsenul pot fi ambele dimetilate, iar seleniul poate fi trimetilat. Unele exemple de compui xenobiotici i endogeni care sufer O-, N- sau S-metilare sunt prezentate n continuare:

- O-metilare:

- N-metilare:

- S-metilare:

Acetilarea

N-acetilarea este o cale major de biotransformare pentru compuii xenobiotici care conin o amin aromatic (R-NH2) sau o grupare hidrazin (R-NH-NH2), care sunt transformate la amide aromatice (R-NH-COCH3) i hidrazide (R-NH-NH-COCH3). Compuii xenobiotici care conin amine alifatice primare sunt rareori substraturi pentru N-acetilare. Ca i metilarea, N-acetilarea mascheaz o amin cu o grupare neionizabil, astfel nct muli metabolii N-acetilai sunt mai puin solubili n ap dect compuii de la care provin.

N-acetilarea compuilor xenobiotici este catalizat de enzime numite transferaze (N-acetiltransferaze) i necesit drept cofactor acetil-coenzima A (acetil-CoA), a crei structur a fost prezentat anterior. Reacia se produce n dou etape, conform unui mecanismping-pong. n prima etap, gruparea acetil de la acetil-CoA este transferat unui centru activ (cistein) din enzima N-acetiltransferaz, cu eliberarea coenzimei A:

E-SH + CoA-S-COCH3 E-S-COCH3 + CoA-SH

n a doua etap, gruparea acetil este transferat de la enzima acetilat la gruparea amin a substratului, cu regenerarea enzimei. Pentru aminele puternic bazice, viteza de N-acetilare este

determinat de prima etap (acetilarea enzimei), n timp ce viteza de acetilare a aminelor slab bazice este determinat de a doua etap (transferul grupei acetil de la enzima acetilat la amina acceptoare).

5

N-acetiltransferazele se gsesc n ficat i n multe alte esuturi ale celor mai multe mamifere, cu excepia cinilor i vulpilor, care nu pot acetila compui xenobiotici.

Substraturile care sunt N-acetilate preferenial includ acidul p-aminobenzoic i p-aminosalicilic.

Acid p-aminobenzoic Acid p-aminosalicilic

Conjugarea cu aminoacizi

Exist dou ci principale prin care compuii xenobiotici sunt conjugai cu aminoacizi, aa cum se observ mai jos.

Prima cale implic conjugarea compuilor xenobiotici ce conin o grupare acid carboxilic cu gruparea amin a unor aminoacizi ca glicin, glutamin i taurin (vezi structurile lor mai sus).

Acid benzoic

Tioester

Acid hipuric

Conjugarea acidului benzoic cu glicin pentru a forma acid hipuric a fost observat n 1842, fiind prima reacie de biotransformare descoperit. Reacia decurge printr-un mecanism ping-pong. Prima etap implic transformarea acidului benzoic ntr-un tioester acil-CoA, cu eliminarea ionului acetat. A doua etap const n formarea unei legturi amidice cu aminoacidul acceptor, cu regenerarea coenzimei A. Substraturile pentru conjugarea cu aminoacizi sunt

limitate la unii acizi alifatici, aromatici i heteroaromatici. A doua cale implic conjugarea compuilor xenobiotici ce conin o hidroxilamin

aromatic (amin N-hidroxi aromatic) cu gruparea acid carboxilic a unor aminoacizi. Aceast cale implic activarea unui aminoacid cu o enzim (sintetaz) care reacioneaz apoi cu hidroxilamina aromatic pentru a forma un N-ester reactiv (iar aminoacidul se elimin i se recircul n reacie).

N-oxid

metabolit reactiv

+ Acetil-CoA

- CH3COO

+ NH2CH2COO

- CoA-SH

- HO

6

Capacitatea compuilor xenobiotici de a suferi conjugare cu aminoacizi depinde de mpiedicarea steric n jurul grupei acid carboxilic, i de substituenii la inelul aromatic sau la catena lateral alifatic.

Compuii obinui prin conjugarea cu aminoacizi sunt eliminai n special prin urin. Pe lng glicin, glutamin i taurin exist i ali aminoacizi acceptori pentru conjugarea

cu compui xenobiotici. Conjugarea compuilor xenobiotici ce conin grupare acid carboxilic este o alternativ la

glucuronidare. Conjugarea cu aminoacizi este o reacie de detoxifiere, n timp ce glucuronidarea lor produce acilglucuronide potenial toxice (vezi acolo).

Spre deosebire de conjugarea cu aminoacizi a compuilor xenobiotici ce conin grupare acid carboxilic, care este o reacie de detoxifiere, conjugarea cu aminoacizi a aminelor N-hidroxi aromatice (hidroxilamine) este o reacie de activare, deoarece produce N-esteri care se pot degrada pentru a forma ioni electrofili reactivi.

Conjugarea cu glutation

Este o reacie de conjugare a compuilor xenobiotici cu glutation, o tripeptid format din glicin, cistein i acid glutamic (ultimul fiind legat de cistein prin gruparea -carboxil, i nu prin gruparea obiuint -carboxil, vezi mai sus). Acest tip de conjugare este fundamental diferit de conjugarea cu ali aminoacizi, deoarece compuii obinui sunt tioeteri, care se formeaz prin atacul nucleofil al anionului tiolat GS al glutationului la un atom de carbon electrofil din compusul xenobiotic. Glutationul poate conjuga i compui xenobiotici care conin heteroatomi electrofili.

Conjugarea compuilor xenobiotici cu glutation este catalizat de o familie de enzime, glutation S-transferaze, care sunt prezente n aproape toate esuturile, dar cu concentraii mai mari n ficat, intestin, rinichi etc.

Substraturile pentru conjugarea cu glutation au trei caracteristici comune: sunt hidrofobe,

conin un atom electrofil i reacioneaz ne-enzimatic cu glutationul cu vitez msurabil. Enzima mrete viteza de reacie prin deprotonarea GSH la GS. Concentraia de glutation n ficat este foarte mare (~ 10 mM), de aceea conjugarea ne-enzimatic a anumitor compui xenobiotici poate fi semnificativ.

Substraturile pentru conjugarea cu glutation pot fi mprite n dou categorii: cele care sunt suficient de electrofile pentru a fi conjugate direct, i cele care trebuie s fie mai nti biotransformate ntr-un metabolit electrofil nainte de a fi conjugate. A doua grup de substraturi include intermediari reactivi produi n timpul fazelor I sau II de biotransformare, cum sunt oxiranii (oxizii arenelor i epoxizii alchenelor), ioni nitreniu, ioni carboniu i radicali liberi. Reaciile de conjugare pot, la rndul lor, s fie mprite n dou categorii: reacii de dislocuire, n care glutationul dislocuiete o grupare atrgtoare de electroni, i reacii de adiie, n care glutationul este adiionat la o dubl legtur activat sau la un sistem de inele tensionat.

a.Dislocuirea de ctre glutation a unei grupe atrgtoare de electroni apare n mod obinuit atunci cnd substratul conine o grupare halogen, sulfat, sulfonat, fosfat sau nitro ataate la un carbon alilic sau benzilic. Dislocuirea gruprii atrgtoare de electroni din compuii xenobiotici aromatici este limitat (mpiedicat) de prezena altor substitueni donori de electroni la inelul aromatic (-NH2, -OH, -OR i R). Dimpotriv, reaciile de dislocuire sunt intensificate prin prezena altor grupe atrgtoare de electroni (-F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -CN, -CHO i COOR).

7

1,2-dicloro-4-nitrobenzen

b. Adiia glutationului la o dubl legtur C=C este facilitat i de prezena n apropiere a unei grupri atrgtoare de electroni, deci substraturile pentru aceast reacie conin n mod obinuit o legtur dubl lng CN, -CHO, -COOR sau COR. Dubla lgtur din dietilmaleat este vecin cu dou grupri atrgtoare de electroni i sufer cu uurin o reacie de adiie cu glutation:

Dietilmaleat

Oxizii arenelor i epoxizii alchenelor, care se formeaz deseori prin oxidarea n prezena citocromului P450 a hidrocarburilor aromatice i alchenelor, sunt exemple de sisteme de inele tensionate, care se deschid prin adiia glutationului:

Clorobenzen

3,4-oxid

Glutationul poate conjuga i compui xenobiotici cu un heteroatom electrofil (O, N sau S). Compusul conjugat format iniial ntre heteroatom i glutation este scindat de o a doua molecul de glutation, pentru a forma glutation oxidat (GSSG). Scindarea esterilor nitrat ai nitroglicerinei elibereaz nitrit, care poate fi transformat ntr-un vasodilatator puternic, oxidul de azot.

P450

8

Compuii conjugai cu glutation formai n ficat pot fi excretai n bil sau n urin. Conjugarea cu glutation reprezint o reacie de detoxifiere important, deoarece

compuii electrofili sunt specii potenial toxice, care se pot lega de specii nucleofile importante cum sunt proteinele i acizii nucleici, producnd deteriorarea celulelor i mutaii genetice. Toate enzimele implicate n biotransformarea compuilor xenobiotici au potenialul de a genera intermediari reactivi, din care cea mai mare parte sunt detoxifiai ntr-o oarecare msur prin conjugare cu glutation.

Bibliografie

1. V. A. Voicu Toxicologie clinic, Editura Albatros, Bucureti, 1997 2. Casarett and Doulls Toxicology: the basic science of poisons, (ed. C. D. Klaassen),

McGraw-Hill, 2001, cap. 6 Biotransformation of xenobiotics