Obiectivele avute în vedere:

- Stabilirea soluţiei pentru conducerea computerizată a bioreactorului;

- Implementarea de tehnici moderne pentru obţinerea informaţiilor în regim “on-line” asupra variabilelor procesului;

- Elaborarea de modele „zonale”, specifice diverselor faze de dezvoltare a bioprocesului, compunerea lor prin tehnici de inteligenţă artificială şi validarea modelelor pe date de bioreactor;

- Elaborarea de modele de vârstă a microorganismelor;

- Elaborarea de metode de conducere inteligentă a bioproceselor.

Ţinând cont de prevederile contractuale, validarea modelelor zonale şi a procedurilor de control bazate pe modele zonale s-a făcut folosind date furnizate de Institutul de Cercetări Alimentare (ICA) Bucureşti, pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtiilis. Validarea modelelor de vârstă a microorganismelor s-a făcut folosind date experimentale preluate din literatura de specialitate, pentru procesul de acumulare de biomasă a populaţiei de Candida lypolitica.

MONITORIZAREA BIOREACTORULUI

Bioreactorul este un bioreactor cu agitare mecanică, de 20L, produs de firma Biolafitte. Pe lângă bioreactor, există deja o serie de echipamente (marcate cu culoarea distinctă în Figura 1), cum sunt: turbina de agitare cu rezerve pentru diverse tipuri de bioprocese; motorul electric cu cuplajul aferent; dulapul cu regulatoarele de temperatură, agitare, pH şi controlul antispumării; traductoare şi elemente de execuţie aferente buclelor de reglare a elementelor de bază ale bioreactorului.

Analizând mărimile care caracterizează un proces biotehnologic şi care trebuie achiziţionate de la un bioreactor, se poate concluziona că acestea se împart în două categorii. În prima categorie intră toate mărimile care pot fi măsurate “on-line” şi care, în general, creează condiţiile de dezvoltare a populaţiei de microorganisme din bioreactor. Dintre aceste mărimi, cele mai importante sunt: temperatura, agitarea, aerarea, presiunea în bioreactor, pH-ul, concentraţia de oxigen dizolvat. În a doua categorie intră o serie de mărimi specifice unui proces biotehnologic, cum sunt concentraţia de biomasă, concentraţia substratului, concentraţia produsului de biosinteză, mărimi specifice bioprocesului. Din nefericire, în majoritatea cazurilor, aceste mărimi nu pot fi măsurate “on-line”, datorită inexistenţei unor senzori ieftini, fiabili şi suficient de robuşti. Achiziţia de date privind biomasa, substratul, produsele de metabolism, se face prin analize de laborator, această metodă făcând dificilă conducerea bioreactoarelor (în sensul reglării directe a acestor mărimi). Analiza de laborator necesită prelevarea unei probe din conţinutul bioreactorului, ceea ce presupune un risc mărit în contaminarea (infectarea) culturii. În cazul acestor mărimi se preferă estimarea acestora, soluţie ce va fi descrisă in cadrul paragrafului 2.3.

Soluţia stabilită pentru achiziţia mărimilor incluse în prima categorie se bazează pe folosirea plăcii de achiziţie PCL-818L. Astfel traductoarele mărimilor specifice bioreactorului au fost conectate la intrările analogice ale plăcii de achiziţie. Placa PCl-818L are pentru intrările analogice 16 canale simple sau 8 diferenţiale, cu o rezoluţie de 12 biţi, cu multiple nivele de intrare (+/- 0.625V, +/- 1.25, …,+/- 5V sau +/- 10V), toate programabile software, tipul conversiei este prin aproximaţii succesive, rata de conversie max. 40KHz, precizia +/- 1bit, linearitatea +/- 1bit. Tipul de transfer al datelor, permis de placă, este prin program, întreruperi sau DMA.

1/37

-

+

er

A

parametrii de acord

comandăacordare Mecanism

de acordare

Proces

Filtrare şi extragere de proprietăţi sintetice

Figura 1: Reprezentarea subsistemelor de măsură şiautomatizare aferente bioreactorului

2.2. STABILIREA SOLUŢIEI PENTRU COMANDAELEMENTELOR DE BAZĂ ALE BIOREACTORULUI

Regulatoarele autoacordabile oferă perspectiva îmbunătăţirii nivelului de performanţă obţinut în reglarea proceselor industriale, creşterea autonomiei sistemului decizional automat şi reducerea cerinţelor de înaltă calificare a personalului uman (Barbu, 2003). Există două tipuri de mecanisme de autoacordare: mecanism paralel de autoacordare (Schonberger, 1998) şi mecanism substitutiv de autoacordare (Leva, 1994). În cadrul acestei activităţi s-a folosit un mecanism substitutiv de acordare, ilustrat în Figura 2. Mecanismul de acordare conţine un regulator bipoziţional cu histerezis variabil, care determină intrarea sistemului într-un regim de oscilaţii întreţinute. Monitorizarea oscilaţiilor se face în blocul de filtrare şi de extragere de proprietăţi sintetice, care le determină amplitudinea şi perioada. Acestea sunt folosite la identificarea parţială a caracteristicii de frecvenţă a procesului şi la evaluarea timpului mort. Blocul de filtrare şi de extragere de proprietăţi sintetice va trimite punctul (punctele) identificate şi timpul mort blocului mecanism de acordare, care va determina parametrii regulatorului tipizat.

Literatura foarte amplă dedicată regulatoarelor autoacordabile reliefează două aspecte esenţiale, de care depinde în mare măsură calitatea autoacordării:

1 - calitatea informaţiilor furnizate de blocul de extragere a informaţiilor sintetice. Acurateţea acestor informaţii depinde, într-o măsură importantă, de calitatea filtrării semnalului de ieşire. Experienţa industrială a arătat că variaţiile aleatoare adiţionale ale mărimii de ieşire măsurate (zgomot de măsură, impulsuri parazite de scurtă durată etc.) pot provoca distorsiuni importante în evaluarea proprietăţilor sintetice ale procesului condus şi ale buclei în ansamblu, cu repercusiuni grave asupra calităţii autoacordării. Acest fapt a condus la investigarea unor soluţii evoluate de filtrare, adecvate cerinţelor regulatoarelor cu autoacordare.

2 – stabilirea criteriului de autoacordare. Frecvent, procedurile de autoacordare vizează cerinţe privind asigurarea unei margini de fază sau/şi de amplificare impuse.

2/37

Figura 2: Sistem automat cu regulator tipizat şi mecanism substitutiv de autoacordare

Prezenta activitate are ca obiectiv elaborarea unor soluţii noi, bazate pe tehnici fuzzy şi neuronale, pentru rezolvarea celor două aspecte menţionate anterior. În esenţă, aceste soluţii se referă la:

- utilizarea unor proceduri de filtrare obţinute pe baza compunerii prin tehnici fuzzy a filtrelor liniare FIR cu cele neliniare în bandă adaptivă;

- analiza neuronală a răspunsului periodic al buclei în regimul de reglare bipoziţională;- utilizarea tehnicilor fuzzy în alegerea cerinţei privind rezerva de stabilitate a sistemului.

3. IMPLEMENTAREA DE TEHNICI MODERNE PENTRU OBŢINEREA INFORMAŢIILOR ÎN REGIM ON-LINE ASUPRA VARIABILELOR PROCESULUI

Una dintre cele mai întâlnite şi mai importante probleme în controlul proceselor biotehnologice este a găsi senzori adecvaţi şi performanţi pentru măsurarea variabilelor cheie ale procesului. Dacă în cazul mărimilor ce creează condiţiile de dezvoltare a populaţiei de microorganisme din bioreactor (temperatura, agitarea, aerarea, presiunea în bioreactor, pH-ul, concentraţia de oxigen dizolvat etc.) există senzori de foarte bună calitate, în cazul mărimilor ce caracterizează, calitativ şi cantitativ, populaţia de microorganisme din bioreactor (concentraţia de biomasă, concentraţia substratului, concentraţia produsului de biosinteză etc.) acestea nu pot fi măsurate “on-line”, datorită inexistenţei unor senzori ieftini, fiabili şi suficient de robuşti. Achiziţia biomasei, a substratului, a produselor de metabolism, se face prin analiză de laborator, această metodă făcând dificilă conducerea bioreactoarelor (în sensul reglării directe a acestor mărimi). Analiza de laborator necesită prelevarea unei probe din conţinutul bioreactorului, ceea ce presupune un risc mărit în contaminarea (infectarea) culturii. De asemenea, metodele de laborator pentru determinarea numărului de microorganisme, determinarea concentraţiei substratului, precum şi a concentraţiilor produselor de metabolism sunt destul de imprecise, generând astfel incertitudini în aprecierea evoluţiei mărimilor menţionate. Aceste probleme sunt mult amplificate în mediul industrial, în special datorită lipsei dotării corespunzătoare şi a unui personal suficient de calificat pentru realizarea unor măsurători de calitate în laborator. În mod normal, în aceste condiţii, se poate conta pe cel mult trei, patru analize de laborator în cursul desfăşurării unui proces biotehnologic.

O posibilitate de a ocoli multiplele neajunsuri legate de achiziţia datelor de la bioreactoare, este estimarea mărimilor de interes din procesul biotehnologic considerat (Barbu, 2004a), (Caraman, 2004b). Estimatorul de stare (numit în literatura de specialitate şi “senzor software” sau “observer”) nu este altceva decât un algoritm utilizat pentru determinarea unor mărimi ale procesului, care nu sunt măsurabile în timp real, pe baza altor mărimi accesibile din punct de vedere al achiziţiei lor.

Reţelele neuronale imită funcţia creierului uman de a depinde de informaţiile acumulate în neuron. Există câteva avantaje ale utilizării reţelelor neuronale în modelarea şi controlul proceselor reale. Reţelele neuronale pot lucra cu sisteme neliniare sau multivariabile şi pot învăţa sau adapta datele procesului în structura lor. Datorită acestor caracteristici, reţelele neuronale au fost aplicate în foarte multe domenii diferite. Potenţialul de aplicabilitate al reţelelor neuronale provine din structura lor specială şi din abilitatea adaptării datelor. În fapt, o reţea neuronală prezervă informaţiile procesului prin conexiunile între neuronii artificiali sau „noduri” printr-un algoritm de învăţare sau antrenare selectat.

Structura feed-forward este folosită foarte des în cazul proceselor biotehnologice, în special pentru controlul acestor procese, dar, în ultima perioadă, şi în cazul senzorilor software. De asemenea, sunt utilizaţi şi alţi algoritmi neuronali, cum ar fi: adaptiv, recurent etc.

3.1.1 Implementarea unui observer neuronal pentru procesul de biosinteză discontinuă a alfaamilazei şi proteazei cu microorganismul Bacillus subtilis

În cadrul acestei activităţi a fost implementat un observer neuronal pentru procesul de biosinteză discontinuă a alfaamilazei şi proteazei cu microorganismul Bacillus subtilis (Caraman, 2002b). S-a plecat de la un model structural-funcţional al procesului mai sus menţionat descris prin sistemul de ecuaţii diferenţiale (4) – (12).

3/37

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

Figura 20: Evoluţia biomasei viabile, alfaamilazei, substratului neasimilabil (amidonul)şi a substratului asimilabil (glucoza).

Semnificaţia mărimilor care apar în modelul dat de ecuaţiile (4) – (12) este următoarea: ES – concentraţia complexului enzimă substrat, E – concentraţia alfaamilazei, P – concentraţia proteazei, S – concentraţia substratului neasimilabil, M – concentraţia substratului asimilabil, X – concentraţia biomasei viabile, Xt – concentraţia biomasei totale, E1 – concentraţia alfaamilazei intracelulare, P1 – concentraţia proteazei intracelulare, i, i=1…12 – viteze de reacţie. Dintre vitezele de reacţie, 4

reprezintă rata de creştere a biomasei viabile, iar 6 – rata de declin. Mărimea n reprezintă turaţia de agitare a mediului din bioreactorul discontinuu.

Rezultatele simulării modelului (4) - (12) sunt prezentate în Figura 20.

În continuare, au fost modificate ecuaţiile (10) – (12) ale modelului, în sensul că a fost introdusă şi vârsta medie în parametrizările din model.

(13)

4/37

(14)

(15)

A fost adăugată ecuaţia vârstei medii (V) la model:

(16)

Rezultatele simulării modelului rezultat prin introducerea ecuaţiei de vârstă medie sunt prezentate în Figura 21.

Figura 21: Evoluţia biomasei viabile, alfaamilazei, vârstei medii şi a substratului asimilabil (glucoza).

Figura 22: Structura reţelei neuronale

5/37

Figura 23: Schema de antrenare a reţelei neuronale

În cazul acestui proces, substratul asimilabil (M) este măsurat, iar componentele vectorului de stare, biomasa viabilă (X) şi alfaamilaza (E), care nu pot fi măsurate, vor fi estimate. Din cauza caracterului puternic neliniar al procesului, un observer liniar nu asigură rezultate bune pentru biomasa X şi alfaamilaza E. Un astfel de observer trebuie să estimeze un mare număr de variabile (X, E1, E, P1, P, S şi ES), ceea ce este foarte greu de implementat. Din acest motiv a fost utilizat un observer neuronal, ce a fost antrenat pe baza ecuaţiilor structural-funcţionale ale modelului.

Structura reţelei neuronale este prezentată în Figura 22. Ea conţine 4 neuroni pe stratul de intrare, 2 straturi ascunse a 10 neuroni şi un strat de ieşire cu 2 neuroni. Funcţiile de activare a stratului de intrare şi a straturilor ascunse sunt logsig, iar pentru stratul de ieşire purelin. Aşa cum se poate observa în Figura 22, intrările reţelei neuronale sunt turaţia (n), substratul asimilabil (M), biomasa viabila (X) şi alfaamilaza (E) la momentul anterior şi ca ieşire X şi E la moment curent. Antrenarea reţelei neuronale a fost facută considerând procesul în buclă deschisă, cu algoritmul back-propagation (Figura 23).

În Figura 24 sunt prezentate rezultatele obţinute prin folosirea observerului neuronal comparativ cu datele obţinute din modelul procesului. Aşa cum se observă din figură, observerul neuronal dă rezultate foarte bune, aproape similare cu cele obţinute din modelul procesului.

Figura 24: Evoluţia (model si estimare) a biomasei viabile, alfaamilazei,vârstei medii si substratului asimilabil – glucoză

6/37

4. ELABORAREA DE MODELE „ZONALE”, SPECIFICE DIVERSELORFAZE DE DEZVOLTARE A BIOPROCESULUI, COMPUNEREA LOR

PRIN TEHNICI DE INTELIGENŢĂ ARTIFICIALĂ ŞI VALIDAREAMODELELOR PE DATE DE BIOREACTOR

Un model matematic este extrem de important pentru cunoaşterea, analiza şi conducerea unui proces în general (biotehnologic în particular). Din păcate, procesele biotehnologice sunt dificil de modelat, din mai multe considerente (Caraman, 2003d), (Caraman, 2004a):

- fenomenele avute în vedere la acest tip de procese sunt puţin cunoscute;- variabilele de stare semnificative sunt dificil de definit şi comportamentul lor dinamic este în

general puternic neliniar;- experimentele sunt lungi (durata se măsoară în ore sau chiar zile) şi dificil de reprodus;- informaţiile asupra variabilelor de stare din proces (în special concentraţiile de biomasă şi ale unor

compuşi) se obţin greu, de obicei prin prelevare de probe şi analize de laborator, datorită lipsei unor senzori adecvaţi (în cele mai multe cazuri se apelelază la măsurători sau determinări indirecte);

- apariţia unui puternic zgomot de măsură, care influenţează posibilităţile de modelare a proceselor biotehnologice.

Obiectivul modelării trebuie să fie bine definit, în funcţie de scopul utilizării modelului. Un model elaborat în vederea realizării conducerii unui proces biotehnologic trebuie să ţină seama de comportamentul dinamic al acestuia, astfel încât să permită determinarea unei comenzi adecvate. Dacă scopul modelării este analiza, atunci modelul trebuie să fie capabil să descrie fenomenele esenţiale ale reacţiilor biologice şi biochimice care se desfăşoară în bioreactor. În general, determinarea modelului matematic al unui proces biotehnologic presupune reunirea unor cunoştinţe din domenii variate, precum microbiologie, biochimie, matematică, automatică, informatică, precum şi o bună colaborare între experţi, lucru deseori dificil de realizat.

În Figura 25 este prezentată structura pe subsisteme a unui proces biotehnologic (Caraman, 2002a). Primele trei subsisteme evidenţiază fenomenele de schimb de masă şi energie care au loc în bioreactor, precum şi dinamica proprietăţilor fizico - chimice ale mediului. Celelalte două subsisteme sunt legate nemijlocit de organismele vii care se dezvoltă în bioreactor, fiind constituite din toate reacţiile biochimice aferente procesului biotehnologic. În Figura 25 s-a notat: u(t) - vectorul comenzilor, y(t) - vectorul mărimilor de ieşire (măsurabile), z(t) - vectorul mărimilor de calitate, v(t) - vectorul perturbaţiilor, (t) - vectorul mărimilor de stare, (0) - starea iniţială (inoculul, concentraţia iniţială de substrat etc.)

Figura 25: Reprezentarea pe subsisteme a unui proces biotehnologic

Procesele din bioreactor reprezintă doar o fază a procesului biotehnologic. Pe lângă acestea, un proces biotehnologic implică o serie de alte operaţii pregătitoare, evidenţiate în Figura 26 (Caraman , 2002a).

Aceste operaţii, care completează procesele din bioreactor, au, la rândul lor, o influenţă importantă asupra desfăşurării procesului biotehnologic, introducând, alături de procesul de măsurare a mărimilor

7/37

procesului, un grad de incertitudine care complică în mare măsură posibilităţile de modelare şi conducere. Sunt avute în vedere următoarele operaţii:

- alegerea microorganismului producător şi a tulpinii cu cea mai mare productivitate;- păstrarea microorganismelor producătoare;- prepararea inoculului;- prepararea substratului;- sterilizarea mediului de cultură;- inocularea bioreactorului;- extragerea produselor de reacţie din mediul de cultură;- spălarea bioreactorului;- curăţarea bioreactorului.

Figura 26: Etapele unui proces biotehnologic discontinuu

La început, efortul de modelare matematică a proceselor biotehnologice s-a concentrat strict pe procesele care au loc în bioreactor, eludând operaţiile auxiliare, care, în general, nu pot fi formalizate matematic. Mai târziu, odată cu dezvoltarea tehnicilor de modelare bazate pe inteligenţă artificială, s-a încercat considerarea în model a unor elemente care nu ţin strict de procesul din bioreactor, cum ar fi calitatea inoculului, compoziţia mediului de cultură etc. O altă remarcă legată de dezvoltarea unor modele matematice pentru procese biotehnologice este aceea că mecanismul intracelular este foarte complex, nepermiţând modelarea detaliată a acestuia.

Concluzionând în literatura de specialitate au fost abordate următoarele tehnici de modelare matematică a proceselor biotehnologice:- modele structural - funcţionale bazate pe ecuaţii de bilanţ;- modele structural - funcţionale bazate pe scheme de reacţii (microbiologice şi biochimice)

(Caraman, 2003b), (Caraman, 2003c);- modele cu structură variabilă, fundamentate pe baze fiziologico-biochimice (modele zonale);- modele structural - funcţionale ţinând cont de distribuţia de vârstă a microorganismelor (Caraman,

2003a), (Caraman, 2003e);- modele calitative/semicalitative;

În cadrul acestui obiectiv s-a urmărit obţinerea unui model zonal, capabil să descrie global dinamica sistemului, având drept scop utilizarea ulterioară a acestui model într-o structură de conducere.

4.1. ELABORAREA UNOR MODELE „ZONALE”, SPECIFICE DIVERSELOR FAZE DE

În (Belea, 2004) se prezintă condiţiile de desfăşurare a procesului de biosinteză a alfaamilazei şi proteazei bacteriene cu microorganismul Bacillus subtilis. Acesta se desfăşoară în bioreactoare discontinue (batch). Procesul conţine o serie de faze pregătitoare (spălarea bioreactorului, introducerea substratului – hrana populaţiei de microorganisme – sterilizarea instalatiei ş a substratului, inocularea), după care începe şarja propriu-zisă de bioreactor. Ceea ce se doreşte de la

8/37

acest proces este obţinerea unei cantităţi cât mai mari de enzime (alfa-amilază şi protează) şi, spre deosebire de procesele biotehnologice continue, determinarea momentului de oprire a şarjei, moment la care producţia de enzime este maximă.

Caracteristicile acestui proces sunt următoarele:- inoculul: 1% (uzual intre 1 si 10%), obţinut prin cultivare 14 – 16 ore într-un bioreactor de

laborator;- densitatea inoculului: 105 celule/ml mediu din bioreactor;- prepararea mediului de cultură: se foloseşte mediu natural compus din 5% (1,4kg) - şrot de

floarea soarelui, 2% (560g) – mălai, antispumant DC – 0,01% (2,8g), apă 28l (coeficient de umplere 0,65), CaCl2 – 0,3% (84g, după 7 ore de la începerea procesului);

- parametrii pentru sterilizarea mediului de cultură: pH înainte de sterilizare – 6, temperatura - 120C, durata – 1 ora, agitare – 300 rot/min, aerare uşoară, numărul maxim de germeni contaminanţi admişi – 106 celule/ml;

- condiţii de desfăşurare a procesului: agitare continuă – 450 rot/min,

Figura 30a

În Figurile 30a, 30b, 30c şi 30d este prezentată evoluţia (afectată de erorile de măsură) a numărului total de germeni (biomasa totală) în 4 experimente. Examinând datele experimentale, se poate observa că evoluţia biomasei în procesul de biosinteză respectă cele 4 zone tipice: fază de inducţie, o fază intermediară, o fază exponenţială şi o fază de declin.

Figura 30b

9/37

Figura 30c

Figura 30d

Pentru verificarea concordanţei dintre modelul prezentat şi datele reale mai întâi s-au considerat datele experimentale prezentate în Figura 30a. Aceste date experimentale reprezintă o mediere a tuturor experimentelor realizate într-un an de ICA Bucureşti pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtilis.

Pornind de la datele experimentale zonarea dinamicii se face astfel:

- faza de inducţie (lag) pentru

- faza intermediară (tranzitorie) pentru

- faza exponenţială pentru

- faza letală pentru

În Figura 31 sunt prezentate datele experimentale (cu *) şi datele obţinute cu ajutorul modelului zonal (cu linie continuă). Din grafic se observă că abaterile modelului faţă de punctele experimentale sunt mici, modelul aproximând bine datele provenind de la procesul real.

10/37

Figura 31: Evoluţia biomasei totale X (model zonal şi date reale)

În continuare s-a realizat modelarea zonală a celorlalte experimente prezentate în Figurile 30b, 30c şi 30d. În Figurile 32a, 32b şi 32c sunt prezentate rezultatele modelării zonale pentru experimentele respective. Din graficele prezentate se observă că abaterile modelului faţă de punctele experimentale sunt mici, modelul aproximând bine şi de această dată datele provenind de la procesul real.

Figura 32a

11/37

Figura 32b

Figura 32c

Se face precizarea că pentru fiecare din cele 4 experimente prezentate, parametrii ce caracterizează fiecare zonă diferă. Practic putem spune că s-au obţinut 4 modele matematice cu structură identică, dar cu parametri diferiţi.

De asemenea, se observă că momentele de timp ce delimitează cele 4 faze diferă de la un experiment la altul. Ţinând cont de aceste lucruri se impune implementarea unui model a cărui timpi de delimitare a fazelor şi coeficienţi k, corespunzători fiecărei faze, să se adapteze în funcţie de o serie de informaţii provenite din subsistemul proceselor fizico-chimice, caracterizat prin mărimi fizice ca: nivelul de CO2, temperatură, pH, aerare, agitare etc.

4.2. MODELAREA INTERACŢIUNII BIOSISTEMELOR „ZONALE” CU SUBSISTEMUL PROCESELOR FIZICO-CHIMICE, CARACTERIZAT PRIN MĂRIMI FIZICE CA: TEMPERATURĂ,

PH, AERARE, AGITARE ETC, CONSIDERATE CA MĂRIMI DE COMANDĂ ÎN SISTEM

Evoluţia proceselor biotehnologice este puternic influenţată de subsistemul proceselor fizico-chimice, caracterizat prin mărimi fizice ca: temperatură, aerare, agitare, pH etc (Mencinicopschi, 1987). Astfel din datele experimentale avute la dispoziţie pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtilis, s-au putut stabili o serie de valori optime, pentru fiecare dintre aceste mărimi, ce conduc la obţinerea unei productivităţi maxime.

12/37

Reglarea mărimilor fizice, precum temperatura, aerae şi agitare, a fost prezentată în cadrul paragrafului 2.2. În acelaşi timp au fost identificate două mărimi – nivelul de CO2 şi cel de O2 – a căror evoluţie poate fi legată direct de procesul de dezvoltare a microorganismelor.

În continuare este prezentată interacţiunea dintre procesul de biosinteză şi fiecare din mărimile prezentate anterior.

Influenţa pH-ului mediului de cultură asupra biosintezei alfa-amilazei

Deoarece enzimele sunt proteine funcţionale, proprietăţile şi biosinteza lor sunt puternic influenţate de valorile pH-ului mediului de cultură. Pe mediile naturale care au pH 6.2-6.5 acumularea enzimei este maximă deoarece aceste valori au ca efect limitarea fenomenului de disociere. În timpul biosintezei alfa-amilazei pe medii de cultură în formula cărora se folosesc subproduse şi produse ca şrot de floarea-soarelui, tărâţe de grâu, făină de porumb, pH-ul natural al acestor medii are în primele faze de dezvoltare a producătorului o uşoară tendinţă de scădere, după care se înregistrează o creştere progresivă până la valori cuprinse între 7.5 şi 8.0. Valorile pH-ului mediului de cultură, înainte şi după procesul de biosinteză, condiţionează acumularea alfa-amilazei (Tabelul 1).

Tabelul 1: Influenţa valorilor pH-ului asupra acumulării alfa-amilazei în culturile submerse ale producătorului Bacillus subtilis pe mediu natural

pH-ul mediului de cultură la începutul procesului

pH-ul mediului de cultură la sfârşitul procesului

Activitatea alfa-amilazei (UN/ml)

5.05.56.06.26.57.07.5

6.57.07.57.58.08.04.5

200035006000700072007000100

Figura 33: Influenţa temperaturii asupra acumulării alfa-amilazei

Influenţa temperaturii asupra biosintezei alfa-amilazei

Temperatura la care se efectuează biosinteza este un factor esenţial pentru formarea şi acumularea în cantitate maximă a enzimei. Ea influenţează viteza de dezvoltare a microorganismului, rata disocierii, viteza de formare a enzimei şi viteza de inactivare a enzimei. Ca şi în cazul pH-ului, există o temperatură optimă de creştere şi dezvoltare a microorganismului, la care rata disocierii este minimă (cuprinsă între valorile 32 şi 37oC) şi care coincide cu temperatura optimă de biosinteză a enzimei. Temperatura de inactivare rapidă a enzimei este mult superioară (fiind mai mare de 80oC).

13/37

Pe mediile naturale durata optimă de dezvoltare este cuprinsă între 20 şi 25 ore, iar temperatura optimă pentru acumularea maximă a enzimei este de 30-35oC. În Figura 33 se prezintă influenţa temperaturii asupra acumulării alfa-amilazei în culturile submerse ale producătorului Bacillus subtilis.

Procesul de dezvoltare a microorganismului producător Bacillus subtilis este puternic exergonic. Temperatura se menţine în limitele optime prin termostatarea bioreactorului (prin intermediul unui schimbător de căldură). Durata procesului se stabileşte în intervalul 20-30 ore, în aşa fel, încât să fie întrerupt în momentul atingerii palierului sau a unei activităţi enzimatice rezonabile pentru evitarea consumului nejustificat de energie şi timp.

Influenţa aerării şi vitezei de agitare asupra biosintezei alfa-amilazei

Biosinteza alfa-amilazei necesită condiţii de intensă aerobie, producătorul Bacillus subtilis având cerinţe deosebite pentru oxigen (>17 milimoli O2/l şi h). Necesarul de oxigen dizolvat în mediul de biosinteză depinde de microorganism şi, mai ales, de faza de dezvoltare în care se află, intensitatea maximă de respiraţie situându-se în timpul fazei exponenţiale.

Pentru producătorul Bacillus subtilis acumularea maximă de alfa-amilază are loc la o turaţie de 400-500 rot/min şi o rată de aerare de 0.8-1 v. aer/v. mediu şi minut, atunci când este dezvoltat submers 25 ore la 33oC pe mediu natural. În Figurile 34 şi 35 se prezintă influenţa aerării, respectiv a vitezei de agitare asupra acumulării alfa-amilazei în culturile submerse ale producătorului Bacillus subtilis .

Figura 34: Influenţa aerării asupra acumulării alfa-amilazei

Figura 35: Influenţa vitezei de agitare asupra acumulării alfa-amilazei

14/37

Evoluţia nivelului de CO2 în cadrul procesului de biosinteză a alfa-amilazei

În cadrul bioproceselor există două mărimi care, în condiţiile menţinerii unei rate de aerare constante, reprezintă un indicator foarte bun al gradului de dezvoltare a populaţiei de microorganisme: nivelul de CO2 şi O2. Cum evoluţia celor două mărimi este complementară şi ţinând cont de datele puse la dispoziţie de ICA Bucureşti, în cadrul acestui contract va fi folosit ca informaţie din proces numai nivelul de CO2. În acelaşi timp, derivata CO2 dă informaţii asupra vitezei de dezvoltare a microorganismelor şi deci implicit asupra fazei de evoluţie a acestora. Astfel, în faza de lag datorită lipsei de activitate a microorganismelor nivelul de CO2 este scăzut, apropiat de zero, în vreme ce derivata CO2 este practic zero. În faza intermediară microorganismele încep să se dezvolte, şi, deşi vom avea în continuare un nivel destul de scăzut de CO2, derivata acestuia începe să crească, fiind diferită de zero. În faza exponenţială nivelul de CO2 creşte şi el practic exponenţial, odată cu dezvoltarea populaţiei de microorganisme, iar derivata acestuia va avea de asemenea valori mari. În cadrul fazei de declin activitatea microorganismelor scade, ajungând până la încetarea activităţii, corespunzător observându-se o scădere a nivelului de CO2 (datorită eliminării amestecului de O2 şi CO2 din bioreactor şi a introducerii de O2, prin menţinerea aerării constante) şi a derivatei acestuia. Astfel derivata nivelului de CO2 va atinge valori negative în zona de declin.

Figura 36: Evoluţia nivelului de CO2 în cazul procesului de biosintezăa alfa-amilazei cu microorganismul Bacillus subtilis

Figura 37: Evoluţia derivatei nivelului de CO2 în cazul procesului de biosintezăa alfa-amilazei cu microorganismul Bacillus subtilis

Pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtilis în Figurile 36 şi

15/37

37 sunt prezentate evoluţia concentraţiei de CO2 şi derivata acestuia pentru cazul prezentat în Figura 30a (se reaminteşte că datele experimentale în acest caz reprezintă o mediere a tuturor experimentelor realizate într-un an de ICA Bucureşti pentru acest proces).

. ELABORAREA DE MODELE DE VÂRSTĂ A MICROORGANISMELOR

Acest tip de modele se încadrează în clasa modelelor structurale, modele în care biomasa este exprimată în funcţie de o proprietate specifică, care poate caracteriza metabolismul celular, creşterea populaţiei, masa sau volumul celulelor, vârsta cronologică. Un caz special al acestui model este cel care descrie distribuţia de vârstă a populaţiei de microorganisme. Vârsta celulei reprezintă intervalul de timp scurs de la naşterea ei. Altfel spus, vârsta este o măsură a ciclului de viaţă a celulei şi poate caracteriza starea fiziologică a acesteia. Ea poate fi legată nemijlocit de proprietăţile de creştere, activitatea metabolică sau activitatea productivă a celulei. În cadrul acestui proiect, pentru modelarea procesului biotehnologic, se va folosi o structura formată dintr-un identificator on-line al bioprocesului şi un observer ce furnizează informaţia privind vârsta medie.

ELABORAREA MODELELOR DE VÂRSTĂ A MICROORGANISMELOR, CU VALIDARE PRIN SIMULARE NUMERICĂ ŞI PE DATE EXPERIMENTALE

Cunoaşterea dinamicii distribuţiei de vârstă a microorganismelor este importantă în analiza proceselor biotehnologice, cât şi în conducerea optimală a bioreactoarelor destinate obţinerii produselor de biosinteză (Ranta, 1982). Determinarea modelelor matematice prin descrierea dinamicii distribuţiei de vârstă se poate face prin două abordări :

- considerând distribuţia de vârstă discretizată în N intervale având fiecare durata tf/N, unde tf este durata procesului din bioreactor (considerat discontinuu). Tehnica de modelare constituie o extindere a procedurilor bazate pe principiul ecuaţiilor de bilanţ sau pe ecuaţiile de cinetică enzimatică. Dezavantajul metodei constă în creşterea uneori excesivă a dimensiunii vectorului de stare, aşa cum se întâmplă adesea când o distribuţie continuă se aproximează printr-una discretă;

- considerând distribuţia continuă pe variabila (vârsta microoorganismelor). În acest caz, modelul este cu derivate parţiale, variabila de stare fiind derivata în raport cu timpul curent, t, şi cu vârsta . Această cale va fi adoptată în cele ce urmează.

Se consideră x(t,) concentraţia biomasei de vârstă , la momentul t. Ţinând cont că x(t,) are caracterul unei densităţi a "distribuţiei" de vârstă, cu unitatea dimensională [g/l.s], rezultă că biomasa totală din bioreactor la momentul t este:

(58)

iar momentele de ordinul 1, respectiv de ordinul n sunt date de relaţiile:

(59)

(60)

Vârsta medie, abaterea medie patratică şi deviaţia standard sunt definite astfel:

16/37

(61)

(62)

(63)

Variaţia biomasei în intervalul de vârstă [,+d] poate fi descrisă în şase moduri principale (Caraman, 2002a):

- prin fenomenul de creştere (“îngrăşare”), ceea ce înseamnă că celulele din intervalul de vârstă [,+d] cresc în volum şi masă, astfel încât biomasa totală din intervalul considerat creşte;

- prin fisiune, ceea ce înseamnă că o celulă din intervalul [,+d] se divide, având drept consecinţă descreşterea biomasei de vârstă din intervalul menţionat şi creşterea cantităţii de biomasă de vârstă zero;

- prin înmugurire, adică o celulă din intervalul [,+d] creează una nouă. Cantitatea de biomasă din intervalul [,+d] nu se modifică, dar cantitatea de biomasă de vârstă zero creşte;

- prin fenomenul de autoliză (trecerea în stare neviabilă), ceea ce înseamnă o descreştere a cantităţii de biomasă din intervalul [,+d];

- evacuare din bioreactor (descreştere a cantităţii de biomasă din intervalul [,+d]);- prin fenomenul de îmbătrânire. Pe măsură ce îmbătrânesc, celulele din intervalul [,-d] trec în

intervalul [,+d], cele din intervalul [,+d] trec în intervalul [+d,+2d], etc. Primele trei cazuri reprezintă mecanisme de modificare a biomasei, de natură biologica. Cazurile 2

şi 3 arată modul cum se pot crea noi celule.

Modelul matematic al distribuţiei de vârstă a populaţiei de microorganisme poate fi obţinut prin mai multe metode, cum ar fi: ecuaţii de bilanţ, metode statistice, metode probabilistice, etc. În continuare, se va determina modelul distribuţiei de vârstă a celulelor printr-o metodă probabilistică.

Se notează prin x(t,-d)d concentraţia de biomasă cu vârsta cuprinsă în intervalul [-d,] la momentul t, iar prin E, condiţia ca o celulă să aparţină intervalului [-d,]. Următoarele evenimente, care se exclud reciproc, pot avea loc în intervalul [t,t+d]:

- A: celula se divide sau trece în stare neviabilă prin autoliză;- B: celula poate fi evacuată din bioreactor;- C: celula îmbătrâneşte cu dt.

Rezultă următoarele probabilităţi ale evenimentelor:

(64)

unde

(65)

este o funcţie cunoscută, care arată că vitezele de fisiune şi autoliză depind de vârsta .

(66)

(67)

Ţinând cont de cele trei probabilităţi, date de relaţiile (64) şi (66) – (67), rezultă cantitatea de biomasă din intervalul [-d,] sub forma

(68)

17/37

Se poate scrie următoarea ecuaţie de bilanţ, pentru concentraţia de biomasă din intervalul [-d,]:

(69)

Dacă dt=d şi , atunci, din relaţia (69), rezultă următoarea ecuaţie diferenţială a distribuţiei de vârstă a microorganismelor:

(70)

unde () este dat de relaţia (65).

Modelul de mai sus trebuie completat cu condiţia la limită (formarea biomasei de vârstă zero)

(71)

cu (t) viteza de înmulţire a biomasei prin înmugurire sau, altfel scris

(72)

şi condiţia iniţială

(73)

Integrând ecuaţia (70) în raport cu vârsta , se obţine:

(74)

unde x(t) este biomasa totală din bioreactor la momentul t. Înmulţind ecuaţia (74) cu şi integrând pe întregul domeniu de vârstă, se obţine

(75)

Ţinând cont de relaţiile (58) – (62), se notează:

(76)

În acelaşi mod, momentul de ordinul doi este dat de ecuaţia diferenţială:

(77)

şi, în general, momentul de ordinul n este dat de

(78)

Ecuaţiile (76) – (78) reprezintă o formă recursivă pentru determinarea momentelor distribuţiei de vârstă a microorganismelor. În forma finală, () trebuie particularizat în funcţie de modul cum se face înmulţirea şi autoliza microorganismelor.

Pentru vârsta medie se poate scrie următoarea ecuaţie:

18/37

(79)

Înlocuind ecuaţiile (61) şi (74) în (76) rezultă

(80)

Introducând ecuaţiile (62), (77) şi (79) în (80) se obţine abaterea medie patratică

(81)

Considerând

(82)

unde KD reprezintă viteza de autoliză şi KF - viteza de înmulţire a microorganismelor prin fisiune, ecuaţiile (74), (80) şi (81) devin

(83)

(84)

(85)

Examinând ecuaţiile (83) – (85), se pot trage următoarele concluzii:- ecuaţia (83) reprezintă ecuaţia de bilanţ pentru biomasă, ecuaţie care ia în considerare şi faza de

declin, prin coeficientul KD;- ecuaţia (84) descrie dinamica vârstei medii, luând în considerare înmulţirea microorganismelor

prin fisiune.

Presupunând, în continuare, că viteza de autoliză şi cea de fisiune depind de vârsta medie, ipoteză mai realistă decât în (82),

(86)

rezultă

(87)

(88)

(89)

Identificarea experimentală a procesului de acumularede biomasă a populaţiei de Candida lypolitica

19/37

Date procesIniţializare

Legături funcţionale

Neuroni liniari

Dinamici interne

z-1

Fie procesul de acumulare de biomasă a populaţiei de Candida lipolytica pe un substrat de sulfat de amoniu. Modelul procesului este dat de următoarea schemă de reacţie (Barbu, 2004d):

(90)

unde S este substratul, E este enzima, S-E reprezintă complexul enzimă-substrat, M este un metabolit

iar ratele cinetice constante.Două presupuneri se fac asupra variabilelor procesului:

1) Concentraţia totală de enzimă E0(t), care este suma complexului enzimă-substrat Cp(t) şi enzima E(t), este proporţională cu concentraţia de biomasă X(t):

(91)

2) Rata de creştere a populaţiei de microorganisme este proporţională cu rata de formare a

metabolitului :

(92)

Modelul este data de următoarele ecuaţii:

(93)

(94)

(95)

unde

, , , , (96)

In ecuaţiile (93) – (95), ce descriu dinamicile procesului de creştere a populaţiei de Candida lipolytica pe un substrat de sulfat de amoniu, m este rata specifică maximă de creştere a biomasei (

), m reprezintă rata specifică maximă de consum ( ), KS şi Km sunt constante de saturaţie, D este reta de diluţie şi Sf este concentraţia de substrat din hrană. Acest model este completat prin adăugarea ecuaţiei de vârstă medie:

(97)

unde m(t) este vârsta medie a populaţiei de microorganisme.

În cadrul acestei activităţi au fost investigate mai multe tipuri de reţele neuronale recurente. În final s-a optat pentru o structură de tip Elman cu utilizarea legăturilor funcţionale (Barbu, 2004d) Legăturile funcţionale realizează transformări suplimentare ale spaţiului intrărilor reţelei furnizând intrări suplimentare neuronilor reţelei. Practic, legăturile funcţionale extind spaţiul de intrări original într-o dimensiune superioară, încercând reducerea încărcării unităţii de calcul în faza de antrenare a reţelei neuronale. Legătura funcţională acţionează asupra unui element al vectorului de intrare sau asupra tuturor vectorilor de intrare generând un set de funcţii liniar independente. Apoi are loc evaluarea acestor funcţii. Se poate observa că nu a fost introdusă nici o informaţie suplimentară. Totuşi, reprezentarea a fost mărită şi, ca o consecinţă, atât perioada de antrenare cât şi eroarea de antrenare se îmbunătăţesc.

Schema folosită în identificare este prezentată în Figura 40. Ea conţine următoarele elemente: neuroni liniari, elemente cu dinamică internă (integratoare) , legături funcţionale de tip multiplicative. Această schemă este utilizată la identificarea procesului descries de ecuaţiile (93) – (95).

20/37

Xs

MXks

CP

X

S

11

Te

z x

x

x

x

Sk

Mk

11

Te

z

z-1

11

Te

z

z-1

Xs

Ss

PCs

Mecanism ajustare

parametri

T[ ]S Mp k k Xs

SXks

Pentru ajustarea parametrilor se foloseşte un criteriu de tip eroare pătratică dintre datele experimentale şi ieşirile modelului:

(98)

unde: , cu - date măsurate şi - ieşirile modelului. Vectorul parametrilor

la pasul k este calculat printr-o metodă de gradient:

(99)

unde ∇ p I este definit pentru fiecare componentă pi:

(100)

Senzitivitatea biomasei X în raport cu fiecare parametru pi ( ) este dată de ecuaţia:

(101)

Luând în considerare ecuaţiile (100) şi (101), ecuaţia (99) devine::

(102

unde h este mărimea pasului de căutare.

Se poate observa că, deşi sunt calculate senzitivităţile fiecărei variabile în raport cu vectorul parametrilor p, în ecuaţia de ajustare a parametrilor apare numai senzitivitatea biomasei în raport cu vectorul parametrilor p. Mecanismul de calcul al senzitivităţii biomasei in raport cu parametrul este

prezentat în Figura 41. Celelalte senzitivităţi ( , , , ) sunt calculate în blocuri similare. Ecuaţiile ce definesc senzitivităţile menţionate mai sus sunt prezentate în Anexa1.

21/37

11

Te

z

z-1

11

Te

z

z-1

11

Te

z

z-1

( 1)X k

( 1)S k

( 1)PC k

x

x

-1

-

Sk

- Mk

x-1

x

x

-1

-1

D

fS

Figure 42: Structura reţelei neuronale cu dinamică

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

5

10

15Biomasa [Kg/m3]

1

2

3

0.5

1

1.5

20

40

60

5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

Substrat [Kg/m3]

Complex enzima-substrat [Kg/m3]

Time [h]

Time [h]

Time [h]

Time [h]

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

5 10 15 20 25 30 35 40 45 500Varsta medie [h]

Structura reţelei neuronale utilizată în identificarea bioprocesului este de tip Elman şi este prezentată în Figura 42. Ea conţine 4 neuroni liniari din care, prin ajustarea ponderilor, se obţin parametrii procesului. Ajustarea ponderilor ce determină parametrul (ai neuronilor 3 şi 4) se realizează sincron.

22/37

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

5

10

15Biomasa [Kg/m3]

1

2

3

0.5

1

1.5

20

40

60

5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

Substrat [Kg/m3]

Complex enzima-substrat [Kg/m3]

Time [h]

Time [h]

Time [h]

Time [h]

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

0

Varsta medie [h]

Figura 43: Evoluţia variabilelor procesului şi modelului(variabilele procesului – cu linie continuă şi variabilele modelului – cu linie întreruptă)

Figura 44: Evoluţia variabilelor procesului şi modelului luând în considerare zgomotul de măsură(variabilele procesului – cu linie continuă şi variabilele modelului – cu linie întreruptă)

Simularea începe cu un set de parametri aleşi aleator. După 10 ore de funcţionare începe procedura de ajustare a parametrilor, ajustarea făcându-se la fiecare oră. A fost aleasă perioada de o oră din două motive: procesele biotehnologice sunt foarte lente (perioada de eşantionare pentru procesul considerat în cadrul acestei activităţi fiind de 0.1 ore) şi datele experimentale sunt dificil de obţinut (se obţin prin prelevarea de mostre ce sunt apoi analizate in laborator). La fiecare oră un nou set de parametri este determinat (prin antrenarea reţelei), pe baza parametrilor anteriori.

Informaţia de vârstă medie este obţinută în cadrul unui observer de vârstă medie, descris de ecuaţia (97). Parametrii ecuaţiei observerului de vârstă medie sunt furnizaţi on-line de către modelul neuronal. Validarea evoluţiei vârstei medii poate fi considerată corectă deoarece în ecuaţia de vârstă medie sunt parametrii din celelalte ecuaţii ale modelului (biomasă, substrat şi complex enzimă-substrat), ce au fost ajustaţi la valorile reale.

În Figura 43 este dată evoluţia biomasei, substratului, complexului enzimă-substrat şi vârsta medie obţinute utilizând procedura de identificare descrisă mai sus. Cea mai.mică eroare se obţine în cazul biomasei, deoarece aceasta este mărimea în funcţie de care se face ajustarea parametrilor. Se observă o bună convergenţă a evoluţiei variabilelor modelului în raport cu cele reale.

Următoarea simulare consideră măsurările de biomasă ca fiind afectate de zgomot de măsură alb. Influenţa zgomotului de măsură este practic imperceptibilă, rezultatele, prezentate în Figura 44, fiind foarte apropiate de cele din Figura 43.

23/37

ELABORAREA DE METODE DE CONDUCERE INTELIGENTĂ A BIOPROCESELOR

În cadrl activităţilor corespunzătoare obiectvului Elaborarea de metode de conducere inteligentă a bioproceselor s-a avut în vedere elaborarea şi implementarea unor metode de control care să ţină cont de cele două caracteristici ale proceselor biotehnologice: sunt procese neliniare şi afectate de incertitudini parametrice (Barbu 2004b), (Barbu, 2004e), (Barbu, 2004f). Astfel, au fost elaborate două metode de control specifice modelelor zonale şi de vârstă medie, obţinute în cadrul activităţilor precedente, şi implementate două metode neliniare de control. Toate metodele elaborate şi implementate utilizează tehnicile de inteligenţă artificială, alegere datorată caracteristicilor bioproceselor prezentate anterior.

6

Obiectivul controlului în cazul unui bioreactor cu funcţionare discontinuă este determinarea timpului de oprire a şarjei astfel încât să rezulte obţinerea unei cantităţi de enzime cât mai mari cu cheltuieli şi consum de resurse minime. Ţinând cont de acest obiectiv avem practic de a face cu un algoritm de conducere optimală a bioreactorului cu funcţionare discontinuă (Barbu, 2004e).

Stabilirea funcţiei criteriu:

Se consideră, următoarea expresie pentru beneficiul obţinut în unitatea de timp de exploatare a bioreactorului:

(103)

în care:VPB - valoarea totală a produselor de biosinteză obţinute într-o singură şarjă;CMP - costul total al materialelor consumate la o singură şarjă;COA - costul total al operaţiilor auxiliare pentru o şarjă;qER - costul în unitatea de timp al energiei consumate pentru funcţionarea bioreactorului;qFM - costul pe unitatea de timp al forţei de muncă utilizată pentru exploatarea bioreactorului;qA - amortismentul bioreactorului în unitatea de timp;tf - timpul final de desfăşurare a reacţiilor de biosinteză;TA - timpul necesar pentru operaţiile auxiliare.Se poate constata că, pentru un anumit produs de biosinteză, CMP, COA, qFM, qA şi TA sunt

constante, qER depinde de intensitatea agitării şi intensitatea aerării, în schimb VPB şi tf depind în mod esenţial de condiţiile de desfăşurare a procesului de biosinteză, deci de vectorul de comandă, u. Valoarea totală a produselor de biosinteză este:

(104)

unde x(tf) este cantitatea de alfa-amilază, produsă la momentul tf, iar Pu este preţul unitar al produsului de biosinteză. În sensul celor prezentate, s-a adoptat ca funcţie criteriu, costul specific al produselor de biosinteză, acesta având următoarea expresie:

(105)

unde cut este costul în unitatea de timp al utilităţilor. Ţinând cont de valorile numerice ale costurilor care intervin în expresia (105), rezultă următoarea formă a criteriului de performanţă:

(106)

Comanda în cazul bioreactorului cu funcţionare discontinuă este timpul de oprire a şarjei:

24/37

(107)

Din datele experimentale avute la dispoziţie pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtilis se pot trage următoarele concluzii:

- în cazul dezvoltării unei cantităţi foarte mari de microorganisme cantitatea de produs (alfa-amilază) obţinută este nesatisfăcătoare (Tabelul 2). În practică se consideră că o şarjă este „satisfăcătoare” atunci când se obţine o cantitate minimă de alfa-amilază de aproximativ 5000-5500 unităţi;

Tabelul 2: Evoluţia numărului total de microorganisme şi a cantităţii de alfa-amilază pentru diverse experimente ale procesului de biosinteză a alfa-amilazei cu microorganismul Bacillus subtilis

Număr total de microorganisme Cantitate de alfa-amilază1200 8233360 14619

1730 92867050 52967500 494312900 463439000 3900

- după momentul atingerii maximului de biomasă, obţinerea optimului din punct de vedere al productivităţii (minimizarea criteriului (106)) are loc într-un interval de timp variabil, dependent de condiţiile de mediu. Acest lucru poate fi observat în Figurile 45a, 45b, 45c şi 45d, în care sunt prezentate simultan evoluţia numărului total de germeni şi a criteriului (106). Una din mărimile fizice ce poate fi corelată cu intervalul de timp scurs între maximul de biomasă şi minimul criteriului este pH-ul. Astfel, dacă la momentul atingerii maximului biomasei în bioreactor pH-ul are o valoare mare (mediul este bazic) nu sunt condiţii pentru ca microorganismele să continue să producă enzimă, deci funcţionarea bioreactorului trebuie oprită imediat (Figurile 45c şi 45d). În schimb, dacă la momentul atingerii maximului de biomasă în bioreactor avem un pH mic (mediul este acid) microorganismele, deşi intră în zona de declin, produc în continuare alfa-amilază. În acest caz decizia de oprire a bioreactorului se va lua după un număr important de ore (Figurile 45a şi 45b). Pentru o exemplificare mai concretă în Tabelul 3 sunt daţi timpii de funcţionare ai bioreactorului după momentul atingerii maximului de biomasă în vederea obţinerii unui maxim de productivitate.

Figura 45a Figura 45b

25/37

Figura 45c Figura 45d

Tabelul 3: Influenţa pH din bioreactor asupra duratei de funcţionare a bioreactorului după atingerea maximului de biomasă folosind datele experimentale

Nivelul de pH în bioreactor în momentul atingerii maximului de biomasă

Durata de funcţionare a bioreactorului după atingerea maximului de biomasă

7.8 46.5 88.3 18 2

Ţinând cont de concluziile formulate mai sus pentru procesul de biosinteză a alfaamilazei cu microorganismul Bacillus subtilis s-a realizat următoarea structură de conducere: sistemul evoluează conform modelului zonal până la momentul intrării în zona exponenţială. Aici are loc o analiză a posibilităţii obţinerii unei şarje satisfăcătoare din punct de vedere al productivităţii. Analiza are în vedere numărul de microorganisme existente în bioreactor la acel moment. În cazul în care numărul de microorganisme este foarte mare se va obţine o productivitate mică şi se ia decizia opririi şarjei, decizie luată din considerente de rentabilitate economică.

În cazul în care se decide continuarea şarjei, se trece din nou pe modelul zonal până în momentul atingerii maximului de biomasă. În acel moment, ţinând cont de a doua concluzie, pe baza nivelului de pH existent la acel moment în bioreactor se stabileşte momentul de oprire a şarjei. Decizia se ia în cadrul unui bloc fuzzy de tip Mamdani având ca intrare nivelul de pH din bioreactor, iar ca ieşire timpul cât bioreactorul va mai funcţiona după momentul atingerii maximului de biomasă.

Funcţiile de apartenenţă utilizate – de tip trapezoidal pentru intrare şi singelton pentru ieşire – sunt prezentate în Figurile 46a şi 46b. Ţinând cont că baza de reguli este următoarea:

DACĂ (pH = Mic) ATUNCI (Timp = Pozitiv)DACĂ (pH = Mare) ATUNCI (Timp = Zero)

se obţine caracteristica blocului fuzzy prezentată în Figura 47.

Figura 46a Figura 46b

26/37

_

+

_+

Referinţa

Proces

Model

u=Dm* X

Xm

Observer vârstă medie

RegulatorPI

m

Figura 47

Folosind blocul fuzzy prezentat anterior se obţin duratele de funcţionare a bioreactorului după momentul atingerii maximului de biomasă prezentate în Tabelul 4. Se observă că rezultatele obţinute cu structura de conducere realizată (prezentate în Tabelul 4) sunt foarte apropiate de cele obţinute din datele experimentale (Tabelul 3).

Tabelul 4: Influenţa pH din bioreactor asupra duratei de funcţionare a bioreactorului după atingerea maximului de biomasă folosind structura de conducere

Nivelul de pH în bioreactor în momentul atingerii maximului de biomasă

Durata de funcţionare a bioreactorului după atingerea maximului de biomasă folosind logica fuzzy

7.8 3.736.5 88.3 1.078 2.67

. ELABORAREA ŞI VALIDAREA PRIN SIMULARE NUMERICĂ A PROCEDURILOR DE CONTROL BAZATE PE MODELE DE VÂRSTĂ MEDIE

Se consideră cazul proceselor de biosinteză continue, unde principala intrare de comandă este rata de diluţie D. Aşa cum s-a arătat în paragraful 5.1, o variabilă importantă, care caracterizează starea fiziologică a populaţiei de microorganisme, este vârsta medie. De ea depinde, în mare măsură, capacitatea de biosinteză a microorganismului producător. Se pune, deci, problema aducerii populaţiei de microorganisme la o vârstă optimă din punct de vedere al capacităţii de biosinteză a celulelor. În această idee, controlul vârstei medii în bioreactor poate fi o soluţie pentru obţinerea unei productivităţi mărite a procesului. Structura de control a vârstei medii într-un bioreactor de biosinteză continuu este prezentată în Figura 48, regulatorul utilizat fiind de tip PI. Regulatorul proiectat are ca intrare eroarea de vârstă medie, definită ca diferenţa dintre referinţa de vârstă medie şi informaţia de vârstă medie furnizată de observerul de vârstă medie, iar ca ieşire rata de diluţie D. Parametrii ecuaţiei observerului de vârstă medie sunt furnizaţi on-line de către reţeaua neuronală.

Rezultatele simulării sunt prezentate în Figura 49, în care referinţa de vârstă medie a fost variată între valorile 10 şi 5 ore. Figura 49 prezintă evoluţia vârstei medii, comenzii (rata de diluţie), substratului şi biomasei. Rezultate similare se obţin în cazul în care se consideră că măsurătorile de biomasă sunt afectate de un zgomot alb (Figura 51).

27/37

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

5

10

Biomasa [Kg/m3]

1

2

3

5

10

15

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

Substrat [Kg/m3]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Vârstă medie [h]

0

0.1

0.2

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

Rata de diluţie [1/h]

Time [h]

Time [h]

Time [h]

Biomasa [Kg/m3]

1

2

3

5

10

15

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

Substrat [Kg/m3]

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Vârstă medie [h]

0

0.1

0.2

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

Rata de diluţie [1/h]

Time [h]

Time [h]

Figura 48: Sistem de reglare a vârstei medii într-un bioreactor

De asemenea, a fost definit un indice de productivitate prin relaţia (Caraman, 2002b):

(108)

Prin studierea evoluţiei acestui indice de productivitate în raport cu vârsta medie (Figura 51), s-a evidenţiat existenţa unei vârste optime (la care indicele de productivitate definit de relaţia (108) este maxim), confirmând în acest fel ipoteza, că fiecare specie de microorganisme este caracterizată de o vârstă optimă la care productivitatea este maximă.

Figura 49: Rezultatele simulării controlului vârstei medii(variabilele procesului – linie continuă şi variabilele modelului – linie întreruptă)

28/37

Figura 50: Rezultatele simulării controlului vârstei medii luând în considerare zgomotul de măsură(variabilele procesului – linie continuă şi variabilele modelului – linie întreruptă)

Figura 51: Dependenţa cantităţii de produs în funcţie de vârsta medie a microorganismelor

Procesul consideratProcesul considerat are loc într-un bioreactor cu agitare continuă şi este descris de următoarele

ecuaţii (Aoyama, 1995):

(123)

(124)

(125)

cu

(126)

X = concentraţia biomasei;P = concentraţia produsului de reacţie;S = concentraţia substratului în cultură;Sf = concentraţia substratului de alimentare;D = rata de diluţie; = rata specifică de creştere a microorganismelor [l/h] dată de relaţia (126), care ia în consideraţie fenomenul de inhibiţie datorat substratului şi produsului de reacţie;

29/37

YX/S = coeficientul de productivitate biomasă (0.4 g/g); = parametru cinetic (2.2 g/g); = parametru cinetic (0.2 l/h);max = rata specifică maximă de creştere a microorganismelor (0.48 l/h);Pm = constanta de saturaţie a produsului (50 g/l);Km = constanta de saturaţie a substratului (1.2 g/l);KI = constanta de inhibiţie a substratului (22 g/l).

Obiectivul conducerii este de a maximiza concentraţia de biomasă de la ieşire pe unitatea de volum de cultură. Caracterul puternic neliniar al procesului rezultă foarte clar din caracteristica statică a acestuia (Figura 53) şi din acest motiv, s-a folosit ca model intern al procesului o reţea neuronală. Reţeaua neuronală are ca ieşire incrementul biomasei, iar structura ei este constituită din trei straturi (strat de intrare - 4 neuroni, strat ascuns - 7 neuroni, strat de ieşire 1 - neuron).

Testarea procesului descris de ecuaţiile (123) – (125) şi a modelului neuronal la o secvenţă de trepte arată că reţeaua neuronală aproximează bine ieşirea procesului în intervalul [3.5-8] g/l (Figura 54).

Figura 53: Caracteristica neliniară a bioprocesului

Figura 54: Răspunsul procesului şi al modelului la o secvenţă de trepte

Rezultate obţinute pentru referinţă treaptă: au fost variaţi parametrii regulatorului predictiv obţinându-se următoarele rezultate:

30/37

1. Orizontul de predicţie (N2) - Figurile 55a şi 55b - ceilalţi parametri au fost păstraţi la valorile: Nu=1, =10 şi =1.

Din figurile 55a şi 55b se observă că, odată cu creşterea orizontului de predicţie, ieşirea procesului se stabilizează mai lent la valoarea impusă iar comanda are variaţii mai atenuate.

2. Orizontul de comandă (Nu) – Figurile 56a şi 56b - ceilalţi parametri au fost păstraţi la valorile: N2=1, =10 şi =1.

Se observa că creşterea valorii orizontului de control conduce la creşterea vitezei de stabilizare a ieşirii procesului la referinţă.

3. Parametrul (factor de penalizare a variaţiilor comenzii) – Figurile 57a şi 57b - ceilalţi parametri au fost păstraţi la valorile: N2=1, Nu=1 şi =1.

4. Parametrul (factor de penalizare a erorilor viitoare ce intervin în minimizarea criteriului) - Figurile 58a şi 58b - ceilalţi parametri au fost păstraţi la valorile: N2=1, Nu=1 şi =1.

Figurile 57a, 57b şi 58a, 58b arată că, deşi parametrii şi acţionează asupra unor mărimi diferite, ei produc efecte asemănătoare atât la ieşirea sistemului, cât şi în comanda aplicată.

(a)

(b)Figura 55 a,b: Influenţa parametrului N2 asupra procesului (a - ieşire, b - comanda)

31/37

(a)

(b)Figura 56 a,b: Influenţa parametrului Nu asupra procesului (a - ieşire, b - comanda)

(a)

32/37

(b)Figura 57 a,b: Influenţa parametrului asupra procesului (a - ieşire, b - comanda)

(a)

(b)Figura 58 a,b: Influenţa parametrului asupra procesului (a - ieşire, b - comanda)

33/37

(a)

(b)Figura 59 a,b: Ilustrarea proprietăţilor de urmărire ale structurii GPC

Figura 60: Studiul robusteţii structurii de control

Rezultate privind proprietăţile de urmărire: proprietăţile de urmărire ale sistemului de conducere din Figura 52 au fost testate aplicând ca referinţă un semnal pseudoperiodic, a cărui frecvenţă a fost

34/37

aleasă suficient de mică, în raport cu durata de timp mare a bioprocesului considerat, astfel încât algoritmul de control predictiv să poată urmări variaţiile referinţei (Figurile 59a şi 59b). Se observă că la valori ale referinţei cuprinse între 2 şi 3, între referinţă şi ieşirea procesului apar erori de urmărire destul de mari, fapt explicabil prin aceea că în această zonă modelul neural nu aproximează destul de precis ieşirea procesului. Creşterea biomasei peste valoarea 9 conduce la valori nerealizabile ale comenzii.

Robusteţea structurii de control a fost testată mărind viteza maximă de creştere a biomasei, după 2.5 ore de la începerea bioprocesului, cu 50%. Se observă că structura GPC cu model intern neuronal se comportă foarte bine (Figura 60).

Rezultatele foarte bune obţinute, privind robusteţea structurii de control GPC implementate, justifică justeţea alegerii unei astfel de metode de conducere automată în cazul proceselor biotehnologice.

6.4. ELABORAREA ŞI IMPLEMENTAREA UNOR PROCEDURI DE TIP „PATTERN RECOGNITION” ÎN CONTROLUL ŞI DIAGNOZA BIOREACTORULUI

Pornind de la caracteristicile proceselor biotehnologice (neliniare şi cu incertitudini parametrice) s-a încercat utilizarea unei metode care foloseşte, pentru determinarea comenzii, un algoritm instruibil, care învaţă din datele înregistrate din proces (Frangu, 2001). Tehnicile de recunoaştere a formelor prezintă o caracteristică utilă în contextul conducerii bioproceselor, aceea că algoritmul de recunoaştere este instruibil. Pe de altă parte, o caracteristică intrinsecă a clasificării este aceea că oferă o aproximare discretă a realităţii, din cauza împărţirii în clase a entităţilor de recunoscut. Ţinând cont de elementele de execuţie disponibile pentru un bioreactor continuu, în care introducerea de substrat se poate face cu pompe care injectează cantităţi fixe, deci comanda constă în utilizarea repetată a pompei la un pas de eşantionare, mărimea de comandă devine un multiplu întreg al capacităţii pompei, deci este o comandă discretă. În consecinţă s-a încercat implementarea unui automat pentru recunoaşterea comenzii discrete pentru comanda proceselor biotehnologice.

6.4.1. Noţiunile specifice conducerii prin recunoaşterea formelor

În esenţă, orice operaţie de recunoaştere implică adoptarea unei decizii privind apartenenţa ansamblului atributelor observate, formînd vectorul "formă" (pattern), la o anumită clasă, dintr-o mulţime finită de clase (Caraman, 2002a). În contextul conducerii automate a unui sistem, semnificaţia recunoaşterii unei clase este aceea de a găsi decizia discretă care maximizează indicatorul îndeplinirii scopului conducerii. Spre exemplu, dacă automatul de recunoaştere trebuie să determine o comandă discretă dintr-un set finit de comenzi disponibile, atunci fiecare clasă corespunde unei comenzi discrete, iar membrii clasei sunt punctele din spaţiul mărimilor măsurabile, pentru care măsura îndeplinirii scopului este maximizată doar de comanda corespunzătoare clasei. În mod generic, clasele menţionate sunt numite situaţii de conducere (Ceangă, 1991). Contextul în care se definesc aceste clase poate fi privit ca o interacţiune între procesul condus şi sistemul instruibil de conducere, aşa cum apar în structura din Figura 61. Abordarea este foarte generală, incluzând şi cazurile când procesul este parţial necunoscut, ceea ce este favorabil pentru conducerea acelor procese biotehnologice pentru care există cunoştinţe a priori sărace despre evoluţia procesului.

Situaţia de comandă

Pentru definirea situaţiilor de comandă se consideră: y - vectorul mărimilor de ieşire; v - vectorul mărimilor perturbatoare măsurabile; e - vectorul perturbaţiilor nemăsurabile; u - vectorul comenzilor. Se face ipoteza că există p valori admisibile ale comenzii, ui, i=1,...,p, formând mulţimea Ud a

comenzilor discrete admisibile. Pe baza mărimilor de ieşire, de comandă şi perturbatoare măsurabile, se defineşte vectorul observaţiilor

(127)

în care na , nb şi nc sunt numere întregi, finite, iar k - timpul mort (în perioade de eşantionare).

Sistemul instruibil trebuie să utilizeze "experienţa" acumulată până în momentul respectiv, astfel

35/37

încât, pentru orice vector z(t) al observaţiilor din mediu, să determine comanda discretă ui(t), i=1,...,p,

care să extremizeze indicatorul .

Figura 61: Conducerea procesului cu un sistem instruibil de recunoaştere

Definiţie: se numeşte situaţie de comandă mulţimea Si a vectorilor z, pentru care comanda discretă

ui este optimă, sub aspectul îndeplinirii scopului:

(128)

Stabilirea legii de comandă înseamnă, în acest caz, deducerea prin instruire a funcţiilor discriminante ale situaţiilor de comandă Si.

După natura procesului biotehnologic condus, sistemele de conducere automată, care utilizează recunoaşterea situaţiilor de comandă, se pot încadra în mai multe categorii. Varianta cea mai generală este aceea în care sistemul instruibil foloseşte informaţia acumulată anterior pentru a determina funcţiile discriminante ale situaţiilor de comandă. Există însă şi cazuri particulare, cum ar fi cel al proceselor cu desfăşurare ciclică, în care măsura îndeplinirii scopului se poate evalua la sfârşitul fiecărui ciclu. Fie

(129)

caracteristica statică a unui proces ciclic, în care y este mărimea de ieşire la sfârşitul ciclului. Comenzile discrete ui , i=1,...,p, trebuie astfel stabilite, încât să se obţină - la sfârşitul ciclului -

mărimea de ieşire cât mai apropiată de o valoare prescrisă yp . Situaţia de comandă Si se defineşte

astfel :

(130)

În cazul proceselor menţionate, instruirea se poate realiza în cadrul unei proceduri de conducere duală, implicând - la ciclul j de funcţionare - efectuarea a doi paşi:

a - clasificarea vectorului curent

(131)

la una din situaţiile Si, i=1,...,p şi adoptarea comenzii corespunzătoare; fie ui comanda discretă

adoptată şi aplicată efectiv în proces, pentru care s-a obţinut, la sfârşitul ciclului, valoarea y a mărimii de ieşire ;

b - instruirea regulatorului, după terminarea ciclului j, cunoscând că vectorul

36/37

(132)

aparţine situaţiei Sk, corespunzătoare comenzii aplicate ukj şi efectului yj obţinut la ieşire. Sistemele

instruibile din această categorie pot fi asimilate cu procesele de tip batch, în care natura procesului (cutura de celule, substratul etc.) şi criteriul de îndeplinire a scopului nu se schimbă de la şarjă la şarjă. În acest caz, reinstruirea ciclică a sistemului are drept rezultat ameliorarea legii de comandă, chiar în absenţa unei expresii analitice a acestei legi.

Problema cardinală a reglării prin sisteme instruibile de recunoaştere a situaţiilor de comandă o constituie realizarea "instructorului", care instruieşte regulatorul automat. De regulă, în compunerea acestui instructor trebuie inclusă atât experienţa acumulată în desfăşurarea anterioară a procesului, cât şi expresia indicatorului de îndeplinire a scopului, care poate fi formulat analitic, vag, etc. O variantă posibilă este utilizarea ca instructor a unui predictor de unul sau mai mulţi paşi, împreună cu indicatorul de îndeplinire a scopului.

Situaţia de ieşire: Recunoaşterea situaţiilor de ieşire poate fi utilizată pentru evaluarea predictivă a efectelor comenzii rezultate prin utilizarea regulatorului instruibil, bazat pe recunoaşterea situaţiilor de comandă. Ca şi în cazul situaţiilor de comandă, aplicaţiile sistemelor de recunoaştere a situaţiilor de ieşire se pot încadra în mai multe categorii, în funcţie de natura "mediului" şi a instructorului. În cele ce urmează, se vor considera numai sistemele instruibile de predicţie a mărimii de ieşire în procese dinamice, categorie căreia îi aparţin procesele biotehnologice.

Situaţii strategice, de adaptare şi de diagnoză

A. Situaţia strategică: se foloseşte în cazul sistemelor de conducere automată, care pot lucra - în funcţie de caracteristicile "mediului" - cu mai multe strategii de comandă. Situaţiile strategice se pot defini îndeosebi pentru sisteme complexe, cu interacţiuni, legături şi restricţii variate, aşa cum sunt sistemele biotehnologice, dar şi cele economice şi de producţie.

B. Situaţia de adaptare: Fie cazul când "mediul" îşi schimbă lent proprietăţile. Comanda este stabilită pentru anumite proprietăţi ale procesului condus, astfel încât, la schimbarea caracteristicilor "mediului", este necesară adaptarea algoritmului de comandă, printr-un număr limitat de tipuri de ajustări ale acestuia. Recunoaşterea situaţiilor de adaptare reprezintă o alternativă la soluţiile cunoscute de conducere adaptivă, care necesită - de regulă - efectuarea unor calcule recursive relativ complicate şi, uneori, riscante sub aspectul incidentelor numerice care se pot produce.

C. Situaţia de diagnozăAprecierea comportării sistemelor dinamice complexe se poate face printr-un ansamblu de

indicatori, care vor fi numiţi criterii locale, la care se poate adăuga un criteriu global de evaluare a sistemului. Fie r vectorul criteriilor locale. Se numeşte situaţie de diagnoză mulţimea punctelor din spaţiul criteriilor locale, căreia îi corespunde un anumit tip de apreciere pentru comportarea de ansamblu a procesului condus. Aprecierile în raport cu care se definesc situaţiile de control sunt de tipul: "admisibil", "situaţie de avertizare i", "situaţie de urgenţă j", "regim de avarie", etc., unde i şi j au semnificaţii specifice procesului supervizat.

37/37