CROMATOGRAFIA Metodele cromatografice reprezintă sisteme experimentale înrudite, utile în analizarea unei mari varietăţi de substanţe chimice. Cromatografia reprezintă o metodă analitică importantă. Dintre domeniile de aplicare cităm: controlul de calitate, purificarea produselor, cercetarea fundamentală. Definiţie Termenul de cromatografie a fost utilizat iniţial de Tsvet (1872-1919), un botanist rus, ca rezultat al combinării a doi termeni din limba greacă (khromatos – culoare şi graphos – scris). El a folosit termenul pentru a descrie studiile de migrare a unui pigment vegetal separat pe o coloană de cretă. Tsvet a descris astfel cromatografia ca o metodă prin care componentele unui amestec sunt separate pe o coloană de absorbţie într-un mediu fluid. IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) defineşte cromatografia ca : o metodă utilizată în principal pentru separarea componentelor unei probe, probă în care componentele sunt distribuite între două faze din care una este staţionară iar cealaltă este mobilă. Faza staţionară poate fi solidă sau un lichid dispus pe un suport solid sau un gel. Faza staţionară poate fi compactată într-o coloană, pulverizată într-un strat sau dispusă ca un film; în aceste definiţii, patul cromatografic este un termen generic denominând diferitele forme de utilizare a fazei staţionare. Faza mobilă poate fi gazoasă sau lichidă. Istoric 1941 – Martin şi Synge inventează cromatografia de partiţie (lichid-lichid) pe coloană şi planară (pe hârtie). Primesc Premiul Nobel în 1952. 1950 – depunerea silicagelului în strat subţire duce la apariţia TLC (thin-layer cromatography) cromatografia în strat subţire 1959 – James şi Martin introduc GLC (gas-liquid chromatography) cromatografia gaz-lichid 1959 – Porah şi Flodin – cromatografia cu excludere dimensională – permite separarea uşoară a macromoleculelor după dimensiuni 1970 – HPLC – high precision liquid chromatography – metodă de mare fineţe. Clasificare Există 3 moduri de clasificare a metodelor cromatografice. Prima şi cea mai folosită este bazată pe mecanismele de retenţie – modul în care substanţa de analizat interacţionează cu faza staţionară. În acest mod de clasificare, cromatografia poate fi de 5 tipuri: 1. Cromatografia de absorbţie Această tehnică este bazată pe competiţia pentru substanţe de analizat neutre dintre faza mobilă (lichid sau gaz) şi faza staţionară. Substanţele cu grupări polare sunt reţinute mai mult de către un adsorbent polar în timp ce substanţele cu grupări nepolare interacţionează optim cu faza staţionară nepolară. În acest tip de cromatografie, substanţele de analizat sunt simultan în contact atât cu faza staţionară cât şi cu faza mobilă.

2. Cromatografia de partiţie Tehnica este bazată pe competiţia pentru substanţele neutre între faza mobilă (lichid sau gaz) şi un lichid neutru sau o fază staţionară de tip lichid (numită şi fază legată deoarece este reprezentată de lanţuri lungi alkilice cuplate la o matrice astfel încât să se comporte ca un fluid). În cromatografia de partiţie, substanţa de analizat (analizatul) este transferat din masa unei faze în masa celeilalte faze astfel încât moleculele analizatului sunt înconjurate de moleculele unei faze. Separarea în cromatografia de partiţie este obţinută prin diferenţele dintre coeficienţii de partiţie ai analizatului între faza mobilă şi staţionară. 3. Cromatografia pe schimbători de ioni Tehnica este bazată pe interacţiunea electrostatică dintre un solvit încărcat şi o fază staţionară încărcată opus. Separarea în cromatografia pe schimbători de ioni este obţinută prin afinitatea diferită a ionilor din soluţie pentru grupările ionice de sens opus din faza staţionară. Acest tip de cromatografie se aplică pentru orice solvit care capătă încărcare electrică în soluţie. Astfel, chiar şi carbohidraţii (glucidele) care sunt nepolare sub pH 12 pot fi separate prin această metodă, în soluţie la un pH peste 12. 4. Cromatografia de excludere dimensională Tehnica este bazată pe principiul sitei şi mai este cunoscută sub denumirea de gel-cromatografie, gel-filtrare sau cromatografie de gel-permeaţie. În această tehnică, particulele fazei staţionare posedă pori de diferite dimensiuni astfel încât moleculele mari sunt excluse. Solviţii sunt astfel separaţi pe baza greutăţii moleculare şi a dimensiunilor; moleculele mari sunt primele eluate (extrase) din sistem. 5. Cromatografia de afinitate Tehnica este bazată pe specificitatea biologică unică a interacţiunilor ligand-receptor (mecanismul cheie-yală). Ligandul este cuplat covalent cu matricea care formează materialul de tapetare a coloanei. Separarea are loc după ce macromoleculele devin specific dar nu ireversibil cuplate ligandul. Eluarea are loc prin modificarea compoziţiei sau pHului solventului de extracţie (eluent) în scopul diminuării interacţiunilor cu ligandul, facilitând disocierea şi facilitarea extracţiei. Aşa cum se observă în imaginea de mai jos, scopul cromatografiei de afinitate este de a separa moleculele cu o specificitate aparte dintr-un amestec molecular cum este serul sanguin. De exemplu, anticorpii serici specifici pentru un determinant antigenic pot fi izolaţi prin această metodă (vezi şi pricepe figura) Etapa 1 este cea de pregătire a imunosorbentului. Acesta constă dintr-o matrice solidă la care antigenul (marcat cu albastru în figură) a fost cuplat (de obicei covalent). Matricea constă de obicei din agaroză, sefadex, derivaţi de celuloză sau alte tipuri de polimeri. Etapa 2. Serul este trecut peste imunosorbent. Atât timp cât capacitatea de tranzitare a coloanei nu este depăşită, anticorpii din amestec (culoare roşie) specifici pentru antigenul cuplat la matricea fixă se vor cupla necovalent şi vor fi reţinuţi. Anticorpii nespecifici (verde) sau alte proteine serice (galben) vor trece nestingherite prin coloană. Etapa 3. Extracţia. Un reactiv este trecut prin coloană pentru a elibera anticorpii de pe imunoadsorbent. Soluţiile tampon care conţin o concentraţie crescută de săruri şi/sau pH scăzut sunt utilizate frecvent pentru a disloca interacţiunile necovalente dintre anticorp şi antigen. Un agent de denaturare cum ar fi ureea 8M va determina de asemenea desfacerea

legăturii antigen-anticorp prin modificarea situsului de cuplare a antigenului cu molecula de anticorp. O metodă de extracţie mai delicată este spălarea coloanei cu o soluţie care conţine antigen specific. Acesta va intra în competiţie cu imunoadsorbentul pentru situsurile de cuplare pentru antigen ale anticorpului şi va prelua anticorpii în faza fluidă. Etapa 4. Soluţia extrasă va fi dializată pe soluţie tampon salină pentru a înlătura reactivul utilizat la extracţie.

DE REŢINUT Dializa reprezintă procedeul de separare a solviţilor cu moleculă mică sau ionilor (ex. glucoză sau Na, Cl) de macromolecule (ex. amidon) datorită ratei diferite de difuziune printr-o membrană cu permeabilitate diferenţială. Exemplu: celofanul este o membrană perforată de pori mici care permit ionilor şi moleculelor mici să o traverseze dar care exclude moleculele cu greutate moleculară peste 12.000 Da. Dacă umplem un rezervor de celofan cu un amestec de amidon şi glucoză şi îl imersăm într-un rezervor cu apă pură, moleculele glucidice vor difuza în apa din mediul înconjurător până la stabilirea unui echilibru adică până când concentraţiile

sunt egale de ambele părţi ale membranei. Datorită dimensiunilor mai mari, moleculele de amidon nu pot trece prin membrana de celofan. ! Greutatea moleculară este suma greutăţilor atomilor din care este compusă molecula. Unitatea de măsură este Da – daltonul – 1/12 din greutatea unui atom de 12C. Astfel, greutatea moleculară – GM sau MW în engleză - a apei este de 18 Da. De ce este atât de important a cunoaşte greutatea moleculară a unui compus ? Să apreciem un exemplu simplu şi americănesc de concret ! Să spunem că suntem responsabili pentru un studiu care se ocupă de răspunsul albinelor de miere la diferite tipuri de zahăr. Una din modalităţile de rezolvare a acestei probleme este crearea unor soluţii cu diferite concentraţii de zaharuri pentru a vedea care sunt preferate de albine. Aţi putea oferi albinelor să aleagă între o soluţie de sucroză 35% (zahărul de masă) şi o soluţie 35% glucoză (component natural al mierii). Pentru a realiza aceste amestecuri ar trebui deci 350 părţi pe greutate (ex. grame) de zahar în 650 părţi (g) apă, producând 1000 g din fiecare soluţie. Este însă o problemă! Modul de răspuns al albinelor la prezenţa zaharului dizolvat în apă este dependent de numărul de molecule dintr-un volum dat de soluţie. Molecula de sucroză (GM=342) este de aproximativ 2 ori mai grea decât molecula de glucoză (GM=180). Astfel, o soluţie de glucoză 35% va conţine aproape de 2 ori mai multe molecule decât o soluţie 35% de sucroză. Pentru a corecta această situaţie trebuie compusă o soluţie cu greutăţile de sucroză şi glucoză în raport de 342:180. În acest caz ar trebui să avem aceeaşi concentraţie de molecule în fiecare soluţie, astfel, picătură cu picătură, fiecare soluţie trebuie să conţină acelaşi număr de molecule. Dacă vom cântări exact 342 g sucroză vom fi cântărit 1 mol de sucroză. Astfel, un mol reprezintă cantitatea de substanţă a cărei greutate în grame este egală cu greutatea moleculară a substanţei. Astfel, 1 mol de glucoză cântăreşte 180 g. dacă se dizolvă 1 mol de substanţă în suficientă apă pentru a crea 1 litru de soluţie, avem o soluţie 1 M (1 molar). O soluţie 1M ar fi prea concentrată pentru albine. O soluţie mai potrivită ar fi cu 34,2g sucroză şi 18 g glucoză. Astfel de soluţii ar fi deci soluţii 0,1M. Considerate picătură cu picătură, aceste două soluţii conţin acelaşi număr de molecule având aceeaşi molaritate. Dar câte molecule sunt într-un mol? Aproximativ 6x1023. Acesta este numărul lui Avogadro. Numărul lui Avogadro se aplică pentru molii oricărei substanţe sau ion. 1 mol de H2 are 1g.