Crioconservare

Bogdan Laura-Teodora

n 1776 omul de tiin italian Lazzaro Spallanzani a ncercat pentru prima dat

crioconservarea spermei n zapad i a observat c spermatozoizi erau mobili dup decongelare.

La sfiritul secolului IX i nceputul secolului XX, oamenii de tiina elucideaza cteva aspecte

legate de adaptarea a materiei vii, n special plante i fungi.

O contribuie remarcabila a avut-o Father Luyet, care este considerat fondatorul

criobiologiei. n 1938 Luyet i Hodapp au realizat vitrificarea spermei de broasca si stocarea n

azot lichid. n 1985 au raportat vitrificarea cu succes a unor embrioni de oarece. Din 1990

vitrificarea a fost aplicat i pentru ovocite i esut ovarian.

Crioconservarea este un proces n cazul n care celule sau esuturi ntregi sunt

conservate prin rcire, sub-zero temperaturi sczute, cum ar fi (de obicei) 77 K sau -196 C

(punctul de fierbere de azot lichid). La aceste temperaturi sczute, orice activitate biologic,

inclusiv reacii biochimice care ar conduce la moartea celulelor, este efectiv oprit. Cu toate

acestea, atunci cand solutiile crioprotector nu sunt utilizate, celulele fiind conservate sunt de

multe ori avariate din cauza congelarii n timpul abordarea la temperaturi sczute sau nclzirea

la temperatura camerei.

Temperatura

Deozitarea produselor criogenate la temperaturi foarte sczute presupune a oferi o durat

nedeterminat, dac nu chiar n apropierea de infinit, longevitatea la celule, dei real "termenul

de valabilitate", este destul de dificil de dovedit. n experimentele cu uscate, semine,

cercettorii au constatat c nu a existat variabilitate ,deteriorare evident n cazul n care

probele au fost inute diferit "ngheate" la temperaturi ultra-chiar i cele rece. Temperaturi sub

punctul de tranziie de sticl (Tg) de ap (n jur de minus 136 C), par a fi acceptate ca limite n

care activitatea biologic foarte substanial ncetinete, i minus 196 C (fazei lichide de azot

lichid) este temperatura preferat pentru depozitare a exemplarelor importante. n timp ce

frigidere, congelatoare profund i extra congelatoare rece adncime, toate similare cu cele

interne, sunt utilizate pentru multe elemente, n general, ultra rece de azot lichid la -196 C este

necesar pentru conservarea cu succes a structurilor mai complexe biologice pentru a opri

aproape toate activitiile biologice.

Riscuri

Fenomene care pot cauza deteriorarea celulelor n timpul crioconservari au loc n

principal n timpul etapei de congelare, i includ: soluie de efecte, formarea extracelulara de

ghea, deshidratare i formarea intracelular de ghea. Multe dintre aceste efecte pot fi reduse

prin cryoprotectants.

Atunci cnd au ajuns n faza de congelate, materialul este relativ conservat n condiii de

siguran fata de viitoarele daune(distrugeri). Cu toate acestea, estimri bazate pe acumularea de

radiaii induse de deteriorarea ADN-ului n timpul depozitrii criogenice au sugerat o perioad

maxim de depozitare de 1000 de ani .

Efecte si soluii

Deoarece cristalele de ghea cresc dizolvarea substanelor n ap de congelare- sunt

excluse,pt ca le determin s devin concentrate n ap rmasa lichid. Concentraii ridicate din

unele substane dizolvate poate fi foarte duntoare.

O celula sau un esut care va fi supus procesului de crioconservare, trebuie sa

ndeplineasc cteva condiii: sa fie o celula sau esut sntos, s nu fie contaminat cu

microorganisme si s fie ntr-un stadiu care s-i permit folosirea dup decongelare ( cu potenial

de diviziune).

Formarea extracelular de ghea

Atunci cnd esuturile sunt rcite lent, apa migreaz din celule i forme de ghea n

spaiul extracelular. Prea mult ghea extracelulara poate provoca leziuni mecanice membranei

celulelor din cauza de zdrobire.

Deshidratarea

Migraia de ap care cauzeaz formarea extracelulara de ghea poate provoca, de

asemenea, deshidratarea celulelor. Asociate pe celul pot provoca daune n mod direct.

Formarea intracelular de ghea

n timp ce unele organisme i esuturi pot tolera ceva ghea extracelulara, orice ghea

semnificativ intracelulara este aproape ntotdeauna fatala n celule.

Prevenirea riscurilor

Vitez controlat-i congelare lent sunt bine stabilite tehnici de pionier la nceputul anilor

1970, care a permis embrionului uman prima natere congelata (Zoe Leyland) n 1984. De

atunci, mainile care congeleaza probe biologice utiliznd paii programabili, sau ratele

controlate, au fost utilizat n ntreaga lume pentru a oamenilor, animalelor i biologiei celulare-

"nghearea joasa" o prob pentru o mai bun pstrare, pentru decongelare n cele din urm,

nainte de a fi congelate, sau crioconservate, n azot lichid. Aceste maini sunt utilizate pentru

nghearea ovocitului, a pielii, a produselor din snge, embrionilor, spermei , celulelor stem i

conservarea general de esut n spitale,in practicile de uz veterinar iin laboratoarele de

cercetare din ntreaga lume. Ca un exemplu, estimrile au pus numrul de nateri vii de la lent

ngheate ", la aproximativ 300.000 de la 400.000 sau 20 de embrioni congelai '% din cele

aproximativ 3 milioane nateri din fertilizarea in vitro.

Letala este nghearea intracelulara, care poate fi evitat dac rcirea este destul de lenta

pentru a permite suficient apei de a prsi celula n timpul nghearii progresive a lichidului

extracelular. Aceast rat difer ntre celulele de diferite dimensiuni i o permeabilitate a apei: o

rat tipic de rcire n jur de 1 C / minut este adecvat pentru multe dintre celulele mamiferelor

dup tratamentul cu crioprotectori, cum ar fi glicerolul sau sulphoxidul de dimetil, dar rata nu

este un optim universal.

Mai multe studii independente au furnizat dovezi c embrionii congelai stocati ,utiliznd

tehnici de congelare lent-ar putea, n anumite moduri s fie "mai buna" dect n stare proaspt

a fertilizarii in vitro.Studiile au fost prezentate Societatii Americane de Medicina Reproductiva

la conferinta din San Francisco, SUA, 2008. Studiile indic faptul c folosind embrioni

congelai, mai degrab dect embrioni proaspei a redus riscul de ft mort i natere prematur

dei motivele exacte sunt nc explorate.

Crioconservarea gameilor, esutului ovarian sau testicular au aplicabilitate n pacienii

oncologici naintea nceperii chimio sau radioterapiei.

n reproducerea uman asistat se folosesc n mod curent dou metode de congelare.

1. Congelarea lenta ( Slow freezing) dupa cum i spune i numele congelarea se face

lent, scaderea punctului de nghe fcndu-se progresiv, volumul intracelular al apei ramnnd n

echilibru cu cel extracelular, deshidratarea celulei facndu-se sub 0C ( n timpul congelrii), la

sfritul congelrii celula fiind deschidratat sau ramnd un volum foarte mic de apa.

Concentraia crioprotectanilor n congelarea lent este mai mica, iar timpul de expunere

al celulei la crioprotectant este mai mare. Stocarea ovocitelor i a embrionilor se face n paiete

care dupa ncarcare snt sigilate i introduse n azot lichid.

2. Vitrificarea ( congelarea rapida) reprezint o metode de congelare rapid prin

introducerea directa n azot lichid. Concentraia crioprotectaniilor pentru vitrificare este mai

mare dect n congelarea lenta, iar timpul de expunere este mai mic. Diferena dintre congelarea

lent i vitrificare const n faptul c expunerea celulelor sau esutului la o concentraie mai mare

de crioprotectani i introducerea directa n azot lichid previne formarea cristalelor de gheata i

astfel o supravieuire mai buna dup decongelare. Celula este deshidrat nainte de introducerea

n azot, iar rata de nghe este 20.000C/ minut fa de congelarea lent n care punctul de nghe

scade cu 1C/minut. Rata de nghe depinde de dispozitivul folosit pentru vitrificare. n practic

sint folosite dou sisteme de vitrificare nchis i deschis. Avantajele vitrificarii comparativ cu

congelarea lent provin din faptul c nu necesit dotari speciale, timpul alocat congelrii este

mult redus de la 2 ore la 5-15 minute n funcie de materialul congelat i mediul folosit, rata de

supravieuire dupa decongelare este superioara fa de congelarea clasic .

Vitrificarea

Cercettorii care au dezvoltat o nou tehnic, vitrificarea, din anul 2000 ca cerere pentru

a oferi beneficiile de crioconservare, fr deteriorri cauzate de formarea cristalelor de ghea. n

crioconservarea clinica, vitrificarea necesit de obicei adugarea de crioprotectori nainte de

rcire. Crioprotectorii acioneaza ca antigel: la cele mai mici temperaturi de congelare. Ei, de

asemenea, crec viscozitatea. n loc de cristalizare, soluia siroposa se transform ntr-o ghea

amorfa, se vitrifica. Vitrificarea de ap este promovat prin rcirea rapid, i poate fi realizata

fr crioprotectori de ctre o cdere extrem de rapid a temperaturii (megakelvins pe secund).

Rata de care este necesar pentru a atinge starea sticlos n ap pur a fost considerat a fi

imposibil pn n anul 2005.

Cele dou condiii de obicei necesare pentru a permite vitrificarea sunt o cretere a

vscozitatii i-o depresiune de temperatura de congelare. Multe substane dizolvate fac ambele,

dar molecule mai mari, n general, au efect mai mari, n special pe viscozitate. Rcirea rapid, de

asemenea, promoveaz vitrificarea.

n stabilirea metodelor de crioconservare, substantele dizolvate trebuie s ptrund

membrana celulelor, n scopul de a realiza viscozitatea a crescut i deprim temperatura de

congelare din interiorul celulei. Zaharurile nu ptrund cu uurin prin membrana. Aceste

substane dizolvate fac, cum ar fi sulfoxidul de dimetil, un crioprotector comun,si sunt de

multe ori toxice, n concentraie mare. Unul dintre compromisurile dificile cu care se confrunt

n crioconservarea este vitrificarea ,de a limita daunele produse de crioprotector insusi.

Tesuturi inghetate

n general, este mai uor de crioconservat pentru probe subtiri si tufe mici de celule

individuale, pentru c acestea pot fi rcite mai rapid i mai impun acest lucru doze mai mici de

crioprotectori toxici. Prin urmare, scopul de a crioconservare de ficat uman i inimii pentru

depozitare i de transplant este nc la distan.

Cu toate acestea, combinaii adecvate de crioprotectori i regimuri de rcire i cltire n

timpul nclzirii de crioconservare permite de multe ori cu succes a materialelor biologice,

suspensii special de celule sau probe de esuturi subire. Exemplele includ:

Material seminal

Snge

Celule speciale pentru transfuzie

Celulele stem

Sngele ombilical din cordonul ombilical (mai multe informaii: Cord banca de

snge # Crioconservare)

Probe de esuturi cum ar fi tumori i seciuni transversale histologice

Ou (ovocitelor) A se vedea crioconservarea ovocitului

Embrionii care sunt 2, 4 sau 8 celule cand sunt inghetate

esut ovarian

Semine de plante sau lstarilor poate fi crioconservati n scopuri de conservare.

n plus, eforturile sunt n curs de a pstra om criogenic, cunoscut sub numele de cryonics.

n astfel de eforturi, fie a creierului n cadrul cap sau ntregul corp pot fi supuse procesului de

mai sus. Cryonics este ntr-o categorie diferit de exemplele menionate anterior, cu toate

acestea, n timp ce pentru nenumrate celule crioconservate , vaccinuri, esut i alte probe

biologice au fost decongelate i folosite cu succes, acest lucru nu a fost nc cazul, la toate

pentru creier crioconservat sau organisme. n cauz sunt criteriile de definire a "victoriei".

Sustinatorii cryonics fac un caz care crioconservare folosind tehnologia actual, n special

vitrificare a creierului, poate fi suficient pentru pstrarea persoanelor ntr-o informare

"teoretica", sensul, astfel nct acestea ar putea fi renviat i a fcut foarte mult n ansamblu, prin

avansarea tehnologiei in viitor.

Material seminal materialul seminal poate fi folosit cu succes practic la infinit, dup

crioconservare. Cea mai lung raportate de stocare de succes este de 21 de ani. El poate fi folosit

pentru donarea de sperma n cazul n care beneficiarul dorete tratament ntr-un timp diferite sau

de loc, sau pentru barbatii care trec printr-o vasectomie, de a avea n continuare posibilitatea de

a avea copii.

Crioprotector mass-media pot fi completat cu glbenu de ou, fie sau lecitin de soia, cu

cele dou care nu au diferene semnificative statistic n comparaie cu reciproc cu privire la

motilitate, morfologie, capacitatea de a lega de Hialuronat in vitro, sau integritatea ADN-ului,

dup decongelare.

ovocitelor

crioconservarea ovocitului la om

crioconservarea ovocitului este o tehnologie nou, n care oule unei femei

(ovocitelor) sunt extrase, congelate i depozitate. Mai trziu, cnd ea este gata s

s rmnei gravid, oule pot fi decongelate, fertilizat, i transferate n uter ca

embrioni.

Embrionii

Crioconservarea pentru embrionii sunt utilizate pentru depozitarea de embrioni, de

exemplu, atunci cnd fertilizarea in vitro a avut drept rezultat embrioni mai mult dect este

necesar n prezent.

Sarcini au fost raportate de la embrioni stocate timp de 16 de ani. Multe studii au evaluat

copiii nscui de la embrioni congelai, sau "inghetati". Rezultatul a fost uniform pozitiv cu nici

o cretere de malformaii congenitale sau anomalii de dezvoltare.

De la 1 octombrie 2009 embrioni umani au permisiunea de a fi stocati timp de 10 ani

din Marea Britanie, n funcie de fertilizare a omului i Embriologie Actul 2008.

Datele utilizate mondial sunt greu de gasit, dar a fost raportat ntr-un studiu din 23 de

ri care aproape 42000 de embrioni congelai transferuri omului s-au efectuat n cursul anului

2001 n Europa.

Un studiu de mai mult de 11.000 crioprotectori de embrioni umani nu au artat nici un

efect semnificativ de timp, de stocare de pe supravieuire dupa dezghetare pentru fertilizarea in

vitro sau cicluri donaiei ovocitului, sau pentru embrioni congelai n etapele de pronuclear sau

de clivaj. n plus, durata de stocare nu a avut nici efecte semnificative asupra sarcinii clinice,

avort spontan, implantare, sau rata natalitii n direct, fie de la fertilizarea in vitro sau cicluri de

donare a ovocitului. mai degrab, de vrst ovocitului, proporia de supravieuire, precum i

numrul de embrioni transferati sunt predictori ai rezultatului sarcinii.

Tesutul ovarian

Crioconservarea de esut ovarian este de interes pentru femeile care vor s pstreze

funcia lor de reproducere, dincolo de limita naturala sau al cror potenial de reproducere este

ameninat de terapie de cancer. copil mai nti s fie nscui de o femeie dup un transplant de

esut ovarian congelat, i n ciuda ca mama fiind ntr-o stare de menopauza premature provocate

de chimioterapie, a fost efectuat de profesorul Jacques Donnez i echipa sa de la Cliniques

Universitaires Saint-Luc, Belgia. O parte din ovar stnga a fost eliminat, iar tesutul a fost lent

congelat nainte de a fi depozitat n terapia de azot lichid n acelai timp, a fost realizat.

esutul sase ani mai trziu a fost implantat n apropiere de trompele uterine i ou au fost n

scurt timp produse, care s permit concepie normal s aib loc .

Crioconservarea naturala

Apa poart (Tardigrada), organisme multicelulare microscopice, poate supravieui

congelarii la temperaturi sczute, prin nlocuirea cea mai mare parte a apei lor interne cu

trehaloz de zahr. Zaharuri i a substanelor dizolvate, altele care nu cristalizeaz uor au ca

efect de limitare subliniaz faptul c prejudiciul membranelor celulare. Trehaloz este un zahar

care nu cristaliza uor. Amestecuri de dizolvate poate obine efecte similare. Unele substanelor

dizolvate, inclusiv srurile, au dezavantajul c acestea pot fi toxice la concentraii mari.

O rat de controlat a procesului de rcire, care s permit s se echilibreze probe

biologice pentru a optimza parametri fizici osmotici ntr-un crioprotector (o form de anti-

blocare) nainte de rcire ntr-un predeterminat, mod controlat dovedit necesar. Capacitatea de

crioprotectorilor , n cazurile nceputul glicerol, pentru a proteja celulele de la un prejudiciu de

ngheare a fost descoperit accidental. Un prejudiciu de congelare are dou aspecte-daune directe

din cristale de ghea i daunele secundare, cauzate de creterea concentraiei de substanelor

dizolvate ca treptat mai mult de ghea se formeaz. n 1963 Peter Mazur, la Oak Ridge National

Laboratory din SUA, a artat c nghearea letalea intracelular ar putea fi evitate dac rcirea a

fost destul de lenta pentru a permite apei suficient pentru a prsi celula n timpul nghearii

progresive a lichidul extracelular. Aceast rat difer ntre celulele de diferite dimensiuni i o

permeabilitate a apei: o rat de tipic de rcire n jur de 1 C / minut este adecvat pentru multe

dintre celulele de mamifere dup tratamentul cu crioprotectori cum ar fi glicerolul sau

sulphoxide de dimetil, dar rata nu este un optim universal.

BIBLIOGRAFIE

Articol de Dr. Marilena Baluta, medic Obstetrica-Ginecologie, Embriolog.

Departamentul de Reproducere Umana Asistata