Craiova Medicală Vol 9, Nr 4, 2007

Prof. Univ.Dr Zorica-Ileana Hertzog, UMF Craiova, Facultatea de Medicină Dentară, Disciplina de Genetică 306

Studiu clinic Unele consideraţii genetice privind asocierea

microftalmiei cu defecte dentare ZORICA-ILEANA HERTZOG(1), D. HERTZOG(2)

(1)UMF Craiova, Facultatea de Medicină Dentară, disciplina de Genetică, (2)UMF Craiova, Facultatea de Medicină Dentară, disciplina de Farmacologie

Several genetic considerations regarding the association between microphtalmia and dental defects

REZUMAT Introducere. In ultimii ani au fost inregistrate progrese remarcabile in identificarea determinantilor moleculari care controleaza dezvoltarea segmentului cefalic, in special dezvoltarea ochilor si a dintilor. Pentru ca toate aceste defecte oculare afecteaza calitatea vietii si, uneori, chiar viata, este necesar sa se identifice cauza genetica a acestor anomalii pentru formularea unui consult genetic corect si a unei strategii terapeutice adecvate. Lucrarea noastra işi propune sa realizeze un studiu genetic in cateva cazuri cu anomalii oculare asociate cu defecte dentare si sa formuleze o retea de semnalizare in care calea de semnalizare a dezvoltarii ochilor se intersecteaza cu aceea a dezvoltarii dintilor. Material si metode de lucru. Au fost luate in studiu 3 cazuri care au prezentat anomalii oculare. Pentru fiecare caz a fost efectuata analiza citogenetica, arborele genealogic si s-a urmărit frecvenţa SCE (sister chromatid exchanges) induse cu bleomicină. Rezultate. Intr-un caz diagnosticat cu sindrom Hallermann Streiff François, la care microftalmia a fost asociată cu incisivi de formă conică, analiza citogenetică a relevat un cariotip normal (46,XX). Intr-un alt caz, care a etalat microftalmie, strabism, blefaroptoză si anomalii dentare (hipodontie, implantare vicioasa), examenul citogenetic a evidentiat o delXq (16%) alaturi de un cariotip normal (84%). La al treilea caz, care a prezentat microftamnie si cataracta congenitala asociate cu dinti supranumerari (un mesiodens conic) si o usoara retardare mentala, am identificat un izodicentric X in 25% din metafazele examinate. Tratamentul culturilor de celule cu bleomicină, un cunoscut clastogen, a condus la o crestere semnificativa a SCE in toate cele trei cazuri in comparatie cu probele de control, obtinute de la donori voluntari. Analiza genealogica arata o transmitere autozomal recesiva in primele doua cazuri si o transmitere dominanta X-linkata in al treilea caz. Concluzii. Frecventa crescuta a aberaţiilor cromozomiale şi a SCE induse demonstreaza o deficienta a enzimelor de reparare a leziunilor ADN. Este foarte posibil ca repararea defectuoasă a AND să contribuie la defectele oculare şi dentare. Asocierea microftalmiei cu anomalii dentare presupune existenta unei complexe retele de semnalizare in dezvoltarea segmentului cefalic in care diferiti factori de transcriptie (Pax6, Pax9, MITF) interactioneaza, iar mutatiile unei gene influenteaza negativ activitatea celorlalte gene.

CUVINTE CHEIE microftalmie, anomalii dentare, instabilitate cromozomială indusă, reţea complexă de semnalizare

ABSTRACT Introduction. Remarcable progresses in the identification of molecular determinants checking both the cephalic segment, and especially, eyes and teeth developments have been achieved in the last years. Because all these ocular defects prevent a good quality of life, and sometimes even the life itself, it is necessary that the genetical cause of these annomalies should be identifiedin order to formulate a correct genetic consulting and an adequate therapeutic strategy. The aim of the paper has to achieve a genetic study in some cases with ocular anomalies associated to dental defects and also to formulate a signal pathway where that of the eyes development intersects to the dental development one. Material and methods. Three patients displaying ocular annomalies have been taken in study. Cytogenetic analysis, pedigree and SCE (sister chromatid exchanges) induced by bleomycin were performed for each case. Results. In a case diagnosed with Hallermann – Streiff – François where microphtalmia has been associated with cone-shaped incisors, cytogenetic analysis shows a normal karyotype (46,XX). In the other case, which exhibited microphtalmia, blepharoptose and dental anomalies (hypodontia, mistaken teeth), the cytogenetic analysis emphasized del(Xq) (16%) and a normal karyotype (84%). In the third case with microphtalmia, congenital cataract, mesiodens cone-incisor and a slight mental retardation, we identified a isodicentric chromosome X in 25% examinated metaphases. The treatment of cell cultures with belomycin, a well-known clastogen, led to a significant increase of chromosomal aberrations and SCE in all the three cases with respect to control samples, obtined from health individuals. Genealogical analysis shows a recessive-autosomale transmission in the first 2 cases and dominante X-linkate in the third case. Conclusions. The increased rate of induced chromosomal aberrations and SCE demonstrated a deficiency in repairing enzymes of DNA lesions. It is very possible that the defective repair of DNA to contribute to ocular and dental defects. The association between microphtalmia and dental deffects suggests the existence of an signaling inrtricate network in the development of the cephalic segment where different transcription factors (Pax6, Pax9, MITF) interact, and the mutations of a gene negatively influences the activity of the other genes.

KEY WORDS microphtalmia, dental anomalies, induced chromosomal instability, a signaling intricate network.

Craiova Medicală Vol 9, Nr 4, 2007

307

Introducere Tulburările oculare sunt relativ frecvente în

populaţia umană, deoarece ele sunt compatibile cu supravieţuirea şi cu reproducerea. Majoritatea defectelor oculare sunt ereditare şi se transmit după modelul mendelian. Anomaliile oculare congenitale sunt contributorii majori ai morbidităţii vizuale la copii.

Microftalmia este prezentă în peste 200 de sindroame cromozomice şi cu toate acestea există foarte puţine lucrări care se referă la genetica microftalmiei, asociate cu alte anomalii oculare, dar şi cu o serie de malformaţii ale membrelor şi ale viscerelor.

Deoarece dezvoltarea normală a ochilor, ca şi de altfel şi a altor organe, se află sub controlul mai multor gene care codifică fie factori de transcripţie fie diferite molecule semnalizatoare, se realizează o complexă interacţiune între acestea şi, astfel, mutaţiile unei gene pot influenţa expresia altor gene care controlează diferenţierea altor organe. Uneori, mutaţiile genelor (duplicaţii, deleţii, inversii, etc.) sunt cauzate de modificări cromozomiale de structură care afectează profund procesul de morfogeneză.

În ultimii ani au fost înregistrate progrese remarcabile în identificarea determinanţilor moleculari care controlează dezvoltarea segmentului cefalic, în special dezvoltarea ochilor şi a dinţilor.

Pentru că toate aceste defecte oculare afectează calitatea vieţii şi, uneori, chiar viaţa, este necesar să se identifice cauza genetică a acestor anomalii pentru formularea unui consult genetic corect şi a unei strategii terapeutice adecvate.

În această lucrare ne-am propus să realizăm un studiu genetic în câteva cazuri cu anomalii oculare asociate cu defecte dentare, pe baza căruia să sugerăm un model de interacţiune între genele care controlează dezvoltarea ochilor şi genele care sunt implicate în dezvoltarea dinţilor.

Material şi metodă Au fost luate în studiu 3 cazuri care au

prezentat anomalii oculare. Pentru fiecare caz a fost efectuată analiza citogenetică, arborele genealogic şi s-a urmărit frecvenţa SCE (sister chromatid exchanges), un indicator sensibil al mutagenităţii.

Analiza citogenetică a fost efectuată prin cariotipare standard şi a cuprins: iniţierea de culturi de limfocite, prepararea cromozomilor şi colorarea lor pentru benzi G. Pentru fiecare caz au fost examinate 25 de metafaze.

Tratamentul cu bleomicină. În două cazuri, culturile de limfocite au fost tratate, pentru un interval de 48 de ore, cu bleomicină în concentraţie finală de 100 mcg/mL, în scopul de a demonstra capacitatea celulelor de a răspunde la un agent clastogen.

Tehnica SCE. Tehnica a inclus tratamentul culturilor de celule pentru 48 de ore cu BrdU (un analog al timinei) în concentraţie finală de 4.10-

5M, coloraţia preparatelor cromozomiale cu Hoechst 33258, iradiere cu raze UV şi coloraţie Giemsa (Hertzog, 1998).

Arborele genealogic. Arborele genealogic a fost alcătuit pe baza informaţiilor obţinute de la părinţii probanzilor.

Rezultate şi discuţii Un caz (AA) în vârstă de 7 ani şi jumătate, de

sex feminin, diagnosticat cu sindrom Hallermann Streiff François, a etalat un facies îmbătrânit, microftalmie bilaterală, hipotricoză generalizată şi statură mică. Dinţii aveau formă conică.

Analiza citogenetică a relevat un cariotip normal 46,XX, însă tratamentul leucocitelor cultivate cu bleomicină a condus la instabilitate cromozomială manifestată prin rupturi, lacune, rearanjamente cromozomiale (fig. 1-2), iar analiza SCE a arătat o frecvenţă crescută a acestora (fig. 3) în comparaţie cu probele de control, obţinute de la donori sănătoşi, de sex feminin. Metafazele cu modificări cromozomiale au reprezentat 85% în comparaţie cu metafazele aberante din culturile de control, care au reprezenatat 6%. SCE/celulă au etalat o frecvenţă cuprinsă între 90-128 /celulă, comparativ cu 11-13 SCE/celulă în celulele de control. Aceste rezultate sugerează o deficienţă a enzimelor reparatorii ale leziunilor ADN. Ca urmare a acestui defect, este posibil ca genele implicate în embriogeneză să fie afectate.

Fig. 1 Metafază prezentând rupturi

Zorica-Ileana Hertzog, Dan Hertzog : Unele consideraţii genetice privind asocierea microftalmiei cu defecte dentare

308

Fig.2 Metafază prezentând interschimburi

cromozomiale.

A

B Fig. 3 Metafază prezentând numeroase

schimburi ale cromatidelor surori (SCE). (A)-control; (B) proba.

Cele mai multe cazuri cu sindrom Hallermann-Streiff François sunt sporadice. Au fost menţionate o transmitere autozomal-dominantă cu expresie variabilă, dar şi o transmitere autozomal-recesivă. Cazul nostru arată o transmitere autozomal-recesivă (fig. 4).

Fig. 4 Arborele genealogic al cazului AA.

Al doilea caz (PV), de sex feminin, în vârstă de 10 ani, a prezentat microftalmie bilaterală, strabism, blefaroptoză, sindactilie şi anomalii

dentare (hipodonţie, implantare vicioasă a dinţilor).

Analiza citogenetică arată un cariotip normal 46,XX în mozaic cu un cariotip în care este prezentă o deleţie pe braţul lung al cromozomului X, care a apărut în 16% dintre metafaze (fig. 5). Tratamentul celulelor cu bleomicină a fost urmat, de asemenea, de o creştere semnificativă a aberaţiilor cromozomiale şi a SCE. Analiza genealogică arată o transmitere autozomal-recesivă.

Fig. 5 Cariotip parţial al deleţiei unui cromozom

X în cazul PV. Al treilea caz, PR, de sex masculin, în vârstă de

16 ani, a prezentat microftalmie bilaterală, cataractă congenitală, microcornee şi un dinte supranumerar de formă conică, (incisiv mesiodens) (fig. 6) şi o uşoară retardare mentală.

Examenul citogenetic a relevat în 75% dintre metafaze un cariotip normal, 46,XY, iar în 25% din metafaze a fost evidenţiat un izodicentric X (fig. 7).

Fig. 6 Incisiv mesiodens.

Studiul arborelui genealogic arată o transmitere dominantă X-linkată (fig. 8).

În această familie, microftalmia a fost asociată cu cataracta congenitală, anomalii dentare şi cu diferite grade de inteligenţă. Pacienţii 2-III şi 3-III au prezentat retardare mentală uşoară, în schimb la 5-III, retardarea mentală a fost severă. Anomaliile dentare cele mai frecvente în această familie au

Craiova Medicală Vol 9, Nr 4, 2007

309

inclus diastemă largă şi dinţi în formă de frunză şi de mărime mică.

Fig. 7 Metafază, bandată G, etalând un i dic(X)

(cazul PR).

Fig. 8 Arborele genealogic al cazului PR.

Discuţii Analiza citogenetică la cazurile investigate a

arătat într-un caz cariotip normal, iar în două cazuri mozaicuri cu două linii celulare: una normală şi alta cu aberaţii cromozomiale de structură. Frecvenţa lor mică sugerează producerea lor într-o fază mai tardivă a embriogenezei, dar frecvenţa crescută a aberaţiilor de structură şi a SCE când celulele au fost tratate cu bleomicină, indică o deficienţă a enzimelor implicate în repararea leziunilor ADN. Este foarte posibil ca repararea defectuoasă a ADN, evidenţiată printr-o frecvenţă crescută a rupturilor, să contribuie la defectele oculare şi dentare (Hou, 2003).

Microftalmia este determinată de mutaţii în gena Mitf (microphtalmia transcription factor) care este localizată în intervalul 3p14.1-p12.3 (Tachibana şi col., 1994), iar dezvoltarea normală a ochilor este condiţinată de gena Pax-6, localizată pe cromozomul 11.

Produsul celular al genei Mitf, un factor de transcripţie, are rol în controlul diviziunii celulare şi în diferenţierea celulelor. Factorul de transcripţie MITF blochează ciclul celular prin activarea expresiei proteinei p16INK4A şi prin

hipofosforilarea proteinei Rb (Loercher şi col., 2005). MITF stimulează transcripţia genelor care codifică enzime ce controlează sinteza melaninei (Planque şi col., 2001). Mutaţiile genei Mitf la şoarece conduc la microftalmie asociată cu o dezvoltare anormală a epiteliului pigmentar al retinei care apare nepigmentată, iar la om, induc sindromul Waandenburg tip 2, o condiţie ereditară asociată cu anormalităţi ale melanocitelor (Bertolotto şi col., 1998). Anomaliile oculare determinate de mutaţiile Mitf trebuie analizate prin prisma promotorilor genei. Există 4 izoforme ale exonului 1: 1A, 1H, 1B şi 1M în direcţia 5'→3', fiecare codificând un N-terminus unic fiecărei izoforme. Regiunile care flanchează 5' a izoformelor exonului 1 au fost denumite promotorii A, H, B şi M. Dintre aceşti promotori, promotorul M este funcţional numai în linia celulară din care derivă melanocitele şi este reglat pozitiv prin calea de semnalizare Wnt. Mai mult, promotorul M este reglat pozitiv de o serie de alţi factori de transcripţie (PAX3, SOX10 şi CREB) (Shibahara şi col., 2001).

Produsul celular al genei Pax-6 este un factor de transcripţie, iar mutaţiile genei Pax-6 produc microftalmie şi aniridie. Proteinele MITF şi PAX-6 interacţionează într-o cale de semnalizare care controlează dezvoltarea ochilor.

O întrebare firească apare: Cum este posibil ca mutaţiile genelor implicate în dezvoltarea ochilor să influenţeze dezvoltarea anormală a dinţilor?

Noi încercăm să răspundem la această întrebare sugerând o interacţiune complexă între produşii celulari ai genelor care se exprimă în perioada de embriogeneză (fig. 9).

Fig. 9 O posibilă reţea de semnalizare în

morfogeneza ochilor şi a dinţilor. Gena Wnt13 (Wingless), care se exprimă foarte

timpuriu în embriogeneză, controlează expresia genei Shh (Sonic Hedge Hog) în epiteliul dentar şi a genei Mitf în epiteliul pigmentar al retinei. Dar pentru inducţia şi menţinerea expresiei genelor

Zorica-Ileana Hertzog, Dan Hertzog : Unele consideraţii genetice privind asocierea microftalmiei cu defecte dentare

310

Wnt13 şi Mitf, gene specifice epiteliului pigmentat al retinei, este necesar mezenchimul extraocular care eliberează molecule semnalizatoare asemănătoare activinei (Fuhrmann şi col., 2000).

Dacă MITF interacţionează cu factorul de transcripţie PAX-6, atunci este simplu să se sugereze că MITF poate interacţiona şi cu alţi factori ai familiei PAX, cum ar fi de exemplu PAX-9 care codifică, de asemenea, un factor de transcripţie ce controlează numărul dinţilor. O mutaţie în oricare din aceste gene poate influenţa dezvoltarea anormală a dinţilor.

Asocierea microftalmiei cu cataracta congenitală şi cu anomalii dentare poate fi explicată prin prisma mutaţiilor genei Nhs (Nance-Horan syndrome) care este localizată pe cromozomul Xp22 şi care are un rol cheie în controlul diferenţierii segmentului cefalic al embrionului. Gena Nhs este activă în timpul dezvoltării embrionare şi codifică o proteină cu rol reglator în diferenţierea cristalinului, diferenţiere care are loc concomitent cu dezvoltarea dinţilor (Burdon şi col., 2003). Cum gena Nhs se găseşte în imediata vecinătate a genei Amg (amelogenină – Xp22.1) şi a genei Mrx2 (retardare mentală- Xp22). Pentru că aceste gene sunt foarte apropiate, iar posibilitatea unei recombinări genice este practic nulă, este foarte posibil ca mutaţia unei gene să influenţeze negativ expresia genelor învecinate; de altfel, există numeroase exemple în patologia genetică în care mutaţia unei gene are efect pleiotropic.

Concluzii Microftalmia se asociază întotdeauna cu alte

modificări oculare şi cu anomalii dentare şi aceasta pentru că produşii celulari ai genelor care controlează dezvoltarea ochilor interacţionează cu produşii celulari ai genelor care controlează dezvoltarea dinţilor şi invers sau mutaţiile unei gene pot exercita un efect pleiotropic aupra genelor linkate.

Unele cazuri cu microftalmie au etalat cariotipuri normale, iar altele au prezentat mozaicuri cu două linii celulare: una euploidă şi

alta cu o aberaţie de structură, prevalentă fiind linia euploidă.

Este foarte posibil ca repararea defectuoasă a ADN, evidenţiată printr-o frecvenţă crescută a rupturilor şi a SCE induse de bleomicină, expresie a deficienţei enzimelor reparatorii, să contribuie la defectele oculare şi dentare.

Limitarea acestor malformaţii în populaţie necesită imperativ investigaţii genetice moleculare prin amniocenteză într-o instituţie de stat sau privată autorizate.

Bibliografie 1. Bertolotto C., Abbe P., Hemesath TJ., Bille K.,

Fisher DE., Ortonne JP., Balotti R., (1998) Microphtalmia gene product as a signal transducer in cAMP-induced differentiation of melanocytes. J Cell Biology, 142 (3): 827-835.

2. Burdon KP., McKay JD., Sale MM., Russell-Egitt IM., Mackey DA., Wirth MG., Elder JE., Nicoll A., Clarke MP., FitzGerald LM., et al., (2003) Mutations in a novel gene, NHS, cause the pleiotropic effects of Nance-Horan syndrome, including severe congenital cataract dental anomalies, and mental retardation. Am J Hum Genet., 73: 1120-1130.

3. Fuhrmann S., Levine EM., Reh TA., (2000) Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development, 127: 4599-4609.

4. Hou JW., (2003) Hallermann-Streiff syndrome associated with small cerebellum endocrinopathy and increased chromosomal breakage. Acta Pediatr., 92:869-871.

5. Loercher AE., Tank EMH., Delston RB., Harbour JW., (2005) MITF links differentiation with cell cycle arrest in melanocytes by transcriptional activation of INK4A. J Cell Biology, 168 (1) 35-40.

6. Planque N., Leconte L., Coquelle FM., Martin P., Saule S., (2001) Specific Pax-6/microphtalmia transcription factor interactions involve their DNA-binding domains and inhibit transcriptional properties of of both proteins. J Biol Chem., 276 (31): 29330-29337.

7. Shibahara S., Takeda K., Yasumoto K., Udono T., Watanabe K., Saito H., Takahashi K., (2001) Microphtalmia-associated transcription factor (MITF): Multiplicity in structure, function, and regulation. J Investig Dermatology, 6 (1): 99.

8. Tachibana M., Perez-Jurado LA., Nakayama A., Hodkinson CA., Li X., Schneider M., Fex J., Francke U., Arnheiter H., (1994) Cloning of MITF, the human homolog of the mouse microphtalmia gene and assignement to chromosome 3p14.1-p12.3, Hum Mol Genet., 3 (4): 553-557.

Adresa pentru corespondenţă: Prof. univ.dr. Zorica Ileana Hertzog,,UMF Craiova, Facultatea de Medicină Dentară, disciplina de Genetică