Colorare Cu Comassie Si Transfer

7/17/2019 Colorare Cu Comassie Si Transfer

http://slidepdf.com/reader/full/colorare-cu-comassie-si-transfer 1/4

Protocol de colorare coloidala

1 SCOP

Solutia de colorare coloidala este un colorant foarte sensibil, utilizat pentru

colorarea proteinelor din gelurile de SDS-PAGE.

2 DOMENIUL DE APLICARE

Colorantul coloidal este foarte sensibil, putand detecta ~30ng de proteina in

gel de SDS-PAGE. Gelurile colorate cu acest colorant au un bacground foarte

scazut.

3 DOCUMENTE DE REFERINTA

Kang et al. (2002) . Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie BrilliantBle in Sodim Dodecyl Sl!ate"Polyacrylamide #el $lectro%horesis Bll. KoreanChem. Soc. 2002& vol. 2'& o. *"*2.

eho!! et al. (+,,). -m%roved staining o! %roteins in %olyacrylamide gels incldingisoelectric !ocsing gels with clear ac/grond at nanogram sensitivity sing CoomassieBrilliant Ble #"2*0 and "2*0. $lectro%horesis. +,, 1n+(3)42**"32.

4 CONDITII PREALABILE

!." Se pregateste aria de lucru cf. S#P

!.$ Aparatura necesara%

" Platfor&a agitatoare

" Cuptor cu &icrounde

!.3 'ateriale necesare%

" Cutie pentru colorare

" Pipeta de "0&l

" Cilindru de (0&l

!.! )eacti*i necesari%

" Gel de SDS-PAGE in care au &igrat probele

" Apa deionizata



" Solu+ie de colorare coloidala "0 sulfat de a&oniu, 0,"

Coo&assie lue, 3 acid orto-fosforic/

" Etanol

5 PROCEDURA

Se indeparteaza SDS-ul din gel prin $-3 spalari a cate 3-(&in fiecare. Se

coloreaza cu o solutie alcatuita din !0&l solutie de colorare coloidala si "0&l etanol.

Se incubeaza cel putin $ ore la ). Se pot utiliza si &icroundele% 1(02, ~"&in ti&p

*ariabil/. Decolorarea se realizeaza cu a.d.

6 RAPORTAREA" Caiet de lucru

7 CRITERII DE VALIDARE/ACCEPTARERE!PIN"ERE

ipsa benzilor de proteina in gel denota faptul ca proteina este in cantaitate

de sub 30ng. # alta cauza ar putea fi si lipsa4insuficienta etanolului.

# !OLU$IE DE COLORARE COLOIDALA %&'( )*l+at de a,o-i*. '.&( Coo,a))ie

l*e. 3( acid orto+o)+oric01

5.d. 63*0 mlSl!at de amoni 00gCoomassie Ble #2*0 20 ml din soltie *7 in a%a5cid orto"!os!oric '0 mlSe di8olv9 reactivii in ordinea din lista. Se adce c a.d. la n volm de ,00ml. Se

%9strea89 la tem%. camerei.Pentr colorare 4 :0 ml sol;ie de colorare < 0 ml etanol (207 !inal).



Transferul proteinelor pe membrana de nitroelulo!a sau P"D#

1 SCOP

Acest protocol descrie realizarea transferului proteinelor pe &e&brana de

nitroceluloza sau P5D6 in *ederea utilizarii &e&branei pentru 7estern blot.

$ CONDITII PREALABILE

$." Se pregateste aria de lucru cf. S#P

$.$ Aparatura necesara%

" aparat de electroforeza folosit pentru SDS-PAGE

" 8artie de nitroceluloza cu pori de di&ensiune 0.!(/ sau P5D6

" filtre 28at&an 3''

$.3 )eacti*i necesari9

" ta&pon pentru electroforeza ae&&li (0&' ris-:Cl 4 0.";< '

glicina p: 1.3/ peste care se adauga &etanol $0 .

" a&pon de transfer 0.0$( ' ris-:Cl 4 $0 &etanol, p: 1.3 /

% PROCED&RA

Daca se foloseste &e&brana de P5D6, aceasta se tine in &etanol ti&p de apro=. (

&in. Atat &e&brana cat si filtrele 2at&an se ec8ilibreaza in ta&pon de transfer

ti&p de "(-30 &in inainte de utilizare.

ATENTIE' 'e&brana de P5D6 nu trebuie sa lasata sa se usuce in ti&pul utilizarii ei.



(odul de ase!are)

Anod *+,- #iltru .atman- membrana- /el de poliarilamida- #iltru .atman-

Catod *0,

6iecare strat se aseaza cu gri>a fara pentru a eli&ina riscul for&arii bulelor de aer

intre ele in special intre &e&brana si gelul de poliacrila&ida/. ot ansa&blul

trebuie i&bibat in ta&ponul de transfer pentru a asigura o buna circulatie a

curentului electric.

Conditii de transfer) "(-30 &in la "0-"( 5

4 DETECTIA

Se realizeaza fie prin colorare te&porara cu 0,$ rosu Ponceau in 3 CA acid

tricloracetic/, fie se ur&eaza protocolul pentru 7estern blot.

Colorare Cu Comassie Si Transfer

Documents

Transcript of Colorare Cu Comassie Si Transfer