Clonarea simpla

1.1 Experimentul de baza

1.1.1. Clonarea folosind o simpla plasmida

Un exemplu simplu pentru a vedea modul de aplicare, au fost supravegheate tehnici si enzime folosite in clonare si astfel, una dintre cele mai simple exercitii este introducerea ADN-ului in E. coli, intr-o plasmida precum pUC18. Plasmidele bacteriene sunt molecule circulare dsADN capabile de reproducere in celulele bacteriene. Inserarea ADN- ului in plasmida, permite propagarea sa in celula gazda. Moleculele utilizate pentru propragarea ADN-ului in acest mod poarta denumirea de vectori. Plasmidul pUC18 este unul dintre o serie similara de vectori ce poarta doua gene de o improranta deosebita: una ce confera rezistenta la antibioticul ampicilina (care blocheaza lanturile reticulare de plozaharide din peretele ceulelor bacteriene). Lipsa lanturilor reticulare slabeste peretele celular bacterian si eventual liza celulelor. Gena de rezistenta (bla sau amp) codifica enzima beta-lactamaza, care hirolizeaza segmentul beta-lactamic al antibiotiului prin inactivarea sa. Cealalta gena codifica o parte din enzima beta-galactozidaza, care in mod normal descompune dizaharidele (cum ar fi lactoza in monozaharide). De asemenea, se poate scinda un substrat artificial 5-Br-4-Cl3-indolil-beta-D-galactosid, cunoscut si sub numele de X-gal, pentru a elibera un colorant albastru. Din acest motiv, substratul este numit cromogenic. Se va observa mai tarziu, de ce intreaga enzima beta-galactozidaza nu este utilizata, dar putem trata pe moment plasmida ca si cum ar contine intreaga gena. Precum genele ampR si lacZ, plasmida are unele caracteristici mai putin imediate, cum ar fi originea replicarii. Are de asemenea, un numar de situsuri de recunoastere pentru endonucleazele de restrictie si multe dintre acestea sunt localizate intr-o zona a genei lacZ cunoscuta sun numele de clonare multipla sau situs de policlonare.

Sa presupunem ca am dori sa clonam ADN genomic din organismul ce a fost studiat in situsul BamHI din pUC18, localizat in situsul de policlonare a genei lacZ (nu trebuie sa utilizati doar situsul BamHI, se poate folosi oricare din situsurile de restrictie din policlonare). Procedura este urmatoarea: prima etapa este purificarea ADN-ului genomic din organismul de interes si separarea acestuia cu enzima BamHI. Trebuie purificat si pUC18 si taiat cu aceeasi enzima. Apoi plasmida BamHI-asimilata si ADN-ul genomic asimilat de BamHI sunt amestecate si apoi adaugate intr-un tampon corespunzator ADN ligaze. Din punct de vedere topologic va genera un numar mare de molecule liniare sau circulare.

Moleculele liniare nu vor fi propragate in mod stabil in etapele ulterioare ale experimentului, asa ca nu vor fi luate in considerare. Ligarea intramoleculara a ADN-ului plasmidial va genera plasmide circulare pUC18 (originale). Pot avea loc o gama larga de ligari intermoleculare. Cel mai important este ca o molecula de ADN genomic poate fi ligata la o molecula de ADN plasmidial, si desigur o mare varietate de ligari poate avea loc cu implicare de trei sau mai multe molecule, dar vor fi mai rar intalnite decat ligarile unimoleculare sau bimoleculare. Moleculele ce contin combinatii noi de secvente/fragmente sunt denumite recombinari. Introducerea ADN-ului in genalacZ va distruge functia genei, pt ca ea perturba regiunea de codificare a proteinei lacZ.

Urmatoarea etapa estre transferul ligantilor inapoi in E. coli, acest experiment este de obicei indus chimic sau prin electroporatie. Utilizarea de ADN de E. coli este mai degraba ineficienta, in care probabilitatea a oricarei celule bacteriene individuale de a lua un fragment de ADN este foarte scazuta. Pentru proceduri cu trasformare simpla doar 10 la puterea5 va avea succces din 10 la puterea9 de celule tratate cu 1 mg de ADN plasmidial superrasucit si spunem ca, este o frecventa de trasformare de 10 la puterea5 colonii/microgram de ADN; acesta este scazuta, deoarece 1 mg de pUC18 contine molecule de ordinul 10 la puterea11. Apoi celulele sunt placate pe agar care contine ampicilina impreuna cu un inductor al genei lacZ (izopropil-tiogalactoza (IPTG)) si un substrat cromogen de X-gal. Celulele care nu au luat plasmida vor fi sensibile la ampicilina si mor dupa cateva generatii, dar si cele care au preluat doar ADN genomic. Cele care au preluat ADN pUC18 vor dobandi o gena de rezistenta la ampicilina si pot astfel creste in mediul selectiv formand colonii izolate, doar daca au fost placate la o dilutie corespunzatoare. Astfel, toti membrii unei colonii sunt derivate de celul i ar trebui s aib dobantit o singura plasmida. (Deoarece probabilitatea unei celule de a prelua o molecula de ADN este scazuta; este posibil sa nu fie cazul, desi doar un mic fragment din celule este capabila de a lua ADN, aceste celule sunt eficiente in asimilarea ADN-ului. Deci, un mic fragment, dar semnificativ de colonii poate contine doua plasmide diferite, si de-a lungul timpului, acestea se segrega cu unele celule care contin o plasmida si restul continand altceva).

Problema este acum de a distinge coloniile care au dobandit ADN genomic din toate celelalte, si in acest exemplu se poate face folosind gena lacZ. Coloniile care au dobandit molecule pUC18 fara un insert de ADN genomic va avea gena lacZ intacta (care va fi indusa prin IPTG); ei vor putea descompune X-galul si sa fie colorat in albastru. Coloniile care au dobandit molecule cu un insert de ADN genomic va avea o gena lacZ inactivata prin insertie, astfel aceste colonii vor fi incapabile de a metaboliza X-galul si va fi de culoare alba (off-white). Moleculele pUC18 dimerice cap-la-coada vor da colonii albastre, si dimerii cap-la-cap nu se vor reproduce stabil in celula gazda. Abundenta relativa a coloniilor de albastru si alb va depinde de factori precum proprortiile relative de ADN genomic si plasmidic in ligarea initiala. In coloniile albe putem confirma ca plasmidele contin o insertie de crestere a bacteriilor, prin purificarea ADN-ul plasmidic si taierea cu o enzima de restrictie. BamHI ar trebui sa genereze doua dimensiuni de molecule: plasmida si ADN-ul genomic inserat. Plasmidele din coloniile albastre, acolo unde nu exista inserare, va da o singura marime/dimensiune a fragmentelor de restrictie corespunzatoare ADN-ului plasmidic, acelasi lucru este vazut la plasmidele dimere cap-la-coada. (O metoda alternativa de a diferentia daca plasmidele au insertie, si sa se masoare dimensiunea insertiei este de a face PCR pe ADN-ul din colonii folosind primeri care alipesc pe fiecare parte a situsului de donare; acesta se poate face direct, fara a fi nevoie de purificarea ADN-ului si poarta numele de colonie PCR).

Rezultatul acestui experiment este un numar mare de colonii de E. coli, fiecare purtand o plasmida care contine un fragment BamHI de ADN genomic; acest lucru este util in multe moduri. De exemplu, pentru a obtine mult mai mult ADN genomic, acesta este o chestiune de cresterea cantitatii de E. coli prin extragerea plasmidei si daca este necesar si prin separarea din plasmida a insertiei (acesta este un mod mult mai usor decat extragerea ADN-ului). Pentru a separa un singur fragment definit din ADN-ul genomic total, ar fi prea laborios . Aceasta propragare specifica, definit ca un fragment de ADN intr-un organism adecvat este clonarea.

Generarea de recombinari in acest mod de catre fragmente de clonare aleatoriu ale ADN-ului total dintr-un organism numit clonare shotgun, si colectarea aleatoarie de colonii de E. coli ce contine molecule de ADN recombinant se numeste library (biblioteca). Acesta se mai numeste biblioteca genomica deoarece a fost utilizat ADN genomic total. O biblioteca genomica ideala ar contine toate secventele prezente in genomul organismului original si poate fi descris ca reprezentant. O biblioteca costruita in modul descris, probabil nu ar fi reprezentativa. De exemplu, fragmente mici de ADN tind sa fie clonate mai eficient decat cele mari, deci biblioteca noastra ar fi nereprezentativa pentru fragmente mari. O alta problema cu biblioteca este ca, orice gena ce contine un situs BamHI nu a putut ramane intact, deoarece asimilarea BamHI a fost utilizata pentru generarea de fragmente pentru clonare (ar fi bine sa fie folosita o alta metoda de generare a fragmente).

1.1.2 Utilizarea sistemului indicator de lacZ (alfa-complementarea)

In acest exemplu, am spus ca plasmida pUC continea doar o parte din gena beta-galactozidaza lacZ. Beta-galactozidaza este o proteina destul de mare (116 kDa) si este mai convenabil sa aiba doar o portiune a genei pe plasmida pentru a mentine plasmida cat mai mica posibil. Acest fragment codifica primii 146 de aminoacizi si uneori este numit minigena lacZ. In aditionarea genei lacZ si gena de rezistenta la ampicilina, plasmida contine gena lacI pentru proteina represor Lac, acest lucru tine minigena reprimata, cu exceptia prezentei unui inductor, de exemplu: IPTG. Acest lucru poate fi deosebit de important in cazul in care secventele inserate in minigena sunt toxice( daca s-a explimat la un nivel inalt). Restul genei lacZ este in gazda, de cele mai multe ori pe plasmida F. De fapt, acesta este o versiune a genei numita M15 delection (stergere/suprimare) care este lipsita de codonii 11-41. Polipeptida produsa din acesta la tetramerize esuiaza si acesta tetramerizare este necesara pentru activitatea enzimatica. Cu toate acestea, in prezenta produsului minigenenic (aminoacizii 1-146) asamblarea poate avea loc pentru a produce o molecula cu scazuta, dar detectabila activitate a beta-galactozidaza; acesta complementare intragenica este numita alfa-complementare. In esenta, acesta este doar o modalitate de a reduce marimea vectorului necesar. Vectorii pUC au fost elaborate la Universitatea din California (de unde si numele lor).

1.2 Vectori, transformare si gazde

1.2.1 Vectori

Vectorii reprezinta molecule de ADN in interiorul carora se introduc fragmente de ADN strain pentru propagarea ulterioara intr-o celula gazda. Un vector ar trebui sa aiba mai multe caracteristici:

1. O origine a replicarii. Fara o origine de replicare, vectorul nu ar putea replica, si atunci cand celulele se divid dupa preluarea moleculei vector doar una din celulele fiice trebuie pastrata. Originea replicarii pUC18 a venit de la o plasmida intr-un izolat clinic bacterian notat pMB1.

2. Un marker de selectie. Acest lucru este necesar pentru a distinge celulele care au

preluat vectorul de cele care nu au preluat. In exemplul dat, marker-ul de selectie a fost rezistenta la ampicilina. Gena de rezistenta la ampicilina deriva dintr-un transpozon (un fragment de ADN capabil sa se miste, sau transpune in diferite locuri in genom) dintr-o alta plasmida: pRSF2124.

3. Situsuri unice de restrictie. pUC18 a avut un singur situs de recunoastere pentru enzima BamHI care a fost utilizat in clonare. Daca ar fi existat mai mult de un situs BamHI in pUC18, vectorul nu ar fi fost adecvate, deoarece taierea cu BamHI ar taia in mai multe fragment. Reasamblarea vectorului cu o insertie in timpul ligaturii ar fi necesar cel putin de o reactie trimoleculara ( care ar fi putin probabil). Daca moleculele de insertie au fost generate de asimilarea Sau3A, ar putea fi folosit BamHI pentru a reduce vectorul, deoarece capetele BamHI sunt compatibile cu capetele Sau3A. Taierea vectorului Sau3A nu ar fi posibil, deoarece exista prea multe situsuri pentru Sau3A in vector. Situsurile de restrictie situate in gene indispensabile vectorului sunt impropii pentru clonare, deoarece inserarea ADN-ului nu ar fi de natura sa distruga functia genei si prin urmare, viabilitatea vectorului.

4. Dimensiune corespunzatoare. Intr-o anumita masura, avand o dimensiune corespunzatoare este corolar de a avea situsuri unice de restrictie. Clivajul situsului unei enzime de restrictie care cuprinde 6 nucleotide va avea loc in medie, aproximativ o data la fiecare 4 la putarea 6 pb (la fiecare 4 kpb). Deci, un vector care a fost mai mare decat 4 kpb ar fi de asteptat sa aiba mai multe situsuri pentru enzima data, iar taierea vectorului ar reduce in mai multe fragmente, care ar fi putin probabil asamblate corect intr-o reactie de ligare; este posibila eliminarea situsurilor de restrictie aflate in exces, dar eliminarea acestora nu inlatura problema. Moleculele mari de ADN sunt sensibile la diviziunea fizica, chiar si in simplul act de pipetare sunt dificil de manevrat. Utilizarea sistemului alfa-complementar a permis reducerea dimensiunii plasmidelor pUC la ceea ce ar fi necesar pentru a codifica beta-galactozidaza.

5. Markeri pentru inserarea ADN-ului. In exemplul dat, inserarea ADN-ului intr-un vector poate fi detectata prin inactivarea genei lacZ, care la randul sau ar putea fi usor determinat prin placarea celulelor pe un mediu continand un inductor si un substrat cromogenic precum ampicilina. La unii vectori mai vechi a fost nevoie de o runda suplimentare de placare pentru distingerea recombinantelor de non-recombinate. Un exemplu in acest sens este vectorul pBR322 care contine o gena de rezistenta la ampicilina si o gena rezistenta la tetraciclina; exista situsuri de donare pentru ambele gene. Sa presupunem ca, am folosit situsul BamHI in tetraciclina, gena de rezistenta pentru inserarea ADN-ului. Dupa transformare, am placat celule de E. coli pe un mediu continand ampicilina pentru selectie ( la achizitionarea de o plasmida). Daca ADN-ul a fost inserat in situsul BamHI, apoi gena de rezistenta la tetraciclina ar fi inactivata si celulele care contin plasmide recombinante ar fi sensibile la tetraciclina. Celulele care au dobandit o plasmida fara insertia ADN-ului ar fi rezistente la tetraciclina, precum si la ampicilina. Acesta are nevoie de doua runde de placare si a fost unul din motivele pentru care plasmidul pBR322 a fost inlocuit de pUC. Singurul mod de a detecta insertia, a fost de a izola ADNs plasmidial asimilat cu o enzima adecvata si analiza fragmentelor produse electroforetic.

6. Numar mare de copii. Este de dorit un numar mare de copii per celula, dar nu esential, avand markeri pentru insertia ADN-ului. Maximizarea randamentului de plasmid din celule transformate, numarul de copii in fiecare celula trebuie sa fie cat mai mare posibil; plasmide diferite au numar de copii diferite. Factorul F are numar mic de copii, probabil unul sau doua pentru fiecare celula. Replicarea factorului F este stars legata de replicarea cromosomului, si astfel controlul de replicare este riguros. Plasmida pSC101 (unul dintre primlee palsmide utilizate pentru clonare) este, de asemenea, sub conlrolul riguros si prezent nu mai mult de 5 copii per celula. Plasmide cu diferite origini de replicare, replicarea a fost mai putin controlata. Aici, numarul de copii poate varia pe scara larga. Numarul de copii a pBR322 este de obicei 15-20 per celula, intrucat vectori cum ar fi plasmidele pUC pot fi prezente in 500-700 copii per celula. Originea replicarii pentru ambele plasmide pBR322 si pUC au venit de la plasmida pMB1. Motivul diferentei numarului de copii intre plasmide este originea aceleeasi replicari ( se poate afla intr-o mutatie a plasmidelor pUC, in regiunea care codifica molecule de ARN care reglementeaza replicarea prin interactiune cu originea). Acesta mutatie face ca sistemul de represiune care controleaza replicarea plasmidei mai putin eficace. Plasmidel cu un numar scazut de copii care are originea pMB1, numarul de copii poate fi crescut de amplificarea cu cloramfeniclol. Cultura de celule gazda este tratata cu cloramfenicol care inhiba sinteza proteinei bacteriene; inhibarea este strans legata de replicarea ADN-ului cromosomial. Replicarea plasmidiala necesita doar proteine ce traiesc mai mult; se poate continua atunci cand replicarea ADN-ului cromosomial si a diviziunii celulare a incetat. Si prin urmare replicarea ADN-ului plasmidial inceteaza, dar numarul de copii per celula este foarte crescurt.

7. Incapacitate. Inca de la primele experimente de manipulare genetica, nu a fost ingrijorarea fata de emanarea si raspandirea in mediu a moleculelor de ADN recombinant. Probabilitatea acestuia se poate reduce daca plasmida este intr-un fel dezactivata, in asa fel incat, sa nu se poate raspandi la alte bacterii prin procese de conjugare. Multe plasmide cum ar fi pBR322 a fost dezactivate pentru indepartarea genei mob, ce este necesara pentru mobilizarea ei prin conjugare. Astfel de plasmide pot fi transmise de la celule care contin alte plasmide ce ofera functiile necesare pentru mobilizare. Acesta transmisie poate fi blocata prin indepartarea unei regiuni care contine situsuri numite nic si bom din plasmida care trebuie mobilizata. Acesta regiune se afla in proteinele furnizate de activitatea altor plasmide; vectorii pUC sunt printre cei care au aceasta regiune indepartata.1.2.2 TransformareaIn functie de eficienta dorinta, necesara, depinde si alegerea metodei de transformare. Metodele chimice complexe pentru o inducere competenta poate genera pana la 10 la puterea 9 transformatii per microgram ADN plasmidic, cu pana 5% celule viabile competente pentru transformare. Daca moleculele recombinante sunt doar de un singur sau de mai multe tipuri, apoi un simplu tratament cu clorura de calciu va fi suficienta pentru a produce mai multe astfel de plasmide, prin reintroducerea unui stoc de ADN plasmidic in celule. Daca numarul disponibil de molecule recombinante este foarte scazut este posibil sa fie recuperate prin electroporare, fiind cel mai eficient sistem. Foarte optimizant este ca, acesta abordare poate produce un numare mare de transformanti pe microgram de ADN decat oricare din tratamentele chimice (au fost revendicate 510 la puterea10 per microgram). De obicei, este utilizata o intensitate de camp de ordinal 15kV/cm cu o constanta de degradare de 5m/s. Aceste conditii vor avea rezultat la celulele ramase viabile si vor mentine un echilibru intre celulele ucise si inductia de competenta.1.2.3 Gazde

Gazda reprezinta celula in care moleculele sunt recombinate pentru a fi propragate. Alegerea unei gazde potrivite este la fel de importanta ca si alegerea potrivita a unui vectorului. Caracterele esentiale sunt urmatoarele:1. O transformare eficienta. Acest lucru depinde de doua caracteristici principale: o caracteristica consta in capacitatea de a lua ADN in celula, dar acest process este prost inteles. Genotipuri diferite raspund diferit la diferite sisteme de transformare. Unele mutatii par sa sporeasca eficienta de trasnformare in sine. Acestea includ mutatii deoR care par sa ajute in special in asimilarea moleculelor mari de ADN. DeoR este un regulator de transcriptie cu activitate de legare a ADN-ului care controleaza expresia setului de gene implicat in catabolismul deoxiribonicleozidic. Principala caracteristica in determinarea randamentului de tarnsformare este in prezenta sau absenta unor sisteme endogene de ADN-degradant. Multe gazde utilizate pentru clonare sunt derivate din tulpina K de E. coli, care contine sistemul K de restrictie-codificare, codificat de locusul hsdRMS. Gena hsdR codifica o endonucleaza care scindeaza ADN-ul ce contine secventa -AACNNNNNNGTGC-, in afara cazului al doilea dintre cele doua resturi de adenina si reziduul adenina pe catena opusa timina este metilat. Multe gazde au o mutatie hsdR (sau cu deletie mai mare) pentru a evita scindarea ADN-ului neprotejat la intrare. Gena hsdM codifica metilaza si protejeaza impotriva degradarii prin trecerea ADN-ului printr-o tulpina hsdR(-)M(+), daca este necesar pot permite metilarea si ulterior sa se propage intr-o tulpina hsdR(+).Exista si alte proteine in tulpina K de E. coli, in cazul in care este metilat va degrada ADN-ul de intrare, apartinand sistemelor de restrictie metilano-dependente (MDRs). Acestea nu sunt la fel de bine intelese precum Clasele de restrictie-modificare I-III. Acestea includ endonucleaze care sunt produse de pozitile mcrA, mcrB si mmr care vor degrada ADN-ul cu metilcitoza (mcrA, mcrB) sau metiladenina (mmr). Este de dorit sa folosim tulpini mutante in special atunci cand clonarea ADN-ului este extrem metilizata.In gazda, gradul de metilare al ADN-ului poate afecta de asemenea eficienta cu care enzimele de restrictie vor scinda ADN-ul in vitro. Metilarea poate fi realizata prin exzimele deja mentionate, dar si de produsul genelor dam si dc m( proteina Dam adenin metilare a secventei - GATC si Dcm citozin metilare a secventelor- CCAGG - i - CCTGG -). Unele enzime de restritie utilizate frecvent au situsuri de recunoastre care se suprapun cu acestea si sunt inhibate de metilare , astfel incat ADN-ul preparat din tulpinile de tip salbatic pentru aceste locusuri nu va fi eficient restrictionata. Utilizarea tulpinelor dam (-) si dcm (-) au ridicat ratele de mutatie. Acest lucru se datoareaza recentei replicari de dsADN care este hemimetilic. Daca polimeraza a indus erori pe parcursul sintezei, acestea vor avea ca rezultate o nepotrivire; aceste nepotriviri sunt rezolvate in mod normal la nivelul celulei de corectie pentru componenta metilica. In dam (-) sau o tulpina similara, nici o componenta un este metilica si corectarea nepotrivirii este la fel de probabila sa fie incorecta (nou sintetizata) ca la o corecta tulpina.2. Mentinerea stabila a plasmidei.Dupa ce o plasmida recombinanta a intrat in celula (presupunand faptul ca a scapat de orice restrictie endogena a activitatii enzimatice), un este inca garantata reproducerea stabila chiar daca are o origine de replicare adecvata. Rearanjarea recombinarii poate aparea si cea mai frecventa manifestare al acestui fapt este deletita partiala (pierderea unei partid in molecula). Acest lucru se intampla, de obicei, prin recombinarea directa a secventelor. Nu toate moleculele plasmidiale dintr-o celula trebuie supuse aceluiasi recombinare in acelasi timp, deci recombinarea directa intr-o pereche de secvente repetate intr-o plasmida va rezulta trei tipuri de molecule in celula: de tip original, cel nerecombinant si produse recombinante mici. La unul dintre produsi le va lipsi o origine a replicarii si astfel vor pierde din populatie. Altele vor fi capabile in continuare de reproducere, si va face acest lucru mai repede decat molecula originala deoarece are dimensiunea mai mica. Peste un numar de runde de replicare, chiar si o mica diferenta in timpul replicarii poate rezulta o mare diferenta in numarul moleculelor prezente. Pentru generarea a 1mg de ADN dintr-o singura copie a plasmidei de 4kpb dureaza aproximativ 40 de cicluri de replicare. O plasmida carea r putea sa re replice mai repede cu 10%, ar genera aproximativ de 16 ori mai mult ADN si prin urmare, vor fi cele mai abundente celule in totalul populatiei. Se pune problema daca plasmida originala este nociva pentru gazda, probabil din pricina exprimarii unei proteine care este toxica pentru celule, si stergerea partiala cauzata de recombinare desfiinteaza productia acestei proteine. Trebuie avuta in vedere posibilitatea de propagare preferentiala a moleculelor modificate in timpul clonarii. Recombinarea un are nevoie intotdeuna de deletie; aceasta poate provoca, de asemenea o inversiune. Deoarece deletiile si inversiunile depind de obicei de recombinare , mutatiile in gazda care suprima recombinarea contribuie la stabilitatea moleculelor de transformare. Exista trei sisteme principale de recombinare in E. coli folosind produsele genelor recBCD, recE si recF; aceste sisteme depind in mare masura de produsul genei recA, astfel tulpinile mutante vor avea o frecuenta de recombinare foarte mult redusa. Unele secvente, in special cele care contin repetitii inversate pot fi supuse rearanjarii intr-un mod recA-independent. Acest lucru poate fi cauza functionarii recF in absenta (sau nivel scazut ) de recA, deci o mutatie recF este de dorit decat recA. Este precizata de asemenea ca deficiente de ADN giraza codificata de genele gyrA si gyrB pot duce la o mai buna stabilitate a moleculelor care contin secvente repetate.3. Incapacitatea.Ca si vectorii, este necesar sa se ia masuri de precautie pentru a se asigura ca tuplinile transporta plasmide recombinante si sete purin probabil sa scape si sa se propage in afara laboratorului (de exemplu sub forma de sport de izolare). Din acest motiv, tulpinile transporta de obicei mutatii care reduc viabilitatea lor in salbaticie. Acestea sunt de multe ori mutatii ce confera auxotrofie.4. Caracteristici care permit utilizarea minigenei lacZ.

Utilizarea minigenei lacZ necesita utilizarea unei gazde producatoare a unui fragment LacZ adecvat, si ca aceasta este uneori codificata pe o plasmida F. In aceste cazuri este necesar sa fie in masura sa asigure retentia plasmidei F. Din acest motiv, plasmidul F contine genele proA si proB pentru doua din encmele biosintezei prolinei (5-glutamil fosfat reductaza, respectiv glutamat-5-kinaza), iar acestea se elimina din cromosomul gazdei. Propagarea gazdei pe mediu lipsit de prolina asigura ca numai celulele transportoare plasmidului rezident F va creste. 5 . Alti markeri.Este foarte util de a avea tulpini care sunt marcate genetic pt ca astfel tulpinile corecte pot fi recunoscute. Recombinarea si deficiente nutritionala a markerilor sunt utile in acesta privinta, este convenabil sa aiba alti markeri care pot fi selectati mai usor. Rezistenta la antibiotice poate fi utila si ar trebui sa fie diferita de oricare rezistenta a antibioticului conferite de vectorii utilizati. O alta mutatie care este adesea incorporat in gazde este endA, inactivarea genei pentru ADN-ul specific. Aceasta mutatie imbunatateste randamentul cat si calitatea a preparatului ADN-ului palsmidial. Mutatia relA suprascrie controlul asupra sintezei ARN-ului prin imbunatatirea ratei de sinteza in absenta sintezei proteinelor. Mutatia tonA cauzeaza pierderea unei proteine a membranei exterioare care absorb fagii T1 si T5. Infectia cu acesti fagi poate fi o problema de laborator, astfelca mutatia tonA este utila deoarece confera rezistenta la infectia cu fagi. Tulpina DH5 este o gazda comuna pentru plasmidele pUC si este un derivat de tulpina K de E. coli, iar genotipul sau este endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyr (nal la puterea r) relA1 (lacZYA-argF) U169 F80lacZM15.endA a fost descris mai sushsdR17 inactiveaza sistemul de restrictie a gazdelor, permitand ca ADn-ul sa fie protejat prin metilare, dar un digerat.supE44 - este utilizat pentru propragarea fagilor, cresterea unor astfel de fagi sete posibila doar intr-o gazda supresoare.thi-1 - este o cerinta nutritionala pentru tiaminarecA1 gyr (nal la puterea r)- nal la puterea r este rezistenta la acidul nalidixic inhibitor a ADN girazei conferita de mutatia gyrA.relA1 (lacZYA-argF) U169 este o deletie a operonului lac , necesara selectiei alb-albastra.80lacZM15 descrie un profag 80lacZ care directionenaza sinteza a LacZ partial sters necesara selectiei alb-albastra.1.3 Modificari

1.3.1 Evitatrea autoligaturariiPAGE 9