Tehnici de clonare, terapiegenică şi transgeneză

Biotehnologii industriale, an III

Clonarea

1. Principalele etape ale diferenţierii2. Clonarea prin transfer nuclear

1. Principalele etape ale diferenţieriiClonarea• reproducerea unei celule/a unui întreg organism fără nici o modificare a genotipului• în esență, clonarea este reproducerea non-sexuată• fenomen întâlnit larg în natură - bacterii, drojdii, celule somatice (diploide) ale organismelor pluricelulareExcepţie – celulele sistemului imun care sintetizează anticorpi şi receptori TGenele care codifică Ig – generate prin asamblarea întâmplătoare a elementelor, după imunizare. Celulele care conţin genele care sintetizează Ig şi care recunosc antigenul folosit pentru imunizare sunt salvate şi amplificate, în timp ce toate celelalte celule sunt eliminateAceastă rearanjare a genomului este foarte specifică unei anumite categorii de limfocite şi afectează doar o regiune limitată a genomului

1. Principalele etape ale diferenţieriiLa animalele superioare – celula iniţială, zigotul, şi

primele 2-4 celule ale embrionului sunt totipotentepot genera toate celulele organismului (dacă sunt introduse în zona pellucida, pot genera un nou organism)

Blastomerele – pluripotente participă la generarea tuturor organelor (dacă sunt introduse în zona pellucida, nu generează un nou organism)

Blastocistul este format din:1. Celule care formează un monostrat de-a lungul zonei

pellucida – trofoectoderm (precursorul placentei)2. Un grup compact, intern, de celule pluripotente –

precursorul embrionului (generează himere)

1. Principalele etape ale diferenţieriiDupă stadiul de blastocist, celulele embrionare devin tot mai specializate – multipotente (pot participa la generarea unui număr restrâns de tipuri celulare)În dezvoltarea timpurie a embrionului, un grup mic de celule rămân slab diferenţiate migrează în creasta genitală organele sexuale gameţiiPrin acest proces sunt evitate multiplicările celulare şi, deci, mutaţiilecelulele primordiale germinale conservă genotipul specieiCelulele precursoare spermatice - unipotenteCelulele stem adulte celule multipotente prezente în anumite organe se divid cu o rată scăzută nu suferă procesul de diferenţiere intervin în regenerarea organelor

1. Principalele etape ale diferenţierii

Etapele dezvoltării de la embrion la adult.Celulele îşi pierd progresiv potenţa în timpul diferenţierii. Celulele stem sunt capabile de autoreplicare, dar şi de diferenţiere sub controlul unor inductori specifici ai diferenţierii.

1. Principalele etape ale diferenţieriiHimerele rezultă dintr-un amestec de celule suprapuse, fiecare din ele păstrându-şi propriul genom se obţin din celulele interne, pluripotente, care se transferă unui blastocist. Acestea participă la dezvoltarea embrionului gameţii şi urmaşii himerelor derivă doar din una din celulele embrionului originar genele nu sunt o combinaţie a celor din cei doi embrioni se pot obţine şi pornind de la specii diferite (capră-oaie; prepeliţă-găină)Hibrizii rezultă în urma fertilizării, deci a combinării genoamelor celor două celule

Obţinerea himerelor

1. Principalele etape ale diferenţierii

1. Principalele etape ale diferenţieriiMultă vreme s-a considerat că diferenţierea este un proces care se petrece în mai multe etape și este ireversibil la vertebrateCelulele tumorale – îşi pierd starea diferenţiată şi capătă unele caracteristici ale celulelor fetale (proces denumit dediferențiere)Însă, până în prezent, nu s-a obţinut dediferenţierea celulelor animale in vitroLa plante dediferenţierea este posibilă – se pot obţine multe plante clone pornind de la una singură

2. Clonarea prin transfer nuclearPrimul animal clonat – XenopusPrincipiul metodei citoplasma oocitului trebuie să fie capabilă să favorizeze sau să

inducă totipotenţa celulară, deoarece nucleul spermatozoizilor este inactiv din punct de vedere transcripţional ADN spermatic este acoperit de protamine, iar cromatina este condensată. După fertilizare, nucleul se decondensează, protaminele sunt înlocuite de histone activarea progresivă a genomului citoplasma oocitului are capacitatea de a reprograma genomul pentru dezvoltarea embrionului

În timpul dezvoltării embrionare – expresie genică masivă, dar nu se ştie în ce moment este necesară

Dediferenţierea unei celule somatice, necesară clonării, implică reactivarea a numeroase gene silenţioase, dar mecanismul este necunoscutși nu a fost observat la animale, dar s-a sugerat că este posibil

Tehnica clonării Xenopus O celulă diploidă embrionară a fost injectată între zona pellucida şi membrana plasmatică a unui oocit enucleat Fuziunea membranelor s-a realizat prin aplicarea unui curent electric alternativ, care destabilizează membranele Fertilizarea nu înseamnă doar transferul spermatozoidului în oocit. Spermatozoidul conţine factori care induc preluarea calciului de către oocit, care reprezintă semnalul pentru iniţierea dezvoltării embrionului. Câmpul electric creează pori în membrana oocitului, care permit intrarea calciului mimează activarea oocitului de către spermatozoid

2. Clonarea prin transfer nuclear

2. Clonarea prin transfer nuclear

Principiul clonării animale prin transfer nuclear. Un blastomer izolat dintr-o morulă sau o celulăa a unui blastocist se inserează între zona pellucida şi membrana plasmatică a unui oocit enucleat. Fuziunea este indusă prin aplicarea unui curent electric alternativ.

2. Clonarea prin transfer nuclearProtocolul clonării Xenopus a fost extins la animalele

domestice, în vederea accelerării selecţiei geneticeOaie – transferul nucleilor s-a realizat de la celule

embrionare pluripotente, deoarece s-a observat că nu este posibilă clonarea cu nuclei proveniţi de la celule adulte

Eficienţa – scăzută. Doar 1% din embrioni dau naştere animalelor adulte insuficient pentru accelerarea selecţiei genetice

Alte aplicaţii: porc, iepure, şobolan, şoarece, dar cu randament chiar mai scăzut decât la rumegătoare

2. Clonarea prin transfer nuclearModificări ale protocoluluiCelulele pluripotente cultivate, considerate ES-like cells participă la dezvoltarea timpurie a embrionilor himerici, dar sunt diluate progresiv şi nu participă la formarea gameţilorDacă sunt transferate oocitelor enucleate, participă la dezvoltarea blastociştilor in vitro. O parte din blastociştii transplantaţi participă la dezvoltarea fetală doar în primele 2-3 luni de sarcină

Motivul – discordanţă între stadiile ciclului de diviziune ale celulelor donoare şi oocitele gazdă

2. Clonarea prin transfer nuclearModificări ale protocoluluiUtilizarea celulelor pluripotente sincronizateMetoda - se elimină din mediul de cultură factorii de

creştere şi serul. Celulele nu se mai divid şi intră în faza G0. Cele mai multe dintre celule nu pot supravieţui în aceste condiţii şi sunt eliminate prin apoptoză. Adiţia serului şi a factorilor de creştere reiniţiază ciclul de diviziune în mod sincronizat

Rata de succes - a fost îmbunătăţită nu doar la celulele embrionare, ci şi adulte oaia Dolly

2. Clonarea prin transfer nuclearAcelaşi protocol, fără modificări majore, a fost ulterior folosit

pentru clonarea vitelor şi caprelorClonările – au continuat cu transferul nucleilor celulelor

somaticeEşec – clonarea şoarecilorPosibila explicaţie – activarea transcripţiei în genomul

zigotului are loc imediat după fertilizare (aprox. 1 zi) şi activarea clonei. Acest fenomen s-ar petrece la şoarece înainte de reprogramarea genomului, ceea ce ar putea duce la reglarea aberantă a genelor şi imposibilitatea dezvoltării embrionului.

2. Clonarea prin transfer nuclearClonarea şoarecilor Nucleii proveniţi de la celule pluripotente sau diferenţiate au fost transferaţi oocitelor enucleate prin microinjectare directă (nu prin difuzie, ca la celelalte specii) Activarea zigotului după transferul nuclear s-a făcut prin adăugarea unor ioni, precum calciul, mediului de cultură, pentru perioade controlate de timp Clonarea porcilor – dificilă datorită conţinutului ridicat de lipide al embrionilorExistă 3 metode:1. Aceeaşi utilizată pentru rumegătoare2. Nucleii izolaţi se microinjectează direct în oocitele enucleate3. Se separă dezvoltarea zigotului de reprogramarea genomului. Se generează zigotul ca pentru Dolly. După o zi, timp considerat suficient pentru reprogramarea genomului, nucleul zigotului se izolează prin micromanipulare şi reintrodus în citoplasma unui oocit enucleat normal

2. Clonarea prin transfer nuclearClonarea iepurilor• nu se poate realiza cu celule pluripotente • s-a reusit doar dezvoltarea zigotului clonat in vitro până la stadiul de blastocist• modificări minore (încă nestandardizate) ale protocolului au permis clonarea lorRezultate slabe cu: şobolani, câini, pisici, cai, peşti, primate, omFenomene observate după clonare:• discrepanţă mare între numărul de blastocişti obţinuţi şi numărul de nou-născuţi care supravieţuiesc• număr mare de avorturi după transferul nuclear• moartea a aprox. 40% dintre fetuşi şi nou-născuţi• număr mare de urmaşi cu placentă nedezvoltată• altele: aplazie timică, atrofia rinichilor, fluctuaţii ale temperaturii corporale, hipertrofie hepatică sau cardiacă, imunosupresie parţială etc

2. Clonarea prin transfer nuclearCelule utilizate actualmente pentru clonare:•celulele cumulus (celule granulare) sunt donori foarte buni, în timp ce ES-like cells, deşi pluripotente, prezintă o rată a clonării destul de scăzută•cele mai utilizate şi eficiente celule donoare sunt fibroblaştii fetali din piele•celulele provenite de la animale adulte sunt mai puţin eficiente în privinţa clonării – pierd capacitatea de a genera clone odată cu înaintarea de la starea pluripotentă spre stadiul de celulă somatică•celulele provenite din acelaşi lot au capacitate diferită de a genera clone •telomerii unor celule sunt anormali de scurţi

2. Clonarea prin transfer nuclearTelomerii• secvenţe localizate la capetele fiecărui cromozom, care protejează ADN de degradare de către exonucleaze• în procesul de îmbătrânire, telomerii se scurtează şi celula moare după aprox. 50 multiplicăriIpoteze privind scurtarea telomerilor în timpul clonării:• Condiţiile de cultură cresc rata mutaţiilor în celulele embrionare• Reprogramarea necorespunzătoare a genomului.Originea – epigenetică De. ex., metilarea ADN (Metilarea selectivă a ADN inhibă specific expresia anumitor gene şi se consideră că joacă rol important în diferenţiere).

2. Clonarea prin transfer nuclearMetilarea ADN după fertilizare, ADN este demetilat în genomul zigotului şi remetilat în stadiul de blastocist. Remetilarea stabileşte care gene pot fi active după implantare. Procesul este stocastic poate juca un rol important în organizarea cromatinei în timpul gametogenezei şi dezvoltării ADN din embrionii generaţi prin transfer nuclear este metilat excesiv, ca rezultat al demetilării incomplete şi remetilării premature ADN din ES-like cells este, de asemenea, mult mai metilat decât celulele pluripotente echivalente din embrionii normali